Рекомбинантный штамм Yarrowia lipolytica - продуцент инкапсулированной фитазы Paenibacillus sp. Российский патент 2024 года по МПК C12N1/16 C12N15/81 C12N9/16 C12R1/645 

Изобретение относится к области биотехнологии и кормопроизводства, в частности к созданию рекомбинантного штамма Yarrowia lipolytica - продуцента инкапсулированной фитазы Obesumbacterium proteus, и может быть использовано для получения кормовых премиксов для использования в животноводстве, обладающих высокой усвояемостью органического фосфора, находящегося в зерновом сырье.

Фитазы группа фосфогидролаз, расщепляющих сложноэфирные связи фосфорной кислоты в молекуле фитата. По типу активного центра фермента выделяют четыре класса фитаз: кислые гистидиновые фосфатазы (histidine acid phosphatase, НАР), цистеиновые фитазы (cystein phytase, CPhy), пурпурные кислые фосфатазы (purple acid phosphatase, PAP) и β-пропеллерные фитазы (beta-propeller phytase, ВРР). Для практического использования в кормовом производстве к фитазам предъявляют следующие требования: устойчивость к кратковременному (5-10 мин.) действию высоких температур (70°С - 80°С), используемых в ходе гранулирования комбикормов; высокая удельная активность в физиологических условиях желудочно-кишечного тракта (температурный оптимум около 42°С, рН 3-5); способностью выдерживать действие среды желудка животных (стабильность при низких значениях рН 1,5-2,5 и устойчивость к протеолитическим ферментам).

В зависимости от оптимальной для ферментативной активности кислотности среды фитазы разделяют на два класса: кислые и щелочные фитазы. Кислые фитазы демонстрируют наибольшую активность при рН 2,5-5,5. В аминокислотных последовательностях кислых гистидиновых фитаз имеется консервативный мотив, содержащий остаток гистидина, который участвует в нуклеофильной атаке на отщепляемую фосфатную группу. В группе кислых фитаз выделяются бактериальные и грибные ферменты. Бактериальные кислые фитазы демонстрируют более высокую удельную активность по сравнению с грибными. По литературным данным, из всех изученных к настоящему времени природных фитаз самую высокую удельную активность демонстрируют фитазы Е. coli и Citrobacter freundii (продукты гена АррА). Большинство известных бактериальных кислых фитаз способны последовательно отщеплять от молекулы фитиновой кислоты до пяти фосфатных остатков, оставляя в качестве конечного продукта мио-инозитолмонофосфат. Недостатком природных бактериальных фитаз является их низкая термостабильность. Глубина гидролиза фитатов для щелочных фитаз обычно ниже, чем для кислых фитаз, но зато щелочные фитазы обладают промышленно-ценной особенностью: они более термостабильны, некоторые выдерживают нагрев до 80-95°С.

Примером щелочной бактериальной фитазы, обладающей высокой термостабильностью, является популярный на рынке препарат Nov9x. АВ Vista (Германия), продающийся также под торговой маркой Quantum Blue. Готовая форма Quantum Blue представляет собой Nov9x, слитую с тиоредоксином (Trx-Nov9x6). Коммерческий препарат имеет активность 2358 FTU/мл, которая не меняется в диапазоне рН от 4,5 до 6,0. При рН 1,5 сохраняется 20% активности. При кратковременном прогреве при 70°С в течение 1 мин активность полностью сохраняется. При прогреве при 60°С в течении 2 ч сохраняется 75% первоначальной активности. После инкубации при 70°С в течение 30 мин сохраняется 29% активности.

Препарат инкапсулированной Файзим™ (Даниско Анимал Ньютришн, Финляндия) используется в технологии Thermostability Protection Technology (ТРТ), допуская прогрев при температуре 95°С. Капсулы ТРТ обеспечивают высвобождение Файзим™ в верхней части пищеварительного тракта животных.

На данный момент в России разрешены для использования три типа фитазы Файзим:

Файзим ХР 5000 G - активность 5000 FTU/гр, термостабильность до 76С;

Файзим ХР 5000 ТРТ - активность 5000 FTU/гр, термостабильность до 96С;

Файзим ХР 10000 ТРТ - активность 10000 FTU/гр, термостабильность до 96С.

Они устойчивы в диапазоне рН от 2,5 до 5,5, рН оптимума 5,5.

Цена препарата в зависимости от объемов поставки и условий оплаты:

Файзим ХР 5000 G - 10 EUR/кг;

Файзим ХР 5000 ТРТ - 12 EUR/кг;

Файзим ХР 10000 ТРТ - 22 EUR/кг

Еще одним представленным на рынке препаратом фитазы является Ронозим ХайФос (DSM Нутришнл продактс), выпускаемый в трех различных формах:

- высокотермостабильная форма Ронозим ХайФос (GT) имеет улучшенные характеристики для применения, такие как отсутствие пыли, хорошая сыпучесть и смешиваемость, максимальная среди фитаз термостабильность - до 95°С. Активность 10000 FTU/г;

- концентрированная форма Ронозим ХайФос (М) оптимальна для мягких режимов производства комбикорма; она также имеет хорошую сыпучесть и гомогенность распределения, безопасна в использовании для персонала (отсутствие пыли). Активность 50000 FTU/г;

- жидкая форма Ронозим ХайФос (L) - стабильный продукт, применяется для жидких концентрированных продуктов. Активность: 20000 FYT/г.

Дрожжи Yarrowia lipolytica являются перспективным объектом биотехнологии, что обусловлено сочетанием в этом организме нескольких уникальных биохимических особенностей [Barth G., Gaillardin С., 1997]. За счет наличия пероксисом Y. lipolytica способна расти на органических субстратах самого различного биогенного и абиогенного происхождения, включая парафины нефти, коммунальные и промышленные стоки. Благодаря склонности к утилизации гидрофобных соединений микроорганизм способен осуществлять исчерпывающую биологическую очистку кормовых ингредиентов от микотоксинов, гидропероксидов и ксенобиотиков. Обладая мощным аэробным метаболизмом, Y. lipolytica устойчива ко многим агрессивным органическим соединениям: спиртам, кислотам, альдегидам и кетонам. В отличие от других видов дрожжей, Y. lipolytica обладает высокой алкало - и галотолерантностью, с высокой эффективностью секретирует белки во внешнюю среду. В течение 10 лет Y. lipolytica использовалась в СССР в качестве биореактора для производства кормового белка для животноводства в качестве субстрата парафинов нефти и газа (паприн, гаприн, белково-витаминный концентрат - БВК) в результате чего накоплены данные, подтверждающие полную безопасность и высокую кормовую ценность ее биомассы [Выслоух В.А. и др., 1987; Ибрагимов Ф.Б., Сычев А.Е. и др., 1995]. В 2000 г надзорный орган США - Food and Drug Administration включил Y. lipolytica в список заведомо безопасных видов (GRAS), без ограничений пригодных для производства кормовых и пищевых ингредиентов. По данным [Guerzoni М.Е. et al., 2001; Suzzi G. et al., 2001], живые клетки Y. lipolytica присутствуют в традиционных продуктах из регионов Италии.

В работе Зыльковой М.В. и соавт (Проблемы биологии продуктивных животных, 2012, №2, 2012, стр. 5-12) описаны результаты испытаний биологической безопасности биодобавки на основе жизнеспособной биомассы рекомбинантного штамма Y. lipolytica, продуцирующей соматолиберин. Добавку в течение 20 суток вносили в корм белых мышей-отъемышей и определяли скорость привесов. В результате показано, что добавка не только не обладает токсичностью, но и обладает анаболическим эффектом, не присущим биомассе, не содержащей соматолиберина.

В работе Эповой Е.Ю. и соавт [Epova et al, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2016, Volume 21, Issue 3, pp 408-413] описана генетическая система, позволяющая получать рекомбинантные штаммы-продуценты Y. lipolytica, адаптированные к эксплуатации в условиях культивирования на малоценных промышленных ингредиентах, в частности, интегративный вектор pUVLT2, содержащий промотор митохондриального порина VDAC Y. lipolytica. С помощью транскрипционного репортера показано, что использование этого вектора позволяет добиваться высокоэффективной экспрессии трансгенов в рекомбинантных штаммах Y. lipolytica, культивируемых на средах на основе малоценного сырья. При этом уровень экспрессии трансгена оказывается не ниже, а в некоторых случаях превышает уровень экспрессии под контролем наиболее эффективного из описанных в литературе промоторов синтетического промотора hp4D. Более того, высокая вариабельность профилей экспрессии независимо полученных при трансформации клонов позволяет с помощью фенотипической отбирать трансформанты, обладающие наибольшей эффективностью экспрессии на конкретной среде на основе малоценных ингредиентов, имеющей промышленное значение.

Прототипом настоящего изобретения патент RU 2664476 (приоритет от 14 июля 2017 г), описывающий рекомбинантный штамм Y. lipolytica - продуцент инкапсулированной фитазы О. proteus, основан на использовании вектора pUVLT2 с промотором VDAC. Он предназначен для использования в рамках технологии, совмещающей решение двух независимых задач биотехнологии: получение кормового белка путем биоконверсии отходов, и получение источника ценного фермента фитазы кормового назначения. Целесообразность использования Y. lipolytica для производства микроинкапсулированных ферментов, в частности, фитазы, обусловлена следующими обстоятельствами. Во всех странах мира признано и происходит использование ферментов в производстве комбикормов для свиней, птицы и других животных. Ферменты позволяют резко повысить эффективность использования кормовых ингредиентов, вовлечь в оборот ряд видов малоценного и непригодного сырья, снизить уровень нагрузки животноводческого производства на окружающую среду. Однако, номенклатура ферментов, доступных для применения в кормовом производстве, серьезно ограничивается его технологическими особенностями. Дело в том, что гранулированные комбикорма получают методом распылительной сушки при температуре ≈70°С. Получение премиксов (комбикормов с предварительно внесенным ферментом) заставляет подвергать сушке в тех же условиях и сам ферментный препарат. Таким образом, для кормового производства приходится отбирать только те ферменты, которые обладают термостабильностью при 70°С и выше. Эта особенность, присущая только небольшой доле промышленно выпускаемых ферментов, не играет роли при их функционировании в ЖКТ сельскохозяйственных животных, где устойчиво поддерживается температура ≈37°С. Однако, за счет возникающего технологического требования термостабильности приходится использовать в кормах ферменты со свойствами, далекими от оптимальных при работе в ЖКТ животных. Например, препараты термостабильных фитаз грибного происхождения, наиболее массово продаваемые в мире: Файзим (Даниско Анимал Ньютришн, Финляндия), Quantum Blue (АВ Vista, Германия) и Ронозим ХайФос (DSM Нутришнл продактс) имеют рН оптимума 2,0 и ниже, что практически не позволяет им работать в двенадцатиперстной и тонкой кишке при рН ≈8. Поскольку при использовании фитазы на 25-40% уменьшается содержание фосфора в помете, пропорционально снижается содержание фосфора в почве и сточных водах, подвергающихся загрязнению животноводческими отходами, природоохранный аспект сыграл решающее значение для выработки рекомендаций на применение фитазы в странах Европейского Союза (например, в Голландии), где внесение этого фермента в корма регламентируется производственными стандартами: не менее 200 фитиновых ед. на кг корма. Однако, выполнение этого требования применительно к Файзим, Quantum Blue и Ронозим ХайФос носит сугубо формальный характер, так как по своим энзиматическим характеристикам они не могут гидролизовать фитат, высвободившийся из зерна в просвете тонкого кишечника при рН тонкого кишечника.

Использование нейтрофильной фитазы из Obesumbacterium proteus (OPP) обеспечивает существенно больший эффект, но оно возможно только за счет увеличения термостабильности этих ферментов при кратковременном прогреве во время гранулирования кормов. Этот фермент [FEMS Microbiol Lett. 2004; V. 236 №2 P. 283-90] характеризуется высокой удельной активностью, равной 310 FYT/мг. Фермент ОРР остается активным в диапазоне значений рН от 1,5 до 6,5, оптимум рН при 4,9. Максимальная активность фермента достигается при 45°С. При культивировании в колбах штамма рекомбинантного штамма Pichia pastoris - продуцента ОРР фитазная активность в культуральной жидкости составляет 500 Ед/мл [RU 2388823].

Основным результатом, лежащим в основе изобретения-прототипа, является доказанная возможность повышения термостабильности ОРР при кратковременном прогреве с 50 до 70°С при инкапсуляции фермента непосредственно в клетках рекомбинантного продуцента: Y. lipolytica. Выход фитазы в расчете на мл культуральной среды при этом будет несколько уступать выходу секретируемого в среду фермента. Однако, комбинирование ферментной и белковой добавки в одном и том же исходном материале, имеющим достаточно низкую себестоимость, делает рациональным внесение ее в корм в количестве 5%, а не ≈0,01%, как в случае очищенных секреторных ферментов. Ведь производство инкапсулированного фермента является безотходным: биомасса продуцента и остаток белка из среды не попадают в стоки и отходы, а используются для кормления животных. Таким образом, производство добавки останется рентабельным даже при сравнительно невысоком выходе фермента. Дополнительным преимуществом инкапсулированного в Y. lipolytica кормового фермента является защита от повреждения кислотой и пепсином в желудке животного: солюбилизация содержимого клеток Y. lipolytica и высвобождение содержимого происходит только в двенадцатиперстной кишке.

Недостатком кормовой добавки, содержащей микроинкапсулированную фитазу с помощью изобретения-прототипа, является невозможность полного извлечения органического фосфора из компонентов комбикорма. В статье Danilova М.А., Epova E.Y., Trubnikova E.V., Badrutdinov N.V., Kokoreva A.S., Pusev M.S., Deryabina Y.I., Isakova E.P. Encapsulated Phytase Produced by Recombinant Yarrowia lipolytica Exhibits High Efficiency on Broiler Chickens in Low Dosage. Appl. Sci. 2022, 12, 11999. https://doi.org/10.3390/app122311999. описывающей результаты биологических испытаний микроинкапсулированной фитазы О. proteus, изготовленной согласно изобретению-прототипу, сообщается, что при введении кормовой добавки с активностью 30 FYT/кг содержание остаточного фосфора в фекалиях удается сократить с 1,78-2,23% от сухого вещества фекалий до 0,79%. Задачей настоящего изобретения является создание кормовой добавки, использование которой отдельно или в сочетании с добавкой, описанной в прототипном изобретении, позволяет добиться дальнейшего снижения концентрации остаточного фосфора в фекалиях, то есть, повысить эффективность использования органического фосфора в кормах для птицы.

Краткое описание графических изображений:

Фиг. 1. Карта конструкции pUV3-PhyPS на основе промотора VDAC Y. lipolytica.

Получение рекомбинантного штамма Y. lipolytica, несущего генетическую конструкцию pUV3-PhyPS

Получение плазмидной конструкции pUV3-PhyPS

Клонирование гена фитазы Panibacillus sp.RB проводили с помощью ПЦР на матрице геномной ДНК Panibacillus sp.RB с праймерами PhyPS-F2(BamHI) ctaGGATCCGCAGCGGTAGCGAGTCC и PhyPS-R2(NotI) tagcGCGGCCGC TT ATTG AC G ATTTTCT A ATTTTCGCGG АТС (Фиг. 1). По данным электрофореза в агарозном геле, размер продукта ПЦР соответствовал ожидаемому - 1366 п.н. Для проведения ПЦР в 30 мкл использовали термостабильную ДНК-полимеразу HS (Евроген, Россия), буфер Turbo, праймеры в концентрации 3 пмоль на реакцию. Для термоциклирования использовали термоциклер Терцик МС-16 в следующем режиме: предварительный прогрев смеси 95°С 3 мин; 30 циклов в режиме: денатурация 95°С 15 сек, отжиг - 66°С 15 сек, элонгация 72°С - 50 сек; заключительная достройка 72°С -13 мин.

Особенностью подобранных праймеров является то, что при их использовании происходит отсечение фрагмента кодирующей области длиной 33 кодонов, соответствующих секреторному лидеру, благодаря чему продукт утрачивает способность секретироваться во внешнюю среду и накапливается в цитоплазме. Праймер PhyPS-F2(BamHI) обеспечивал введение сайта рестриктазы BamHI, наличие которого приводила также к введению на N-конец модифицированного гена PhyPS искусственного кодона GGA (Gly), который, следуя непосредственно за инициаторным кодоном ATG (присутствует в векторе pUV3LT непосредственно выше сайта рестриктазы BamHI).

Продукт ПЦР очищали с помощью набора DNA Gene Jet (ThermoFisher Scientific), обрабатывали рестриктазами BamHI и NotI и лигировали с ДНК вектора pUV-LT3 (Epova et al, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2016, V. 21, №3, pp 408-413), обработанного рестриктазами BamHI и NotI (при этом произошло отщепление последовательности репортерного гена LacZ от остальной части вектора).

Лигазную смесь использовали для трансформации штамма Е. coli TG1 по стандартному протоколу с применением ионов Са²⁺. Трансформированные клетки Е. coli высевали на среду LB с канамицина (30 мкг/мл) и X-gal, отбирали колонии, не имеющие синего оттенка (для контрселекции клонов, содержащих ген LacZ в составе исходного вектора pUV-LT3). 6 отобранных клонов выращивали на жидкой среде LB с добавлением канамицина (30 мкг/мл), выделяли плазмидную ДНК, которую картировали с помощью рестриктаз BamHI и NotI. Было отобрано 2 независимых клона, содержащих вставку искомого размера 1366 п.н. (вставка в клонах, содержащих исходный вектор, имела размер ~3000 п.н.). Плазмидную ДНК одного из клонов подвергали секвенированию с праймерами Txpr-rev(XbaI) ggTCTAGAgccacctacaagccagattt, VDAC3F10 CGTAGCTTTTCGCTCCCCGTAACT и PhyPS-F2(BamHI) Сэнгеру на капиллярном генетическом анализаторе Нанофор 05 (Завод Аналитического приборостроения, Россия) с помощью набора BigDye® Terminator v3.1, убедившись в полном соответствии полученной последовательности ранее известной [FEMS Microbiol Lett. 2004; V. 236 №2 P. 283-90]. Полученная конструкция получила название pUV3-PhyPS (Фиг. 1).

Трансформация штамма Y. lipolytica POlf плазмидной конструкцией pUV3-PhyPS

Введение ДНК конструкции pUV3-PhyPS в клетки Y. lipolytica POlf (MatA, leu2-270, ura3-302, xpr2-322, axp-2) (депонирован в коллекции CIRM-Levures (Франция) под номером CLIB-724 и в АТСС под номером MYA-2613) проводилось методом трансформации с использованием солей Li⁺, как описано ранее [Davidow et al, Curr. Genet. 1985]. Отбор трансформантов проводили на минимальной синтетической среде, свободной от урацила с добавлением лейцина при 28°С.

Оценка продуктивности трансформантов штамма Y. lipolytica POlf(pUV3-PhyPS)

Выросшие колонии (11 клонов) упорядочивали пересевом на чашку с минимальной средой YNB, обогащенной 2% глюкозой и лейцином. После этого каждый клон высевали на стерильную жидкую среду, представляющую собой 5% водную суспензию мясокостной муки с естественным рН (5,3), объемом 3 мл, разлитую в плоскодонные пенициллиновые флаконы, закрытые ватно-марлевыми пробками. Клоны культивировали в течение 34 часов при 28°С на микробиологическом шейкере-культиваторе при максимально интенсивной аэрации.

Выросшую биомассу вместе с нерастворимой фракцией среды собирали кратковременным центрифугированием на настольной центрифуге в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл. Растворимую фракцию культуральной жидкости удаляли и суспендировали осадок в 500 мл физиологического раствора, повторно осаждали на настольной центрифуге и суспендировали в 1 мл стерильной деионизованной воды. Суспензию охлаждали до 4°С, переносили в охлажденную до 0°С фарфоровую ступку объемом 100 мл, добавляли 50-70 мг стерильного кварцевого песка и гомогенизировали фарфоровым пестиком в течение 3 мин. Фитазную активность трансформантов оценивали в чашечном тесте по диаметру зон просветления суспензии фитата кальция. Для этого 50 мкл суспензии биомассы клонов Y. lipolytica вносили в лунки агаризованной среды, полученной путем суспендирования фитата кальция (2 мас.%) в 250 мМ Na-ацетатном буфере рН 5,5, содержащего 1% агарозу. Для дальнейшей работы использован клон №7, давший зону просветления фитата наибольшего диаметра по сравнению с другими клонами.

Исследование термостабильности фитазы PhyPS, инкапсулированной в биомассе рекомбинантного штамма Y. lipolytica, несущего генетическую конструкцию pUV3-PhyPS

Получение препарата инкапсулированной фитазы PhyPS

Штаммы Polf (pUV3-PhyPS)№7 и Polf (pUV3LT) (отрицательный контроль) выращивали при 28°С в течение 1 суток в чашках Петри с агаризованной средой YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, глюкоза - 2, агар - 2).

Инокулят (жидкую посевную культуру) выращивали в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих по 30 мл жидкой питательной среды YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, глюкоза - 2). Засев колб осуществляли посевной культурой, выращенной на твердой агаризованной среде YPD. Колбы инкубировали на микробиологическом шейкере-инкубаторе (250 об/мин) при 28°С в течение 24 ч.

В колбу с 25 мл ферментационной среды (мас. %: мясокостная мука - 5) засевали 5 мл инокулята. Культивирование осуществляли на качалке со скоростью 250 об/мин при температуре 28°С. Ферментацию проводили в течение 34 часов.

Моделирование условий кратковременного прогрева фитазы PhyPS (имитация распылительной сушки)

Полученную культуральную жидкость штаммов Polf (pUV3-PhyPS)№7 и Polf (pUV3LT) распределяли по 1 мл в стерильные полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл, не допуская осаждения суспензии под действием силы тяжести и замораживали в жидком азоте, после чего подвергали их лиофильному высушиванию на установке SpeedVac Savant SPD1010 в течение 6 часов до постоянной массы (при дальнейшем высушивании масса сухого остатка уменьшалась менее чем на 2% за 1 час).

По пять пробирок, содержащих биомассу штаммов Polf (pUV3-PhyPS)№7 и Polf (pUV3LT), устанавливали в твердотельный термостат Термит при температуре 70°С на 30 сек, после чего пробирки охлаждали на льду. Затем по пять пробирок прогревали в аналогичных условиях при 60°С и 50°С.

Во все прогретые пробирки, а также в пять непрогретых пробирок с биомассой каждого штамма, вносили по 1 мл деионизованной воды, охлажденной на льду, суспендировали и гомогенизировали в фарфоровой ступке, как описано выше. Далее перед определением ферментативной активности проводили очистку фермента от примесей фосфата, имевшихся в гомогенатах.

Для этого гомогенаты центрифугировали на настольной центрифуге в течение 10 мин при 14,5 тыс. g, отбирали по 500 мкл супернатанта, переносили в чистые полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл и добавляли по 1 мл насыщенного сульфата аммония, приготовленного на 250 мМ Na-ацетате, рН 5,5. Пробирки тщательно перемешивали на ручном вортексе и инкубировали при +4°С в течение 6 часов. Осадки отделяли центрифугированием на настольной центрифуге в течение 5 мин при 14,5 тыс. g, супернатанты удаляли с помощью водоструйного насоса, а осадки растворяли в 100 мкл 250 мМ Na-ацетате, рН 5,5 в течение 15 мин при +4°С.

Фитазную активность определяли по накоплению в реакционной смеси свободного фосфат-иона, детектируемого методом Фиске-Субарроу [J. Biol. Chem., 1925, V. 66, pp.375-400]. За единицу фитазной активности принимали количество фермента, способного высвободить 1 моль неорганического фосфата из фитата натрия в минуту при 37°С и рН 5,5. Для определения отбирали аликвоты фермента 5 мкл, проводили измерение оптической плотности при λ=415 нм, после чего нормировали остаточную активность на мл исходной культуральной жидкости штамма.

Результаты измерений (ед/мл культуральной жидкости) представлены в таблице.

Таким образом, приведенные выше результаты показывают, что:

1. Сконструированный в процессе осуществления изобретения штамм Polf (pUV3-PhyPS)№7 обладает способностью к синтезу фитазы при культивировании на среде, представляющей собой суспензию мясокостной муки кормового назначения.

2. Уровень продукции фитазы PhyPS штаммом Polf (pUV3-PhyPS)№7 составляет около 369 ед FYT/мл культуральной жидкости.

3. После кратковременного прогрева при 70°С остаточная активность фитазы PhyPS, инкапсулированной в биомассе, составляет 83,4±19,6% от исходного уровня. Этот результат позволяет сделать вывод о высокой термостабильности микроинкапсулированной фитазы PhyPS, позволяющей использовать ее в составе кормов, получаемых методом гранулирования на распылительной сушке. Уровень термостабильности микроинкапсулированной фитазы, накопленной в биомассе рекомбинантного штамма (pUV3-PhyPS)№7, обеспечивает ее пригодность для изготовления кормовых премиксов с применением распылительной сушки.

--->

Список последовательностей

<110> Federal state budgetary institution “N.I. Vavilov Institute of

General Genetics of Russian Academy of Sciences”

<120> Recombinant strain Yarrowia lipolytica, a producer of

encapsulated phytase Paenibacillus sp.

<160> SEQ ID NO 1

<210> SEO ID NO:1

<211> 1356 bp

<212> DNA

<213> Native sequence from Paenibacillus sp.

<220> Recombinant strain Yarrowia lipolytica, a producer of

encapsulated phytase Paenibacillus sp.

<221>

<400> 1

atgggatccGCAGCGGTAGCGAGTCCGCTGGTATATGCAGCAGAAGGTTCATCCGTTCCGCTTAGACAAT

CGATCGAGGCTATCGGTGGCAAAATGTACTGGGACGGAGAAGATAAAGCAGCCTTTTTCCAATTGAAAAA

TGGAATTACAGGTTCGATTACAGTGGGTGAGAAGAAATACCGACTGGCTGGCAAAAGTGGCGTATTGGAA

CAAGCTGCTCATTTACAACAGGGAGCTACCTATATTCCACAAAGCTTGCTGACAATGATCACTGCTGAAA

ATGCCAAATTCAATGATCCTGCTGATGCTATCCCTGTATTTTCGGTTCAGCCTACAGGCGAGACAGCTGC

TGTAGAGTCAGGTGAAGATGCAGCAGATGATCCAGCGATCTGGCTTGATCCATCCAACGCAGCCAACAGC

AAGATTATTGCTACGAACAAAGGCGGAGGCATGTTGGTCTATGATCTGAAAGGCAAAGAGTTACAATCTT

ATCCTACAGGTAAAATGAACAATACCGACCTTCGTTACGATTTTCCATTGAACGGTAAAAAAGTGGATAT

TGTTGGTGCGACCAATCGTTCAAGCAATACGATTGATATCTTTTCGTTTAATGGTCAAACAGGCGCACTT

CAAAATATCCTTGCTACACCAATCAAATCCAAAATGGGTGAAGTATACGGATTTAGCTTGTACCATAGTG

TAAAAACAAACAAATACTATGCGCTTGTTTTGGGTAAAGAAGGCGAATTCGAACAATATGAATTAATGGA

TAATGGTAAAGGCAAAGTAAAAGGATCATTGGTACGTCAATTCAAGCTGGATACGCAATCAGAAGGTATG

GTTGCTGATGATGAATATGGCACATTATATATTGCTGAAGAAGATGCAGCGATCTGGAAATACAGTGCAG

AACCTGATGGTGGTACCAAAGCTTTAGGCACAGTCGATGTTGCAGATGGTCGTCGTCTCCATGATGATAT

CGAAGGGTTAACCCTTTATTATGGTGCAGATGGAACAGGTTACTTGATGGCTTCAAGTCAAGGTAATAAC

ACGTATGCTGTCTATGATCGCCAGAATAACAATCCATACATCTCTAACTTTACGATTAACGATGGTAAAG

GTATCGATGGCACGACAGAAACTGATGGTATTGATGTATTAGGTGCGAATATGGGTAGCCAGTATCCGTA

TGGTGTATTTATTGCTCAAGATGATGAGAATTTGCAAAATGGTAAAAAGCTTAATCAAAACTTCAAGCTT

GTACCATGGCAGTCGATTGATGCGGGTCTACATGAAGGTGTAGAGATGACGACCAACACTAGCCCTGATC

CGCGAAAATTAGAAAATCGTCAATAA//

<110> Federal state budgetary institution “N.I. Vavilov Institute of

General Genetics of Russian Academy of Sciences”

<120> Recombinant strain Yarrowia lipolytica, a producer of

encapsulated phytase Paenibacillus sp.

<160> SEQ ID NO 2

<210> SEO ID NO:2

<211> 451 aa

<212> DNA

<213> artificial sequence (optimized for expression in E. coli)

<220> Recombinant strain Yarrowia lipolytica, a producer of

encapsulated phytase Paenibacillus sp.

<221>

<400> 2

MGSAAVASPLVYAAEGSSVPLRQSIEAIGGKMYWDGEDKAAFFQLKNGITGSITVGEKKYRLAGKSGVLE

QAAHLQQGATYIPQSLLTMITAENAKFNDPADAIPVFSVQPTGETAAVESGEDAADDPAIWLDPSNAANS

KIIATNKGGGMLVYDLKGKELQSYPTGKMNNTDLRYDFPLNGKKVDIVGATNRSSNTIDIFSFNGQTGAL

QNILATPIKSKMGEVYGFSLYHSVKTNKYYALVLGKEGEFEQYELMDNGKGKVKGSLVRQFKLDTQSEGM

VADDEYGTLYIAEEDAAIWKYSAEPDGGTKALGTVDVADGRRLHDDIEGLTLYYGADGTGYLMASSQGNN

TYAVYDRQNNNPYISNFTINDGKGIDGTTETDGIDVLGANMGSQYPYGVFIAQDDENLQNGKKLNQNFKL

VPWQSIDAGLHEGVEMTTNTSPDPRKLENRQ

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и кормопроизводства. Предложен рекомбинантный штамм Yarrowia lipolytica – продуцент инкапсулированной фитазы Panibacillus sp. RB, характеризующейся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 2. Штамм получают путём введения в коллекционный штамм Yarrowia lipolytica PO1f плазмиды pUV3-PhyPS. Целевая вставка плазмиды представляет собой ген фитазы PhyPS, характеризующийся нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO. 1. Фитаза накапливаться в цитоплазме рекомбинантного продуцента и обладает повышенной термостабильностью при кратковременном прогреве при 70°С, что позволяет использовать ее в составе кормов, получаемых методом гранулирования на распылительной сушке. 1 ил., 1 табл.

Рекомбинантный штамм Yarrowia lipolytica, обладающий способностью к синтезу фитазы Panibacillus sp. RB, характеризующейся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 2, инкапсулированной в цитоплазме и обладающей за счёт этого повышенной термостабильностью при кратковременном прогреве при 70°С, получаемый путём введения в коллекционный штамм Yarrowia lipolytica PO1f плазмиды pUV3-PhyPS, целевая вставка которой представляет собой ген фитазы PhyPS и характеризуется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO. 1.