АМИНОТИОЛЭФИРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C07D213/34 C07D213/59 C07C327/22 A61K31/4402 A61K31/4406 A61K31/4409 A61K31/255 A61K47/50 A61P35/00 

Настоящее изобретение касается новых аминоэфирных соединений или их фармацевтически приемлемых солей или оптических изомеров, рацематов, диастереоизомеров, энантиомеров или таутомеров. Настоящее изобретение касается также способа их получения и применения этих соединений в качестве лекарственного средства, в частности для предотвращения или лечения рака. Настоящее изобретение касается также конъюгата антитело-препарат, содержащего такие соединения.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время рак является одной из главных проблем здравоохранения в развитых странах. Рак представляет собой нерегулируемое разрастание клеток вследствие потери нормального контроля, что приводит к неконтролируемому росту, потере дифференциации, локальной инвазии тканей и, часто, метастазам. Рак может развиться в любой ткани или органе в любом возрасте.

Некоторые виды рака являются излечимыми при обнаружении на ранних стадиях, и долговременное лечение возможно также на поздних стадиях. Однако излечение не всегда возможно, и лечение не проводится в некоторых застарелых случаях, когда паллиативная терапия дает более высокое качество жизни, чем агрессивное лечение, особенно у пожилых людей или у пациентов с сопутствующими заболеваниями.

Апоптоз является частью развития ткани, ее дифференциации и обновления. Поэтому индуцирование апоптоза представляет большой интерес с терапевтической точки зрения.

Очень большой ряд разнообразных природных или синтетических противораковых лекарственных препаратов, доступных в настоящее время, являются апоптоз-индуцирующими соединениями.

Среди таких противоопухолевых медицинских препаратов следует упомянуть алкилирующие агенты, такие как циклофосфамид, нитрозомочевины, такие как 1,3-бис(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевина (BCNU), интеркалирующие агенты, такие как актиномицин D или адриамицин, аналоги пуриновых или пиримидиновых оснований, такие как 6-тиогуанин и 5-фторурацил, ингибиторы de novo синтеза пуриновых оснований, такие как метотрексат, и, наконец, ингибиторы полимеризации тубулина, такие как Таксол®.

Одним из главных недостатков при использовании этих соединений является отсутствие селективной апоптозной активности в отношении опухолевых клеток.

Поэтому сохраняется потребность в доступных молекулах, которые индуцируют максимальный уровень апоптоза в опухолевой ткани, и при этом повреждают здоровые ткани организма по возможности минимально и обратимым образом.

Описание изобретения

Авторы настоящего изобретения идентифицировали новые соединения формулы (I), которые обладают интересными свойствами в предотвращении или лечении рака.

Настоящее изобретение касается соединения формулы (I):

(I)

в котором:

- X представляет собой атом, выбранный из O или S;

- R1 и R2 одинаковые или разные и независимо выбраны из: линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкенила, арила, гетероарила, CHR₅CHR₆OR₄ и (CHR₅)_vOR_4,

где указанный арил и гетероарил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, галогена, NO₂ и CONH₂;

- _V выбран из интервала от 2 до 4;

- R₃ выбран из линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, (C₁-C₇)алкил-CO₂Z и линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкил-NY₁Y₂; где указанный линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил-NY₁Y₂ необязательно замещен заместителем
(C₁-C₇)алкил-CO₂Z;

- R₄ выбран из H, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкила, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкенила, -CONR₇R₈, арила, гетероарила,
(C₂-C₇)циклоалкила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-арила и линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила;

указанный арил, (C₂-C₇)циклоалкил и гетероарил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из галоген, линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, необязательно замещенного одним или больше атомами галогена, линейной или разветвленной (C₁-C₇)алкокси-группы, необязательно замещенной одним или больше атомами галогена, -COOH, арила, -NRR’, -NO₂, или где указанный арил и гетероарил необязательно сконденсирован с образованием гетероциклоалкила;

- R₅ и R₆ одинаковые или разные и независимо выбраны из:

- H и линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, или

- R₅ и R₆ объединены с атомами углерода, к которым они присоединены, с образованием циклоалкила, арила или гетероарила, или

- R₅ представляет собой H, и R1 и R₆ объединены с атомом азота, соединенным с R1, с образованием гетероциклоалкила или гетероарила, или

- R₆ представляет собой H, и R1 и R₅ объединены с R1 и вместе с атомом азота, соединенным с R1, образуют гетероциклоалкил;

- R₇ представляет собой -(C₁-C₃)алкил;

- R₈ представляет собой -(C₁-C₃)алкилNRR’;

- R и R’ одинаковые или разные, независимо выбраны из H и линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила,

- Y₁ и Y₂ одинаковые или разные и независимо выбраны из H и -CO-(C₁-C₇)алкила;

- Z выбран из H и линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила;

и в котором по меньшей мере один из R1 и R2 представляет собой CHR₅CHR₆OR₄ или (CHR₅)_vOR₄ когда X представляет собой S, и R3 представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил;

или его фармацевтически приемлемых солей или оптических изомеров, рацематов, диастереоизомеров, энантиомеров или таутомеров.

В одном варианте осуществления, соединение по настоящему изобретению представляет собой соединение приведенной выше формулы (I), в котором:

- X представляет собой атом, выбранный из O или S;

- R1 и R2 одинаковые или разные и независимо выбраны из: линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкенила, арила, гетероарила, CHR₅CHR₆OR₄ и (CHR₅)_vOR₄,

где указанный арил и гетероарил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, галогена, NO₂ и CONH₂;

- _V выбран из интервала от 2 до 4;

- R₃ выбран из линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила и линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкил-NY₁Y₂; где указанный линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил-NY₁Y₂ необязательно замещен заместителем (C₁-C₇)алкил -CO₂Z;

- R₄ выбран из H, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкила, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкенила, арила, гетероарила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-арила и линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила;

где указанный арил и гетероарил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, необязательно замещенного одним или больше атомами галогена, линейной или разветвленной (C₁-C₇)алкокси-группы, необязательно замещенной одним или больше атомами галогена, -COOH, арила, -NRR’, -NO₂, или где указанный арил и гетероарил необязательно сконденсирован с образованием гетероциклоалкила;

- R₅ и R₆ одинаковые или разные и независимо выбраны из:

- H и линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, или

- R₅ и R₆ объединены с атомами углерода, к которым они присоединены, с образованием циклоалкила, арила или гетероарила, или

- R₅ представляет собой H, и R1 и R₆ объединены с атомом азота, соединенным с R1, с образованием гетероциклоалкила или гетероарила, или

- R₆ представляет собой H, и R1 и R₅ объединены с R1 и вместе с атомом азота, соединенным с R1, образуют гетероциклоалкил;

- R и R’ одинаковые или разные и независимо выбраны из H и линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила,

- Y₁ и Y₂ одинаковые или разные и независимо выбраны из H и -CO-(C₁-C₇)алкила;

- Z выбран из H и линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила;

и в котором по меньшей мере один из R1 и R2 представляет собой CHR₅CHR₆OR₄ или (CHR₅)_vOR₄ когда X представляет собой S, и R3 представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил;

или его фармацевтически приемлемые соли или оптические изомеры, рацематы, диастереоизомеры, энантиомеры или таутомеры.

В другом варианте осуществления, соединение по настоящему изобретению представляет собой соединение приведенной выше формулы (I), в котором X представляет собой O, и R₃ выбран из этила или метила.

В другом варианте осуществления, соединение по настоящему изобретению представляет собой соединение приведенной выше формулы (I), в котором X представляет собой S, R3 представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил, предпочтительно метил, R1 представляет собой линейный или разветвленный
(C₁-C₇)алкил, предпочтительно метил, R2 представляет собой CHR₅CHR₆OR₄ или (CHR₅)_vOR₄, и R5 и R6 представляют собой:

- H или

- R₅ представляет собой H, и R1 и R₆ объединены с атомом азота, связанным с R1, с образованием гетероциклоалкила, предпочтительно пирролидинила, или

- R₆ представляет собой H, и R1 и R₅ объединены с R1 и вместе с атомом азота, соединенным с R1, образуют гетероциклоалкил, предпочтительно пирролидинил.

В другом варианте осуществления, соединение по настоящему изобретению представляет собой соединение приведенной выше формулы (I), в котором X представляет собой S, R3 представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил, R1 представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил, и R2 представляет собой CHR₅CHR₆OR₄ или (CHR₅)_vOR₄, в частности CHR₅CHR₆OR_4.

В частности, R₄ выбран из H, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкила, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкенила, -CONR₇R₈, (C₂-C₇)циклоалкила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила, арила или бензила; где указанный (C₂-C₇) циклоалкил замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C1-C₇)алкила; где указанный бензил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, необязательно замещенного одним или больше атомами галогена, линейной или разветвленной (C₁-C₇)алкокси-группы, необязательно замещенной одним или больше атомами галогена, или указанный бензил необязательно сконденсирован с образованием 1,3-бензодиоксола.

Альтернативно, в частности, R₄ выбран из H, линейного или разветвленного
(C₂-C₇)алкила, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкенила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила, арила, линейного или разветвленного
-(C₁-C₇)алкил-арила или бензила; где указанный бензил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, необязательно замещенного одним или больше атомами галогена, линейной или разветвленной (C₁-C₇)алкокси-группы, необязательно замещенной одним или больше атомами галогена, или пиридила, или указанный бензил необязательно сконденсирован с образованием 1,3-бензодиоксола.

Более конкретно, R₅ и R₆ представляют собой H, и R₄ выбран из H, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкила, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкенила, CONR₇R₈, (C₂-C₇)циклоалкила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила или бензила; где указанный (C₂-C₇)циклоалкил замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C1-C₇)алкила; где указанный бензил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C1-C₇)алкила, необязательно замещенного одним или больше атомами галогена, линейной или разветвленной (C₁-C₇)алкокси-группы, необязательно замещенной одним или больше атомами галогена.

Альтернативно, более конкретно, R₅ и R₆ представляют собой H, и R₄ выбран из H, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкила, линейного или разветвленного
(C₂-C₇)алкенила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-арила или бензила; где указанный бензил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C1-C₇)алкила, необязательно замещенного одним или больше атомами галогена, линейной или разветвленной (C₁-C₇)алкокси-группы, необязательно замещенной одним или больше атомами галогена,.

Еще более конкретно, R1 представляет собой метил, и R₄ выбран из H, CONR₇R₈, где R₇ представляет собой метил, и R₈ представляет собой NRR’, где R и R’ представляют собой метил, этил, пропен, бензил, пиридил, бензилоксибутил, метил-циклогексенил, замещенный одним или больше метилами, и бензил, замещенный одним или больше атомами фтора, хлора, метокси-группами или метилами.

Альтернативно, еще более конкретно, R1 представляет собой метил, и R₄ выбран из H, этила, пропена, бензила, пиридила, бензилоксибутила и бензила, замещенного одним или больше атомами фтора, хлора, метокси-группами или метилами.

В другом варианте осуществления, X представляет собой S, R1 и R2 представляют собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил, и R3 представляет собой -(C₁-C₇)-CO₂Z или линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил-NY₁Y₂, где указанный линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил-NY₁Y₂ необязательно замещен заместителем (C₁-C₇)-CO₂Z, в частности, X представляет собой S, R1 и R2 представляют собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил, и R3 представляет собой линейный или разветвленный
(C₁-C₇)алкил-NY₁Y₂, где указанный линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил-NY₁Y₂ необязательно замещен заместителем (C₁-C₇)-CO₂Z.

В частности, Y₁ и Y₂ одинаковые или разные и независимо выбраны из H и -CO-CH₃.

Более конкретно Z выбран из H и т-бутильной (трет-бутильной) группы.

В частности, R3 представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₃)алкил-NY₁Y₂.

В частном варианте осуществления, соединение формулы (I) выбрано из следующих:

- S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-[2-аллилоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-[2-бензилоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(м-толилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат;

- S-метил 4-[2-[(3,4-диметилфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-[2-[(4-метоксифенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-[2-[(3,4-диметоксифенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-[2-[(3-хлорфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-[2-[(3-фторфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(2-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат;

- S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(3-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат;

- S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(4-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат;

- метил 4-(диметиламино)-4-метил-пент-2-иноат;

- этил 4-(диметиламино)-4-метил-пент-2-иноат;

- 2-амино-3-((4-(диметиламино)-4-метилпент-2иноил)тио)пропановая кислота;

- 2-амино-4-((4-диметиламино)-4-метилпентил-2-иноил)тио)бутановая кислота;

- этил-2-ацетамидо-3-((4-(диметиламино)-4-метилпент-2-иноил)тио)пропаноат;

- трет-бутил 2-((4-(диметиламино)-4-метилпент-2-иноил)тио)ацетат;

- 2-((4-(диметиламино)-4-метилпент-2-иноил)тио)уксусная кислота;

- S-метил 4-((4-(бензилокси)бутил)(метил)амино)-4-метилпент-2-интиоат;

- S-метил 4-((2-гидроксиэтил)(метил)амино)-4-метилпент-2-интиоат;

- S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(2-нафтилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат;

- S-метил 4-метил-4-[метил-[2-[(2,6,6-триметилциклогексен-1-ил)метокси]этил] амино]пент-2-интиоат;

- 2-[(1,1-диметил-4-метилсульфанил-4-оксо-бут-2-инил)-метиламино]этил-3,4-диметоксибензоат;

- 2[(1,1-диметил-4-метилсульфанил-4-оксо-бут-2-инил)-метиламино]этил ацетат;

- S-метил 2,5,10,11,11-пентаметил-6-оксо-7-окса-2,5,10-триазатетрадец-12-ин-14-тиоат;

- S-метил 4-[2-(метоксиметил)пирролидин-1-ил]-4-метилпент-2-интиоат;

- S-метил 4-(3-метоксипирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоат;

- S-метил 4-метил-4-[метил(2-феноксициклопентил)амино]пент-2-интиоат;

- (S)-S-метил 4-(2-((бензилокси)метил)пирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоат;

- S-метил 4-[(3(бензилокси)-1пирролидинил])-4-метилпент-2-интиоат

или их фармацевтически приемлемых солей или оптических изомеров, рацематов, диастереоизомеров, энантиомеров или таутомеров.

В частном варианте осуществления, соединение формулы (I) выбрано из следующих:

- S-метил 4-[2-бензилоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат; и

- S-метил 4-[2-[(3,4-диметилфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

или их фармацевтически приемлемых солей или оптических изомеров, рацематов, диастереоизомеров, энантиомеров или таутомеров.

В другом варианте осуществления, соединение по настоящему изобретению представляет собой соединение приведенной выше формулы (I), в котором:

- X представляет собой S;

- R1 представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил;

- R2 представляет собой CHR₅CHR₆OR₄ или (CHR₅)_vOR₄;

- R4 выбран из H, арила, гетероарила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-арила и линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила;

где указанный арил и гетероарил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из -COOH, -NRR’ и -NO₂; и

- R и R’ одинаковые, представляют собой H.

Настоящее изобретение касается также способа получения описанного выше соединения формулы (I), включающего:

- реакцию соединения формулы (II) с органической или неорганической кислотой

(II)

- реакцию соединения, полученного на стадии a), с основанием;

- реакцию соединения, полученного на стадии b), с CO₂;

- реакцию соединения, полученного на стадии c), с алкил хлорформиатом, с реагентом, способным образовывать ацилгалогенид с соединением, полученным на стадии c), или с реагентом, способным образовывать с соединением, полученным на стадии c), смешанный ангидрид;

- реакцию соединения, полученного на стадии d), с соединением-прекурсором аниона SMe^-;

где R1 и R2 имеют указанные в настоящем тексте значения.

В частности, оно касается описанного выше способа, в котором основание на стадии b) имеет pKa выше 25, предпочтительно основание, используемое на стадии b), выбрано из литиевых или магниевых оснований, предпочтительно основание выбрано из бутиллития или гексиллития.

Настоящее изобретение касается также фармацевтической композиции, содержащей соединение описанной выше формулы (I) и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Оно также касается соединения описанной выше формулы (I) для применения в качестве лекарственного средства.

В частности, оно касается соединения описанной выше формулы (I) для применения для предотвращения или лечения рака.

Более конкретно, настоящее изобретение касается соединения описанной выше формулы (I) для применения для предотвращения или лечения лейкоза.

Настоящее изобретение касается также конъюгата антитело-препарат формулы B-L-Ab, где:

- B представляет собой соединение приведенной выше формулы (I), в котором:

- X представляет собой S;

- R1 представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил;

- R2 представляет собой CHR₅CHR₆OR₄ или (CHR₅)_vOR₄;

- R4 выбран из H, арила, гетероарила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-арила и линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила;

где указанный арил и гетероарил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из -COOH, -NRR’ и -NO₂; и

- R и R’ одинаковые и представляют собой H;

- L представляет собой линкер; и

- Ab представляет собой антитело.

В частности, антитело в указанном конъюгате антитело-препарат выбрано из ритуксимаба, трастузумаба, алемтузумаба, ибритумомаба, тиуксетана, тозитумомаба, бревацизумаба, цетуксимаба, панитумумаба, офатумумаба, ипилимумаба и обинутузумаба.

Соединение формулы (I) по настоящему изобретению такое как описано выше.

Оно также касается любых из описанных далее вариантов осуществления или любых их комбинаций, при условии что по меньшей мере один из R1 и R2 представляет собой CHR₅CHR₆OR₄, когда R3 представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил, и X представляет собой S.

В одном варианте осуществления, X представляет собой S.

В другом варианте осуществления, R3 представляет собой метил.

В другом варианте осуществления, R1 представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил, в частности метил, и R2 представляет собой CHR₅CHR₆OR₄ или (CHR₅)_vOR₄.

В одном варианте осуществления, R₄ выбран из H, линейного или разветвленного
(C₂-C₇)алкила, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкенила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила, арила, линейного или разветвленного
-(C₁-C₇)алкил-арила или бензила; где указанный бензил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, необязательно замещенного одним или больше атомами галогена, линейной или разветвленной (C₁-C₇)алкокси-группы, необязательно замещенной одним или больше атомами галогена, или пиридила, или указанный бензил необязательно сконденсирован с образованием 1,3-бензодиоксола, в частности R₄ выбран из H, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкила, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкенила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила, линейного или разветвленного
-(C₁-C₇)алкил-арила или бензила; где указанный бензил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, необязательно замещенного одним или больше атомами галогена, линейной или разветвленной (C₁-C₇)алкокси-группы, необязательно замещенной одним или больше атомами галогена, или галогена, и более конкретно R₄ выбран из H, этила, пропенила, бензила, пиридила, бензилоксибутила и бензила, замещенного одним или больше атомами фтора, хлора, метокси-группами или метилами.

Если не указано иное, термины, использованные выше или ниже по тексту в отношении соединений формулы (I), имеют указанные ниже значения:

- _V, выбранный из диапазона от 2 до 4, означает что заместитель “CHR₅” повторяется два раза CHR₅CHR₅OR₄, три раза CHR₅CHR₅CHR₅OR₄ или четыре раза CHR₅CHR₅CHR₅CHR₅OR₄;

- “галоген” означает атом фтора, хлора, брома или иода, в частности атом фтора или хлора.

- "алкил'' представляет собой алифатическую углеводородную группу, которая может быть линейной или разветвленной, содержащую 1 - 7 или 2 - 7 атомов углерода в цепочке (C₁-C₇)алкила или (C₂-C₇)алкила, если не указано иное. В частности, алкильные группы содержат 1 - 3 атомов углерода в цепочке (C₁-C₃) алкила. «Разветвленный» означает, что одна или больше алкильных групп, таких как метил, этил или пропил, присоединены к линейной алкильной цепочке. Примеры алкильных групп включают метил, этил, н-пропил, изо-пропил, н-бутил, трет-бутил, 2,2-диметилбутил, н-пентил, н-гексил, н-гептил, в частности метил или этил.

- "алкенил" представляет собой алифатическую углеводородную группу, содержащую двойную связь углерод-углерод, которая может быть линейной или разветвленной и содержит 2 - 7 атомов углерода в цепочке (C₂-C₇)алкенила, если не указано иное. Предпочтительные алкенильные группы содержат 2 - 3 атома углерода в цепочке (C₂-C₃)алкенила. Примеры алкенильных групп включают этенил, н-пропенил, изо-пропенил, н-бутенил, изо-бутенил, 2,2-диметилбут-1-енил, н-пентенил, в частности пропенил.

- “алкокси-группа” представляет собой описанную выше алкильную группу, связанную простой связью с атомом кислорода. Примеры линейной или разветвленной (C₁-C₇)алкокси-группы включают метокси-группу (CH₃O–) и этокси-группу (CH₃CH₂O–) .

- "арил" представляет собой ароматическую моноциклическую или полициклическую углеводородную кольцевую систему, содержащую 6 - 14 атомов углерода, предпочтительно 6 - 10 атомов углерода. Примеры арильных групп включают фенил, нафтил, бензил, фенантрил, бифенил, в частности фенил.

- "гетероарил" представляет собой 5-14-, предпочтительно 5-10-членное ароматическое моно-, би- или полицклическое кольцо, где по меньшей мере один член кольца представляет собой гетероатом. Гетероатомы могут представлять собой O или N, в частности N. В частности, каждое кольцо содержит от 1 до 3 гетероатомов. Примеры включают пирролил, пиридил, пиперидинил, пиразолил, пиримидинил, пиразинил, индолил, имидазолил, в частности пиридил.

- “циклоалкил” представляет собой насыщенное моноциклическое или бициклическое неароматическое углеводородное кольцо, содержащее 2 - 7 атомов углерода, предпочтительно 3 - 6 атомов углерода, которое может иметь один или больше ненасыщенных элементов. Частные примеры моноциклических циклоалкильных групп включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил. Предпочтительно, циклоалкильная группа представляет собой циклогексенил.

- “-(C₁-C₇)алкил-арил” или “-(C₁-C₇)алкил-гетероарил” означает, что R₄ связан с атомом кислорода через атом углерода алкильной группы; в частности
-(C₁-C₇)алкил-арил представляет собой бензил.

- -"гетероцикл" или "гетероциклоалкил" представляет собой насыщенное или частично ненасыщенное неароматическое стабильное 3 - 14, предпочтительно 5 - 10-членное моно-, би- или полициклическое кольцо, которое может опционально быть мостиковым и в котором по меньшей мере один член кольца представляет собой гетероатом. В типичном случае гетероатомы включают (но не ограничиваются только ими) O или N. В частности, каждое кольцо содержит от 1 до 3 гетероатомов. Подходящие гетероциклы также описаны в работе Handbook of Chemistry and Physics, 76th Edition, CRC Press, Inc., 1995-1996, pages 225 to 226, содержание которой включено в настоящий текст посредством ссылки. Примеры гетероциклоалкила включают (но не ограничиваются только ими) тетрагидропиридил, тетрагидропиранил, пирролидинил, пиперидил, морфолинил, имидазолидинил или бензодиоксол, в частности 1,3 бензодиоксол.

- Термин “замещенный” означает, если не указано иное, замещение одним или больше заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, например, выбранными из линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, галогена, NO₂ и CONH_2, линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, замещенного одним или больше атомами галогена, линейной или разветвленной (C₁-C₇)алкокси-группы, линейной или разветвленной (C₁-C₇)алкокси-группы, замещенной одним или больше атомами галогена, арила, -COOH, -COOCH₂CH₃, -NRR’, NH₂, NHалкила и N(алкил)₂. Примеры включают, в частности, метил, метокси-группу, хлор, фтор, CF₃ и OCF₃.

Соединения формулы (I) по настоящему изобретению могут содержать один или больше асимметрических атомов углерода. Поэтому они могут существовать в форме энантиомеров или диастереоизомеров. Эти энантиомеры и диастереоизомеры, а также их смеси, включая рацемические смеси, являются частью настоящего изобретения.

Соединения формулы (I) по настоящему изобретению могут быть в форме свободного основания или в форме аддитивных солей с кислотами, которые также являются частью настоящего изобретения.

Эти соли предпочтительно получают с фармацевтически приемлемыми кислотами, но соли с другими кислотами, которые могут применяться, например, для очистки или для выделения соединений формулы (I) по настоящему изобретению, также являются частью настоящего изобретения.

При использовании в настоящем тексте, выражение “фармацевтически приемлемый” относится к соединениям, материалам, вспомогательным веществам, композициям или дозированным формам, которые в рамках современных медицинских знаний подходят для контакта с тканями человека и животных без вызывания избыточной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблемных осложнений, соответствуя разумному соотношению польза/риск.

При использовании в настоящем тексте, термин “фармацевтически приемлемые соли” относится к производным соединений по настоящему изобретению, в которых материнское соединение модифицировано путем получения его соли с кислотой или основанием. Фармацевтически приемлемые соли включают общеизвестные нетоксичные соли или четвертичные аммониевые соли материнского соединения, образованные, например, с нетоксичными неорганическими или органическими кислотами. Например, такие общеизвестные нетоксичные соли включают соли, образованные с неорганическими кислотами, такими как соляная, бромистоводородная, серная, сульфаминовая, фосфорная, азотная и т.п., включая моно-, ди- или три соли; и соли, полученные с органическими кислотами, такими как уксусная, пропионовая, янтарная, винная, лимонная кислота, метансульфокислота, бензолсульфокислота, глюкуроновая кислота, глутаминовая кислота, бензойная, салициловая кислота, толуолсульфокислота, щавелевая, фумаровая, малеиновая, молочная кислота и т.п.. Другие аддитивные соли включают аммониевые соли, такие как соли трометамина, меглумина, эполамина и т.д., соли металлов, такие как соли натрия, калия, кальция, цинка или магния.

Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению можно синтезировать из материнского соединения, содержащего основный или кислотный фрагмент, общеизвестными химическими методами. В целом, такие соли можно получить реакцией этих соединений в форме свободной кислоты или свободного основания со стехиометрическим количеством подходящего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе, или в их смеси. В целом, предпочтительной является неводная среда, такая как эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Перечень подходящих солей можно найти в работе Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20^th ed., Mack PublishingCompany, Easton, PA, 2000, содержание которой включено в настоящий текст в полном объеме посредством ссылки.

Способ

Настоящее изобретение также касается способа получения соединений формулы (I), описанных выше.

Соединения по настоящему изобретению можно получить рядом путей, хорошо известных квалифицированным специалистам в данной области. Соединения можно синтезировать, например, путем применения или адаптации описанных ниже способов, или их вариациями, известными квалифицированным специалистам в данной области. Необходимые модификации и замены будут легко понятны квалифицированным специалистам и хорошо известны или легко находимы в научной литературе.

Следует понимать, что соединения по настоящему изобретению могут содержать один или больше асимметрично замещенных атомов углерода и могут быть выделены в оптически активных или рацемических формах. Все хиральные, диастереомерные, рацемические формы, изомерные формы структур включены в настоящее изобретение, если только специально не указана конкретная стереохимия или изомерная форма. В данной области техники хорошо известно как получать и выделять такие оптически активные формы.

Например, смеси стереоизомеров можно разделить стандартными методиками, включающими (но не ограничиваясь только ими) расщепление рацемических форм, нормальную, обращенно-фазную и хиральную хроматографию, предпочтительное образование соли, перекристаллизацию и т.п., или хиральным синтезом из хирального исходного вещества, или направленным синтезом целевых хиральных центров.

Соединения по настоящему изобретению можно получить широким рядом химических способов. Реагенты и исходные материалы являются коммерчески доступными или могут быть легко синтезированы по хорошо известным методикам квалифицированным специалистом в данной области. Все заместители, если иное не указано отдельно, имеют указанные ранее значения.

В описанных далее реакциях может оказаться необходимым защищать реакционно-способные функциональные группы, например, гидроксильные, амино-, имино-, тио- или карбоксильные группы, когда они присутствуют в финальном продукте, чтобы избежать их нежелательного участия в реакциях. Общеизвестные защитные группы можно применять согласно стандартным методикам, которые описаны, например, в работе T.W. Greene and P. G. M. Wuts in Protective Groups in Organic Chemistry, 4th ed.(2007), John Wiley & Sons Inc., 1999; J. F. W. McOmie in Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, 1973.

Некоторые реакции можно проводить в присутствии основания. Нет определенных ограничений по природе основания, применяемого в реакции, и можно применять любое основание, обычно используемое в реакциях такого типа, при условии, что оно не оказывает вредного воздействия на остальные части молекулы, и если специально не указано иное. Примеры подходящих оснований включают: гидроксид натрия, карбонат калия, триэтиламин, гидриды щелочных металлов, такие как гидрид натрия и гидрид калия; алкиллитиевые соединения, такие как метиллитий и бутиллитий; и алкоксиды щелочных металлов, такие как метоксид натрия и этоксид натрия.

Обычно реакции проводят в подходящем растворителе. Можно применять различные растворители, при условии, что они не оказывают побочного воздействия на реакцию или используемые реагенты. Примеры подходящих растворителей включают: углеводороды, которые могут представлять собой ароматические, алифатические или циклоалифатические углеводороды, такие как гексан, циклогексан, бензол, толуол и ксилол; амиды, такие как диметилформамид; спирты, такие как этанол и метанол, и простые эфиры, такие как диэтиловый эфир и тетрагидрофуран.

Реакции могут проходить в широком диапазоне температур. В целом, удобно проводить реакции при температуре от 0°C до 150°C (более предпочтительно, примерно от комнатной температуры до 100°C). Время, необходимое для прохождения реакции, также может варьироваться в широких пределах, в зависимости от многих факторов, в частности от температуры реакции и природы реагентов. Однако, при условии, что реакцию проводят в описанных выше предпочтительных условиях, обычно достаточным является период времени примерно от 3 часов до 20 часов.

Полученное таким образом соединение можно выделить из реакционной смеси общеупотребимыми способами. Например, соединения можно выделить путем отгонки растворителя из реакционной смеси или, при необходимости, после отгонки растворителя из реакционной смеси, выливания остатка в воду с последующей экстракцией несмешивающимся с водой растворителем и отгонкой растворителя из экстракта. Кроме того, продукт при необходимости можно дополнительно очищать различными хорошо известными методами, такими как перекристаллизация, переосаждение или различные хроматографические методы, в частности колоночная хроматография или препаративная тонкослойная хроматография.

Способ получения соединения формулы (I) по настоящему изобретению представляет собой другой предмет настоящего изобретения.

В первом аспекте, соединение формулы (I) по настоящему изобретению можно получить путем:

a) реакции соединения формулы (II) с органической или неорганической кислотой

(II);

b) реакции соединения, полученного на стадии a), с основанием;

c) реакции соединения, полученного на стадии b), с CO₂;

d) реакции соединения, полученного на стадии c), с алкил хлорформиатом, с реагентом, способным формировать с соединением, полученным на стадии c), ацилгалогенид, или с реагентом, способным формировать с соединением, полученным на стадии c), смешанный ангидрид;

e) реакции соединения, полученного на стадии d), с соединением-прекурсором аниона SMe-;

где R1 и R2 имеют указанные в настоящем тексте значения.

В частности, основание на стадии b) имеет pKa выше 25, предпочтительно основание, использующееся на стадии b), выбрано из литиевых или магниевых оснований, предпочтительно основание выбрано из бутиллития или гексиллития.

В частности, соединение формулы (II) получают по стадии a1) реакции между 3-хлор-3-метилбут-1-ином с R1R2NH в водной среде.

В частности, указанное соединение, полученное на стадии a1), очищают посредством одного или больше фильтрований, например после одного фильтрования или последовательности из 2 - 10 фильтрований, предпочтительно в ходе последовательных 2 – 5 фильтрований, например, в ходе 4 фильтрований.

В одном варианте осуществления, 3-хлор-3-метилбут-1-ин получают реакцией 2-метилбут-3-ин-2-ола с хлористоводородной кислотой в присутствии медного катализатора.

В другом варианте осуществления, кислота является неорганической кислотой, выбранной из соляной, фосфорной, азотной, серной кислоты, предпочтительно из соляной кислоты.

В другом варианте осуществления, стадию d) проводят с:

- алкил хлорформиатом, содержащим (C₁-C₆)алкил, который может содержать по меньшей мере одну двойную связь, предпочтительно метил, этил, изопренил, трет-бутил или изобутил хлорформиатом, предпочтительно с изобутил хлорформиатом; или

- реагентом, способным формировать с соединением, полученным на стадии c), смешанный ангидрид, выбранным из ацилхлоридов, например с пивалоилхлоридом; или

- реагентом, способным формировать с соединением, полученным на стадии c), ацилхлорид, выбранным из SOCl₂, COCl₂, PCl₃, PCl₅, PBr₃ или PPh₃Br₂.

В одном варианте осуществления, соединения-прекурсоры аниона SMe- выбраны из солей формулы XSMe, в которых X представляет собой щелочной металл или щелочно-земельный металл, например Na, метилмеркаптаном или (SMe)₂, предпочтительно NaSMe.

Данный процесс подробно описан в патентных заявках FR 1651283 и PCT/EP2017/053457, содержание которых включено в настоящий текст посредством ссылки.

Альтернативно, соединение по настоящему изобретению можно получить из соответствующего ацетиленового амина, с последующей обработкой BuLi, COS и MeI. Подробное описание данного способа получения можно найти, например, в работе G.Quash et al., European Journal of Medicinal Chemistry 43 (2008) 906-916, содержание которого включено в настоящий текст посредством ссылки, в частности в части 2 раздела Материалы и Методы.

Описанные выше реакции могут быть проведены квалифицированным специалистом в данной области с использованием или с адаптацией способов, проиллюстрированных ниже в Примерах.

Кроме того, способ по настоящему изобретению может также включать дополнительную стадию выделения соединения формулы (I) или (II). Её может провести квалифицированный специалист в данной области любым из известных методов, таких как как описанные выше способы выделения.

В целом, исходные соединения коммерчески доступны от Aldrich или Acros или других известных поставщиков химических реагентов, или их можно получить, используя или адаптируя известные методы или методы, описанные в Примерах.

Применение

Как уже было сказано, настоящее изобретение также касается применения описанного в настоящей заявке соединения формулы (I) в качестве лекарственного средства.

Более конкретно, оно касается применения описанного в настоящей заявке соединения формулы (I) для предотвращения и/или лечения рака.

Настоящее изобретение также касается способа предотвращения и/или лечения рака, включающего введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества описанного выше соединения формулы (I).

Термины "лечить" или “лечение” при использовании в контексте настоящего изобретения означают терапевтическое лечение с целью устранить или ослабить симптомы у объекта лечения. Положительный или целевой клинический результат включает (но не ограничивается только ими) устранение симптомов, ослабление симптомов, снижение степени тяжести патологического состояния, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) патологического состояния, задержку или замедление развития патологического состояния.

Термины “предотвращать”, “предотвращение” или “профилактика”, при использовании в контексте настоящего изобретения, означают предотвращение появления, возврата или распространения заболевания или нарушения, или одного или больше из его симптомов. В некоторых вариантах осуществления, данные термины означают лечение соединением по настоящему изобретению или введение соединения по настоящему изобретению до появления симптомов, в частности пациентам, подвергающихся риску развития указанных в настоящем тексте заболеваний или нарушений. Данные термины включают также подавление или ослабление симптома определенного заболевания. Субъекты с семейной историей определенного заболевания в особенности являются кандидатами на профилактическое введение в некоторых вариантах осуществления. Кроме того, субъекты с историей повторно появляющихся симптомов также являются потенциальными кандидатами для введения соединения по настоящему изобретению в целях предотвращения. В этой связи, термин “предотвращение” может использоваться взаимозаменяемо с термином “профилактическое лечение”.

При использовании в настоящем тексте и если не указано иное, термин "рак" означает рост, деление или пролиферацию аномальных клеток в организме. Он относится к любому типу злокачественных (т.е. не доброкачественных) опухолей. Злокачественная опухоль может являться первичной опухолью или вторичной опухолью (т.е. метастазы). Кроме того, опухоль может представлять собой солидную злокачественную опухоль, которая включает, например, карциному, аденокарциному, саркому, меланому, мезотелиому, бластому, или рак крови, такой как лейкоз, лимфома и миелома. Рак может представлять собой, например, солидную карциному, меланому, рак легких (включая, но не ограничиваясь только ими: немелкоклеточный рак легких (NSCLC), мелкоклеточный рак легких (SCLC), комбинированную мелкоклеточную карциному, плевролегочную бластому, карциноидную опухоль, саркоматоидную карциному, карциноидную опухоль, железисто-клеточную карциному, плоскоклеточный рак легкого, аденокарциному и крупноклеточный рак легких), рак мозга (включая, но не ограничиваясь только ими: глиому, глиобластома, астроцитома, олигоастроцитома, олигодендроглиома и эпендимома), рак почки, рак простаты, рак груди, миелодиспластический синдром и лейкоз.

В частности, настоящее изобретение касается соединения формулы (I) по настоящему изобретению для предотвращения и/или лечения лейкоза.

В частности, субъект, нуждающийся в лечении от рака, представляет собой субъект, страдающий этим заболеванием.

В контексте настоящего изобретения, идентификация субъектов, нуждающихся в лечении описанных в настоящем тексте заболеваний и нарушений, проводится как описано выше и находится в рамках знаний и умений квалифицированного специалиста в данной области. Квалифицированный врач способен легко идентифицировать, по описанным выше методикам, субъектов, нуждающихся в таком лечении.

Терапевтически эффективное количество может легко определить квалифицированный лечащий врач с использованием стандартных методик и на основе наблюдений результатов, полученных в аналогичных случаях. При определении терапевтически эффективного количества квалифицированный врач учитывает ряд факторов, включая (но не ограничиваясь только ими) вид субъекта; его вес, возраст и общее состояние здоровья; вид заболевания; степень выраженности или тяжести заболевания; ответ конкретного субъекта на лечение; конкретное вводимое соединение; путь введения; характеристики биодоступности вводимого препарата; выбранный режим дозирования; применение дополнительных лекарств; и другие обстоятельства, имеющие отношение к данному вопросу.

При использовании в настоящем тексте, термин «эффективное количество» означает количество, которое эффективно уменьшает, устраняет, излечивает или контролирует симптомы описанных в настоящем тексте заболеваний и патологических состояний. Термин «контролирует» означает все процессы, в которых происходит замедление, прерывание или остановка развития заболеваний и патологических состояний, описанных в настоящем тексте, но необязательно означает полное устранение всех симптомов заболевания и патологического основания, и включает профилактическое лечение и хроническое использование.

Количество соединения по настоящему изобретению, необходимое для достижения целевого биологического эффекта, варьируется в зависимости от ряда факторов, включая дозировку лекарственного соединения, химические характеристики (например, гидрофобность) применяемых соединений, эффективность соединений, тип заболевания, степень тяжести заболевания у пациента и путь введения.

Соединения по настоящему изобретению можно вводить в состав фармацевтических композиций, необязательно путем смешивания с одним или больше фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.

Такие композиции можно готовить для применения путем перорального введения, особенно в форме таблеток или капсул, в частности таблеток для рассасывания; или парентерального введения, в частности в форме жидких растворов, суспензий или эмульсий.

Их можно готовить любым из методов, известных в области фармацевтики, например, описанных в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^th ed.; Gennaro, A. R., Ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000. Фармацевтически совместимые связующие агенты и/или адъюванты могут являться частью композиции. Композиции для перорального приема обычно включают инертный разбавляющий носитель или съедобный носитель. Их можно вводить в виде единичных дозированных форм, где термин «единичная доза» означает единичную дозу, которую можно вводить пациенту и с которой легко обращаться и упаковывать ее, с сохранением физически и химически стабильной однократной дозы, представляющей собой само действующее вещество или его фармацевтически приемлемую композицию.

Таблетки, пилюли, порошки, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать один или больше из следующих ингредиентов или соединений похожей природы: связующее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза или трагакантовая камедь; разбавитель, такой как крахмал или лактоза; разрыхлитель, такой как крахмал и производные целлюлозы; лубрикант, такой как стеарат магния; глидант, такой как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как мята или метил салицилат. Капсулы могут быть в форме твердых капсул или мягких капсул, которые обычно изготавливают из желатина, необязательно в смеси с пластификаторами, а также крахмальных капсул. Кроме того, единичные дозированные формы могут содержать различные другие материалы, которые модифицируют физическую форму дозированной формы, например покрытия из сахара, шеллака или кишечно-растворимые агенты. Другие дозированные формы для перорального приема – сироп или эликсир – могут содержать подсластители, консерванты, красители, пигменты и ароматизаторы. Кроме того, действующие вещества могут быть включены в состав быстрорастворимых препаратов, препаратов с модифицированным высвобождением или замедленным высвобождением, и препаратов, в которых такие композиции с замедленным высвобождением предпочтительно являются бимодальными.

Жидкие препараты для введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Жидкие композиции могут также включать связующие вещества, буферы, консерванты, хелатирующие агенты, подсластители, ароматизаторы, красители и т.п. Неводные растворители включают спирты, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, акрилатные сополимеры, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические эфиры, такие как этил олеат. Водные носители включают смеси спиртов и воды, гидрогели, буферные смеси и солевой раствор. В частности, биосовместимый, биоразлагаемый лактидный полимер, лактид/гликолидный сополимер или полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые сополимеры могут представлять собой подходящие вспомогательные вещества для контроля высвобождения действующего вещества. Носители для внутривенного введения могут включать заменители жидкой среды и питательных веществ, заменители электролитов, такие как основанные на декстрозном растворе Рингера и т.п.

Примеры способов введения включают парентеральное, например, подкожное внутримышечное, внутривенное, внутрикожное, а также пероральное введение.

Конъюгат антитело-препарат

Как уже указано выше, настоящее изобретение касается также конъюгата антитело-препарат формулы B-L-Ab, где:

- B представляет собой соединение приведенной выше формулы (I), в котором:

- X представляет собой S;

- R1 представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил;

- R2 представляет собой CHR₅CHR₆OR₄ или (CHR₅)_vOR₄;

- R4 выбран из H, арила, гетероарила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-арила и линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила;

где указанный арил и гетероарил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из -COOH, -NRR’ и -NO₂; и

- R и R’ одинаковые, представляют собой H;

- L представляет собой линкер; и

- Ab представляет собой антитело.

Термин “конъюгат антитело-препарат” или КАП означает важный класс высокоэффективных биофармацевтических лекарственных средств, разработанных в качестве таргетированной терапии для лечения людей, страдающих от рака. В отличие от химиотерапии, КАП разработаны с целью таргетировать и убивать только раковые клетки и не поражать здоровые клетки. КАП представляют собой молекулы, состоящие из антитела, связанного с биологически активным цитотоксическим (противораковым) компонентом или лекарственным средством. В контексте настоящего изобретения, цитотоксическое лекарственное средство представляет собой описанное выше соединение формулы (I). Это соединение связано с антителом через линкер.

Термин “линкер” при использовании в настоящем тексте означает химический фрагмент, содержащий ковалентную связь или цепочку атомов, которая ковалентно связывает антитело и соединение приведенной выше формулы (I).

Линкер в конъюгате антитело-препарат может представлять собой любой линкер, способный осуществлять конъюгацию антитела и описанного выше соединения формулы (I). Подходящие линкеры хорошо известны в данной области. В частности, он может представлять собой биоразлагаемый линкер.

Более конкретно, описанное выше соединение по настоящему изобретению связывается с антителом через присоединяющую группу (малеимид, сукцинимидиловый эфир, специфичная пептидная последовательность, являющаяся субстратом для фермента, и т.д.), связанную с расщепляемым линкером (сайт протеазы, гидразин, дисульфид) или нерасщепляемым линкером и с саморасщепляющимся спейсером (или без него).

В приведенном выше определении для конъюгата антитело-препарат B-L-Ab, линкер L включает как сам линкер, так и линкер, связанный с присоединяющей группой, как описано в настоящем тексте.

Расщепляемые дипептидные линкеры, такие как Val-Ala и Val-Cit, можно привести в качестве примеров. Они работают по механизму таргетирования конъюгата антитело-препарат, который включает связывание конъюгата антитело-препарат с распознанным антигеном на поверхности раковых клеток, являющихся для него мишенями, и дальнейшую интернализацию комплексов КАП-антиген по эндосомальному-лизосомальному механизму.

В этих случаях внутриклеточное высвобождение цитотоксического противоракового лекарственного средства основано на том факте, что эндосомы/лизосомы являются кислотными компартментами, способствующими расщеплению кислотно-лабильных химических связок, таких как гидразон. Кроме того, если в линкер вставлен сайт расщепления лизосомно-специфической протеазой, например сайт катепсина B в vcMMAE, то цитотоксины будут высвобождаться в непосредственной близости от своих внутриклеточных мишеней.

Альтернативно, линкеры, содержащие смешанные дисульфиды, работают по другому механизму высвобождения цитотоксических компонентов внутри клетки, поскольку они селективно расщепляются в восстановительной среде клетки, но не в обогащенной кислородом среде кровотока.

Эти линкеры можно получить способами, известными квалифицированному специалисту в данной области.

В частности, линкер по настоящему изобретению представляет собой малеимидокапроил-Val-Cit, описанный в экспериментальной части.

Другие примеры линкеров, которые могут применяться в контексте настоящего изобретения, а также способы их получения, могут представлять собой малеимидокапроильный линкер, меркаптоацетамидокапроильный, гидразоновый линкер и глюкуронид, в комбинации с саморасщепляющимся линкером п-аминобензиловым спиртом (PAB), как описано в работе Perez et al.: “Antibody-drug conjugates: current status and future directions”; Drug Discovery Today, Volume 00, Number 00, December 2013, и в работе McCombs and Shawn: “Antibody-drug conjugates: Design and Selection of Linker, Payload and Conjugation Chemistry”, The AAPS Journal, Vol.17, No.2, March 2015.

Антитело в конъюгате антитело-препарат по настоящему изобретению может представлять собой любое антитело, известное как применимое в лечении рака.

В частности, антитело в указанном конъюгате антитело-препарат выбрано из ритуксимаба, трастузумаба, алемтузумаба, ибритумомаба тиуксетан, тозитумомаба, бревацизумаба, цетуксимаба, панитумумаба, офатумумаба, ипилимумаба и обинутузумаба.

Эти антитела коммерчески доступны и хорошо известны квалифицированному специалисту в данной области.

Больше информации об этих антителах приведено ниже в Таблице 1.

Год Международное напатентованное название/Торговое название Мишень Показания 1997 Ритуксимаб/Rituxan® CD20 В-клеточная лимфома 1998 Трастузумаб/Herceptin® HER2 Рак груди 2001 Алемтузумаб/Campath® CD52 Хронический лимфолейкоз 2002 Ибритумомаб тиуксетан/Zevalin® CD20 В-клеточная лимфома 2003 Тозитумомаб/Bexxar® CD20 В-клеточная лимфома 2004 Бевацизумаб/Avastin® VEGF Рак толстой кишки, легкого, груди и почки 2004 Цетуксимаб/Erbitux® EGFR Рак толстой кишки, легкого 2004 Гемтузумаб/MYLOTARG® CD33 Острый миелоидный лейкоз 2006 Панитумумаб/Vectibix® EGFR Рак толстой кишки 2009 Офатумумаб/Arzerra® CD20 Хронический лимфолейкоз 2013 Обинутузумаб/ Gazyvaro® CD20 Хронический лимфолейкоз

Способ получения конъюгата антитело-препарат по настоящему изобретению адаптируется квалифицированным специалистом в данной области в зависимости от выбранного линкера и антитела. Квалифицированный специалист в данной области способен получить конъюгат антитело-препарат на основе общих знаний. Пример описан в экспериментальной части настоящего изобретения.

Настоящее изобретение касается также конъюгата антитело-препарат, описанного выше, для применения в качестве лекарственного средства, в частности для применения в целях предотвращения и/или лечения рака.

Оно также касается способа предотвращения и/или лечения рака, включающего введение конъюгата антитело-препарат по настоящему изобретению.

Примерами видов рака, на которые нацелено лечение, являются В-клеточная лимфома, рак груди, хронический лимфолейкоз, рак толстой кишки, рак легкого, рак груди, рак почки и меланома.

Настоящее изобретение касается также фармацевтической композиции, содержащей конъюгат антитело-препарат по настоящему изобретению.

Термины "лечить" или “лечение” при использовании в контексте настоящего изобретения означают терапевтическое лечение с целью устранить или ослабить симптомы. Положительный или целевой клинический результат включает (но не ограничивается только ими) устранение симптомов, ослабление симптомов, снижение степени тяжести патологического состояния, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) патологического состояния, задержку или замедление развития патологического состояния

Термины “предотвращать”, “предотвращение” или “профилактика”, при использовании в контексте настоящего изобретения, означают предотвращение появления, возврата или распространения заболевания или нарушения, или одного или больше из его симптомов. В некоторых вариантах осуществления, данные термины означают лечение соединением по настоящему изобретению или введение соединения по настоящему изобретению до появления симптомов, в частности пациентам, подвергающихся риску развития указанных в настоящем тексте заболеваний или нарушений. Данные термины включают также подавление или ослабление симптома определенного заболевания. Субъекты с семейной историей определенного заболевания в особенности являются кандидатами на профилактическое введение в некоторых вариантах осуществления. Кроме того, субъекты с историей повторно появляющихся симптомов также являются потенциальными кандидатами для введения соединения по настоящему изобретению в целях предотвращения. В этой связи, термин “предотвращение” может использоваться взаимозаменяемо с термином “профилактическое лечение”.

При использовании в настоящем тексте и если не указано иное, термин "рак" означает рост, деление или пролиферацию аномальных клеток в организме. Он относится к любому типу злокачественных (т.е. не доброкачественных) опухолей. Злокачественная опухоль может являться первичной опухолью или вторичной опухолью (т.е. метастазы).

В частности, субъект, нуждающийся в лечении от рака, представляет собой субъект, страдающим этим заболеванием.

В контексте настоящего изобретения, идентификация субъектов, нуждающихся в лечении описанных в настоящем тексте заболеваний и нарушений, проводится как описано выше и находится в рамках знаний и умений квалифицированного специалиста в данной области. Квалифицированный врач способен легко идентифицировать, по описанным выше методикам, субъектов, нуждающихся в таком лечении.

Терапевтически эффективное количество может легко определить квалифицированный лечащий врач с использованием стандартных методик и на основе наблюдений результатов, полученных в аналогичных случаях. При определении терапевтически эффективного количества квалифицированный врач учитывает ряд факторов, включая (но не ограничиваясь только ими) вид субъекта; его вес, возраст и общее состояние здоровья; вид заболевания; степень выраженности или тяжести заболевания; ответ конкретного субъекта на лечение; конкретное вводимое соединение; путь введения; характеристики биодоступности вводимого препарата; выбранный режим дозирования; применение дополнительных лекарств; и другие обстоятельства, имеющие отношение к данному вопросу.

При использовании в настоящем тексте, термин «эффективное количество" означает количество, которое эффективно уменьшает, устраняет, излечивает или контролирует симптомы описанных в настоящем тексте заболеваний и патологических состояний. Термин «контролирует» означает все процессы, в которых происходит замедление, прерывание или остановка развития заболеваний и патологических состояний, описанных в настоящем тексте, но необязательно означает полное устранение всех симптомов заболевания и патологического основания, и включает профилактическое лечение и хроническое использование.

Термин “пациент” или “субъект” относится к теплокровному животному, такому как млекопитающее, в частности человек, мужчина или женщина, если не указано иное, которые страдают или потенциально могут пострадать от одного или более заболеваний и патологических состояний, описанных в настоящем тексте.

Количество конъюгата антитело-препарат по настоящему изобретению, необходимое для достижения целевого биологического эффекта, варьируется в зависимости от ряда факторов, включая вводимую дозировку, химические и биологические характеристики (например, гидрофобность) применяемых соединений, эффективность соединений, тип заболевания, степень тяжести заболевания и путь введения.

Конъюгат антитело-препарат по настоящему изобретению можно вводить в состав фармацевтических композиций, необязательно путем смешивания с одним или больше фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.

Такие композиции можно готовить для применения путем перорального введения, особенно в форме таблеток или капсул, в частности таблеток для рассасывания; или парентерального введения, в частности в форме жидких растворов, суспензий или эмульсий.

Их можно готовить любым из методов, известных в области фармацевтики, например, описанных в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^th ed.; Gennaro, A. R., Ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000. Фармацевтически совместимые связующие агенты и/или адъюванты могут являться частью композиции. Композиции для перорального приема обычно включают инертный разбавляющий носитель или съедобный носитель. Их можно вводить в виде единичных дозированных форм, где термин «единичная доза» означает единичную дозу, которую можно вводить пациенту и с которой легко обращаться и упаковывать ее, с сохранением физически и химически стабильной однократной дозы, представляющей собой само действующее вещество или его фармацевтически приемлемую композицию.

Таблетки, пилюли, порошки, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать один или больше из следующих ингредиентов или соединений похожей природы: связующее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза или трагакантовая камедь; разбавитель, такой как крахмал или лактоза; разрыхлитель, такой как крахмал и производные целлюлозы; лубрикант, такой как стеарат магния; глидант, такой как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как мята или метил салицилат. Капсулы могут быть в форме твердых капсул или мягких капсул, которые обычно изготавливают из желатина, необязательно в смеси с пластификаторами, а также крахмальных капсул. Кроме того, единичные дозированные формы могут содержать различные другие материалы, которые модифицируют физическую форму дозированной формы, например покрытия из сахара, шеллака или кишечно-растворимые агенты. Другие дозированные формы для перорального приема – сироп или эликсир – могут содержать подсластители, консерванты, красители, пигменты и ароматизаторы. Кроме того, действующие вещества могут быть включены в состав быстрорастворимых препаратов, препаратов с модифицированным высвобождением или замедленным высвобождением, и препаратов, в которых такие композиции с замедленным высвобождением предпочтительно являются бимодальными.

Жидкие препараты для введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Жидкие композиции могут также включать связующие вещества, буферы, консерванты, хелатирующие агенты, подсластители, ароматизаторы, красители и т.п.. Неводные растворители включают спирты, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, акрилатные сополимеры, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические эфиры, такие как этил олеат. Водные носители включают смеси спиртов и воды, гидрогели, буферные смеси и солевой раствор. В частности, биосовместимый, биоразлагаемый лактидный полимер, лактид/гликолидный сополимер или полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые сополимеры могут представлять собой подходящие вспомогательные вещества для контроля высвобождения действующего вещества. Носители для внутривенного введения могут включать заменители жидкой среды и питательных веществ, заменители электролитов, такие как основанные на декстрозном растворе Рингера и т.п.

Примеры способов введения включают парентеральное, например, подкожное внутримышечное, внутривенное, внутрикожное, а также пероральное введение.

В контексте настоящего изобретения выражение “соединение для применения в лечении или предотвращении” эквивалентно выражению “применение соединения для лечения или предотвращения” и “применение соединения для производства лекарственного средства для лечения или предотвращения”.

Настоящее изобретение далее будет проиллюстрировано чертежами и примерами.

Описание чертежей

Фиг. 1: Средняя жизнеспособность клеток Raji в процентах по сравнению с контрольными клетками, не подвергавшимися обработке, после обработки 50 мкг/мл ритуксимабом (85.50% ± 2.268%) и ритуксимабом (102.9% ± 1.789%), конъюгированным с соединением 5. Различие между двумя средними значениями было значимым, по данным двухвыборочного t-критерия для независимых выборок (P < 0.01, **).

Примеры

Репрезентативные соединения по настоящему изобретению представлены ниже в Таблице 2:

Таблица 2

Пример Структура Название 1 S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат 2 S-метил 4-[2-аллилоксиэтил(метил) амино]-4-метил-пент-2-интиоат 3 S-метил 4-[2-бензилоксиэтил(метил) амино]-4-метил-пент-2-интиоат 4 S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(м-толилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат 5 S-метил 4-[2-[(3,4-диметилфенил) метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат 6 S-метил 4-[2-[(4-метоксифенил) метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат 7 S-метил 4-[2-[(3,4-диметоксифенил) метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат 8 S-метил 4-[2-[(3-хлорфенил)метокси] этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат 9 S-метил 4-[2-[(3-фторфенил)метокси] этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат 10 S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(2-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат 11 S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(3-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат 12 S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(4-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат 13 метил 4-(диметиламино)-4-метил-пент-2-иноат 14 этил 4-(диметиламино)-4-метил-пент-2-иноат 15 трет-бутил 2-((4-(диметиламино)-4-метилпент-2-иноил)тио)ацетат 16 2-((4-(диметиламино)-4-метилпент-2-иноил)тио)уксусная кислота 17 S-метил 4-((4-(бензилокси)бутил) (метил)амино)-4-метилпент-2-интиоат 18 S-метил 4-((2-гидроксиэтил)(метил) амино)-4-метилпент-2-интиоат 19 S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(2-нафтилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат 20 S-метил 4-метил-4-[метил-[2-[(2,6,6-триметилциклогексен-1-ил)метокси] этил]амино]пент-2-интиоат 21 2-[(1,1-диметил-4-метилсульфанил-4-оксо-бут-2-инил)-метиламино]этил ацетат 22 2-[(1,1-диметил-4-метилсульфанил-4-оксо-бут-2-инил)-метиламино]этил-3,4-диметоксибензоат 23 S-метил 2,5,10,11,11-пентаметил-6-оксо-7-окса-2,5,10-триазатетрадец-12-ин-14-тиоат 24 S-метил 4-[2-(метоксиметил) пирролидин-1-ил]-4-метилпент-2-интиоат 25 S-метил 4-(3-метоксипирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоат 26 S-метил 4-метил-4-[метил(2-феноксициклопентил)амино]пент-2-интиоат 27 (S)-S-метил 4-(2-((бензилокси)метил) пирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоат 28 S-метил 4-[(3(бензилокси)-1-пирролидинил])-4-метилпент-2-интиоат 29

Репрезентативные соединения по настоящему изобретению можно синтезировать по описанным ниже методикам.

Общие аналитические методики

¹H и ¹³C ЯМР спектры записывали на приборах Bruker Advance ALS300 и DRX400 МГц производства фирмы Bruker. Значения химических сдвигов приведены в м.д. (δ), и в качестве стандартов использованы ДМСО-d6 (¹H, 2.50 м.д. ¹³C, 39.52 м.д.) или CDCl₃ (7.26 м.д.). Константы спин-спинового взаимодействия (J) приведены в Гц.

HRMS-ESI масс-спектры снимали в режиме регистрации положительно заряженных ионов на гибридном квадрупольном времяпролетном масс-спектрометре (MicroTOFQ-II, Bruker Daltonics, Bremen) с источником ионов для ионизации методом электроспрея (ESI). Масс-спектры низкого разрешения LRMS-ESI записывали на спектрометре Thermo Finnigan MAT 95 XL.

Часть 1: Получение соединений по настоящему изобретению

Пример 1: S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат

Получение N-(2-этоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина: В раствор N-метил-N-(2’гидроксиэтил)-3-амино-3-метил-1-бутина (Easton, Nelson R.; Hennion, George F. U.S. (1967), US 3337625 19670822.) (1.0 г, 7.08 ммоль) и иодэтана (0.98 мл, 7.6 ммоль) в ТГФ (12 мл) добавляли NaH (0.459 г, 11.5 ммоль) при комнатной температуре и полученную смесь кипятили в течение 3 часов. Смесь затем осторожно гидролизовали при комнатной температуре водой и экстрагировали этилацетатом (3x25 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над Na₂SO₄ и упаривали в вакууме. Очистка полученного сырого продукта методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 70/30) дала чистый N-(2-этоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амин (0.479 г, 40%).

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 3.45 – 3.36 (м, 4H), 3.11 (с, 1H), 2.51 (т, J = 6.7 Гц, 2H), 2.20 (с, 3H), 1.27 (с, 6H), 1.09 (т, J = 7.0 Гц, 3H).

ESI-LRMS 170.0 [M+H]+.

Получение S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата: К N-(2-этоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амину (0.367 г, 2.17 ммоль) в ТГФ (11 мл) добавляли по каплям 2.28 M раствор n-BuLi в гексане (1.14 мл, 2.60 ммоль) при -70°C. После 5 минут при -70°C реакционную смесь нагревали до 0°C, выдерживали 10 минут при этой температуре, затем охлаждали до -70°C и 30 минут барботировали через раствор карбонил сульфид (COS). Полученный желтый раствор нагревали до 0°C, перемешивали еще 10 минут при этой температуре, затем по каплям добавляли иодметан (0.162 мл, 2.60 ммоль). Полученную смесь перемешивали 2 часа, осторожно гидролизовали при 0°C водой и экстрагировали эфиром. Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над Na₂SO₄ и упаривали в вакууме. Очистка полученного сырого продукта методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 90/10) дала чистый S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат (0.369 г, 70%) в виде практически бесцветного масла.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 3.42 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 3.42 (кв, J = 7.0 Гц, 2H), 2.56 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 2.39 (с, 3H), 2.25 (с, 3H), 1.36 (с, 6H), 1.10 (т, J = 7.0 Гц, 3H).

ESI- HRMS вычислено для C₁₂H₂₂NO₂S [M+H]+: 244.1366, найдено: 244.1362.

Пример 2: S-метил 4-[2-аллилоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат

Получение N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина: К N-метил-N-(2’гидроксиэтил)-3-амино-3метил-1-бутину (Easton, Nelson R.; Hennion, George F. U.S. (1967), US 3337625 19670822.)) (1.0 г, 7.08 ммоль) в ТГФ (12 мл) добавляли NaH (0.340 г, 8.50 ммоль) при 0°C. После 15 минут при 0°C и 15 минут при комнатной температуре, n-Bu₄NI (0.026 г, 0.071 ммоль) добавляли в один прием при 0°C, затем по каплям добавляли аллилбромид (0.735 мл, 8.50 ммоль). Реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры, перемешивали в течение ночи, затем осторожно гидролизовали водой и экстрагировали эфиром (3x25 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия (25 мл), сушили над Na₂SO₄ и упаривали в вакууме. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/эфир = от 80/20 до 70/30) дала чистый N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амин (0.941 г, 73%) в виде масла.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 5.88 (ддт, J = 17.3, 10.5, 5.3 Гц, 1H), 5.24 (ддд, J = 17.3, 3.8, 1.7 Гц, 1H), 5.16 – 5.09 (м, 1H), 3.93 (дт, J = 5.3, 1.6 Гц, 2H), 3.43 (т, J = 6.4 Гц, 2H), 3.12 (с, 1H), 2.55 (т, J = 6.4 Гц, 2H), 2.21 (с, 3H), 1.27 (с, 6H).

ESI-LRMS 182.0 [M+H]+.

Получение S-метил 4-[2-аллилоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата: Соединение получают тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина. Масштаб: 2.2 ммоль. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = от 90/10 до 80/20). Выход: 65%. Почти бесцветное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 5.88 (ддт, J = 17.3, 10.5, 5.3 Гц, 1H), 5.24 (ддд, J = 17.3, 3.8, 1.7 Гц, 1H), 5.17 – 5.10 (м, 1H), 3.94 (дт, J = 5.3, 1.5 Гц, 2H), 3.45 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 2.58 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 2.39 (с, 3H), 2.26 (с, 3H), 1.36 (с, 6H).

ESI- HRMS вычислено для C₁₃H₂₂NO₂S [M+H]+: 256.1366, найдено: 256.1364.

Пример 3: S-метил 4-[2-бензилоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат

Получение N-(2-бензилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина: Соединение получают тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], используя 1.015 экв. NaH и 1.01 экв. бензилбромида. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 90/10). Выход: 81%. Бесцветное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.39 – 7.24 (м, 5H), 4.47 (с, 2H), 3.49 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 3.12 (с, 1H), 2.58 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 2.21 (с, 3H), 1.27 (с, 6H). ESI-LRMS 232.0 [M+H]+.

Получение S-метил 4-[2-бензилоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата: Соединение получают тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из N-(2-бензилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина. Масштаб: 2.2 ммоль. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 90/10). Выход: 79%. Бесцветное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.37 – 7.26 (м, 5H), 4.48 (с, 2H), 3.52 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.62 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.26 (с, 3H), 1.36 (с, 6H).

ESI- HRMS вычислено для C₁₇H₂₄NO₂S [M+H]+: 306.1522, найдено: 306.1514.

Альтернативная методика: К N-(2-бензилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амину (0.650 г, 2.81 ммоль) в ТГФ (8 мл) добавляли по каплям 2.28 M раствор n-BuLi в гексане (1.36 мл, 3.09 ммоль) при -70°C. После 5 минут при -70°C, реакционную смесь нагревали до 0°C, выдерживали 30 минут при этой температуре и барботировали CO₂ через раствор 30 минут. Полученную смесь нагревали до комнатной температуры в течение 5 минут, затем снова охлаждали до 0°C. Добавляли по каплям изобутил хлорформиат (0.40 мл, 3.08 ммоль), и полученную смесь перемешивали 10 минут, затем добавляли раствор метоксида натрия (0.236 г, 3.37 ммоль) в один прием. Полученную смесь нагревали до комнатной температуры, перемешивали еще 15 минут при этой температуре, затем осторожно гидролизовали при 0°C водой и экстрагировали эфиром. Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над Na₂SO₄ и упаривали в вакууме. Очистка полученного сырого продукта методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 90/10) дала чистый S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат (0.307 г, 36%).

Пример 4: S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(м-толилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат

Получение N-2-диметил-N-[2-(м-толилметокси)этил]бут-3-ин-2-амина: Соединение получают тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], используя 3-метилбензилбромид. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 90/10). Масштаб: 4.5 ммоль. Выход: 79%. Бесцветное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.26 – 7.19 (м, 1H), 7.16 – 7.05 (м, 3H), 4.43 (с, 2H), 3.48 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 3.12 (с, 1H), 2.57 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 2.30 (с, 3H), 2.21 (с, 3H), 1.27 (с, 6H).

ESI-LRMS 246.1 [M+H]+.

Получение S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(м-толилметокси)этил]амино]пент-2-интиоата: Соединение получают тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из N-2-диметил-N-[2-(м-толилметокси)этил]бут-3-ин-2-амина. Масштаб: 1.3 ммоль. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 90/10). Выход: 77%. Бесцветное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.26 – 7.19 (м, 1H), 7.16 – 7.05 (м, 3H), 4.44 (с, 2H), 3.50 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.62 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.30 (с, 3H), 2.26 (с, 3H), 1.36 (с, 6H).

ESI- HRMS вычислено для C₁₈H₂₆NO₂S [M+H]+: 320.1679, найдено: 320.1667.

Пример 5: S-метил 4-[2-[(3,4-диметилфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоата

Получение N-[2-[(3,4-диметилфенил)метокси]этил]-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина: Соединение получают тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], используя 3,4-диметилбензил бромид. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 60/40). Масштаб: 3.8 ммоль. Выход: 60%. Бесцветное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.12 – 7.06 (м, 2H), 7.04 – 6.99 (м, 1H), 4.39 (с, 2H), 3.45 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 3.12 (с, 1H), 2.56 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 2.20 (с, 6H), 2.19 (с, 3H), 1.27 (с, 6H).

ESI-LRMS 182.0 [M+H]+. ESI-LRMS 260.0 [M+H]+.

Получение S-метил 4-[2-[(3,4-диметилфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоата: Соединение получают тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из N-[2-[(3,4-диметилфенил)метокси]этил]-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина. Масштаб: 1.3 ммоль. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 90/10). Выход: 77%. Почти бесцветное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.12 – 7.06 (м, 2H), 7.05 – 6.99 (м, 1H), 4.40 (с, 2H), 3.48 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 2.60 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.25 (с, 3H), 2.20 (с, 3H), 2.19 (с, 3H), 1.36 (с, 6H).

ESI- HRMS вычислено для C₁₉H₂₈NO₂S [M+H]+: 334.1835, найдено: 334.1825.

Пример 6: S-метил 4-[2-[(4-метоксифенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоата

Получение N-[2-[(4-метоксифенил)метокси]этил]-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина: Соединение получают тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], используя 1-(бромметил)-4-метоксибензол. Очистка методом хроматографии на силикагеле (ДХМ/MeOH = от 99/1 до 97.5/2.5). Масштаб: 4.0 ммоль. Выход: 53%. Бесцветное масло.

1H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.27 – 7.20 (м, 2H), 6.93 – 6.86 (м, 2H), 4.39 (с, 2H), 3.74 (с, 3H), 3.45 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 3.12 (с, 1H), 2.55 (т, J = 6.4 Гц, 2H), 2.20 (с, 3H), 1.27 (с, 6H).

ESI-LRMS 261.9 [M+H]+.

Получение S-метил 4-[2-[(4-метоксифенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоата: Соединение получают тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из N-[2-[(4-метоксифенил)метокси]этил]-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина. Масштаб: 1.3 ммоль. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 80/20). Выход: 74%. Почти бесцветное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.27 – 7.21 (м, 2H), 6.93 – 6.87 (м, 2H), 4.40 (с, 2H), 3.74 (с, 3H), 3.48 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 2.60 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.25 (с, 3H), 1.36 (с, 6H).

ESI- HRMS вычислено для C₁₈H₂₆NO₃S [M+H]+: 336.1628, найдено: 336.1613.

Пример 7: S-метил 4-[2-[(3,4-диметоксифенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат

Получение N-[2-[(3,4-диметоксифенил)метокси]этил]-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина: Соединение получают тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], используя 4-(бромметил)-1,2-диметоксибензол. Очистка методом хроматографии на силикагеле (ДХМ/MeOH = от 99/1 до 97.5/2.5). Масштаб: 4.0 ммоль. Выход: 67%. Бесцветное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 6.94 – 6.88 (м, 2H), 6.87 – 6.80 (м, 1H), 4.39 (с, 2H), 3.74 (с, 3H), 3.73 (с, 3H), 3.46 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 3.12 (с, 1H), 2.56 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 2.21 (с, 3H), 1.27 (с, 6H).

ESI-LRMS 292.0 [M+H]+.

Получение S-метил 4-[2-[(3,4-диметоксифенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоата: Соединение получают тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из N-[2-[(3,4-диметоксифенил)метокси]этил]-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина. Масштаб: 1.0 ммоль. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 90/10). Выход: 67%. Почти бесцветное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 6.94 – 6.87 (м, 1H), 6.87 – 6.81 (м, 1H), 4.40 (с, 2H), 3.74 (с, 3H), 3.73 (с, 3H), 3.48 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.61 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.26 (с, 3H), 1.36 (с, 6H).

ESI- HRMS вычислено для C₁₉H₂₈NO₄S [M+H]+: 366.1734, найдено: 336.1720.

Пример 8: S-метил 4-[2-[(3-хлорфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат

Получение N-[2-[(3-хлорфенил)метокси]этил]-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина: Соединение получают тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], используя 3-хлорбензил бромид. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 70/30). Масштаб: 4.0 ммоль. Выход: 71%. Бесцветное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.43 – 7.25 (м, 4H), 4.49 (с, 2H), 3.50 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 3.12 (с, 1H), 2.58 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 2.22 (с, 3H), 1.28 (с, 6H).

ESI-LRMS 266.0 [M+H]+.

Получение S-метил 4-[2-[(3-хлорфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоата: Соединение получают тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из N-[2-[(3-хлорфенил)метокси]этил]-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина, за исключением того, что реакционную смесь выдерживали при -70°C после добавления n-BuLi в течение 30 минут перед началом пропускания COS. Масштаб: 1.3 ммоль. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 75/25). Выход: 63%. Почти бесцветное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.44 – 7.24 (м, 4H), 4.50 (с, 2H), 3.52 (т, J = 6.0 Гц, 2H), 2.63 (т, J = 6.0 Гц, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.27 (с, 3H), 1.37 (с, 6H).

ESI- HRMS вычислено для C₁₇H₂₃ClNO₂S [M+H]+: 340.1133, найдено: 340.1120.

Пример 9: S-метил 4-[2-[(3-фторфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат

Получение N-[2-[(3-фторфенил)метокси]этил]-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина: Соединение получают тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], используя 3-фторбензил бромид. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 80/20). Масштаб: 4.0 ммоль. Выход: 71%. Бесцветное масло.

Получение S-метил 4-[2-[(3-фторфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоата: Соединение получают тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из N-[2-[(3-фторфенил)метокси]этил]-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина за исключением того, что реакционную смесь выдерживали при -70°C после добавления n-BuLi в течение 30 минут перед началом пропускания COS. Масштаб: 1.3 ммоль. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 70/30). Выход: 87%. Почти бесцветное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.44 – 7.34 (м, 1H), 7.20 – 7.05 (м, 3H), 4.51 (с, 2H), 3.53 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.63 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.27 (с, 3H), 1.37 (с, 6H).

ESI- HRMS вычислено для C₁₇H₂₃FNO₂S [M+H]+: 324.1428, найдено: 324.1415

Пример 10: S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(2-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат

Получение N-2-диметил-N-[2-(2-пиридилметокси)этил]бут-3-ин-2-амина: Соединение получают тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], исходя из 2-(бромметил)пиридин гидробромида и используя 4 экв. NaH. Очистка методом хроматографии на силикагеле (ДХМ/MeOH = от 99/1 до 95/5). Масштаб: 2.1 ммоль. Выход: 71%. Желтое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 8.50 (ддд, J = 4.8, 1.8, 0.9 Гц, 1H), 7.80 (тд, J = 7.7, 1.8 Гц, 1H), 7.44 (д, J = 7.8 Гц, 1H), 7.32 – 7.24 (м, 1H), 4.55 (с, 2H), 3.56 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 3.13 (с, 1H), 2.61 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 2.23 (с, 3H), 1.28 (с, 6H).

ESI-LRMS 233.1 [M+H]+.

Получение S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(2-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоата: Соединение получают по той же методике, как описано для S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из N-2-диметил-N-[2-(2-пиридилметокси)этил]бут-3-ин-2-амина и используя 1.5 экв. n-BuLi, 1.5 экв. MeI и экстракции дихлорметаном. Масштаб: 0.9 ммоль. Очистка методом хроматографии на силикагеле (ДХМ/MeOH = от 99/1 до 90/10). Выход: 18%. Желтое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 8.54 – 8.48 (м, 1H), 7.80 (тд, J = 7.7, 1.8 Гц, 1H), 7.44 (д, J = 7.8 Гц, 1H), 7.28 (дд, J = 6.7, 5.1 Гц, 1H), 4.56 (с, 2H), 3.59 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.65 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.28 (с, 3H), 1.37 (с, 6H).

ESI- HRMS вычислено для C₁₆H₂₃N₂O₂S [M+H]+: 3071475, найдено: 307.1471.

Пример 11: S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(3-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат

Получение N-2-диметил-N-[2-(3-пиридилметокси)этил]бут-3-ин-2-амина: Соединение получают тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], исходя из 3-(бромметил)пиридин гидробромида и используя 4 экв. NaH. Очистка методом хроматографии на силикагеле (ДХМ/MeOH = от 99/1 до 95/5). Масштаб: 2.1 ммоль. Выход: 67%. Желтое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 8.56 – 8.52 (м, 1H), 8.49 (дд, J = 4.8, 1.7 Гц, 1H), 7.78 – 7.70 (м, 1H), 7.38 (ддд, J = 7.8, 4.8, 0.8 Гц, 1H), 4.52 (с, 2H), 3.52 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 3.12 (с, 1H), 2.58 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 2.21 (с, 3H), 1.27 (с, 6H).

ESI-LRMS 233.1 [M+H]⁺.

Получение S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(3-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоата: Соединение получают тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из N-2-диметил-N-[2-(3-пиридилметокси)этил]бут-3-ин-2-амина и используя 1.5 экв. n-BuLi, 1.5 экв. MeI и экстракции дихлорметаном. Масштаб: 0.4 ммоль. Очистка методом хроматографии на силикагеле (ДХМ/MeOH = от 99/1 до 95/5). Выход: 15%. Желтое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 8.54 (д, J = 1.5 Гц, 1H), 8.49 (дд, J = 4.8, 1.7 Гц, 1H), 7.78 – 7.70 (м, 1H), 7.38 (ддд, J = 7.8, 4.8, 0.8 Гц, 1H), 4.53 (с, 2H), 3.54 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.63 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.26 (с, 3H), 1.36 (с, 6H).

ESI- HRMS вычислено для C₁₆H₂₃N₂O₂S [M+H]+: 3071475, найдено: 307.1474.

Пример 12: S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(4-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат

Получение N-2-диметил-N-[2-(4-пиридилметокси)этил]бут-3-ин-2-амина: Соединение получают тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], исходя из 4-(бромметил)пиридин гидробромида и используя 4 экв. NaH. Очистка методом хроматографии на силикагеле (ДХМ/MeOH = от 99/1 до 95/5). Масштаб: 2.1 ммоль. Выход: 95%. Желтое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 8.56 – 8.49 (м, 2H), 7.38 – 7.27 (м, 2H), 4.54 (с, 2H), 3.53 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 3.13 (с, 1H), 2.61 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 2.23 (с, 3H), 1.28 (с, 6H).

ESI-LRMS 233.1 [M+H]+.

Получение S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(4-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоата: Соединение получают тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из N-2-диметил-N-[2-(4-пиридилметокси)этил]бут-3-ин-2-амина и используя 1.5 экв. n-BuLi, 1.5 экв. MeI и экстракции дихлорметаном. Масштаб: 1.0 ммоль. Очистка методом хроматографии на силикагеле (ДХМ/MeOH = от 99/1 до 95/15). Выход: 24%. Желтое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 8.60 – 8.45 (м, 2H), 7.37 – 7.26 (м, 2H), 4.55 (с, 2H), 3.56 (т, J = 6.0 Гц, 2H), 2.65 (т, J = 6.0 Гц, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.28 (с, 3H), 1.37 (с, 6H).

ESI- HRMS вычислено для C₁₆H₂₃N₂O₂S [M+H]+: 3071475, найдено: 307.1470.

Пример 13: метил 4-(диметиламино)-4-метил-пент-2-иноат

Получение 4-(диметиламино)-4-метил-пент-2-иновой кислоты хлогидрата: К N,N,2-триметилбут-3-ин-2-амину (0.928 г, 8.35 ммоль) в ТГФ (42 мл) добавляли по каплям 2.35M раствор n-BuLi в гексане (3.73 мл, 8.76 ммоль) при -70°C. После 5 минут при -70°C, реакционную смесь нагревали до 0°C, выдерживали 10 минут при этой температуре, затем охлаждали до -70°C, затем 45 минут пропускали диоксид углерода. Полученную смесь нагревали до 0°C в течение 2 часов, затем осторожно гидролизовали при 0°C водой и промывали (2x25 мл) эфиром. Водные слои подкисляли (рH 1-2) добавлением 6н. раствора HCl, затем упаривали в вакууме. Полученное твердое вещество растирали и дважды промывали метанолом. Полученный сырой хлоргидрат 4-(диметиламино)-4-метил-пент-2-иновой кислоты (0.721 г, 45%) в виде белого твердого вещества использовали в следующей стадии без очистки.

¹H ЯМР (300 МГц, D₂O) δ 2.94 (с, 6H), 1.70 (с, 6H). ¹³C ЯМР (75 МГц, D₂O) δ 158.97 (C), 83.64 (C), 76.05 (C), 60.35 (C), 38.46 (2CH₃), 23.66 (2CH₃).

Получение Метил 4-(диметиламино)-4-метил-пент-2-иноата: к хлоргидрату 4-(диметиламино)-4-метил-пент-2-иновой кислоты (0.500 г, 2.61 ммоль) в MeOH (10 мл) добавляли конц. H₂SO₄ (0.15 мл) при 0°C, затем перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. После упаривания в вакууме, остаток растворяли в этилацетате. Органический слой промывали насыщенным водным раствором NaHCO₃ и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над Na₂SO₄, и растворитель упаривали в вакууме, получая (выход <10%, неоптимизированный) метилового эфира в виде практически бесцветного масла.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 3.71 (с, 3H), 2.19 (с, 6H), 1.35 (с, 6H).

ESI-LRMS [M+H]+ вычислено для C₉H₁₅NO₂ [M+H]+: 170.11, найдено: 170.1.

Пример 14: этил 4-(диметиламино)-4-метил-пент-2-иноат:

Соединение получают по той же методике, которая описана в Примере 13, используя EtOH на стадии этерификации. Масштаб 5.22 ммоль. Выход: 73%. Бесцветное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 4.17 (кв, J = 7.1 Гц, 2H), 2.19 (с, 6H), 1.34 (с, 6H), 1.22 (т, J = 7.1 Гц, 3H).

ESI- HRMS вычислено для C₁₀H₁₈NO₂ [M+H]+: 184.1332, найдено: 184.1326.

Пример 15: трет-бутил 2-((4-(диметиламино)-4-метилпент-2-иноил)тио)ацетат: Соединение получали тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из N,N,2-триметилбут-3-ин-2-амина и используя трет-бутил иодацетат вместо иодметана. Очистка методом хроматографии на силикагеле (циклогексан/EtOAc = 70/30). Масштаб: 3 ммоль. Выход: 57%. Красное масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 3.82 (с, 2H), 2.21 (с, 6H), 1.41 (с, 9H), 1.37 (с, 6H).

ESI – HRMS: вычислено для C₁₄H₂₄NO₃S [M+H]+ 286.1471, найдено 286.1472.

Пример 16: 2-((4-(диметиламино)-4-метилпент-2-иноил)тио)уксусная кислота

В раствор трет-бутил 2-((4-(диметиламино)-4-метилпент-2-иноил)тио)ацетата (200 мг, 0.7 ммоль) в дихлорметане (3.6 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (0.36 мл). Полученную смесь перемешивали в течение ночи в темноте. После упаривания при пониженном давлении полученный сырой остаток растирали и промывали диэтиловым эфиром. Получали соль с ТФУК в виде аморфного твердого вещества. Выход: 84%.

1H ЯМР (300 МГц, ацетон) δ 12.14 (с, 1H), 3.95 (с, 2H), 2.99 (с, 6H), 1.87 (с, 6H).

ESI – HRMS: вычислено для C₁₀H₁₆NO₃S [M+H]+ 230.0845, найдено 230.0847

Пример 17: S-метил 4-((4-(бензилокси)бутил)(метил)амино)-4-метилпент-2-интиоат

Получение 4-(метил(2-метилбут-3-ин-2-ил)амино)бутан-1-ола: Данное соединение получали по стандартным методикам, описанным ранее для синтеза N-метил-N-(2’гидроксиэтил)-3-амино-3-метил-1-бутина (Easton, Nelson R.; Hennion, George F. U.S. (1967), US 3337625 19670822.), исходя из коммерчески доступного 4-(метиламино)бутан-1-ола. Получали 4-(метил(2-метилбут-3-ин-2-ил)амино)бутан-1-ол в виде ярко-желтого масла. Масштаб: 3 ммоль. Выход: 99%.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 4.41 (т, J = 5.2 Гц, 1H), 3.42 - 3.33 (м, 2H), 3.09 (с, 1H), 2.38 – 2.29 (м, 2H), 2.14 (с, 3H), 1.45 – 1.36 (м, 4H), 1.27 (с, 6H).

ESI – LRMS: 170.1 [M+H]+

Получение N-(4-(бензилокси)бутил)-N,2-диметилбут-3-ин-2-амина: Соединение получали тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], исходя из 4-(метил(2-метилбут-3-ин-2-ил)амино)бутан-1-ола и используя 1.015 экв. NaH и 1.01 экв. бензилбромида. Очистка методом хроматографии на силикагеле (циклогексан/EtOAc = 80/20). Масштаб: 2.4 ммоль. Выход: 55%. Желтое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.39 – 7.22 (м, 5H), 4.44 (с, 2H), 3.42 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 3.08 (с, 1H), 2.34 (т, J = 6.9 Гц, 2H), 2.13 (с, 3H), 1.60 – 1.37 (м, 4H), 1.26 (с, 6H).

ESI – LRMS: 260.2 [M+H]+

Получение S-метил 4-((4-(бензилокси)бутил)(метил)амино)-4-метилпент-2-интиоата: Соединение получали тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из N-(4-бензилоксибутил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина. Очистка методом хроматографии на силикагеле (циклогексан/EtOAc = 90/10). Масштаб: 0.77 ммоль. Выход: 80%. Желтое масло.

1H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 7.38 – 7.19 (м, 5H), 4.48 (с, 2H), 3.47 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.45 (т, J = 6.9 Гц, 2H), 2.35 (с, 3H), 2.26 (с, 3H), 1.73 – 1.48 (м, 4H), 1.39 (с, 6H).

ESI – HRMS: вычислено для C19H28NO2S [M+H]+ 334.1835, найдено 334.1840.

Пример 18: S-метил 4-((2-гидроксиэтил)(метил)амино)-4-метилпент-2-интиоат

a) см. Easton, Nelson R.; Hennion, George F., U.S. (1966), US 3285913 b) 3,4-DHP, pTSA, ДХМ (70%) c) nBuLi, ТГФ, -70°C, карбонилсульфид, затем MeI 0°C (59%) d) pTSA, MeOH, комнатная температура (90%)

Получение соединения 3: N,2-диметил-N-(2-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)бут-3-ин-2-амина: К 2-(метил(2-метилбут-3-ин-2-ил)амино)этанолу 2 (3.00 г, 21.2 ммоль) и 3,4-дигидро-2H-пирану (5.0 экв.) в безводном ДХМ (135 мл) добавляли п-толуолсульфокислоту (0.1 экв.) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи, промывали насыщенным водным раствором NaHCO₃ (30 мл), затем насыщенным раствором хлорида натрия (30 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали в вакууме. Остаток сначала очищали короткой дистилляцией на аппарате Кугельрор (10-12 Торр., баня 155°C), затем методом флэш-хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этил ацетат = от 95/5 до 60/40), получая соединение 3 в виде масла (выход 70%).

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 4.60 – 4.50 (м, 1H), 3.82-3.70 (м, 1H), 3.59-3.56 (м, 1H), 3.49 – 3.35 (м, 2H), 3.12 (с, 1H), 2.55 (т, J = 6.5 Гц, 2H), 2.21 (с, 3H), 1.77 – 1.35 (м, 6H), 1.27 (с, 6H).

Получение соединения 4: S-метил 4-метил-4-(метил(2-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)амино)пент-2-интиоат: к ацетиленовому амину 3 (1.00 г, 4.44 ммоль) в безводном ТГФ (22 мл) добавляли раствор n-бутиллития (2.2 M в гексане, 1.5 экв.) по каплям. Полученную смесь оставляли нагреваться до 0°C в течение 10 минут, затем снова охлаждали до -70°C и барботировали карбонил сульфид. Через 30 минут полученный ярко-желтый раствор осторожно нагревали до 0°C, перемешивали 30 минут при этой температуре и добавляли метилиодид (1.2 экв.) по каплям. Реакционную смесь перемешивали 2 часа при 0°C, затем гидролизовали водой. Экстракционная обработка дихлорметаном (промывка насыщенным раствором хлорида натрия, сушка над сульфатом натрия и упаривание при пониженном давлении) дала сырой продукт, который очищали методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этил ацетат = от 90/10 до 60/40), получая соединение 4 в виде масла (выход 59%).

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 4.58 (т, J = 3.2 Гц, 1H), 3.75 (ддд, J = 11.4, 7.9, 3.3 Гц, 1H), 3.70 – 3.60 (м, 1H), 3.49 – 3.38 (м, 2H), 2.59 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 2.39 (с, 3H), 2.27 (с, 3H), 1.77 – 1.39 (м, 6H), 1.36 (с, 6H). ¹³C ЯМР (75 МГц, CDCl₃) δ 176.62 (C=O), 98.94 (CH), 96.46 (C), 80.97 (C), 66.55 (CH₂), 62.37 (CH₂), 55.19 (C), 52.43 (CH₂), 37.92 (CH₃), 30.75 (CH₂), 28.01(2xCH₃), 25.59 (CH₂), 19.63 (CH₂), 12.61 (CH₃).

Получение соединения 5: S-метил 4-((2-гидроксиэтил)(метил)амино)-4-метилпент-2-интиоат: К аминотиолэфиру 4 (1.00 г, 3.34 ммоль) в метаноле (15 мл) добавляли п-толуолсульфокислоту (1.1 экв.) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи, промывали насыщенным водным раствором NaHCO₃ (30 мл), затем насыщенным раствором хлорида натрия (30 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали в вакууме. Остаток очищали методом флэш-хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этил ацетат = от 80/20 до 20/80), получая соединение 5 в виде масла (выход: 90%).

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 4.42 (т, J = 5.6 Гц, 1H), 3.44 (тд, J = 6.7, 5.6 Гц, 2H), 2.46 (, J = 6.7 Гц, 2H), 2.39 (с, 3H), 2.24 (с, 3H), 1.36 (с, 6H). ¹³C ЯМР (75 МГц, CDCl₃) δ 176.46 (C=O), 95.56 (C), 80.89 (C), 58.92 (CH₂), 54.99 (C), 53.52 (CH₂), 36.12 (CH₃), 27.88 (2xCH₃), 12.53(CH₃). ESI-HRMS: Вычислено для C₁₀H₁₈NO₂S [M+H]⁺ 216.1053, найдено 216.1043.

Пример 19. S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(2-нафтилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат

Получение N,2-диметил-N-[2-(2-нафтилметокси)этил]бут-3-ин-2-амина: Соединение получают тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], используя 1.015 экв. NaH и 1.01 экв. 2-нафтил бромида. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 90/10). Выход: 61%. Оранжевое масло.

1H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.91 – 7.88 (м, 4H), 7.50 – 7.48 (м, 3H), 4.65 (с, 2H), 3.55 (т, 6.1 Гц, 2H), 3.13 (с, 1H), 2.62 (т, 6.2 Гц, 2H), 2.23 (с, 3H), 1.28 (с, 6H).

Получение S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(2-нафтилметокси)этил]амино]пент-2-интиоата: Соединение получают тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из N,2-диметил-N-[2-(2-нафтилметокси)этил]бут-3-ин-2-амина. Масштаб: 0.65 ммоль. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 85/15). Выход: 28%. Желтое масло.

1H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.95 – 7.82 (м, 4H), 7.55 – 7.41 (м, 3H), 4.66 (с, 2H), 3.57 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 2.66 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.28 (с, 3H), 1.37 (с, 6H).

ESI – HRMS: вычислено для C₂₁H₂₆NO₂S 356.1683, найдено 356.1679 [M+H]+

Пример 20: S-метил 4-метил-4-[метил-[2-[(2,6,6-триметилциклогексен-1-ил)метокси]этил]амино]пент-2-интиоат

Получение N,2-диметил-N-[2-[(2,6,6-триметилциклогексен-1-ил)метокси]этил]бут-3-ин-2-амина: Соединение получают тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], используя 1.015 экв. NaH и 1.01 экв. 2-(бромметил)-1,3,3-триметил-1-циклогексена (получен из β-циклоцитраля по известным методикам (WO 2015048363)). Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 95/05). Выход: 67%. Бледно-желтое масло.

3.86 (с, 2H), 3.41 (т, J = 6.5 Гц, 2H), 3.12 (с, 1H), 2.53 (т, J = 6.4 Гц, 2H), 2.20 (с, 3H), 1.90 (т, J = 5.9 Гц, 2H), 1.62 (с, 3H), 1.57 – 1.49 (м, 2H), 1.41 – 1.33 (с, 2H), 1.27 (с, 6H), 0.97 (с, 6H).

Получение S-метил 4-метил-4-[метил-[2-[(2,6,6-триметилциклогексен-1-ил)метокси] этил]амино]пент-2-интиоата: Соединение получают тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата (пример 19), исходя из N,2-диметил-N-[2-[(2,6,6-триметилциклогексен-1-ил)метокси]этил]бут-3-ин-2-амина. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 90/10). Выход: 63%. Желтое масло.

1H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 3.87 (с, 2H), 3.44 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 2.57 (т, J = 6.3 Гц, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.26 (с, 3H), 1.91 (т, J = 6.2 Гц, 2H), 1.62 (с, 3H), 1.57 – 1.49 (м, 2H), 1.36 (с, 6H), 1.39 – 1.34 (м, 2H), 0.97 (с, 6H).

ESI – HRMS вычислено для C20H34NO2S [M+H]+: 352.2305, найдено: 352.2289.

Пример 21: 2-[(1,1-диметил-4-метилсульфанил-4-оксо-бут-2-инил)-метиламино]этил ацетат:

К S-метил 4-[2-гидроксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоату (100 мг, 0.46 ммоль) и диизопропилэтиламину (1.2 экв.) в дихлорметане (2.3 мл) добавляли по каплям ацетилхлорид (1.2 экв.) при 0°C. После 10 минут при 0°C, реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали до полной конверсии (ТСХ-мониторинг). Полученную смесь затем равзодили дихлорметаном (30 мл), промывали насыщенным раствором хлорида натрия (40 мл), сушили над сульфатом натрия, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Полученный сырой продукт очищали методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этил ацетат = 75/25), получая продукт 21 в виде желтого масла. Выход 58%.

1H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 4.05 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.62 (т, J = 6.1 Гц, 2H), 2.39 (с, 3H), 2.26 (с, 3H), 2.01 (с, 3H), 1.36 (с, 6H).

ESI -HRMS вычислено для C12H19NO3S [M+H]+: 258.1086, найдено: 258.1150.

Пример 22: 2-[(1,1-диметил-4-метилсульфанил-4-оксо-бут-2-инил)-метиламино]этил-3,4-диметоксибензоат:

Соединение получают тем же способом, который описан для получения 2-[(1,1-диметил-4-метилсульфанил-4-оксо-бут-2-инил)-метиламино]этил ацетата [пример 21], исходя из 3,4-диметоксибензоил хлорида. Масштаб: 0.46 ммоль. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 60/40). Выход: <10%. желтое масло.

1H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.59 (дд, J = 8.4, 2.0 Гц, 1H), 7.45 (д, J = 2.0 Гц, 1H), 7.08 (д, J = 8.5 Гц, 1H), 4.28 (т, J = 7.1 Гц, 2H), 3.83 (с, 3H), 3.80 (с, 3H), 2.72 (т, J = 7.1 Гц, 2H), 2.38(с, 3H), 2.33 (с, 3H), 1.39 (с, 6H).

Пример 23: S-метил 2,5,10,11,11-пентаметил-6-оксо-7-окса-2,5,10-триазатетрадец-12-ин-14-тиоат

Соединение получают тем же способом, который описан для получения S-метил 4-метил-4-[метил-[2-[метил-[2-(метиламино)этил]карбамоил]оксиэтил]амино]пент-2-интиоата [соединение 7 / Пример 29], исходя из N,N,N′-Триметилэтилендиамина. Очистка методом хроматографии на силикагеле ДХМ/MeOH (85/15). Выход: 34%. Желтое масло.

1H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 4.01 (т, J = 5.9 Гц, 2H), 3.32-3.25 (м, 2H), 2.83 (большой с, 3H), 2.62 (т, J = 5.8 Гц, 2H), 2.6-2.5 (м, частично скрыт пиком растворителя, 2H), 2.39 (с, 3H), 2.27 (с, 3H), 2.17 (большой с, 6H), 1.36 (с, 6H).

ESI-HRMS вычислено для C16H30N3O3S [M+H]+: 344.1992, найдено: 344.1993.

Пример 24: (S)-S-метил 4-(2-(метоксиметил)пирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоат

Получение (S)-2-(метоксиметил)-1-(2-метилбут-3-ин-2-ил)пирролидина: Соединение получали тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], используя 1 экв. (S)-пирролидин-2-илметанола, 1.015 экв. NaH и 1.01 экв. иодметана. Очистка методом хроматографии на силикагеле (дихлорметан/метанол = 90/10). Масштаб: 3.0 ммоль. Выход: 61%. Оранжевое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 3.23 (с, 3H), 3.16 – 3.06 (м, 2H), 3.05 (с, 1H), 3.03 – 2.91 (м, 1H), 2.91 – 2.80 (м, 1H), 2.67 – 2.54 (м, 1H), 1.77 – 1.49 (м, 4H), 1.30 (с, 3H), 1.24 (с, 3H).

ESI – LRMS: 182.2 [M+H]+.

Получение (S)-S-метил 4-(2-(метоксиметил)пирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоата: Соединение получали тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из (S)-2-(метоксиметил)-1-(2-метилбут-3-ин-2-ил)пирролидина. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 80/20). Масштаб: 0.8 ммоль. Выход: 57%. Желтое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 3.24 (с, 3H), 3.19 – 2.89 (м, 4H), 2.67 – 2.53 (м, 1H), 2.38 (с, 3H), 1.83 – 1.50 (м, 4H), 1.39 (с, 3H), 1.33 (с, 3H).

ESI- HRMS вычислено для C₁₃H₂₂NO₂S [M+H]+: 256.1366, найдено: 256.1363.

Пример 25: S-метил 4-[(3R)-3-метоксипирролидин-1-ил]-4-метил-пент-2-интиоат

Получение (R)-3-метокси-1-(2-метилбут-3-ин-2-ил)пирролидина: Соединение получали тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], исходя из (R)-1-(2-метилбут-3-ин-2-ил)пирролидин-3-ола, используя 1.015 экв. NaH и 1.01 экв. иодметана. Очистка методом хроматографии на силикагеле (дихлорметан/метанол = 90/10). Масштаб: 3.3 ммоль. Выход: 30%. Желтое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 3.85 (ддд, J = 10.8, 7.2, 3.6 Гц, 1H), 3.17 (с, 3H), 3.13 (с, 1H) 2.82 (дд, J = 9.8, 6.5 Гц, 1H), 2.66 - 2.60 (м, 1H), 2.56 – 2.50 (м, 2H), 2.01 – 1.87 (м, 1H), 1.73 – 1.55 (м, 1H), 1.28 (с, 6H).

ESI – LRMS: 168.0 [M+H]⁺.

Получение (R)-S-метил 4-(3-метоксипирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоата:

Соединение получали тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из (R)-3-метокси-1-(2-метилбут-3-ин-2-ил)пирролидина. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 60/40). Масштаб: 0.8 ммоль. Выход: 55%. Желтое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 3.87 (ддд, J = 10.5, 6.9, 3.4 Гц, 1H), 3.18 (с, 3H), 2.90 – 2.76 (м, 1H), 2.77 – 2.65 (м, 1H), 2.65 – 2.54 (м, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.07 – 1.86 (м, 1H), 1.76 – 1.60 (м, 1H), 1.36 (с, 6H).

Пример 26: S-метил 4-(((1R,2R)-2-(бензилокси)циклопентил)(метил)амино)-4-метилпент-2-интиоат

Получение (1R, 2R)-2-бензилокси-N-(1,1-диметилпроп-2-инил)циклопентанамина:

В раствор коммерчески доступного (1R,2R)-2-(бензилокси)циклопентанамина (0.93 г, 4.86 ммоль), 3-хлор-3-метилбут-1-ина (1.3экв.) и триэтиламина (1.3экв.) в ТГФ (20 мл) добавляли CuI (8 мол.%) при комнатной температуре. Полученную смесь оставляли пермешиваться на ночь. Растворитель упаривали при пониженном давлении, и полученный сырой продукт затем разводили в насыщенном водном растворе NaHCO₃, экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали 2%-ным водным раствором NH₄OH, затем насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над Na₂SO₄, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Получали (1R, 2R)-2-бензилокси-N-(1,1-диметилпроп-2-инил)циклопентанамин в виде коричневого масла. Выход: 99%.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.37 – 7.16 (м, 5H), 4.56 – 4.36 (м, 2H), 3.72 – 3.58 (м, 1H), 3.28 – 3.19 (м, 1H), 3.08 (с, 1H), 2.00 – 1.88 (м, 1H), 1.86 – 1.67 (м, 2H), 1.65 – 1.49 (м, 3H), 1.40 – 1.28 (м, 1H), 1.25 (с, 3H), 1.25 (с, 3H).

Получение (1R,2R)-2-(бензилокси)-N-метил-N-(2-метилбут-3-ин-2-ил) циклопентанамина: К (1R,2R)-2-(бензилокси)-N-(2-метилбут-3-ин-2-ил) циклопентанамину (0.25 г, 0.97 ммоль) добавляли 5 экв. муравьиной кислоты и 1.5 экв. формальдегида (37% в воде). Полученную смесь кипятили в течение ночи, затем 2н. HCl добавляли до pH 1 и промывали эфиром. Водный слой подщелачивали 1н. раствором NaOH и экстрагировали дихлорметаном. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над Na₂SO₄ и упаривали растворители при пониженном давлении. Полученный сырой продукт затем очищали методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 80/20), получая желтое масло. Выход: 68%.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.43 – 7.17 (м, 5H), 4.52 (м, 2H), 3.94 – 3.78 (м, 1H), 3.62 – 3.49 (м, 1H), 3.11 (с, 1H), 2.20 (с, 3H), 1.78 – 1.45 (м, 6H), 1.37 (с, 3H), 1.34 (с, 3H).

ESI – LRMS: 272.1 [M+H]⁺.

Получение S-метил 4-(((1R,2R)-2-(бензилокси)циклопентил)(метил)амино)-4-метилпент-2-интиоата: Соединение получали тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из (1R,2R)-2-(бензилокси)-N-метил-N-(2-метилбут-3-ин-2-ил)циклопентанамина. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 80/20, затем ДХМ = 100). Масштаб: 0.64 ммоль. Выход: 47%. Желтое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.35 – 7.20 (м, 5H), 4.51 (с, 2H), 3.92 – 3.80 (м, 1H), 3.59 – 3.45 (м, 1H), 2.36 (с, 3H), 2.24 (с, 3H), 1.78 – 1.49 (м, 6H), 1.45 (с, 3H), 1.42 (с, 3H).

ESI – HRMS вычислено для C₂₀H₂₈NO₂S [M+H]+: 346.1835, найдено: 346.1824.

Пример 27: (S)-S-метил 4-(2-((бензилокси)метил)пирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоат:

Получение (S)-2-((бензилокси)метил)-1-(2-метилбут-3-ин-2-ил)пирролидина: Соединение получали тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], исходя из (S)-(1-(2-метилбут-3-ин-2-ил)пирролидин-2-ил)метанола, 1.015 экв. NaH и 1.01 экв. бензилбромида. Очистка методом хроматографии на силикагеле (дихлорметан/метанол = 95/5). Масштаб: 3.0 ммоль. Выход: 60%. Оранжевое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.41 – 7.19 (м, 5H), 4.46 (с, 2H), 3.24 (дд, J = 8.3, 2.7 Гц, 1H), 3.14 (дд, J = 7.6, 3.2 Гц, 1H), 3.11 – 3.02 (м, 2H), 2.86 (дд, J = 8.4, 6.0 Гц, 1H), 2.65 – 2.54 (м, 1H), 1.81 – 1.51 (м, 4H), 1.25 (с, 3H), 1.23 (с, 3H).

ESI-LRMS: 258.1 [M+H]+.

Получение (S)-S-метил 4-(2-((бензилокси)метил)пирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоата: Соединение получали тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из (S)-2-((бензилокси)метил)-1-(2-метилбут-3-ин-2-ил)пирролидина. Очистка методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/EtOAc = 80/20). Масштаб: 1.2 ммоль. Выход: 50%. Оранжевое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.46 – 7.18 (м, 5H), 4.47 (с, 2H), 3.29 – 3.23 (м, 1H), 3.17 – 3.03 (м, 2H), 2.94 (дд, J = 8.5, 5.7 Гц, 1H), 2.62 – 2.53 (м, 1H), 2.38 (с, 3H), 1.85 – 1.58 (м, 4H), 1.34 (с, 3H), 1.32 (с, 3H).

Пример 28: (R)-S-метил 4-(3-(бензилокси)пирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоат:

Получение (R)-3-(бензилокси)-1-(2-метилбут-3-ин-2-ил)пирролидина: Соединение получали тем же способом, который описан для получения N-(2-аллилоксиэтил)-N,2-диметил-бут-3-ин-2-амина [пример 2], исходя из (R)-1-(2-метилбут-3-ин-2-ил)пирролидин-3-ола, используя 1.01 экв. NaH и 1.01 экв. бензилбромида. Очистка методом хроматографии на силикагеле (дихлорметан/метанол = 98/2). Масштаб: 3.3 ммоль. Выход: 69%. Оранжевое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.40 – 7.17 (м, 5H), 4.42 (с, 2H), 4.07 (тт, J = 7.3, 3.7 Гц, 1H) 3.13 (с, 1H), 2.86 (дд, J = 9.6, 6.7 Гц, 1H), 2.75 – 2.65 (м, 2H), 2.60 – 2.53 (м, 1H), 2.06 – 1.95 (м, 1H), 1.75 – 1.65 (м, 1H), 1.29 (с, 6H).

ESI – LRMS 244.1 [M+H]+.

Получение (R)-S-метил 4-(3-(бензилокси)пирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоата: Соединение получали тем же способом, который описан для получения S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоата [пример 1], исходя из (R)-3-(бензилокси)-1-(2-метилбут-3-ин-2-ил)пирролидина. Очистка методом хроматографии на силикагеле (дихлорметан/метанол = 98/2). Масштаб: 1.2 ммоль. Выход: 69%. Оранжевое масло.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 7.32 (м, 5H), 4.44 (с, 2H), 4.09 (д.кв, J = 10.2, 3.5 Гц, 1H), 2.97 – 2.83 (м, 1H), 2.80 – 2.65 (м, 2H), 2.65 – 2.55 (м, 1H), 2.37 (с, 3H), 2.11 – 1.90 (м, 1H), 1.83 – 1.67 (м, 1H), 1.37 (с, 6H).

ESI – HRMS вычислено для C₁₈H₂₄NO₂S [M+H]+: 318.1522, найдено: 318.1518.

Пример 29: КАП соединение (без антитела)

Получение линкера (Mc-Val-Cit-PAB-PNP): Линкер, выбранный для получения конъюгата, был спроектирован на известной платформе, уже использовавшейся в ритуксимабе и других веществах, содержащей малеимид для присоединения к антителу, катепсин-расщепляемую группу и п-аминобензильную систему для 1,6-элиминирования: Mc-Val-Cit-PAB-PNP, CAS 159857-81-5.

Ее получали по стандартным методикам, исходя из Fmoc-Val-OSu [CAS 3392-12-9], или ее можно приобрести у коммерческих поставщиков (например, creative biolabs, ALB technology, Carbosynth и т.д.).

Общая формула линкера показана ниже:

Получение соединения по настоящему изобретению (пример 18), конъюгированного с Mc-Val-Cit-PAB-PNP

Соединение 6:

К п-нитрохлорформиату (140 мг, 0.70 ммоль, 1.5 экв.) в ДХМ (2.5 мл) добавляли по каплям раствор соединения 5 (100 мг, 0.46 ммоль) и ТЭА (1.5 экв.) в ДХМ (1.5 мл) при 0°C. После 10 минут при 0°C, реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали до полной конверсии (ТСХ-мониторинг, 1 ч). Полученную смесь затем разводили в ДХМ (30 мл), промывали насыщенным раствором хлорида натрия (40 мл), сушили над Na₂SO₄, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Полученный сырой продукт очищали методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этил ацетат = от 100/0 до 70/30), получая соединение 6 в виде аморфного твердого вещества (выход 82%). ¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО): δ (м.д.) 8.35-8.30 (м, 2H), 7.59-7.53 (м, 2H), 4.30 (т, J = 5.7 Гц, 2H), 2.75 (т, J = 5.7 Гц, 2H), 2.39 (с, 3H), 2.30 (с, 3H), 1.39 (с, 6H).

Соединение 7:

К соединению 6 (200 мг, 0.53 ммоль) в ДХМ (3 мл) добавляли ТЭА (1.2 экв.) при комнатной температуре. Затем добавляли раствор трет-бутил N-метил-N-[2-(метиламино)этил]карбамата (1.2 экв.) в ДХМ (2.3 мл) при 0°C. Полученную ярко-желтую реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Полученную смесь разводили 30 миллилитрами ДХМ, промывали 40 мл насыщенного раствора хлорида натрия, сушили над Na₂SO₄, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Полученный сырой продукт очищали методом хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/этил ацетат = от 75/25 до 20/80), получая соединение 7 в виде вязкого масла (выход 70%).

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО): δ (м.д.) 3.99 (т, J = 5.7 Гц, 2H), 3.30 (с, 3H), 2.85-2.70 (м, 7H), 2.66-2.58 (м, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.26 (с, 3H), 1.37 (с, 9H), 1.36 (с, 6H). ESI – LRMS: Вычислено для C₂₀H₃₆N₃O₅S [M+H]⁺: 430.2; найдено: 430.2.

Соединение 8:

К соединению 7 (44.5 мг, 0.104 ммоль) в 4.5 мл ДХМ (4.5 мл) добавляли ТФУК (0.5 мл) при 0°C. Полученную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. После упаривания в вакууме (температура бани < 45°C), маслянистый остаток растирали и обрабатывали ультразвуком в Et₂O. Полученное липкое твердое вещество (бис-трифторацетатная соль) промывали эфиром и сушили. Выход: 67%.

¹H ЯМР (300 МГц, D₂O) δ 4.57 – 4.44 (м, 2H), 3.73 – 3.69 (м, 2H), 3.62 (т, J = 5.7 Гц, 2H), 3.30 – 3.19 (т, J = 5.8 Гц, 2H), 3.05 – 2.99 (м, 3H), 2.99 – 2.90 (м, 3H), 2.73 (с, 3H), 2.45 (с, 3H), 1.79 (с, 6H). ESI – LRMS: Вычислено для C₁₅H₂₈N₃O₃S [M+H]⁺: 330.2; найдено: 330.1.

Соединение 9:

К MC-Val-Cit-PABC-PNP (52 мг, 0.07 ммоль) и соединению 8 (1.06 экв.) в ДМФА (1.4 мл) последовательно добавляли при 0°C: HOBt (1 экв.) в один прием, затем DIPEA (3 экв.) по каплям. После 5 минут при 0°C, реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Полученную смесь затем концентрировали в вакууме (упаривали ¾ объема, температура бани <45°C) и осаждали добавлением Et₂O. Белое твердое вещество получали после промывания/растирания (x3) в Et₂O. Финальная очистка методом хроматографии на силикагеле (MeOH/ДХМ = от 95/5 до 90/10) дала финальный продукт (соединение 9) в виде белого твердого вещества. Выход: 75%.

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО) δ 9.99 (с, 1H), 8.08 (д, J = 7.4 Гц, 1H), 7.80 (д, J = 8.6 Гц, 1H), 7.59 (д, J = 8.5 Гц, 2H), 7.35 – 7.22 (м, 2H), 7.01 (с, 2H), 5.97 (т, J = 5.8 Гц, 1H), 5.41 (с, 2H), 4.98 (с, 2H), 4.44 – 4.32 (м, 1H), 4.25 – 4.14 (м, 1H), 3.99 (с, 2H), 3.45 – 3.33 (м, 4H), 3.09 – 2.89 (м, 2H), 2.89 – 2.70 (м, 6H), 2.65 – 2.56 (м, 2H), 2.38 (с, 3H), 2.30 – 2.11 (м, 5H), 2.10–1.90 (м, 1H), 1.77 – 1.09 (м, 18H), 0.84 (дд, J = 9.5, 6.8 Гц, 6H).

ЖХ: Zorbax, ACN/H₂O 0.1% ТФУК, 254 нм, 96%.

ESI-HRMS: Вычислено для C₄₄H₆₆N₉O₁₁S [M+H]⁺ 928.4597, найдено 928.4586.

Часть 2: Применение соединения по настоящему изобретению

Пример 1: Активность соединений по настоящему изобретению

Материалы и методы

Линии клеток. Линию клеток лейкоза, HL-60 (получена от 36-летней женщины с AML-M2), использовали для определения эффективности лекарственного средства. Клетки получали от Европейской коллекции клеточных культур (European Collection of Cell Cultures, ECACC). Все клетки выращивали в подходящей среде согласно рекомендациям производителя.

Тест выживаемости клеток, 96-луночный формат. Клетки высевали в 96-луночный планшет для выращивания культур клеток в концентрациях обеспечивающих примерно 80% конфлюентность в контроле (клетки, не подвергавшиеся обработке) в конце эксперимента (0.5 x 10⁴ – 5 x 10⁴ клеток на лунку).

Чувствительность к соединениям по настоящему изобретению определяли, используя разные концентрации каждого соединения в диапазоне от 0.5 до 100 мкМ (0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100 мкМ). После 48 часов инкубирования при 37⁰C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂, анализировали эффективность соединений в ингибировании роста, применяя резазурин согласно инструкциям производителя.

Для гарантии высокого качества результатов и минимизации влияния ошибки в навесках, каждую концентрацию соединения тестировали по средней интенсивности флуоресценции для 8 отдельных лунок. Ответ на воздействие соединения количественно характеризовали по концентрации полумаксимального ингибирования (IC₅₀) для каждой конкретной линии клеток, и определяли анализом методом нелинейной регрессии кривых log-доза/ответ.

Статистический анализ. Значения выражали в виде среднего значения ± SD (стандартное отклонение) или частот и пропорций. Кривые жизнеспособности клеток строили с использованием кривой регрессии по 4 параметрам. Различия между группами определяли по данным двухвыборочного t-критерия для независимых выборок, анализа методом хи-квадратов, точного критерия Фишера или дисперсионного анализа, где это применимо. Значение P <0.05 считали статистически значимым. Анализ проводили с помощью программы GraphPad prism version 5.0 (GraphPad software, San Diego California USA).

Результаты

Значения IC₅₀, полученные в тестах цитотоксической активности соединений по настоящему изобретению на клетках HL60, приведены ниже в Таблице 3.

Таблица 3

Пример Название IC₅₀ через 48ч 1 S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат 4.977 мкМ 2 S-метил 4-[2-аллилоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат 6.5 мкМ 3 S-метил 4-[2-бензилоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат 1.169 мкМ 4 S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(м-толилметокси)этил]амино] пент-2-интиоат 5.622 мкМ 5 S-метил 4-[2-[(3,4-диметилфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат 4.722 мкМ 6 S-метил 4-[2-[(4-метоксифенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат 6.478 мкМ 7 S-метил 4-[2-[(3,4-диметоксифенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат 6.085 мкМ 8 S-метил 4-[2-[(3-хлорфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат 7.069 мкМ 9 S-метил 4-[2-[(3-фторфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат 6.647 мкМ 10 S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(2-пиридилметокси)этил] амино]пент-2-интиоат 5.622 мкМ 11 S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(3-пиридилметокси)этил] амино]пент-2-интиоат 6.560 мкМ 12 S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(4-пиридилметокси)этил] амино]пент-2-интиоат 5.684 мкМ 13 метил 4-(диметиламино)-4-метил-пент-2-иноат 42.66 мкМ 14 этил 4-(диметиламино)-4-метил-пент-2-иноат 40.00 мкМ 15 трет-бутил 2-((4-(диметиламино)-4-метилпент-2-иноил)тио) ацетат 25 мкМ 16 2-((4-(диметиламино)-4-метилпент-2-иноил)тио)уксусная кислота 22.48 мкМ 17 S-метил 4-((4-(бензилокси)бутил)(метил)амино)-4-метилпент-2-интиоат 11.31 мкМ 18 S-метил 4-((2-гидроксиэтил)(метил)амино)-4-метилпент-2-интиоат 6.75 мкМ 19 S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(2-нафтилметокси)этил]амино] пент-2-интиоат 11.31 мкМ 20 S-метил 4-метил-4-[метил-[2-[(2,6,6-триметилциклогексен-1-ил)метокси]этил]амино]пент-2-интиоат 13.62 мкМ 21 2-[(1,1-диметил-4-метилсульфанил-4-оксо-бут-2-инил)-метиламино]этил ацетат 12.72 мкМ 22 2-[(1,1-диметил-4-метилсульфанил-4-оксо-бут-2-инил)-метиламино]этил-3,4-диметоксибензоат 15.32 мкМ 23 S-метил 2,5,10,11,11-пентаметил-6-оксо-7-окса-2,5,10-триазатетрадец-12-ин-14-тиоат 10.61 мкМ 24 S-метил 4-[2-(метоксиметил)пирролидин-1-ил]-4-метилпент-2-интиоат 20.5 мкМ 25 S-метил 4-(3-метоксипирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоат 16.5 мкМ 26 S-метил 4-метил-4-[метил(2-феноксициклопентил)амино] пент-2-интиоат 17.5 мкМ 27 (S)-S-метил 4-(2-((бензилокси)метил)пирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоат 10.38 мкМ 28 S-метил 4-[3(бензилокси)-1пирролидинил])-4-метилпент-2-интиоат 11.83 мкМ

Пример 2: Активность соединений 3 и 5 в ферментном анализе с человеческим рекомбинантным ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH2 и ALDH3A1

Материалы и методы

Человеческий рекомбинантный ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH2 (Creative BioMart, NY, USA) готовили в концентрации 1 мг/мл. Ферментные реакции проводили в насыщенных концентрациях субстрата. Для тестирования ферментной активности ферментов, 10 мкл фермента добавляли в реакционный буфер, содержащий 50 мM HEPES pH 7.2, 30 мM MgCl₂, плюс 20 мM НАД⁺ кофактор и 2 мM гексаналь (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) в присутствии или в отсутствии различных тестируемых соединений. Внутренние стандарты готовили с никотинамид-аденин-динуклеотидом в восстановленной форме (НАДН, 500 мкМ, Sigma-Aldrich) в реакционном буфере (50 мM HEPES pH 7.2, 30 мM MgCl₂).

Для ALDH3A1 (1 мг/мл), 10 мкл фермента добавляли в реакционный буфер, содержащий 50 мM Tris, 5 мM DTT, pH 8, плюс 40 мM никотинамид-аденин-динуклеотид фосфат (окисленная форма, НАДФ⁺) и 4-нитробензальдегид (4-NBA) (Sigma-Aldrich). Внутренние стандарты готовили с никотинамид-аденин-динуклеотид фосфатом в восстановленной форме (НАДФН, 5 мкМ, Sigma-Aldrich) в реакционном буфере (50 мM Tris, 5 мM DTT, pH 8).

Тестирование времязависимого ингибирования проводили для 0-2-5-10-15-20-30-45-60 минут при 37ᵒC в кварцевой кювете объемом 1 мл. Отслеживали образование НАДН, считывая образцы при длине волны возбуждения = 340 нм/длине волны излучения = 460 нм (флуоресценция) в течение по меньшей мере 600 секунд, используя флуориметр Cary Eclipse Varian.

Отрицательный контроль состоял из той же самой реакционной смеси за исключением того, что не был добавлен фермент (т.е. без фермента). Чтобы определить угол наклона для контрольного образца без фермента и вычислить концентрацию продукта (единицы флуоресценции), использовали следующее уравнение:

где Cst это концентрация НАДН в стандарте, Fst это флуоресценция стандарта, и dF/dt это угол наклона кривой времязависимой флуоресценции (S. Sołobodowska et al, 2012).

Специфическую активность ферментов (мкмоль/мин·мг – Ед/мг) в отсутствии или в присутствии ингибиторов вычисляли следующим образом:

В указанных реакциях активность соединений 3 и 5 по настоящему изобретению сравнивали с DIMATE (S-метил 4-(диметиламино)-4-метилпент-2-интиоат, описан в EP 1296946).

Результаты

Полученные значения IC₅₀ приведены ниже в Таблице 4.

Таблица 4

СОЕДИНЕНИЕ ALDH1A1
IC₅₀ (мкМ) ALDH1A2
IC₅₀ (мкМ) ALDH1A3
IC₅₀ (мкМ) ALDH3A1
IC₅₀ (мкМ) ALDH2
IC₅₀ (мкМ) DIMATE (не является частью настоящего изобретения) 37 ± 5 18 ± 4 20 ± 2 303 ± 46 72 ± 9 Соединение 3 3.8 ± 1.1 0.568 ± 0.09 3.4 ± 0.1 242 ± 11 3.1 ± 0.8 Соединение 5 4.3 ± 0.4 1.3 ± 0.2 4.8 ± 0.1 143 ± 2 12 ± 3

Соединения 3 и 5 показали более сильное ингибирование ферментов ALDH класса 1, чем DIMATE.

Пример 3: Кинетические параметры для соединений 3 и 5 в реакциях с человеческим рекомбинантным ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH2 или ALDH3A1

Материалы и методы

Кинетические данные выражены в виде среднего значения ± стандартная погрешность, для трех независимых экспериментов. K_inact/K_i определяли по графикам зависимости K_obs от концентрации ингибитора [I]. K_obs определяли по графикам зависимости концентрации продукта от времени инкубирования для ферментов с соединениями 3 и 5 или DIMATE в разных концентрациях (300 мкМ, 200 мкМ, 100 мкМ, 50 мкМ, 20 мкМ и 10 мкМ ингибиторов). K_obs были получены из экспоненциального приближения для отрицательного контроля с использованием программы для анализа методом нелинейной регрессии GraFit 5.0 (программа Erithacus).

Результаты

Полученные кинетические параметры приведены ниже в Таблице 5.

Таблица 5

СОЕДИНЕНИЕ ALDH1A1
K_inact/K_i
(M^-1 ·мин^-1) ALDH1A2
K_inact/K_i
(M^-1 ·мин^-1) ALDH1A3
K_inact/K_i
(M^-1 ·мин^-1) ALDH3A1
K_inact/K_i
(M^-1 ·мин^-1) ALDH2
K_inact/K_i
(M^-1 ·мин^-1) DIMATE (не является частью настоящего изобретения) 900 5 100 1 700 Ki =253 ± 48 мкМ 425 Соединение 3 500 100 000 38 500 Ki =233 ± 16 мкМ 540 Соединение 5 3 700 21 100 11 800 300 2450

Эффективность ингибирования у соединений 3 и 5 от 4 до 20 раз выше, чем у DIMATE, в отношении рекомбинантных ферментов ALDH класса 1, в частности ALDH1A2 и ALDH1A3.

Пример 4: Определение типа ингибирования после полной ферментативной и биохимической характеризации соединений 3 и 5

Материалы и методы

Для определения механизмов ингибирования протестированных соединений в отношении каждого изофермента, соответствующие K_obs были вычислены как описано выше, путем построения графика зависимости концентрации продукта от времени инкубирования ферментов с протестированными соединениями в концентрациях 300 мкМ, 200 мкМ, 100 мкМ, 50 мкМ, 20 мкМ и 10 мкМ. Значения k_obs были получены для каждой концентрации протестированного ингибитора из экспоненциального приближения для отрицательного контроля с использованием программы для анализа методом нелинейной регрессии GraFit 5.0 (программа Erithacus). Наконец, кинетический параметр k_inact/K_I определяли по графикам зависимости K_obs от соответствующей концентрации ингибитора. Угол наклона линейной кривой, построенной по полученным данным, отражал константу скорости в мкМ^-1·мин^-1. Основываясь на разных построенных графиках, необратимое ингибирование характеризовали как специфичное или неспецифичное аффинное мечение.

В случае специфичного аффинного мечения, график представляет собой диаграмму зависимости насыщающей k_obs от концентрации ингибитора (сходно с графиком обратимого ингибирования), выходя на плато при высоких концентрациях ингибитора. В случае неспецифичного аффинного мечения, зависимость k_obs от концентрации ингибитора является ненасыщающей.

В указанном эксперименте соединения 3 и 5 сравнивали с Dimate.

Результаты

Полученные результаты приведены ниже в Таблице 6

Таблица 6

СОЕДИ-НЕНИЕ ALDH1A1
Тип ингиби-
рования ALDH1A2
Тип ингиби-
рования ALDH1A3
Тип ингибирования ALDH3A1
Тип ингибирования ALDH2
Тип ингибирования DIMATE специфичное Неспецифичное аффинное мечение Неспецифичное аффинное мечение Неконкурентное Неспецифичное аффинное мечение Соеди-
нение 3 Неспецифичное аффинное мечение Неспецифичное аффинное мечение специфичное Неконкурентное Неспецифичное аффинное мечение Соеди-
нение 5 Неспецифичное аффинное мечение Неспецифичное аффинное мечение специфичное Неспецифичное аффинное мечение Неспецифичное аффинное мечение

Хотя все протестированные соединения показали необратимое ингибирование, тип инактивации, наблюдающийся для разных изоферментов, варьировался между специфичным и неспецифичным аффинным мечением. Следует отметить, что соединения 3 и 5 взаимодействуют с более высокой специфичностью с ALDH1A3, в то время как для DIMATE это ингибирование проходит по одностадийному механизму инактивации, как описано для неспецифичного аффинного мечения, необратимых ингибиторов.

Часть 3: Получение конъюгата антитело-препарат (ADC) по настоящему изобретению

КАП представляет собой трехкомпонентную систему, включающую цитотоксический агент, связанный через биоразлагаемый линкер с антителом. Антитело связывается со специфичными маркерами (антигены или рецепторы) на поверхности раковых клеток. Затем весь конъюгат антитело-препарат интернализуется в раковую клетку, где линкер разрушается, и высвобождается активный компонент.

В контексте настоящего изобретения, цитотоксический агент, соединение по настоящему изобретению, связывается с антителом через присоединяющую группу (малеимид, сукцинимидиловый эфир, специфичная пептидная последовательность, являющаяся субстратом для фермента, и т.д.), связанную с расщепляемым линкером (сайт протеазы, гидразин, дисульфид) или нерасщепляемым линкером и с саморасщепляющимся спейсером (или без него).

Синтез соединения по настоящему изобретению

См. часть 1 пример 29.

Конъюгирование с антителом ритуксимаб

Антитело ритуксимаб (Roche®) смешивали с DTT при 37°C на 30 минут и затем диафильтровали относительно PBS, содержащего 1 ммоль/л EDTA, используя Amicon Ultra-15, MWCO 30kDa, Merck-Millipore. Концентрацию тиола количественно оценивали реагентом Эллмана, 5,5’-дитио-бис(2-нитробензойной кислотой) [DTNB]. 50-кратный мольный избыток финального соединения 9, полученного в предыдущем абзаце, растворяли в ДМФА, добавляли к восстановленному антителу при 4°C на 1 час. Конъюгат антитело-препарат диафильтровали в PBSx1, используя Amicon Ultra-15, MWCO 30kDa, Merck-Millipore. Для определения соотношения препарат/антитело (СПА), с помощью реагента Эллмана количественно определяли концентрацию тиола в модифицированном антителе после сочетания.

Механизм высвобождения соединения по настоящему изобретению после расщепления катепсином изображен ниже на схеме:

Высвобождаемые фрагменты:

Часть 4: Применение КАП по настоящему изобретению

Определение соотношения препарат/антитело (СПА).

СПА для конъюгата антитело-препарат согласно части 3 контролировали по разнице между количественным анализом тиола реагентом Эллмана, после мягкого тиолирования ритуксимаба дитиотреитолом (DTT) и закрытия свободных тиольных групп путем сочетания с малеимидной группой. После тиолирования дитиотреитолом (DTT), 10 новых свободных тиольных групп образовывалось на молекуле ритуксимаба. После конъюгирования с финальным продуктом 9, все эти новые свободные тиольные группы были закрыты, что говорит о конъюгировании десяти соединений 9 на молекулу ритуксимаба.

Клеточная цитотоксичность для ритуксимаб-соединение 9.

50000 жизнеспособных клеток Raji высевали в трех повторностях. Затем добавляли ритуксимаб-соединение 9 или ритуксимаб в качестве контроля в виде серийных 1:2 разведений, создавая финальные концентрации (стартовые концентрации 50 мкг/мл). Клетки инкубировали 48 часов, после чего в каждую лунку добавляли 20 мкл аламарового синего (Thermo Fisher Scientific). Планшеты инкубировали еще 4 часа и считывали интенсивность флуоресценции на планшет-ридере при длине волны возбуждения 540 нм и длине волны излучения 620 нм.

Полученные результаты показывают, что жизнеспособность клеток Raji была существенно (Фиг. 1; p < 0.01; **) ниже при обработке дозой 500 мкг/мл ритуксимаб-соединение 9 в течение 48 часов, чем при обработке только ритуксимабом.

Настоящее изобретение относится к новому аминоэфирному соединению формулы (I) или к соединению, представляющему собой 2-[(1,1-диметил-4-метилсульфанил-4-оксо-бут-2-инил)метиламино]этилацетат, а также к их фармацевтически приемлемым солям, которые могут быть использованы в качестве лекарственного средства для лечения или предотвращения рака. В формуле (I) X представляет собой S; R1 представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил; R2 представляет собой CHR₅CHR₆OR₄ или (CHR₅)_vOR₄, выбран из интервала от 2 до 4; R₃ представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил, а R₄-R₆ имеют значения, указанные в формуле изобретения. Технический результат – получение молекул, которые индуцируют максимальный уровень апоптоза в опухолевой ткани и при этом повреждают здоровые ткани организма по возможности минимально и обратимым образом. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 табл., 33 пр.

(I)

1. Соединение формулы (I)

(I),

в котором:

- X представляет собой S;

- R1 представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил,

- R2 представляет собой CHR₅CHR₆OR₄ или (CHR₅)_vOR₄,

- v выбран из интервала от 2 до 4;

- R₃ представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил;

- R₄ выбран из H, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкила, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкенила, -CONR₇R₈, (C₆-C₁₄) арила, 5-14-членного гетероарила с по меньшей мере одним членом кольца, представляющим собой гетероатом, выбранный из O или N, (C₃-C₇)циклоалкила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-(C₆-C₁₄) арила и линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила, указанный гетероарил представляет собой 5-14-членный гетероарил с по меньшей мере одним членом кольца, представляющим собой гетероатом, выбранный из O или N;

где указанный арил, (C₃-C₇)циклоалкил и гетероарил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из галогена, линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, необязательно замещенного одним или больше атомами галогена, линейной или разветвленной (C₁-C₇)алкокси-группы, необязательно замещенной одним или больше атомами галогена, -COOH, (C₆-C₁₄) арила, -NRR’, -NO₂, или где указанный арил и гетероарил необязательно конденсирован с образованием 1,3-бензодиоксола;

- R₅ и R₆ выбраны из:

- H, или

- R₅ представляет собой H, и R1 и R₆ объединены с атомом азота, соединенным с R1, с образованием 3-14-членного гетероциклоалкила или

- R₆ представляет собой H, и R1 и R₅ объединены с R1 и вместе с атомом азота, соединенным с R1, образуют 3-14-членный гетероциклоалкил;

- R₇ представляет собой -(C₁-C₃)алкил;

- R₈ представляет собой -(C₁-C₃)алкилNRR’;

- R и R’ одинаковые или разные, независимо выбраны из H и линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила,

- или соединение представляет собой 2-[(1,1-диметил-4-метилсульфанил-4-оксо-бут-2-инил)метиламино]этилацетат;

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п. 1 в котором R3 представляет собой метил, R1 представляет собой метил, R2 представляет собой CHR₅CHR₆OR₄ или (CHR₅)_vOR₄, и R5 и R6 представляют собой:

- H, или

- R₅ представляет собой H, и R1 и R₆ объединены с атомом азота, связанным с R1, с образованием пирролидинила, или

- R₆ представляет собой H, и R1 и R₅ объединены с R1 и вместе с атомом азота, соединенным с R1, образуют пирролидинил.

3. Соединение по п. 1 или 2, в котором R₄ выбран из линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкила, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкенила, -CONR₇R₈, (C₃-C₇)циклоалкила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила, указанный гетероарил представляет собой 5-14-членный гетероарил с по меньшей мере одним членом кольца, представляющим собой гетероатом, выбранный из O или N, (C₆-C₁₄) арила или бензила; где указанный (C₃-C₇) циклоалкил замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C1-C₇)алкила, указанный бензил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, необязательно замещенного одним или больше атомами галогена, линейной или разветвленной (C₁-C₇)алкокси-группы, необязательно замещенной одним или больше атомами галогена, или указанный бензил необязательно сконденсирован с образованием 1,3-бензодиоксола.

4. Соединение по п. 1 или 2, в котором R₅ и R₆ представляют собой H, и R₄ выбран из линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкила, линейного или разветвленного (C₂-C₇)алкенила, -CONR₇R₈, (C₃-C₇)циклоалкила, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила, указанный гетероарил представляет собой 5-14-членный гетероарил с по меньшей мере одним членом кольца, представляющим собой гетероатом, выбранный из O или N, или бензила; где указанный (C₃-C₇)циклоалкил замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, указанный бензил необязательно замещен одним или больше заместителями, выбранными из линейного или разветвленного (C₁-C₇)алкила, необязательно замещенного одним или больше атомами галогена, линейной или разветвленной (C₁-C₇)алкокси-группы, необязательно замещенной одним или больше атомами галогена.

5. Соединение по п. 4, в котором R1 представляет собой метил, и R₄ выбран из -CONR₇R₈, где R₇ представляет собой метил, и R₈ представляет собой NRR’, где R и R’ представляют собой метил, этил.

6. Соединение по любому из пп. 1-5, выбранное из группы, состоящей из следующих соединений:

- S-метил 4-[2-этоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-[2-аллилоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-[2-бензилоксиэтил(метил)амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(м-толилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат;

- S-метил 4-[2-[(3,4-диметилфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-[2-[(4-метоксифенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-[2-[(3,4-диметоксифенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-[2-[(3-хлорфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-[2-[(3-фторфенил)метокси]этил-метил-амино]-4-метил-пент-2-интиоат;

- S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(2-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат;

- S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(3-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат;

- S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(4-пиридилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат;

- S-метил 4-((4-(бензилокси)бутил)(метил)амино)-4-метилпент-2-интиоат;

- S-метил 4-((2-гидроксиэтил)(метил)амино)-4-метилпент-2-интиоат;

- S-метил 4-метил-4-[метил-[2-(2-нафтилметокси)этил]амино]пент-2-интиоат;

- S-метил 4-метил-4-[метил-[2-[(2,6,6-триметилциклогексен-1-ил)метокси]этил] амино]пент-2-интиоат;

- 2-[(1,1-диметил-4-метилсульфанил-4-оксо-бут-2-инил)-метиламино]этил-3,4-диметоксибензоат;

- 2[(1,1-диметил-4-метилсульфанил-4-оксо-бут-2-инил)-метиламино]этил ацетат;

- S-метил 2,5,10,11,11-пентаметил-6-оксо-7-окса-2,5,10-триазатетрадец-12-ин-14-тиоат;

- S-метил 4-[2-(метоксиметил)пирролидин-1-ил]-4-метилпент-2-интиоат;

- S-метил 4-(3-метоксипирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоат;

- S-метил 4-метил-4-[метил(2-феноксициклопентил)амино]пент-2-интиоат;

- (S)-S-метил 4-(2-((бензилокси)метил)пирролидин-1-ил)-4-метилпент-2-интиоат;

- S-метил 4-[3(бензилокси)-1пирролидинил])-4-метилпент-2-интиоат,

или его фармацевтически приемлемой соли.

7. Соединение по п. 1, в котором:

- X представляет собой S;

- R1 представляет собой линейный или разветвленный (C₁-C₇)алкил;

- R2 представляет собой CHR₅CHR₆OR₄ или (CHR₅)_vOR₄;

- R4 выбран из H, (C₆-C₁₄) арила, 5-14-членного гетероарила с по меньшей мере одним членом кольца, представляющим собой гетероатом, выбранный из O или N, линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-(C₆-C₁₄)арила и линейного или разветвленного -(C₁-C₇)алкил-гетероарила, указанный гетероарил представляет собой 5-14-членный гетероарил с по меньшей мере одним членом кольца, представляющим собой гетероатом, выбранный из O или N;

где указанный арил и гетероарил необязательно замещены одним или больше заместителями, выбранными из -COOH, -NRR’ и -NO₂; и

- R и R’ одинаковые и представляют собой H.

8. Способ получения соединения по любому из пп. 1-7, включающий:

- реакцию соединения формулы (II) с органической или неорганической кислотой

(II)

- реакцию соединения, полученного на стадии a), с основанием;

- реакцию соединения, полученного на стадии b), с CO₂;

- реакцию соединения, полученного на стадии c), с алкил хлорформиатом, с реагентом, способным формировать с соединением, полученным на стадии c), ацилгалогенид, или с реагентом, способным формировать с соединением, полученным на стадии c), смешанный ангидрид;

- реакцию соединения, полученного на стадии d), с соединением-прекурсором аниона SMe^-;

где R1 и R2 имеют значения, указанные в пп. 1-7.

9. Фармацевтическая композиция, предназначенная для применения для лечения и/или профилактики рака, содержащая эффективное количество соединения по любому из пп. 1-7 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

10. Соединение по любому из пп. 1-7 для применения в качестве лекарственного средства.

11. Соединение по любому из пп. 1-7 для применения для предотвращения или лечения рака, в частности лейкоза.

12. Конъюгат антитело-препарат формулы B-L-Ab, где

- B представляет собой соединение формулы (I) по п. 7;

- L представляет собой химический фрагмент, содержащий ковалентную связь или цепочку атомов, которая ковалентно связывает Ab и соединение формулы (I); и

- Ab представляет собой антитело, выбранное из ритуксимаба, трастузумаба, алемтузумаба, ибритумомаба, гемтузумаба, тиуксетана, тозитумомаба, бревацизумаба, цетуксимаба, панитумумаба, офатумумаба и обинутузумаба.