Перекрестная ссылка на родственные заявки
[0001] В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США №62/895230, поданной 3 сентября 2019 г., и предварительной заявки на патент США №62/983862, поданной 2 марта 2020 г., и содержание каждой из них в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки.
Ссылка на список последовательностей
[0002] Настоящая заявка подана вместе со списком последовательностей, представленным в электронном формате. Файл списка последовательностей под названием 2089_1006PCT_SL.txt был создан 3 сентября 2020 г. и имеет размер 18341 байт. Информация, поданная в Списке последовательностей в электронном формате, в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки.
Область изобретения
[0003] Настоящее изобретение относится к композициям и способам ферментной терапии для лечения гомоцистинурии и для лечения состояний, ассоциированных с повышенными уровнями гомоцистеина, с использованием описанного здесь лекарственного препарата.
Предпосылки создания изобретения
[0004] Классическая гомоцистинурия, обозначаемая здесь как HCU или HCU типа 1, а также известная как гомоцистинурия с дефицитом цистатионин-β-синтазы (CBSDH), представляет собой редкое заболевание, поражающее как детей, так и взрослых. HCU представляет собой редкое аутосомно-рецессивное метаболическое заболевание, характеризующееся избытком соединения гомоцистеина (Hcy) в моче, в тканях и в плазме из-за снижения или отсутствия активности фермента цистатионин-β-синтазы (CBS) (см. публикации Kraus et al., In: Carmel R, Jacobsen DW, eds. Homocysteine in Health and Disease. Cambridge, United Kingdom: Cambridge University Press; 2001:223-243; Sacharow et al., Homocystinuria Caused by Cystathionine Beta-Synthase Deficiency. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, Wallace SE, Bean LJH, Mefford HC, et al, eds. GeneReviewsTM [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle, 2017; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0005] Диагноз HCU может быть подтвержден путем молекулярно-генетического тестирования гена CBS, как описано Sacharow и др. CBS представляет собой фермент, участвующий в метаболизме серусодержащей аминокислоты метионина (Met), которая присутствует в белках пищевых продуктов (см. публикациию Maclean et al. J Biol Chem. 2012; 287(38):31994-32005, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0006] Подозрение на HCU может быть основано: 1) на клинических признаках, включая эктопию хрусталика (смещение хрусталика глаза) и/или тяжелую миопию, астеническое телосложение (высокий рост и худобу), скелетные патологии, остеопороз с ранним началом развития и/или тромбоэмболии, необъяснимую задержку развития/умственную отсталость; 2) на обследовании новорожденных на гиперметионинемию или, в частности, на дефицит CBS в семейном анамнезе с положительным результатом, позволяющем выявить пациента еще до развития у него симптомов и 3) на семейном анамнезе. Все эти клинические признаки и возраст, в котором появляются симптомы у пациентов, значительно различаются. Существующие подходы к обследованию обычно не позволяют выявить новорожденных с менее тяжелым дефицитом CBS, и выявляют лишь небольшую часть пациентов с более тяжелой HCU (см. публикации Huemer et al. J Inherit Metab Dis. 2015 Nov; 38(6):1007-19; Yap, Orphanet Encyclopedia [online serial]. 2005, pages 1-13; Schiff et al. Neuropediatrics. 2012 Dec;43(6):295-304, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0007] Помимо гомоцистинурии (то есть, диагностированной или генетически наследуемой HCU), повышенный уровень общего гомоцистеина в плазме был ассоциирован с повышенным риском остеопороза и/или перелома костей (см. van Meurs et al. N Engl J Med 2004; 350:2033-2041). Кроме того, повышенный уровень tHcy является «модифицируемым фактором риска снижения когнитивных функций, развития деменции и болезни Альцгеймера» (Smith, A. David, et al. «Homocysteine and dementia: an international consensus statement» Journal of Alzheimer's Disease 62.2 (2018): 561-570).
[0008] Таким образом, в настоящее время существует потребность в разработке способов выявления, стратификации и лечения индивидуумов с дефицитом CBS и/или повышенными уровнями tHcy, у которых не была диагностирована HCU или не была выявлена ее генетическая предрасположенность.
Сущность изобретения
[0009] Настоящее изобретение относится к способам улучшения когнитивной функции у индивидуума, имеющего повышенный уровень общего гомоцистеина в плазме (tHcy), где указанные способы включают введение индивидууму терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей: лекарственное вещество, содержащее выделенный белок цистатионин-β-синтазы (CBS), включающий SEQ ID NO: 1; молекулу ПЭГ, ковалентно связанную с белком CBS; и фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или адъювант.
[0010] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способы улучшения когнитивной функции у индивидуума с повышенными уровнями общего гомоцистеина в плазме (tHcy) дополнительно включают лечение когнитивных или поведенческих расстройств.
[0011] В некоторых вариантах осуществления изобретения, лечение когнитивных или поведенческих расстройств включает тренинг родителей по обучению поведению детей (BPT) или контроль за поведением в классе (BCM).
[0012] Настоящее изобретение также относится к способам снижения хрупкости скелета у индивидуума с повышенными уровнями общего гомоцистеина в плазме (tHcy), где указанный способ включают введение индивидууму терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей: лекарственное вещество, содержащее выделенный белок цистатионин-β-синтазы (CBS), содержащий SEQ ID NO: 1; молекулу ПЭГ, ковалентно связанную с белком CBS; и фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или адъювант.
[0013] В некоторых вариантах осуществления изобретения, хрупкость скелета индивидуума оценивают по минеральной плотности костей.
[0014] В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула ПЭГ, ковалентно связанная с белком CBS, представляет собой ME-200GS.
[0015] В некоторых вариантах осуществления изобретения, терапевтически эффективное количество включает дозу от приблизительно 0,25 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг лекарственного вещества. В некоторых вариантах осуществления изобретения, терапевтически эффективное количество включает дозу от приблизительно 0,25 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг лекарственного вещества, вводимую два раза в день.
[0016] В некоторых вариантах осуществления изобретения, доза составляет приблизительно 0,33 мг/кг лекарственного вещества. В некоторых вариантах осуществления изобретения, доза составляет приблизительно 0,33 мг/кг лекарственного вещества, вводимого два раза в день.
[0017] В некоторых вариантах осуществления изобретения, доза составляет приблизительно 0,66 мг/кг лекарственного вещества. В некоторых вариантах осуществления изобретения, доза составляет приблизительно 0,66 мг/кг лекарственного вещества, вводимого два раза в день.
[0018] В некоторых вариантах осуществления изобретения, доза составляет приблизительно 1,0 мг/кг лекарственного вещества. В некоторых вариантах осуществления изобретения, доза составляет приблизительно 1,0 мг/кг лекарственного вещества, вводимого два раза в день.
[0019] В некоторых вариантах осуществления изобретения, доза составляет приблизительно 1,5 мг/кг лекарственного вещества. В некоторых вариантах осуществления изобретения, доза составляет приблизительно 1,5 мг/кг лекарственного вещества, вводимого два раза в день.
[0020] В некоторых вариантах осуществления изобретения, доза вводится самим пациентом.
[0021] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способы дополнительно включают введение индивидууму одного или более из витамина B6 и бетаина.
[0022] В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуум находится на диете с ограничением метионина (Met).
[0023] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способы дополнительно включают прекращение или ограничение потребления пищи с ограниченным содержанием метионина. Так, например, после введения фармацевтически эффективного количества лекарственного средства, описанного в настоящей заявке, индивидууму может быть отменена диета с ограничением метионина или он может перейти на более мягкую диету с ограничением метионина.
[0024] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способы дополнительно включают введение антитромбоцитарного агента.
[0025] В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитромбоцитарный агент представляет собой агент, снижающий уровень варфарина в крови, или антикоагулянт.
[0026] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции осуществляют приблизительно один раз через каждые 3 дня.
[0027] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции осуществляют приблизительно один раз в 2 дня. В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции осуществляют приблизительно один раз в день.
[0028] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции осуществляют приблизительно два раза в день.
[0029] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции осуществляют приблизительно один раз в неделю.
[0030] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции осуществляют приблизительно два раза в неделю.
[0031] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции повторяют в течение приблизительно 6 недель.
[0032] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции повторяют в течение приблизительно 3 месяцев.
[0033] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции повторяют в течение приблизительно 6 месяцев.
[0034] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции повторяют в течение более 6 месяцев.
[0035] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции повторяют в течение всей жизни индивидуума.
[0036] В некоторых вариантах осуществления изобретения, повышенные уровни общего гомоцистеина в плазме (tHcy) у индивидуума включают уровни tHcy выше приблизительно 5 мкмоль/л.
[0037] В некоторых вариантах осуществления изобретения, повышенные уровни общего гомоцистеина в плазме (tHcy) у индивидуума включают уровни tHcy выше приблизительно 10 мкмоль/л.
[0038] В некоторых вариантах осуществления изобретения, повышенные уровни общего гомоцистеина в плазме (tHcy) у индивидуума включают уровни tHcy выше приблизительно 15 мкмоль/л.
[0039] В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуумом с повышенными уровнями общего гомоцистеина в плазме (tHcy) является пациент с генетически наследуемой HCU.
[0040] В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуумом с повышенными уровнями общего гомоцистеина в плазме (tHcy) является пациент с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy или дефицитом CBS.
[0041] Настоящее изобретение также относится к способам лечения дефицита CBS у индивидуума, включающим: определение уровня метаболического показателя тяжести заболевания или прогрессирования заболевания у индивидуума и введение индивидууму терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей: (i) лекарственное вещество, содержащее выделенный белок цистатионин-β-синтазы (CBS), содержащий SEQ ID NO: 1; (ii) молекулу ПЭГ, ковалентно связанную с белком CBS; и (iii) фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или адъювант, где индивидуумом является пациент с генетически наследуемой HCU или с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy или дефицитом CBS, и где терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции включает дозу лекарственного вещества, скорректированную в соответствии с уровнем метаболического показателя тяжести заболевания или прогрессирования заболевания у индивидуума.
[0042] В некоторых вариантах осуществления изобретения, определение уровня метаболического показателя тяжести заболевания или прогрессирования заболевания у индивидуума включает взятия пробы крови или плазмы у индивидуума, оценку уровня одного или более метаболических показателей тяжести заболевания или прогрессирования заболевания в указанной пробе, и сравнение уровня одного или более метаболических показателей тяжести заболевания или прогрессирования заболевания с уровнем метаболического показателя в контрольной пробе, взятой у здорового индивидуума.
[0043] В некоторых вариантах осуществления изобретения, доза лекарственного вещества, скорректированная в соответствии с уровнем метаболического показателя тяжести заболевания или прогрессирования заболевания у индивидуума, включает низкую дозу, среднюю дозу или высокую дозу 20NHS PEG-CBS.
[0044] В некоторых вариантах осуществления изобретения, низкая доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 0,25 мг/кг до приблизительно 1,0 мг/кг 20NHS PEG-CBS и вводится один или два раза в день.
[0045] В некоторых вариантах осуществления изобретения, средняя доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 1,5 мг/кг 20NHS PEG-CBS и вводится один или два раза в день.
[0046] В некоторых вариантах осуществления изобретения, высокая доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 2 мг/кг 20NHS PEG-CBS и вводится один или два раза в день.
[0047] В некоторых вариантах осуществления изобретения, высокая доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 2 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг 20NHS PEG-CBS и вводится один или два раза в день.
[0048] В некоторых вариантах осуществления изобретения, метаболическим показателем тяжести или прогрессирования заболевания является общий гомоцистеин (tHcy), метионин, креатинин, С-реактивный белок, диметилглицин, аланинаминотрансфераза, белок С, аспартатаминотрансфераза (АСТ), антитромбин III и/или аполипопротеин А.
[0049] В некоторых вариантах осуществления изобретения, метаболическим индикатором тяжести или прогрессирования заболевания является tHcy, и дозу 20NHS PEG-CBS вводят индивидууму, имеющему tHcy на уровне несколько выше низкого, среднего или высокого.
[0050] Настоящее изобретение также относится к способам лечения индивидуума, страдающего гомоцистинурией, или с подозрением на гомоцистинурию, где указанные способы включают: оценку уровня одного или более из креатинина, высокочувствительного С-реактивного белка, фибриногена или уровня активности белка С у индивидуума; сравнение одного или более уровней с известным диапазоном значений для одного или более уровней у группы индивидуумов, которые, как известно, не страдают гомоцистинурией, или у группы индивидуумов, которые страдают гомоцистинурией, или у тех и других; оценку прогрессирования заболевания или тяжести заболевания у индивидуума в соответствии с одним или несколькими уровнями, оцененными у индивидуума; корректировку дозы при ферментной терапии для индивидуума в соответствии с прогрессированием заболевания или тяжестью заболевания; и проведение ферментной терапии индивидууму. В этих способах, проведение ферментной терапии включает введение лекарственного вещества, содержащего выделенный белок цистатионин-β-синтазы (CBS), включающий SEQ ID NO: 1 или состоящий из SEQ ID NO: 1, где указанный белок CBS имеет молекулу ПЭГ, ковалентно связанную с белком CBS.
Краткое описание чертежей
[0051] Вышеупомянутые и другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из нижеследующего описания конкретных вариантов его осуществления, как показано на прилагаемых чертежах. Чертежи не обязательно должны быть масштабированы, и вместо этого акцент делается на иллюстрацию принципов различных вариантов осуществления изобретения.
[0052] На фиг. 1 представлена диаграмма, на которой указано количество пациентов с высокими, нормальными или низкими лабораторными значениями определенных биологических маркеров, протестированных при исследовании патогенеза у пациентов с HCU. На фиг. 1, ALT-SGPT=аланинаминотрансфераза - сывороточная трансаминаза глутаминовой кислоты-пировиноградной кислоты; AST-SGOT=аспартатаминотрансфераза - сывороточная трансаминаза глутаминовой кислоты - щпвелевоуксусной кислоты; DMG=диметилглицин; hsCRP=«высокочувствительный» С-реактивный белок; P1NP=N-концевой пропептид проколлагена типа 1.
[0053] На фиг. 2 показаны корреляции уровней tHcy в плазме ≤100 мкМ и>100 мкМ в случае хрупкости скелета.
[0054] На фиг. 3 показаны медианные и квартильные баллы NIH Toolbox для протестированных когнитивных функций. Прямоугольники на графиках Toolbox охватывают данные от 25-го до 75-го процентиля, а медианное значение представлено в виде горизонтальной линии в прямоугольнике. «Бахрома» представляет минимальные и максимальные значения. Составной анализ «кристаллизованного интеллекта»=область познания, отражающая познавательную способность в прошлом и знания. Составной анализ «подвижного интеллекта»=область познания, отражающая способность к обучению, к решению новых задач и память.
[0055] Фиг. 4 показано влияние уровней tHcy на когнитивную функцию.
Подробное описание изобретения
I. Введение
[0056] Гомоцистинурия с дефицитом цистатионин-бета-синтазы (HCU) характеризуется повышенными уровнями гомоцистеина в плазме (Hcy) вместе с высокими уровнями Met и пониженной концентрацией цистеина (Cys) (см. публикации Yap S. Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. Orphanet Encyclopaedia [serial online] 2005; Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017;40:49-74; NORD, Kraus JP. Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. NORD [serial online] 2017; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). На сегодняшний день идентифицировано более 180 различных мутаций гена CBS, связанных с HCU (см. Базу данных мутаций генома человека. 2017. Тип документа: Интернет-источник. Доступен на сайте hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php, который в полном объеме включен в настоящее описание посредством ссылки). Гомоцистеин (Hcy) представляет собой природную аминокислоту, которая вместе с серином служит субстратом для фермента CBS. CBS регулирует однонаправленный поток серы от метионина (Met) к цистеину (Cys), действуя на пересечении путей трансметилирования, транссульфирования и реметилирования (см. публикацию Maclean et al. J Biol Chem. 2012;287(38):31994-32005, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Нативный CBS активируется посредством связывания аллостерического активатора S-аденозилметионина (SAM) и катализирует реакцию β-замещения, в которой серин конденсируется с Hcy по механизму, зависимому от пиридоксаль-5'-фосфата (пиридоксина или витамина B6) с образованием цистатионина (Cth). Цистатионин-γ-лиаза (CGL), действующая ниже CBS, использует Cth в качестве субстрата для образования Cys. Таким образом, правильная функция CBS имеет важнное значение для регуляции метаболизма Hcy, Met и Cys.
[0057] Нормальные уровни общего гомоцистеина (tHcy) варьируются в зависимости от возраста, пола и режима питания, но обычно находятся в диапазоне от 4,5 до 11 мкмоль/л (см. документ Quest Diagnostics Reference Range; questdiagnostics.com, который в полном объеме включен в настоящее описание посредством ссылки). Мужчины, как правило, имеют немного (на 1-2 мкмоль/л) более высокие уровни tHcy, чем женщины, и у пациентов с детства и до 80 лет наблюдается приблизительно удвоение средних значений (см. публикацию Refsum et al. Clin Chem 2004; 50:3-32, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). У групп, которым вводили фолат, верхний предел (97,5%) уровней tHcy составляет приблизительно 12 мкмоль/л у взрослых<65 лет и 16 мкмоль/л у взрослых старше 65 лет.Многие пациенты с HCU имеют тяжелую гипергомоцистеинемию с общим уровнем tHcy более 100 мкмоль/л, в то время как у других наблюдается повышение в диапазоне от невысокого до в несколько раз выше нормы (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017;40:49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Было обнаружено, что уровни tHcy в высокой степени коррелируют с тяжестью заболевания (см. публикацию Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21:738-747, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0058] Тяжесть и проявления признаков и симптомов HCU сильно различаются у разных пациентов (см. публикации Karaca et al. Gene 2014; 534:197-203; Trondle et al. Acta Med Austriaca 2001; 28:145-151; Kluijtmans et al. Am J Hum. Genet 1999; 65:59-67; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). У многих пациентов наблюдается тяжелая гипергомоцистеинемия с уровнями общего гомоцистеина (tHcy) выше 100 мкмоль/л, в то время как у других наблюдается повышение уровня tHcy в диапазоне от низкого до в нескольких раз выше нормы (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74), которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Значительно повышенные уровни tHcy обычно коррелируют с более тяжелым течением заболевания, тогда как более низкие уровни обычно коррелируют с более легкой формой заболевания.
[0059] HCU обычно классифицируют в зависимости от реакции индивидуума на лечение, направленное на снижение уровня общего гомоцистеина (tHcy), с использованием пиридоксина (витамина B6), кофактора фермента CBS, необходимого для нормального функционирования CBS (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37: 1-31; Abbott et al., Am J Med Genet 1987;26:959-969, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). В целом, пациенты, которые реагируют на пиридоксин, имеют более низкие уровни tHcy, что приводит к более легкой форме расстройства. У этих пациентов в более позднем возрасте может появиться только один или несколько симптомов HCU, и многие из них остаются недиагностированными. Следовательно, считается, что пациенты, которые хорошо реагируют на пиридоксин, недостаточно представлены в большинстве исследований.
[0060] Ретроспективные исследования показали, что пациенты с самыми высокими уровнями tHcy (прошедшие или не прошедшие леченные) имеют более тяжелые симптомы и в более раннем возрасте (см. публикации Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21:738-747; Mudd et al. Am J Hum Genet. 1985; 37:1-31, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). У не прошедших лечение индивидуумов с повышенными уровнями tHcy обычно наблюдаются задержка развития, тромбоэмболия, тяжелая миопия с последующим вывихом хрусталика, переломы по типу остеопороза, марфаноподобное телосложение (в частности, удлинение длинных костей) и психические расстройства, включая трудности в обучении (см. публикации Yap S. Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. Orphanet Encyclopaedia [serial online] 2005; Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017;40:49-74; NORD, Kraus JP. Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. NORD [serial online] 2017; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Некоторые пациенты с повышенным уровнем tHcy имеют тяжелое мультисистемное заболевание с началом развития в детском возрасте. В отсутствии лечения, ожидаемая продолжительность жизни у более тяжелых пациентов заметно снижается (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0061] Происходящие от Hcy соединения, обозначаемые как tHcy, состоят из свободного тиол-гомоцистеина (Hcy-SH или fHcy), дисульфидов (таких как гомоцистеин-цистеин и гомоцистеин) и гомоцистеина, связанного с белком (см. публикации Ueland; Nord Med 1989; 104:293-298); Mudd et al. N Engl J Med 1995; 333:325; Mudd et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000; 20:1704-1706, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Различие между сульфгидрильной формой (гомоцистеин; Hcy) и дисульфидной формой (гомоцистеин) (см. публикацию Yap S. Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. Orphanet Encyclopaedia [serial online] 2005; которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) имеет важное значение, поскольку многие патофизиологические эффекты зависят от присутствия сульфгидрильной группы в Hcy (см. публикации Yap S. Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. Orphanet Encyclopaedia [serial online] 2005; Ueland et al. Nord Med 1989; 104: 293-298; Mudd et al., N Engl J Med 1995; 333:325, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0062] CBS в основном экспрессируется в печени, в поджелудочной железе, в почках и головном мозге (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Каталитический домен связывается с пиридоксаль-5'-фосфатом (кофактором, также известным как пиридоксин или витамин B6), а регуляторный домен связывается с SAM (аллостерическим активатором).
[0063] Недостаточные уровни ферментативной активности CBS блокируют путь транссульфирования на первой стадии, что приводит к накоплению Hcy, повышению уровней SAH и Met и снижению уровней Cth и Cys. Клинические данные о нарушении регуляции метаболитов Met, рассмотренные в настоящей заявке, продемонстрировали, что повышенный уровень Hcy (чаще всего измеряемый клинически как tHcy в плазме) наиболее сильно влияет на патофизиологию HCU.
[0064] Уровни Hcy выше нормы модифицируют сульфгидрильные группы белков, что препятствует правильному сшиванию белков и приводит к структурным аномалиям во многих системах организма. Повышенные уровни Hcy также нарушают внутриклеточную передачу сигналов, что приводит к эндотелиальной дисфункции и, в конечном счете, к тромбоэмболии и к сосудистым заболеваниям. При HCU, накопление Hcy приводит к развитию глазных, скелетных, сосудистых и психических заболеваний.
[0065] Диагноз HCU иногда подтверждается молекулярно-генетическим тестированием гена CBS (см. публикации Sacharow et al. Homocystinuria Caused by Cystathionine Beta-Synthase Deficiency. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, Wallace SE, Bean LJH, Mefford HC, et al, editors. GeneReviewsTM [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2017, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки). Существующие подходы к скринингу обычно не позволяют выявить новорожденных с менее тяжелым дефицитом CBS и выявляют лишь небольшую часть пациентов с более тяжелой HCU (см. Huemer et al. J Inherit Metab Dis. 2015 Nov;38(6):1007-19; Yap, Orphanet Encyclopedia [online serial]. 2005, pages 1-13; Schiff et al. Neuropediatrics. 2012 Dec;43(6):295-304).
[0066] Критерием выбора для определения уровней Hcy в клинических образцах является tHcy, который включает свободный Hcy, а также Hcy, связанный с белком или присутствующий в форме дисульфидов. Нормальные уровни tHcy варьируются в зависимости от возраста, пола и режима питания, но обычно составляют от 4,5 до 11 мкМ (исходный диапазон QUEST DIAGNOSTICS™). У многих пациентов с HCU наблюдается тяжелая гипергомоцистинурия с общим уровнем tHcy выше 100 мкМ, в то время как у других наблюдается повышение уровней от небольшого до уровня, превышающего норму в несколько раз (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Jan;40(1):49-74, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки). Уровни tHcy сильно коррелируют с тяжестью заболевания (см. Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21: 738-47).
[0067] Исследования показали, что снижение уровней Hcy у пациентов с HCU коррелирует с менее тяжелыми проявлениями клинических симптомов (см. публикации Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21: 738-47; Yap et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2001). Dec; 21(12):2080-5; которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Пути, посредством которых уровни гомоцистеина вызывают повреждение этих систем, подробно описаны в литературе (см. публикации Ajith et al. Clin Chim Acta 2015;450:316-321; Behera et al. J Cell Physiol 99999:1-6, 2016; Saha et al. FASEB J 2016;30:441-456; которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки) и положили начало проведению исследований относительно роли Hcy у большой группы индивидуумов, которые выявили значительную патогенную роль Hcy в заболевании.
[0068] Одной из целей лечения с использованием описаннго здесь лекарственного препарата является повышение активности фермента CBS в кровотоке, что приводит к улучшению метаболического контроля, и тем самым, к уменьшению клинических проявлений заболеваний и замедлению или предотвращению их дальнейшего прогрессирования. Высокомолекулярные соединения, такие как ферменты, обладают ограниченной способностью проникать в ткани, а поэтому в основном присутствуют в плазме. Эти белки обычно сохраняются в кровотоке в течение короткого периода времени, поскольку они удаляются из кровотока по нескольким механизмам (см. публикацию Vugmeyster et al. World J Biol Chem. 2012;3(4):73-92, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В идеале, введенный CBS должен поддерживать высокую активность в плазме в течение периода времени, достаточного для достижения устойчивого влияния на метаболизм серусодержащих аминокислот.Эта цель может быть достигнута посредством ПЭГилирования, то есть, присоединения фрагментов ПЭГ к поверхности белка. ПЭГилирование белков представляет собой широко распространенную стратегию, которая, как было показано, сводит к минимуму протеолиз, иммунный ответ и антигенность, и одновременно повышает стабильность и размер белка и уменьшает почечную экскрецию (см. публикацию Kang et al. 2009;14(2):363-380, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Лекарственный препарат, описанный в настоящей заявке, представляет собой ПЭГилированный фермент htCBS C15S, полученный для введения индивидууму и предназначенный для длительного системного воздействия.
A. Клинические проявления гомоцистинурии
[0069] Имеются убедительные доказательства, указывающие на причинный эффект повышенных уровней tHcy и на негативные клинические исходы в четырех системах, обычно поражаемых у пациентов с HCU (то есть, в глазах, в скелете, в сердечно-сосудистой системе и нервной системе). Эти данные дополнительно пополняются исследованиями большой группы индивидуумов, демонстрирующими значительную взаимосвязь между умеренно повышенными уровнями tHcy и неблагоприятным исходом.
1. Глаза
[0070] Патологии, поражающие глаза, могут быть ранним клиническим признаком HCU. У многих людей развивается смещение хрусталика глаза от центра глазного яблока (эктопия хрусталика). У больных также обычно развивается тяжелая миопия (близорукость или миопия) и иридодонез (дрожание радужки глаза). Эктопия хрусталика и миопия обычно развиваются после первого года жизни и до десяти лет, обычно у индивидуумов, не проходивших лечение (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37: 1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Другие патологии глаз, которые встречаются реже, включают катаракту, дегенерацию зрительного нерва и глаукому. У некоторых людей может быть отслоение сетчатки, что может вызвать нечеткость зрения или появление «мушек» в поле зрения (см. публикацию Burke et al. Br J Ophthalmol, 1989; 73(6): 427-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0071] Повышенные уровни Hcy являются важным и независимым фактором риска развития глазных осложнений, а в частности, вывиха хрусталика, у пациентов с HCU и у большой группы населения (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37: 1-31; Ajith et al. Clin Chim Acta 2015;450:316-321; Mulvihill et al. J AAPOS 2001;5:311-315, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Даже при назначении фармакологических средств и диеты у большинства пациентов с HCU в конечном итоге возникают глазные осложнения. Наблюдалось, что снижение уровней Hcy задерживает и, возможно, предотвращает вывих хрусталика у пациентов с HCU (см. публикацию Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21: 738-47, которая в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки).
2. Центральная нервная система
[0072] Задержка в развитии и проблемы с обучением, такие как когнитивные симптомы, также могут быть ранними признаками HCU, возникающими в возрасте от одного до трех лет (см. публикации Screening, Technology and Research in Genetics (STAR-G) Project. 2016. Homocystinuria. Available at newbornscreening.info; National Institutes of Health (NIH), US National Library of Medicine, Genetics Home Reference. Homocystinuria. 2016. ghr.nlm.nih.gov; которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Сообщалось, что коэффициент интеллекта (IQ) у людей с HCU колеблется от 10 до 138. Пациенты с самым высоким уровнем tHcy с большей вероятностью будут иметь более низкий IQ (со средним значением IQ 57 при отсутствии лечения) по сравнению с менее тяжелыми пациентами (со средним IQ 79) (см. публикацию Sacharow et al., Homocystinuria Caused by Cystathionine Beta-Synthase Deficiency. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, Wallace SE, Bean LJH, Mefford HC, et al, editors. GeneReviewsTM [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2017, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0073] Приступы возникают приблизительно у 20% не прошедших лечение пациентов с HCU (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37: 1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Многие люди страдают психическими расстройствами, включая расстройство личности, тревогу, депрессию, синдром навязчивых состояний и приступы психоза (см. Sacharow et al. 2017). Также могут возникать экстрапирамидные признаки, такие как дистония (см. публикацию Screening, Technology and Research in Genetics (STAR-G) Project. 2016. Homocystinuria. Available at newbornscreening.info, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0074] Исследования показали, что раннее снижение уровней Hcy, вызванное диетой с низким содержанием Met, приемом фолиевой кислоты/витамина B и/или терапией пиридоксином и бетаином, может задержать, а иногда предотвратить или обратить вспять прогрессирование различных нервных расстройств и обеспечить нормальный IQ у пациентов с HCU (см. публикации El Bashir et al. JIMD Rep 2015; 21:89-95; Yap et al. J Inherit Metab Dis 2001; 24:437-447; которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Связь между повышенным уровнем Hcy и симптомами центральной нервной системы (ЦНС), включая когнитивные симптомы, нейродегенеративные заболевания, эпилептические припадки, дистонию, психоз, когнитивные нарушения, деменцию и депрессию, хорошо задокументирована у пациентов с HCU и среди населения в целом (см. публикации Abbott et al. Am J Med Genet 1987;26:959-969;Shimke et al.JAMA 1965;193:711-719; Herrmann et al.Clin Chem Lab Med 2011;49:435-441; которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки).
3. Система скелета
[0075] У людей с HCU часто развиваются различные скелетные патологии. Люди с такими патологиями часто бывают высокими и худыми с «марфаноподобным» телосложением, которое характеризуется истончением и удлинением длинных костей (долихостеномелией), и при котором: колени согнуты внутрь, так что при выпрямлении ног они соприкасаются («вывернутые колени» или genu valgum), стопа сильно изогнута (pes cavus), наблюдается аномальное боковое искривление позвоночника (сколиоз), аномально выпирающая грудная клетка (pectus carinatum) или аномально впалая грудная клетка (pectus excavatum). К подростковому возрасту, у 50% людей проявляются признаки остеопороза (см. публикацию Screening, Technology and Research in Genetics (STAR-G) Project. 2016. Homocystinuria, доступную на сайте newbornscreening.info, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). HCU ассоциируется с повышенным риском переломов при остеопорозе, что частично может быть связано с низкой минеральной плотностью кости (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37: 1-31; Weber et al. Mol Genet Metab 2016; 117:351-354; которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки).
[0076] В исследовании, в котором принимали участие 25 ирландских пациентов с HCU, наблюдаемых в течение 25 лет, было обнаружено, что риск скелетных аномалий был значительно ниже у пациентов с надлежащим соблюдением режима лечения, снижающего уровень Hcy, по сравнению с пациентами, не соблюдающими такой режим (см. публикацию Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21:738-47, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
4. Сердечно-сосудистая система
[0077] Взаимосвязь между HCU и сосудистым заболеванием была впервые продемонстрирована в 1985 г. в эпидемиологическом исследовании у пациентов с умеренными или сильно повышенными уровнями Hcy вследствие гомозиготной HCU (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37: 1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Тромбоэмболия является наиболее серьезным, часто опасным для жизни осложнением HCU и может поражать любой сосуд. Она является основной причиной заболеваемости и ранней смерти пациентов с HCU (см. публикацию Yap et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2001 Dec; 21(12):2080-5, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0078] Риск тромбоэмболических осложнений составлял приблизительно 25% в возрасте 16 лет и 50% в возрасте 29 лет.В нескольких сообщениях упоминается, что лечение, снижающее уровень tHcy, значительно снижает частоту сосудистых осложнений, являющихся основной причиной заболеваемости у пациентов с HCU (см. публикации Wilcken et al. J Inherit Metab Dis 1997; 20:295-300; Yap et al. Arterioscler Thromb Vasc). Biol., 2001 Dec;21(12):2080-5, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). С тех пор, в ряде других исследований был продемонстрирован повышенный риск сосудистых осложнений, а в частности венозного тромбоза, у пациентов с HCU (см. публикации Kelly et al. Neurology 2003; 60:275-279; Magner et al. J Inherit Metab Dis 2011; 34:33-37; которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки).
5. Дополнительные симптомы
[0079] У пациентов с HCU было зарегистрировано несколько дополнительных, хотя и редко встречающихся признаков, включая очень тонкую, хрупкую кожу, ломкие волосы, изменение цвета кожи (гипопигментацию) и сыпь на щеках (румянец скул). У некоторых людей могут развиваться жировые изменения в печени, выпячивание части кишечника через разрыв брюшной стенки (паховая грыжа) или воспаление поджелудочной железы. Аномальное искривление позвоночника вперед-назад (кифоз) и коллапс легкого (спонтанный пневмоторакс) также были зарегистрированы у пациентов с HCU (см. публикацию Yap; Orphanet Encyclopedia [online serial]. 2005, pages 1-13, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
B. Повышенные уровни гомоцистеина у групп пациентов с заболеваниями, не являющимися генетически наследуемыми
[0080] Нормальные уровни tHcy варьируются в зависимости от возраста, пола и режима питания, но обычно находятся в диапазоне от 4,5 до 11 мкмоль/л (см. документ Quest Diagnostics Reference Range; questdiagnostics.com.). Мужчины, как правило, имеют немного (на 1-2 мкмоль/л) более высокие уровни tHcy, чем женщины, и у пациентов с детства и до 80 лет наблюдается приблизительное удвоение средних значений (см. публикацию Refsum et al. Clin Chem 2004; 50:3-32, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). У групп, которым вводили фолат, верхний предел (97,5%) уровней tHcy составляет приблизительно 12 мкмоль/л у взрослых<65 лет и 16 мкмоль/л у взрослых старше 65 лет.
[0081] Индивидуумы, у которых уровни tHcy выше нормы, подвергаются более высокому риску развития осложнений, связанных с повышенным уровнем tHcy. Так, например, повышенные уровни общего гомоцистеина в плазме были связаны с повышенным риском остеопороза и/или перелома костей (см. публикацию van Meurs et al. N Engl J Med 2004; 350:2033-2041; которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Кроме того, повышенный уровень гомоцистеина является известным фактором риска развития когнитивных симптомов, включая деменцию и болезнь Альцгеймера (см. публикацию Smith, A. David, et al. "Homocysteine and dementia: an international consensus statement." Journal of Alzheimer's Disease 62.2 (2018): 561-570; которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0082] Таким образом, пациенты с повышенными уровнями tHcy, то есть, превышающими нормальный диапазон от 4,5 до 11 мкмоль/л, могут быть подвергнуты лечению с применением описанных здесь соединений и способов для ослабления скелетных, сердечно-сосудистых и/или когнитивных симптомов, вызываемых повышенными уровнями tHcy, независимо от генетически наследуемого дефицита цистатионин-β-синтазы.
II. Композиции
A. Нативный фермент CBS человека
[0083] Полноразмерный нативный фермент CBS представляет собой тетрамер с четырьмя идентичными мономерами, где каждый мономер (размером 63 кДа) состоит из трех функциональных доменов. Первый домен представляет собой N-концевую область приблизительно из 70 аминокислот, которые связываются с гемом и, как предполагается, участвуют в окислительно-восстановительной реакции и/или в укладке ферментов. Второй домен представляет собой центральный домен, который содержит каталитическую сердцевину и обеспечивает укладку зависимых от PLP (пиридоксаль-5'-фосфата) ферментов семейства типа II. Кофермент PLP глубоко спрятан в щели между N- и C-концевыми доменами. Третья область представляет собой С-концевой регуляторный домен, состоящий из тандемной пары мотивов CBS, которые при связывании с S-аденозилметионином (SAM) активируют фермент.Удаление регуляторной области приводит к образованию конститутивно активного фермента (см. публикацию Miles et al. J Biol Chem. 2004 Jul 16; 279(29):29871-4, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0084] Зависимая от пиридоксаль-5'-фосфата (PLP) ферментная укладка содержит гемовую группу. Эта группа катализирует PLP-зависимую реакцию бета-замещения, в которой она конденсирует L-гомоцистеин с L-серином с образованием L-цистатионина. Эта группа аллостерически регулируется посредством связывания S-аденозил-L-метионина (Ado-Met) с С-концевыми регуляторными доменами, что приводит к конформационной перегруппировке этих доменов и высвобождению аутоингибиторного блока. Активация CBS также может быть достигнута путем полного удаления С-концевых регуляторных доменов с образованием конститутивно активной димерной формы фермента (см. публикации Miles et al. J Biol Chem. 2004 Jul 16; 279(29):29871-4; Ereno-Orbea et al. Proc Natl Acad Sci USA 111(37), E3845-3852 (2014), каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки).
[0085] Активное вещество в лекарственном продукте, описанном в настоящей заявке, представляет собой рекомбинантный усеченный белок CBS человека с заменой цистеина на серин в аминокислотном положении 15 белка (htCBS C15S) по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 в списке последовательностей, которая представляет собой нативный белок CBS, модифицированный посредством присоединения полиэтиленгликоля (ПЭГ). Этот фермент также известен как htCBS C15S. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственное вещество htCBS C15S имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
[0086] Эта форма фермента имеет высокую склонность к агрегации, что создает серьезные ограничения для продуцирования и получения человеческого CBS (hCBS). ПЭГилированный htCBS C15S (включая «20NHS PEG-CBS», как определено в настоящей заявке) был сконструирован так, чтобы он образовывал димеры, а не тетрамеры, которые менее подвержены агрегации. Высокомолекулярные соединения, такие как ферменты, удаляются из кровотока посредством разложения в результате протеолиза и различных механизмов клиренса (см. публикацию Vugmeyster et al. World J Biol Chem. 2012;3(4):73-92, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Известно, что ПЭГилирование сводит к минимуму протеолиз и иммуногенность при одновременном повышении стабильности белка и снижении почечной экскреции (см. публикацию Kang et al. 2009;14(2):363-380, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Эти структурные модификации делают описанный здесь лекарственный продукт, содержащий ПЭГилированный htCBS C15S, более подходящим кандидатом, чем нативный hCBS, в качестве ферментной терапии (ET) для лечения HCU.
[0087] Нативный CBS является внутриклеточным ферментом, но, при этом, ничего не известно о механизме захвата фермента из внеклеточной среды в его первичный внутриклеточный участок действия, в то время как ПЭГилированный htCBS C15S действует внеклеточно. В отличие от нативного эндогенного CBS, ПЭГилированный htCBS C15S корректирует метаболические нарушения, действуя непосредственно в кровотоке и опосредованно в тканях, и при этом, отсутствует необходимость в SAM для активации. Нативный фермент hCBS активируется в клетках при связывании S-аденозилметионина (SAM) с его С-концевым регуляторным доменом. Однако, уровни SAM в кровотоке как у пациентов, так и у здоровых людей намного ниже уровней, необходимых для активации CBS (см. публикацию Stabler et al. Metabolism, 2002. 51(8): p.981-8, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Следовательно, введение нативного CBS в кровоток было бы неэффективным, так как в этом случае, CBS не активировался бы. ПЭГилированный htCBS C15S, хотя он остается в кровотоке и не проникает в клетки, был сконструирован для того, чтобы обойти необходимость в активации SAM путем удаления С-концевого регуляторного домена CBS, который делает фермент конститутивно активным.
B. Ферментная терапия (ЕТ)
[0088] ПЭГилированный htCBS C15S представляет собой ПЭГилированный усеченный hCBS с заменой цистеина на серин в положении 15 для ET и может быть использован для лечения HCU и/или для лечения заболевания, вызываемого повышенными уровнями общего гомоцистеина в плазме у пациентов, у которых это заболевание не является генетически наследуемым. Эта модификация оптимизирует фермент для образования димеров, а не тетрамеров, и является конститутивно активной.
[0089] ПЭГилированный htCBS C15S восполняет дефицит активности CBS, что тем самым снижает уровни гомоцистеина (Hcy) и метионина (Met) в плазме, повышает уровни цистатионина (Cth) и нормализует уровни цистеина (Cys) у моделей HCU. Снижение уровня общего Hcy (tHcy) является главной целью лечения (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Jan; 40(1):49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) и значительно коррелирует с ослаблением клинических симптомов (глазных, скелетных, сосудистых и неврологических) (см. публикацию Yap; Orphanet Encyclopedia [online serial]. 2005, pages 1-13, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0090] ПЭГилированный htCBS C15S снижает уровни гомоцистеина (Hcy) в плазме у индивидуумов с повышенными уровнями Hcy, включая индивидуумов с генетически не наследуемым увеличением уровней tHcy. ПЭГилированный htCBS C15S представляет собой рекомбинантную форму человеческого нативного фермента CBS, продуцируемого бактериями E.coli. Последовательность ДНК нативного человеческого CBS (SEQ ID NO: 3 в списке последовательностей) была генетически модифицирована для удаления С-концевой регуляторной области (аминокислоты 414-551) (SEQ ID NO: 4) с образованием усеченного человеческого CBS. Последовательность ДНК усеченного человеческого CBS была дополнительно модифицирована для введения точковой мутации T→A в положение 43 кодирующей области ДНК (соответствующей SEQ ID NO: 3), что приводило к замене цистеина серином в положении 15 транслированного белка, и к образованию человеческого усеченного CBS C15S (htCBS C15S) (SEQ ID NO: 5). Это изменение снижает степень агрегации и обеспечивает согласованность между партиями по сравнению с нативным hCBS.
[0091] Фермент был дополнительно модифицирован в бактериях E.coli во время экспрессии, что приводило к удалению первого Met из белка, как показано в SEQ ID NO: 1. После очистки, фермент htCBS C15S дополнительно модифицировали путем ПЭГилирования с использованием молекул ПЭГ размером 20 кДа, функционализированых N-гидроксилсукцинимидоэфиром, которые реагируют с первичными аминами на поверхности белка. В среднем, приблизительно 5,1 молекул ПЭГ присоединены к каждому мономерному звену фермента с образованием гетерогенного димерного продукта со средней молекулярной массой 290 кДа.
C. ПЭГилирование htCBS C15S с получением 20NHS-ПЭГ-CBS
[0092] ME-200GS (также называемый метокси-ПЭГ-СО(СН2)3COO-NHS) используется здесь для ПЭГилирования htCBS C15S:
ME-200GS имеет молекулярную массу 20 кДа и химическое название α-сукцинимидилоксиглутарил-ω-метоксиполиоксиэтилен. ME-200GS нацелен на свободные амины на поверхности htCBS C15S. Между ПЭГ и остатком лизина на htCBS C15S образуется амидная связь. Полученная молекула упоминается здесь как «20NHS PEG-CBS» и представляет собой ПЭГилированную молекулу цистатионин-бета-синтазы человека, которая является усеченной и имеет мутацию C15S, как показано в SEQ ID NO: 1.
D. Посттрансляционные модификации
[0093] Посттрансляционные модификации могут потребовать проведения дополнительных биотехнологических стадий для разделения модифицированных и немодифицированных полипептидов, что увеличивает затраты и снижает эффективность производства биопрепаратов. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретения, продуцирование полипептидного агента в клетке усиливается посредством модулирования экспрессии гена-мишени, кодирующего белок, который влияет на посттрансляционную модификацию. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, продуцирование биологических препаратов увеличивается посредством модулирования экспрессии первого гена-мишени, кодирующего белок, который влияет на первую посттрансляционную модификацию, и модулирования экспрессии второго гена-мишени, кодирующего белок, который влияет на вторую посттрансляционную модификацию.
[0094] Кроме того, белки, экспрессированные в прокариотических или эукариотических клетках, могут подвергаться нескольким посттрансляционным модификациям, которые могут негативно влиять на продуцирование и/или на структуру, биологическую активность, стабильность, гомогенность и/или другие свойства биологического продукта. Многие из этих модификаций происходят спонтанно во время роста клеток и экспрессии полипептида и могут возникать в нескольких сайтах, включая остов пептида, боковые цепи аминокислот и амино- и/или карбоксильные концы данного полипептида. Кроме того, данный полипептид может содержать модификации нескольких различных типов. Так, например, белки, экспрессируемые в бактериальных клетках, таких как E.coli, могут подвергаться ацетилированию, захвату гистонов, карбоксилированию и/или дезамидированию (см. публикацию Yang et al., PNAS 111 (52) E5633-E5642 (2014), которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Так, например, белки, экспрессируемые в клетках птиц и млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (СНО), могут подвергаться ацетилированию, карбоксилированию, гамма-карбоксилированию, захвату гистона, дезамидированию, N-концевой циклизации и дезамидированию глутамина, а также дезамидированию аспарагина.
[0095] В некоторых вариантах осуществления изобретения, продуцирование белка усиливается посредством модулирования экспрессии гена-мишени, который кодирует белок, участвующий в дезамидировании белка. Белки могут дезамидироваться несколькими путями, включая циклизацию и дезамидирование N-концевого глутамина и дезамидирование аспарагина. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения, белок, участвующий в дезамидировании белка, представляет собой N-концевую аспарагин-амидогидролазу. Дезаминирование белка может приводить к изменению структурных свойств, снижению активности, снижению биологической активности, снижению эффективности, повышению иммуногенности и/или к появлению других нежелательных свойств и может быть оценено несколькими методами, включая, но не ограничиваясь ими, разделение белков на основе заряда, например, посредством ионообменной хроматографии, ВЭЖХ, изоэлектрического фокусирования, капиллярного электрофореза, электрофореза в нативном геле, обращенно-фазовой хроматографии, гидрофобной хроматографии, аффинной хроматографии, масс-спектрометрии, или использование L-изоаспартилметилтрансферазы.
[0096] В некоторых вариантах осуществления изобретения, белок, влияющий на секрецию белка, представляет собой молекулярный шаперон, выбранный из группы, состоящей из: Hsp40, HSP47 (также называемого ингибитором серпин-пептидазы кладотипа H; белком теплового шока 47), HSP60, Hsp70, HSP90, HSP100, протеиндисульфидизомеразы, пептидилпролилизомеразы, калнексина, Erp57 (семейства протеиндисульфидизомеразы А, члена 3) и BAG 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения, белок, влияющий на секрецию белка, выбран из группы, состоящей из γ-секретазы, p115, белка частицы распознавания сигналов (SRP), секретина и киназы (например, MEK).
[0097] Предполагается, что дальнейшая оптимизация может быть достигнута путем систематического добавления или удаления нуклеотидов для создания более длинных или более коротких последовательностей и тестирования последовательностей, полученных путем «пропускания через окно» более длинного или более короткого размера вверх или вниз от РНК-мишени, начиная с указанной точки. Сочетание этого подхода для создания новых кандидатов-мишеней с тестированием эффективности эффекторных молекул РНК на основе этих последовательностей-мишеней в анализе на ингибирование, как известно специалистам или как описано в настоящей заявке, может приводить к дальнейшему повышению эффективности ингибирования. Более того, такие оптимизированные последовательности могут быть скорректированы, например, путем введения модифицированных нуклеотидов, как описано в настоящей заявке или как известно специалистам в данной области, добавления или модификации выступающих концов или путем введения других модификаций, известных специалистам в данной области и/или обсуждаемых в настоящей заявке, для дальнейшей оптимизации молекулы (например, повышения стабильности в сыворотке или периода времени полужизни в кровотоке; повышения термостабильности, усиления трансмембранной доставки, нацеливания на определенный участок или клетки определенного типа, усиления взаимодействия с ферментами пути сайленсинга, усиления высвобождения из эндосом и т.п.), используемой в качестве ингибитора экспрессии.
E. Стабильность
[0098] Лекарственное вещество или лекарственный продукт являются стабильными при различных температурах и в различных условиях хранения. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственное вещество или лекарственный продукт являются стабильными при их хранении при -65°С и -20°С.Альтернативно, лекарственное вещество или лекарственный продукт могут быть стабильными при хранении при температуре в диапазоне от приблизительно 2°C до приблизительно 8°C. Альтернативно, лекарственное вещество или лекарственный продукт могут быть стабильными при хранении при температуре в пределах 25°С±2°С.Так, например, лекарственное вещество или лекарственный препарат остаются стабильными при температуре от 20°C до 25°C. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственное вещество или лекарственный продукт являются стабильными в восстанавливающих условиях. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственное вещество или лекарственный продукт стабильны в невосстанавливающих условиях. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственное вещество или лекарственный продукт остаются стабильными в течение по меньшей мере 2 дней, по меньшей мере 7 дней, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев или по меньшей мере 12 месяцев. Так, например, лекарственное вещество или лекарственный продукт остаются стабильными при хранении в течение приблизительно 2 дней. Так, например, лекарственное вещество или лекарственный продукт остаются стабильными при хранении в течение приблизительно 7 дней. Так, например, лекарственное вещество или лекарственный препарат остаются стабильными при хранении в течение приблизительно 1 месяца. Так, например, лекарственное вещество или лекарственный препарат остаются стабильными при хранении в течение приблизительно 2 месяцев. Так, например, лекарственное вещество или лекарственный препарат остаются стабильными при хранении в течение приблизительно 3 месяцев. Так, например, лекарственное вещество или лекарственный продукт остаются стабильными при хранении в течение приблизительно 6 месяцев. Так, например, лекарственное вещество или лекарственный препарат остаются стабильными при хранении в течение приблизительно 12 месяцев. Так, например, лекарственное вещество или лекарственный препарат остаются стабильными при хранении в течение приблизительно 18 месяцев.
[0099] В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственное вещество или лекарственный продукт остаются стабильными при хранении при -65°C до 18 месяцев. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственное вещество или лекарственный продукт остаются стабильными при хранении при температуре от приблизительно 2°C до приблизительно 8°C в течение периода времени до 3 месяцев. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственное вещество или лекарственный продукт остаются стабильными при хранении при 25°С±2°С до 1 месяца.
[0100] В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственное вещество или лекарственный продукт остаются стабильными в течение по меньшей мере 3 циклов замораживания и оттаивания. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственное вещество или лекарственный продукт остаются стабильными до 6 циклов замораживания и оттаивания. Так, например, лекарственное вещество или лекарственный препарат остаются стабильными в течение 5 циклов замораживания и оттаивания. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственный продукт остается стабильным после его инъецирования из шприца.
III. Фармацевтические композиции
[0101] Описанный здесь лекарственный продукт, содержащий ПЭГилированный htCBS C15S, предназначен для восстановления метаболического контроля и ослабления клинических проявлений заболевания посредством снижения уровней гомоцистеина и нормализации уровней цистеина у пациентов с HCU. htCBS C15S получают по рекомбинантной технологии с использованием E.coli BL21 (DE3) и изготавливают в виде стерильного лекарственного препарата в 15 мМ фосфата калия, 8% (масс./об.) трегалозы, рН 7,5. Лекарственный препарат предназначен для введения путем подкожной (SC) инъекции.
[0102] Активность ПЭГилированного htCBS C15S в кровотоке также улучшает или даже полностью нормализует профили метаболитов в тканях (см. заявку WO 2017/083327, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Следовательно, лекарственный продукт не обязательно должен быть доставлен в его нативную внутриклеточную среду.
[0103] Лекарственный продукт уменьшает накопление токсического Hcy у пациентов с HCU; нормализует уровни Cys в кровотоке; повышает уровни Cth в кровотоке; и/или предотвращает, задерживает начало и/или устраняет развитие симптомов HCU. Лекарственный продукт обеспечивает по меньшей мере одно из этих преимуществ, что позволяет пациентам получать удовольствие от нормального питания. Фактически, повышение активности Cth даже при регулярном питании (например, 4,0 г/кг МЕТ) свидетельствует о повышенной активности лекарственного препарата и/или уменьшении его выведения из почек.
[0104] Молекулярная масса лекарственного вещества, рассчитанная по усредненной изотопной молекулярной массе с помощью ЭХ/УФ/МС, составляет 45,290 кДа для мономера и 90,58 кДа для димера.
[0105] Все партии представляют собой прозрачную жидкость, практически не содержащую видимых частиц, и имеющую темно-красную окраску. Кроме того, электрофорез в ДСН-ПААГ, проводиый как в восстанавливающих, так и в невосстанавливающих условиях, и результаты Вестерн-блот-анализа соответствовали друг другу для каждой партии. С применением каждого из этих методов был продемонстрирован характерный, однородный и постоянный паттерн варианта ПЭГилирования. Сопутствующие лекарственные средства, включая антикоагулянты, витаминные и минеральные добавки, бетаин, антидепрессанты, могут быть также введены в комбинации с описанным здесь лекарственным продуктом для повышения эффективности фармацевтической композиции.
IV. Препараты
[0106] Для вышеупомянутых терапевтических применений, вводимая доза будет варьироваться в зависимости от используемого соединения, способа введения, желаемого лечения и указанного расстройства. Так, например, суточная доза соединения согласно изобретению при вдыхании может составлять в диапазоне от 0,05 микрограммов на килограмм массы тела (мкг/кг) до 100 микрограммов на килограмм массы тела (мкг/кг). Альтернативно, если соединение вводят перорально, то суточная доза соединения согласно изобретению может находиться в диапазоне от 0,01 микрограмма на килограмм массы тела (мкг/кг) до 100 миллиграммов на килограмм массы тела (мг/кг).
[0107] Белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, который был ПЭГилирован с получением лекарственного вещества, описанного в настоящей заявке, может быть использован отдельно, но обычно его вводят в форме фармацевтической композиции в комбинации с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем. Таким образом, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей лекарственное вещество, описанное в настоящей заявке, в комбинации с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем.
[0108] Фармацевтически приемлемые адъюванты, разбавители или носители, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях согласно изобретению, представляют собой адъюванты, разбавители или носители, которые обычно используются в фармацевтике, и включают, но не ограничиваются ими, сахара, спирты ряда сахаров, крахмалы, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, белки сыворотки, такие как альбумин человеческой сыворотки, буферные вещества, такие как фосфаты, глицерин, сорбиновая кислота, сорбат калия, неполные глицеридные смеси насыщенных растительных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, динатрийгидрофосфат, гидрофосфат калия, хлорид натрия; соли цинка, коллоидную двуокись кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрий-содержащую карбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, воски, блоксополимеры полиэтилена и полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и шерстяной жир (ланолин).
[0109] Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть введены перорально, парентерально, путем ингаляции, ректально, интраназально, трансбуккально, вагинально или через имплантированный резервуар. В одном варианте осуществления изобретения, фармацевтическая композиция может быть введена перорально. В одном варианте осуществления изобретения, фармацевтическая композиция может быть введена подкожно. Фармацевтические композиции согласно изобретению могут содержать любые стандартные нетоксичные фармацевтически приемлемые адъюванты, разбавители или носители. Используемый здесь термин «парентеральный» включает подкожную, внутрикожную, внутривенную, внутримышечную, внутрисуставную, интрасиновиальную, интрастернальную, интратекальную инъекцию или инфузию, и инъекцию или инфузию в участок поражения и во внутричерепную область.
[0110] Фармацевтические композиции могут быть приготовлены в форме стерильного препарата для инъекций, например, в виде стерильной водной или масляной суспензии для инъекций. Суспензия может быть получена стандартными методами, известными специалистам в данной области, с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов (таких как, например, Твин 80) и суспендирующих агентов. Стерильный препарат для инъекций может также представлять собой стерильный раствор или суспензию для инъекций в нетоксичном парентерально приемлемом адъюванте, разбавителе или носителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. В число приемлемых адъювантов, разбавителей и носителей, которые могут быть использованы, входят маннит, вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные жирные масла. Для этой цели может быть использовано любое мягкое жирное масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, являются подходящими для приготовления препаратов для инъекций, как и натуральные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно в их полиоксиэтилированных формах. Эти масляные растворы или суспензии могут также содержать разбавитель или диспергирующий агент на основе длинноцепочечного спирта.
[0111] Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть введены перорально в любой приемлемой лекарственной форме, включая, но не ограничиваясь ими, капсулы, таблетки, порошки, гранулы и водные суспензии и растворы. Эти лекарственные формы приготавливают в соответствии с методами, хорошо известнмиы специалистам в области получения фармацевтических препаратов. В случае таблеток для перорального применения обычно используются носители, такие как лактоза и кукурузный крахмал. Также обычно добавляют лубриканты, такие как стеарат магния. Для перорального введения в форме капсул используют подходящие разбавители, такие как лактоза и высушенный кукурузный крахмал. При пероральном введении водных суспензий, активный ингредиент объединяют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При желании могут быть добавлены определенные подсластители, и/или ароматизаторы, и/или красители.
[0112] Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть также приготовлены в виде суппозиториев для ректального введения. Эти композиции могут быть приготовлены путем смешивания активного ингредиента с подходящим нераздражающим наполнителем, который является твердым при комнатной температуре, но жидким при ректальной температуре, и следовательно, будет расплавляться в прямой кишке с высвобождением активного ингредиента. Такие материалы включают, но не ограничиваются ими, масло какао, пчелиный воск и полиэтиленгликоли.
[0113] Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть введены с помощью интраназального аэрозоля или ингаляции. Такие композиции приготавливают методами, хорошо известными специалистам в области получения фармацевтических препаратов, и могут быть приготовлены в виде растворов в физиологическом растворе с использованием бензилового спирта или других подходящих консервантов, усилителей поглощения для повышения биодоступности, фторуглеродов и/или других известных солюбилизирующих или диспергирующих агентов.
[0114] Описанные здесь фармацевтические композиции могут быть получены в форме, подходящей для введения через систему кровообращения, как описано в заявках WO 2015/153102, WO 2016/183482 и WO 2018/009838, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки. Белок CBS может кодироваться рекомбинантной нуклеиновой кислотой, экспрессируемой ядро-содержащими гемопоэтическими клетками (EHC), включая эритроидные или тромбоидные клетки. Так, например, эритроидные клетки представляют собой красные кровяные тельца, эритроциты или ретикулоциты. Так, например, тромбоидные клетки представляют собой тромбоциты. В некоторых вариантах осуществления изобретения, кодируемый белок CBS связан с транслируемым заякоренным на мембране полипептидом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, белок CBS локализован на поверхности EHC. Белок CBS может быть расщеплен для активации фермента во внеклеточном пространстве. Альтернативно, белок CBS, локализованный внутри, может высвобождаться во внеклеточное пространство посредством лизиса EHC. Альтернативно, ферментативная мишень белка CBS может проникать в EHC, а затем выходить через мембрану после модификации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, белок CBS имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 в Списке последовательностей, представленном в настоящем изобретении.
[0115] В зависимости от способа введения, фармацевтическая композиция будет содержать от 0,05 до 99 масс. % (процентов по массе), более конкретно, от 0,05 до 80 масс. %, еще более конкретно от 0,10 до 70 масс. % и еще более конкретно от 0,10 до 50 масс. % активного ингредиента, где все проценты по массе приводятся исходя из общего состава.
[0116] Обычные процедуры выбора и приготовления подходящих фармацевтических композиций описаны, например, в публикации «Pharmaceutics - The Science of Dosage Form Design», M.E. Aulton, Churchill Livingstone, 1988, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственный продукт приготавливают для введения индивидууму в дозе приблизительно 50 мЕд/мкл. Лиофилизированный препарат может быть использован для введения человеку после разведения.
A. Лиофилизация
[0117] Фармацевтические композиции могут быть получены в виде лиофилизированного препарата. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лиофилизированный препарат содержит лекарственное вещество, буфер и наполнитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения, после разведения лиофилизированного препарата в подходящем буфере для разведения, воде или в любом другом фармацевтически приемлемом адъюванте, разбавителе или носителе, концентрация лекарственного вещества составляет приблизительно 20-30 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения, концентрация лекарственного вещества составляет приблизительно 20 мг/мл, приблизительно 21 мг/мл, приблизительно 22 мг/мл, приблизительно 23 мг/мл, приблизительно 24 мг/мл, приблизительно 25 мг/мл, приблизительно 26 мг/мл, приблизительно 27 мг/мл, приблизительно 28 мг/мл, приблизительно 29 мг/мл или приблизительно 30 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения, концентрация лекарственного вещества составляет приблизительно 25,4 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения, после разведения лиофилизированного препарата в подходящем буфере для разведения, воде или в любом другом фармацевтически приемлемом адъюванте, разбавителе или носителе, концентрация буфера, представляющего собой фосфат калия, составляет 15 мМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наполнитель представляет собой трегалозу в концентрации 8% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления изобретения, препарат содержит сахарозу, так, что после разведения лиофилизированного препарата в подходящем буфере для разведения, воде или в любом другом фармацевтически приемлемом адъюванте, разбавителе или носителе, концентрация сахарозы составляет 5%. В некоторых вариантах осуществления изобретения, температура в начале разложения (Tc, on), определенная с помощью микроскопии посредством сушки вымораживанием, составляет -21°C. В некоторых вариантах осуществления изобретения, препарат имеет pH 7,5.
[0118] В некоторых вариантах осуществления изобретения, процесс лиофилизации может быть осуществлен за 48 часов или менее без расплавления структуры кристаллической лепешки. Процесс лиофилизации может быть оптимизирован для коррекции одного или более из следующих параметров или свойств, таких как, но не ограничивающихся ими, (i) уменьшенное время разведения лиофилизированного препарата (например, менее 1 минуты), (ii) уменьшенная вязкость, позволяющая получить более концентрированный лекарственный продукт, (iii) включение изотонического буфера для минимизации боли у пациентов и/или (iv) снижение степени де-ПЭГилирования.
[0119] Лиофилизированный препарат может быть приготовлен в соответствии с нижеследующим протоколом. За три дня до приготовления препарата, лекарственное вещество (хранящееся при -80°С) в концентрации 20-30 мг/мл или приблизительно 25 мг/мл оттаивают в течение 72 часов при 2-8°С в холодильнике. После оттаивания, лекарственное вещество гомогенизируют путем осторожного встряхивания. Диализ проводят в контролируемых условиях при 2-8°С в течение 24 часов. При этом, используют диализные кассеты с отсечкой 20 кДа, и буфер заменяют три раза при объемном соотношении больше или равном 1:50 каждый раз. Буфер заменяют через 3 и 6 часов в течение всего времени диализа. Последнюю стадию диализа проводят в течение ночи. После диализа, препарат извлекают из диализных кассет и фильтруют с использованием поливинилидендифторидного (ПВДФ) фильтра с размером пор 0,22 мкм. После фильтрации, флаконы наполняют объемом 1,0 мл в условиях ламинарного потока воздуха.
[0120] Лиофилизацию проводят в экспериментальной сублимационной сушилке Epsilon 2-12D (Martin Christ, Osterode, Germany). Давление в камере регулируется емкостным датчиком и вакуумным насосом и контролируемой дозировкой азота.
[0121] После уравновешивания флаконов до 5°С, флаконы замораживают до -45°С и уравновешивают в течение дополнительных 5 часов при -45°С.Температуру хранения устанавливают на -15°C на 31 час при первичной сушке. Вторичную сушку проводят при температуре хранения 40°С в течение 2,5 часов. В конце процесса лиофилизации, камеру аэрируют азотом до 800 мбар и флаконы закрывают, а затем поднимают на стенды для хранения. После закрытия, камеру аэрируют азотом до достижения атмосферного давления.
[0122] В процессе лиофилизации проводят мониторинг температуры продукта, температуры хранения, температуры холодильника и давления в камере (с помощью емкостного датчика и датчика Пирани). Температура продукта регулируется датчиками Pt100 (OMEGA™).
V. Лечение заболеваний, расстройств или состояний
[0123] Индивидуумы с HCUк обычно не имеют симптомов при рождении, и, если их не лечить, то симптомы появляются у этих людей с течением времени, у некоторых уже в младенчестве, а у многих в детстве, и, поскольку это заболевание имеет широкий спектр симптомов, то у некоторых пациентов симптомы появляются только во взрослом возрасте (см., публикации Yap, 2005; Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Morris et al. Guidelines for the diagnosis and management of cystathionine beta-synthase deficiency. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74; Mudd et al. In: Scriver CL, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, eds. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7 ed. New York: McGraw Hill; 2001;1279-1327, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Обычно поражаются четыре основные системы органов: глаза, скелет и сосудистая система, а также ЦНС.При этом, могут также поражаться и другие органы, такие как печень, поджелудочная железа, желудочно-кишечный тракт и кожа, включая волосяные фолликулы (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74; Muacevic-Katanec et al. Coll Antropol 2011; 35:181-185; Suri et al. J Neurol Sci 2014; 347:305-309, каждая из которых в полном объеме вводится в настоящее описание посредством ссылки).
[0124] Полученные данные показали, что снижение уровней Hcy могут служить показателем успешного применения ферментной терапии (ЭТ) при лечении HCU. Это соответствует определению группой специалистов по биомаркерам NIH-FDA (см. публикации FDA-NIH Biomarker Working Group.BEST (Biomarkers, EndpointS, and other Tools) Resource [Internet]. Silver Spring (MD): Food and Drug Administration (US); 2016-. Reasonably Likely Surrogate Endpoint. 2017 Sep 25. Co-published by National Institutes of Health (US), Bethesda (MD). ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK326791/, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки), а именно, по биомаркерам фармакодинамических уровней/ответа, которые изменяются в ответ на воздействие лекарственного продукта» и, которые, кроме того, тесно связаны с маркером, а в случае ET для HCU, в ответ на механизм действия лекарственного средства. Таким образом, уровни Hcy в крови или в плазме являются не только ценным маркером для фармакодинамических исследований, но также ранее были признаны «достаточно вероятным суррогатным конечным показателем» гомоцистинурии (HCU).
[0125] У младенцев и детей с HCU, приоритетом является профилактика осложнений, ассоциированных с HCU, и обеспечение надлежащего роста и развития нормального интеллекта (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). У пациентов, у которых такое заболевание было диагностировано в более позднем возрасте, целью лечения должно быть предотвращение опасной для жизни тромбоэмболии и минимизация прогрессирования уже выявленных осложнений. Для достижения этих целей, биохимические патологии, ассоциированные с HCU, должны быть уменьшены и, если это возможно, нормализованы (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0126] В соответствии с Руководством по диагностике и лечению HCU от 2016 г., уровни Hcy должны поддерживаться как можно ближе к норме. Обычно, это невозможно у пациентов с HCU, получающих доступное в настоящее время лечение, а поэтому были предложены желательные дозы ниже 50 мкмоль/л у пациентов с HCU, реагирующих на пиридоксин, и ниже 100 мкмоль/л у пациентов, не реагирующих на пиридоксин (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Как отмечалось ранее, пациенты, не реагирующие на пиридоксин, обычно имеют более высокие уровни Hcy, чем пациенты, чувствительные к пиридоксину. Хотя для пациентов с одним и тем же заболеванием рекомендуются два способа лечения, однако, они были разработаны так, чтобы они были достижимыми, а не оптимизированными, и сводили осложнения к минимуму.
[0127] В целом, эффективность долгосрочного лечения, необходимого для лечения HCU, особенно потому, что оно чаще всего зависит от диетических ограничений и добавок, не будет достигаться при плохом или непостоянном соблюдения режима лечения на протяжении всей жизни. ET для лечения HCU позволяет избежать многие из этих ловушек. Благодаря компенсации метаболического дефекта в HCU с помощью механизма, который не требует серьезного ограничения Met или добавления Cys, можно ожидать, что ET будет приводить к более последовательному снижению Hcy и не опасному повышению уровня Met, а также позволит улучшить самочувствие или нормализовать режим питания.
[0128] В настоящее время не существует каких-либо лекарств от HCU, которое устраняло бы основные генетические причины состояния, но основной терапевтической целью является максимально возможное снижение уровня tHcy (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Jan;40(1):49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Следовательно, современная терапия направлена на коррекцию биохимических нарушений, что позволяет снижать риск неблагоприятных клинических проявлений заболевания. Уровни Hcy редко полностью нормализуются при лечении, доступном в настоящее время для пациентов с HCU.
[0129] Для достижения целей лечения у большинства пациентов требуется комбинация стратегий. Эти стратегии лечения включают: 1) повышение остаточной активности CBS путем введения фармакологических доз пиридоксина (витамина B6, кофактора для CBS, вместе с фолиевой кислотой) пациентам, чувствительным к пиридоксину (см. публикацию Yap et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2001 Dec; 21(12):2080-5, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки); 2) снижение метиониновой нагрузки за счет строгого ограничения питания/белка при одновременном пополнении рациона продуктами, не входящими в метаболический блок, и 3) усиление альтернативных метаболических путей для устранения последствий дефицита CBS, например, введение бетаина (донора метила) для усиления реметилирования Hcy до Met. В некоторых вариантах осуществления изобретения предусмотрено введение добавок с фолатом и (при необходимости) с витамином B12 (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Jan; 40(1):49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
A. Современные методы лечения HCU
[0130] В некоторых вариантах осуществления изобретения, пациенты с HCU должны получать адекватную добавку фолата и (при необходимости) добавку витамина B12 (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Кроме того, пациенты должны проходить терапию пиридоксином (при положительном ответе), терапию с назначением диеты с ограничением Met и добавлением Cys, и/или терапию бетаином. Для достижения целей лечения, большинству пациентов требуется комбинация стратегий.
[0131] Наиболее распространенным назначаемым лечением является комбинация диеты и введения бетаина, а затем введение только бетаина и только соблюдение диеты (см. публикацию Adam et al. Mol Genet Metab 2013; 110:454-459, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Когда возраст пациентов превышает 16 лет, им чаще всего назначают бетаин, но без диеты, в связи с плохим соблюдением взрослыми пациентами диеты с ограничением Met. Однако, соблюдение режима приема бетаина у взрослых также неудовлетворительно. Медиана потребления белка широко варьируется среди пациентов и резко возрастает с возрастом.
[0132] В соответствии с этими выводами, в недавнем отчете сообщается, что только четыре взрослых пациента из 24 пациентов, которым была назначена диета с низким содержанием белка и со специфическими добавками аминокислот, подходящими для лечения HCU, соблюдали такой режим лечения (см. публикацию Lorenzini et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Oct 4, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Несколько экспертов по HCU описали такую же широкую изменчивость у пациентов в Соединенных Штатах (Научно-исследовательский консультативный совет по лечению редких заболеваний, состоящий из врачей, являющихся экспертами по HCU в США). Исследование путем сравнения значений tHcy у пациентов, не проходивших лечение, и у пациентов, прошедших лечение (25 и 93 пациента соответственно), показало, что между этими двумя группами не было существенных различий (tHcy варьировался от 15,7 до 281,4 и от 4,8 до 312 мкмоль/л, соответственно, а медиана значений составляла от 125,0 до 119,0 мкмоль/л, соответственно), хотя в этом исследование не представлено каких-либо подробностей о схемах лечения пациентов (см. публикацию Stabler et al. JIMD Rep 2013; 11:149-163, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Эти результаты позволяют сделать вывод или ряд нижеследующих выводов: пациенты либо имели гетерогенную картину заболевания; стандартное лечение было неэффективным; и/или плохо соблюдался режим лечения.
1. Пиридоксин
[0133] После постановки диагноза, пациентов проверяют на чувствительность к пиридоксину, кофактору CBS. Введение пиридоксина (витамина B6) в фармакологических дозах увеличивает остаточную активность CBS у индивидуумов, которые, как было показано, являются чувствительными к пиридоксину. Определение чувствительности к пиридоксину широко варьируется в различных исследовательских центрах, хотя согласно Руководству 2016 г., представленному как часть Европейской сети и реестра гомоцистинурии и дефектов метилирования (EHOD), чувствительность к пиридоксину определяется как 20% снижение уровней tHcy в течение 6 недель после начала лечения пиридоксином. Пациенты с сильно повышенным уровнем tHcy и пациенты со слегка или умеренно повышенным уровнем tHcy могут быть определены как чувствительные, несмотря на очень разные уровни tHcy. Кроме того, разные лечебные центры по-разному определяют чувствительность к пиридоксину, а поэтому классификация пациентов по уровням tHcy, а не по их чувствительности к пиридоксину, является более подходящей и строгой. В целом, пациенты, которые реагируют на пиридоксин, имеют некоторую остаточную активность CBS и, следовательно, более низкие уровни tHcy, что приводит к менее тяжелым симптомам заболевания.
[0134] Пиридоксин обычно считается безопасным для пациентов с HCU (см. публикацию Yap; Orphanet Encyclopedia [online serial], 2005, pages 1-13, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Его наиболее часто сообщаемые побочные эффекты включают периферическую невропатию у пациентов, получавших высокие дозы, определяемые как более 900 мг/день (см. публикацию Schaumburg et al. N Engl J Med 1983; 309:445-448; Ludolph et al. Eur J Pediatr 1993; 152:271; которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), апноэ и отсутствие реакции у новорожденных, получавших пиридоксин в дозе 500 мг/день (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37: 1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) и рабдомиолиз (см. публикацию Shoji et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21:439-440, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0135] Хотя лечение пиридоксином широко применяется в настоящее время, однако, оно дает лишь умеренное снижение уровней tHcy, и у большинства пациентов, которые определены как чувствительные к нему, не могут быть значительно снижены уровни tHcy, не говоря уже о их нормализации, после приема только пиридоксина, поскольку их начальные уровни во много раз превышают норму (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Jan; 40(1):49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Помимо длительного лечения пиридоксином, пациентам с HCU, чувствительным к пиридоксину, рекомендуется также вводить фолат и, при необходимости, добавки с витамином B12.
2. Диетические ограничения
[0136] Пожизненные диетические ограничения ранее рекомендовались всем пациентам с HCU (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Jan; 40(1):49-74; Walter et al. Eur J Pediatr. 1998 Apr;157 Suppl 2: S71-6; которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Рекомендуемая диета была крайне ограничена и направлена на снижение потребления Met за счет ограничения содержания белка.
[0137] Основой современной терапии пациентов с HCU является пожизненная диета с низким содержанием белка, включающая всего 5 г натурального белка в день (www.hcunetworkamerica.org) и дополненная L-аминокислотами, не содержащими Met, и, во многих случаях, дополненная Cys в потребляемые продукты питания (см. публикации Yap et al. J Inherit Metab Dis. 1998; 21: 738-47; Morris et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Jan; 40(1):49-74; которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Строго ограниченная диета состоит из продуктов на основе злаков с низким содержанием метионина; фруктов и овощей с низким содержанием метионина; лечебных продуктов с низким содержанием метионина; масел и сахара. Следует избегать таких продуктов, как мясо, курица, рыба, яйца, молоко, йогурт, сыр, соевые продукты, орехи, бобовые и многие фрукты и овощи, которые содержат умеренное количество Met. Поскольку нативный CBS является ключевым ферментом в метаболизме Met, то прием Met, то есть, незаменимой аминокислоты, содержащейся во многих пищевых продуктах, приводит к повышению концентрации tHcy в плазме и снижению концентрации нижестоящих метаболитов Cth и Cys.
[0138] Готовые продукты, выпечка и готовые продукты должны быть строго ограничены, так как они часто содержат молоко, яйца или муку. Количества белка, необходимые и усваиваемые каждым пациентом с HCU, различаются и, вероятно, будут меняться со временем. Это количество корректируется в соответствии с уровнями tHcy, которые контролируются с помощью частых анализов крови (в соответствии с Руководством ASIEM по анализу на уровень белка при гомоцистинурии). Большинству пациентов, находящихся на диетическом лечении, также требуется ежедневное потребление малопривлекательной смеси синтетических аминокислот, не содержащей Met, для предотвращения вторичной недостаточности питания, для правильного роста детей и для правильного усваивания пищи у взрослых (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab). Dis. 2017 Jan; 40(1):49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0139] Хотя диетические модификации с комбинацией витаминных добавок могут до некоторой степени снижать уровни tHcy у пациентов, полностью соблюдающих строго ограничительную диету, однако, уровни tHcy у большинства пациентов с HCU остаются в несколько раз или даже на порядки выше нормы. Большинству людей очень сложно полностью соблюдать такой измененный режим питания на протяжении всей жизни, и возникающие в результате периоды плохого метаболического контроля имеют в целом негативные последствия (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Jan; 40 (1): 49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Соблюдение диеты часто является плохим и, обычно, еще больше ухудшается в подростковом и взрослом возрасте (см. публикации Walter et al. Eur J Pediatr. 1998 Apr;157 Suppl 2:S71-6; Schiff et al. Neuropediatrics. 2012 Dec;43(6):295-304; Garland et al., Paediatr Child Health, 1999 Nov;4(8):557-62, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Более того, употребление в пищу продуктов с высоким содержанием Met не вызывает немедленной негативной физической реакции, что еще больше усугубляет трудности с соблюдением диеты (www.hcunetworkamerica.org). Ограничение приема Met является еще более сложной задачей для детей из-за необходимости обеспечения достаточного количества Met, необходимого для стимуляции роста и развития. Большинству пациентов, которым было рекомендовано диетическое лечение, также требуется добавка L-аминокислот, обогащенная Cys и не содержащая Met, для правильного роста детей и для правильного питания взрослых (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0140] В недавнем отчете сообщалось, что только четыре взрослых пациента из 24 пациентов, которым была назначена диета с низким содержанием белка и со специфическими добавками аминокислот, подходящими для лечения HCU, соблюдали такой режим лечения (см. публикацию Lorenzini et al. J Inherit Metab Dis. (2018) 41:109-115, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Несколько экспертов по HCU описали такую же широкую изменчивость у пациентов в Соединенных Штатах
3. Добавка с бетаином
[0141] Проблемы, связанные с терапией, основанной в основном на диете, потребовали других подходов к снижению уровня Hcy, в первую очередь, к введению добавок с бетаином (N, N,N-триметилглицином, продаваемым как CYSTADANE™), по меньшей мере два раза в день. Бетаин редко эффективен в качестве монотерапии (см. публикацию Sakamoto et al. Pediatr Int 2003; 45:333-338, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) и обычно используется в качестве дополнения к пиридоксину и/или в диете с ограничением Met (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Jan; 40(1):49-74; которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0142] Бетаин не устраняет основной дефицит CBS, а скорее индуцирует альтернативный путь, приводящий к реметилированию Hcy обратно в Met и к коррекции частично неправильной укладки мутантов CBS (см. публикациию Kopecka et al. J Inherit Metab Dis 2011; 34: 39-48, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В присутствии бетаина, фермент бетаин-гомоцистеинметилтрансфераза (BHMT) реметилирует Hcy в Met (см. публикациию Singh et al. Genet Med 2004; 6:90-95, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), что приводит к частичному снижению уровней Hcy и к повышению и без того сильно повышенных уровней Met. Метаболиты, действующие после CBS, не дают эффекта при введении бетаина, и может потребоваться добавление Cys. Более того, лечение бетаином было ассоциировано с патологиями белого вещества головного мозга, то есть, признаком повреждения сосудов головного мозга (см. публикацию Prins et al. Nat Rev Neurol 2015; 11:157-165, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) у пациентов с острым отеком головного мозга (см. публикацию Devlin et al. J Pediatr 2004, 144:545-548; Yaghmai et al. Am J Med Genet 2002; 108:57-63; которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) и без такого отека (см. публикацию Vatanavicharn et al. J Inherit Metab Dis 2008; 31 Suppl 3:477-481; Brenton et al. J Child Neurol 2014; 29:88-92; Sasai et al. Tohoku J Exp Med 2015; 237:323-327; которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Хотя известно, что лечение бетаином усугубляет накопление метионина, однако, Schwann и др. показали, что метионин является основным агентом, вызывающим отек головного мозга (см. публикацию Schwahn, Bernd C., et al. JIMD reports 52.1 (2020): 3-10, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0143] Бетаин может быть неприятным на вкус (см. публикациию Walter et al. Eur J Pediatr. 1998 Apr; 157 Suppl 2:S71-6, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) и может вызывать неприятный рыбный запах тела и/или дыхания (см. публикацию Manning et al., JIMD Rep 2012;5:71-75, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Оба эффекта потенциально усугубляются из-за потребности его введения в высоких дозах (более 6 г/сутки у взрослых и детей). Следовательно, соблюдение режима лечения обычно является плохим (см. публикации Adam et al. Mol Genet Metab. 2013 Dec;110(4):454-9; Walter et al. Eur J Pediatr. 1998 Apr;157 Suppl 2:S71-6; Sakamoto et al., Pediatr Int 2003;45:333-338, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки).
[0144] Фармацевтический препарат на основе бетаина, CYSTADANE™ был одобрен FDA в 2006 г. и показан для снижения повышенного уровня Hcy в крови при гомоцистинурии, включая дефицит CBS, дефицит 5,10-метилентетрагидрофолат-редуктазы (MTHFR) и дефекты метаболизма кофактора кобаламина (cbl). (см. публикацию Recordati. CYSTADANE™ Product Information (PI). 2017. Ref Type: Online Source, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0145] Самое масштабное на сегодняшний день исследование диетического лечения пациентов с HCU, не отвечающих на пиридоксин, показало, что бетаин является обычным выбором для лечения, а особенно лечения пациентов с поздним диагнозом, подростков и взрослых. Считается, что назначение бетаина в качестве основной терапии 34% пациентов без диеты связано с несоблюдением диеты, поскольку не проводилось каких-либо контролируемых исследований, позволяющих изучающих долгосрочную эффективность бетаина при приеме без диеты (см. публикацию Adam et al. Mol Genet Metab 2013;110:454-459, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Действительно, исследование на мышах с моделью HCU показало, что эффект лечения бетаином, который значительно снижает уровень tHcy, со временем уменьшался (см. публикацию Maclean KN. Betaine treatment of cystathionine b-synthase-deficient homocystinuria; does it work and can it be improved? Dove press 2012; 2:23-33, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
4. Антитромбоцитарная терапия
[0146] В дополнение к терапии, снижающей уровень Hcy, пациентам с плохо контролируемым уровнем Hcy и/или пациентам с дополнительными факторами риска тромбоза (например, пациентам с фактором V Лейдена, с тромбозом в анамнезе и беременным пациенткам), может быть назначено лечение антитромбоцитарными средствами (например, аспирином, дипиридамолом или клопидогрелем) (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Jan; 40(1):49-74; которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Препараты для разжижения крови COUMADIN™ также могут быть назначены пациентам с венозным тромбозом в анамнезе. Однако, антикоагулянты ассоциируются с повышенным риском кровоизлияния в мозг, и использование таких антикоагулянтов должно определяться индивидуально для каждого пациента (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Jan; 40(1):49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
5. Клинические результаты современных методов лечения
[0147] Проявления HCU продолжают прогрессировать вместе с классическими клиническими симптомами, приводящими к инвалидности в различной степени и влияющими на качество жизни больных. Независимо от возраста, при котором начинается заболевание, потеря биохимического контроля в любом возрасте связана с развитием серьезных осложнений, которые могут быть опасными для жизни (см. публикацию Walter et al. Eur J Pediatr. 1998 Apr;157 Suppl 2:S71-6), которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0148] Лечение должно продолжаться на протяжении всей жизни, так как периоды плохого метаболического контроля имеют кумулятивные опасные последствия, которые могут привести к тяжелым осложнениям и преждевременной смерти (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Jan; 40(1):49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0149] Без лечения, прогноз при HCU, резистентной к пиридоксину, является неблагоприятным, а ожидаемая продолжительность жизни пациентов заметно снижается. С момента первого описания этой болезни в 1962 г. не проводилось каких-либо рандомизированных контролируемых испытаний при диетической или иной терапии HCU (см. публикацию Carson et al. Arch Dis Child. 1969 Jun; 44(235):387-92; Gerritsen et al. Biochem Biophys). Res Commun., 1962 Dec 19;9:493-6, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Тем не менее, были опубликованы некоторые экспериментальные исследования.
[0150] Международное исследование, в котором был задокументирован патогенез 629 пациентов с CBS, не подвергавшихся лечению, показало, что риск осложнений увеличивается с возрастом (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37: 1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Лечение (пиридоксином, диетой с ограничением Met) снижало уровни tHcy в плазме и заметно снижало риск тромбоэмболических осложнений и вывиха хрусталика даже при плохом соблюдении такой диеты.
[0151] Yap et al. (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2001 Dec;21(12):2080-5) провели международное многоцентровое исследование с участием 158 пациентов, прошедших лечение. Частота сердечно-сосудистых заболеваний была заметно снижена в этой лечебной группе по сравнению с анамнестическими контрольными данными (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Это очевидное преимущество коррелировало с более низкими (но не нормализованными) уровнями tHcy в плазме у пациентов, проходивших лечение. Было отмечено, что последовательное соблюдение необходимого режима очень сложно выполнить.
[0152] В целом, несмотря на наличие нескольких стратегий лечения HCU, у большинства пациентов, они не позволяют восстановить близкие к нормальным уровни tHcy. Более того, их долгосрочная эффективность снижается в результате плохого или непостоянного соблюдения режима лечения на протяжении всей жизни. Таким образом, постоянное снижение Hcy трудно поддерживать у пациентов с HCU. Лечение описанным здесь лекарственным средством направлено на то, чтобы избежать многих из этих «ловушек». Ожидается, что за счет компенсации метаболического дефекта при HCU с помощью механизма, который не требует серьезного ограничения Met или добавления Cys, ферментная терапия (ET) может привести к более последовательному снижению Hcy и к не опасному повышению уровня Met.
B. Способы улучшения когнитивной функции
[0153] Настоящая патентная заявка относится к способам улучшения когнитивной функции у индивидуума, страдающего гомоцистинурией или с подозрением на это заболевание. Эти способы могут включать введение индивидууму терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей: лекарственное вещество, включающее выделенный белок цистатионин-β-синтазы (CBS) (SEQ ID NO: 1); молекулу ПЭГ, ковалентно связанную с белком CBS; и фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или адъювант.В некоторых аспектах, комбинирование ферментной терапии, включающей введение фармацевтической композиции, содержащей белок htCBS C15S, как описано в настоящей заявке, с одним или несколькими терапиями для улучшения когнитивных или поведенческих функций, может обеспечивать дополнительное улучшение когнитивной функции или поведенческой функции у индивидуума, страдающего гомоцистинурией или с подозрением на это заболевание. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лечение или терапия нейроповеденческих или когнитивных расстройств включает поддержку, аналогичную той, которая применяется при других проблемах исполнительных функций, таких как ADHD, включая, например, поведенческую терапию, такую как тренинг родителей по обучению поведению детей (BPT) и контроль за поведением в классе (BCM) (см. например, публикации Pelham Jr, William E., and Gregory A. Fabiano. «Evidence-based psychosocial treatments for attention-deficit/hyperactivity disorder» Journal of Clinical Child & Adolescent Psychology 37.1 (2008): 184-214; and Pfiffner, Linda J., and Lauren M. Haack. «Behavior management for school-aged children with ADHD». Child and Adolescent Psychiatric Clinics 23.4 (2014): 731-746, содержание каждой из которых в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Таким образом, настоящее изобретение относится к комбинированной терапии, включающей ферментную терапию, описанную в настоящей заявке, в комбинации с нейроповеденческой или когнитивной терапией для дальнейшего улучшения когнитивной функции у индивидуумов, страдающих гомоцистинурией или с подозрением на это заболевание. Ожидается, что такая комбинированная терапия будет эффективно улучшать когнитивную функцию пациента, включая когнитивное развитие у детей, в большей степени, чем ферментная терапия или нейроповеденческая/когнитивная терапия по отдельности.
[0154] Фармацевтические препараты для их применения в способах улучшения когнитивной функции могут включать ME-200GS, который может быть введен в виде молекулы ПЭГ. Фармацевтические препараты могут содержать лекарственное вещество в концентрации приблизительно 25,4 мг/мл, необязательно в 5% сахарозе, приблизительно 15 мМ фосфата калия; и приблизительно 8% (масс./об.) трегалозы. Фармацевтические препараты могут быть лиофилизованы.
C. Способы лечения на основе метаболических показателей
[0155] В настоящей заявке также описаны способы лечения индивидуума, страдающего гомоцистинурией или с подозрением на это заболевание, где указанные способы включают: определение уровня одного или более из креатинина, высокочувствительного С-реактивного белка, фибриногена или активности белка С у индивидуума; сравнение одного или более уровней с известным диапазоном значений для одного или более уровней у группы индивидуумов, которые, как известно, не страдают гомоцистинурией, или у группы индивидуумов, которые, как известно, страдают гомоцистинурией, или в тех и других случаях; оценку прогрессирования заболевания или тяжести заболевания у индивидуума исходя из одного или более уровней, оцененных у индивидуума; коррекцию дозы ферментной терапии для индивидуума в зависимости от прогрессирования заболевания или тяжести заболевания; и проведение индивидууму ферментной терапии. В этих способах, проведение ферментной терапии включает введение лекарственного средства, содержащего выделенный белок цистатионин-β-синтазы (CBS), содержащий SEQ ID NO: 1 или состоящий из SEQ ID NO: 1, где белок CBS имеет молекулу ПЭГ, ковалентно связанную с белком CBS.
[0156] В описанных здесь способах, уровни метионина ≥600 мкМ могут быть использованы для идентификации и стратификации индивидуумов на основе ответа на диету с ограниченным содержанием метионина и/или добавки бетаина и/или витаминов у детей и взрослых пациентов с HCU. В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровни метионина>1000 мкМ могут быть использованы для идентификации и стратификации индивидуумов исходя из ответа на диету с ограниченным содержанием метионина и/или добавки бетаина и/или витаминов у детей и взрослых индивидуумов с HCU.
[0157] Уровни диметилглицина (DMG) выше верхнего предела нормы (ULN) могут быть использованы для идентификации и стратификации индивидуумов исходя из ответа на бетаин у детей и взрослых пациентов с HCU. Уровни креатинина ниже нижнего предела нормы (LLN) могут быть использованы для идентификации и стратификации индивидуумов, у которых может наблюдаться позитивный эффект от ферментной терапии, проводимой в соответствии с описанными здесь способами. В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровни высокочувствительного С-реактивного белка (hsCRP) выше ULN могут быть использованы для идентификации и стратификации индивидуумов, у которых может наблюдаться позитивный эффект от ферментной терапии, проводимой в соответствии с описанными здесь способами. В некоторых вариантах осуществления изобретения, низкие уровни активности белка С и/или низкие уровни фибриногена могут быть использованы для идентификации и стратификации индивидуумов, у которых может наблюдаться позитивный эффект от ферментной терапии, проводимой в соответствии с описанными здесь способами.
[0158] Способы, описанные в настоящей заявке, могут дополнительно включать молекулярно-генетическое тестирование гена CBS у индивидуума, где идентификация мутации в гене CBS указывает на степень тяжести заболевания или подтверждает диагноз гомоцистинурии. Неограничивающие примеры мутаций гена CBS представлены в Таблице 3.
D. Способы снижения хрупкости скелета
[0159] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам снижения хрупкости скелета у индивидуума, страдающего гомоцистинурией или с подозрением на это заболевание. Способы могут включать введение индивидууму терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей: лекарственное вещество, содержащее выделенный белок цистатионин-β-синтазы (CBS) (SEQ ID NO: 1); молекулу ПЭГ, ковалентно связанную с белком CBS; и фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или адъювант.
[0160] Фармацевтические композиции для их применения в способах снижения хрупкости скелета могут содержать ME-200GS в виде молекулы ПЭГ. Вводимые фармацевтические композиции могут включать лекарственное вещество в концентрации приблизительно 25,4 мг/мл, необязательно в 5% сахарозе, приблизительно 15 мМ фосфата калия; и приблизительно 8% (масс./об.) трегалозы. Фармацевтические композиции могут быть лиофилизованы.
E. Способы ослабление сердечно-сосудистых симптомов
[0161] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам ослабления сердечно-сосудистых симптомов и сосудистых осложнений, как описано в настоящей заявке, у индивидуума, страдающего гомоцистинурией или с подозрением на это заболевание (см. публикации van Meurs et al. N Engl J Med 2004; 350:2033-2041; Hankey et al., Lancet, 1999, 354:407-413, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Способы могут включать введение индивидууму терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей: лекарственное вещество, содержащее выделенный белок цистатионин-β-синтазы (CBS) (SEQ ID NO: 1); молекулу ПЭГ, ковалентно связанную с белком CBS; и фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или адъювант.
[0162] Фармацевтические композиции для их применения в способах ослабления сердечно-сосудистых симптомов и сосудистых осложнений могут содержать ME-200GS в виде молекулы ПЭГ. Вводимые фармацевтические композиции могут включать лекарственное вещество в концентрации приблизительно 25,4 мг/мл, необязательно в 5% сахарозе, приблизительно 15 мМ фосфата калия; и приблизительно 8% (масс./об.) трегалозы. Фармацевтические композиции могут быть лиофилизованы.
F. Способы снижения повышенных уровней tHcy у группы пациентов с генетически не наследуемым заболеванием
[0163] Способы, описанные в настоящей заявке, включают лечение групп пациентов с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy. Термины «пациент с генетически не наследуемым заболеванием» или «индивидуум с генетически не наследуемым заболеванием» относятся к одному или более индивидуумам, которые не имеют или у которых не был диагностирован генетически наследуемый дефицит цистатионин-β-синтазы (например, у которых отсутствует миссенс-мутация или мутация с потерей функции в одном или нескольких аллелях гена CBS).
[0164] Индивидуумы с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy, могут иметь скелетные патологии или повышенный риск развития скелетных патологий, таких как повышенная частота переломов костей, снижение минеральной плотности костей и/или остеопороз (см., например, публикации Filip, Alexandru, et al. "The Relationship between Homocysteine and Fragility Fractures-A Systematic Review." Annual Research & Review in Biology (2017): 1-8; van Meurs et al. N Engl J Med 2004; 350:2033-2041; которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Таким образом, некоторые варианты способов, описанных в настоящей заявке, включают лечение или ослабление скелетных симптомов, ассоциированных с повышенными уровнями tHcy, путем введения индивидууму фармацевтических композиций или фармацевтических препаратов, описанных в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение описанных фармацевтических композиций или фармацевтических препаратов индивидуумам с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy, снижает уровни tHcy у индивидуумов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение описанных фармацевтических композиций или фармацевтических препаратов индивидуумам с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy, ослабляет скелетные симптомы, ассоциированные с повышенными уровнями tHcy у индивидуума, включая риск перелома костей, снижение минеральной плотности костей и/или остеопороз.
[0165] Индивидуумы с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy, могут иметь когнитивные симптомы или когнитивные патологии или повышенный риск развития когнитивных симптомов или когнитивных патологий, таких как повышенная распространенность снижения когнитивных функций, деменция и/или болезнь Альцгеймера (см., например, публикации Smith, A. David, et al. "Homocysteine and dementia: an international consensus statement." Journal of Alzheimer's Disease 62.2 (2018): 561-570; Smith, A. David, and Helga Refsum. "Homocysteine, B vitamins, and cognitive impairment." Annual review of nutrition 36 (2016): 211-239; Setién-Suero, Esther, et al. "Homocysteine and cognition: a systematic review of 111 studies." Neuroscience & Biobehavioral Reviews 69 (2016): 280-298; которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Таким образом, некоторые варианты способов, описанных в настоящей заявке, включают лечение или ослабление когнитивных симптомов, ассоциированных с повышенными уровнями tHcy, путем введения индивидууму фармацевтических композиций или фармацевтических препаратов, описанных в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления изобретения, способы, описанные в настоящей заявке, включают лечение или профилактику или замедление прогрессирования нейродегенеративных расстройств, ассоциированных с повышенными уровнями tHcy, включая болезнь Альцгеймера (см. публикацию Farina, Nicolas, et al. "Homocysteine concentrations in the cognitive progression of Alzheimer's disease." Experimental Gerontology 99 (2017): 146-150, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение описанных фармацевтических композиций или фармацевтических препаратов индивидуумам с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy, приводит к снижению уровней tHcy у индивидуумов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение описанных фармацевтических композиций или фармацевтических препаратов индивидуумам с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy, приводит к ослаблению когнитивных симптомов, ассоциированных с повышенными уровнями tHcy у индивидуума, включая снижение когнитивных функций, деменцию или болезнь Альцгеймера.
[0166] Индивидуумы с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy, могут иметь сосудистое заболевание или повышенный риск развития сосудистого заболевания (см., например, публикации Kang, Soo-Sang, and Robert S. Rosenson. "Analytic approaches for the treatment of hyperhomocysteinemia and its impact on vascular disease". Cardiovascular drugs and therapy 32.2 (2018): 233-240 содержание которых в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки). Таким образом, некоторые варианты осуществления способов, описанных в настоящей заявке, включают лечение, облегчение или профилактику сосудистого заболевания.
[0167] Индивидуумы с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy, могут иметь инсульт или повышенный риск развития инсульта (см., например, публикации Spence, J. David. "Homocysteine lowering for stroke prevention: unravelling the complexity of the evidence." International Journal of Stroke 11.7 (2016): 744-747, содержание которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Таким образом, некоторые варианты осуществления способов, описанных в настоящей заявке, включают лечение, облегчение или профилактику инсульта.
[0168] Индивидуумы с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy, могут иметь глазные болезни или повышенный риск развития глазных болезней (см., например, публикацию Ajith, Thekkuttuparambil Ananthanarayanan. «Homocysteine in ocular Diseases». Clinica Chimica Acta 450 (2015): 316-321, содержание которой в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Таким образом, некоторые варианты осуществления способов, описанных в настоящей заявке, включают лечение, облегчение или профилактику глазных болезней.
[0169] Повышенные уровни tHcy могут влиять на широкий спектр метаболических и физиологических систем. Соответственно, индивидуумы с генетически не наследуемым заболеванием могут иметь различных фенотипические симптомы или иметь повышенный риск развития таких симптомов, включая, помимо прочих, скелетные симптомы, когнитивные симптомы, глазные болезни, сердечно-сосудистые симптомы и репродуктивные симптомы.
[0170] Так, например, женщины с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy, могут иметь выкидыш или повышенный риск выкидыша (см. публикацию Cavallé-Busquets, Pere, et al. "Moderately elevated first trimester fasting plasma total homocysteine is associated with increased probability of miscarriage. The Reus-Tarragona Birth Cohort Study." Biochimie (2020), содержание которой в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Соответственно, описанные здесь способы позволяют избежать выкидыша у женщин с умеренно повышенным уровнем tHcy в первом триместре.
[0171] Индивидуумы, включая детей и подростков, с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy, могут иметь состояния тревоги и депрессию или повышенный риск их развития (см. публикации Folstein, Marshal, et al. "The homocysteine hypothesis of depression." American Journal of Psychiatry 164.6 (2007): 861-867; Chung, Kuo-Hsuan, Hung-Yi Chiou, and Yi-Hua Chen. "Associations between serum homocysteine levels and anxiety and depression among children and adolescents in Taiwan." Scientific reports 7.1 (2017): 1-7; см. также публикации Mech, Arnold W., and Andrew Farah. "Correlation of clinical response with homocysteine reduction during therapy with reduced B vitamins in patients with MDD who are positive for MTHFR C677T or A1298C polymorphism: a randomized, double-blind, placebo-controlled study." The Journal of clinical psychiatry 77.5 (2016): 668-671; содержание которых в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Соответственно, описанные здесь способы позволяют предупреждать возникновение тревоги или депрессии у детей и подростков с повышенными уровнями tHcy.
[0172] Индивидуумы с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy, могут иметь почечные осложнения и/или сердечно-сосудистых заболевания и ассоциированные с ними состояния, включая ишемическую болезнь сердца и инсульт, или повышенный риск развития этих заболеваний (см. публикации Guldener, Coen. "Why is homocysteine elevated in renal failure and what can be expected from homocysteine-lowering?." Nephrology Dialysis Transplantation 21.5 (2006): 1161-1166; Clarke, Robert, Sarah Lewington, and Martin Landray. "Homocysteine, renal function, and risk of cardiovascular disease." Kidney international 63 (2003): S131-S133; Yang, Hui-Fang, et al. "Does serum homocysteine explain the connection between sexual frequency and cardiovascular risk?" The Journal of Sexual Medicine 14.7 (2017): 910-917; содержание которых в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки). Соответственно, описанные здесь способы обеспечивают лечение или профилактику почечных осложнений, включая, например, почечную недостаточность и хроническое заболевание почек, а также сердечно-сосудистые заболевания у индивидуумов с повышенными уровнями tHcy.
VI. Дозы и введение
[0173] В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственный продукт может быть введен индивидууму путем подкожной (SC), внутривенной (IV) или внутрибрюшинной (IP) инъекции. В одном варианте осуществления изобретения, лекарственный продукт может быть введен индивидууму 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 раз. В другом варианте осуществления изобретения, лекарственный продукт вводят более 20 раз. В другом варианте осуществления изобретения, лекарственный продукт вводят более 100 раз. Альтернативно, лекарственный продукт может быть введен в течение всей жизни индивидуума.
[0174] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение лекарственного продукта может быть проведено повторно через каждые 12 часов, 13 часов, 14 часов, 15 часов, 16 часов, 17 часов, 18 часов, 19 часов, 20 часов, 21 час, 22 часов, 23 час, ежедневно, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели и через месяц. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственный продукт вводят один раз через каждые 3 дня, один раз через каждые 2 дня или один раз в день.
[0175] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение лекарственного продукта может представлять собой серию доз, которые могут быть введены с интервалами в несколько минут, часов, дней или недель. Так, например, количество доз в этой серии может составлять 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В качестве неограничивающего примера, индивидууму вводят 3 дозы с интервалом в 24 часа. В качестве другого неограничивающего примера, индивидууму вводят 5 доз с интервалом в 12 часов. Индивидуумом может быть человек.
[0176] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение лекарственного продукта может быть проведено по схеме введения серии доз с перерывом между введением первой серии и второй серии доз. Промежуток между приемами доз может составлять 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 13 часов, 14 часов, 15 часов, 16 часов, 17 часов, 18 часов, 19 часов, 20 часов, 21 час, 22 часа, 23 часа, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 13 месяцев, 14 месяцев, 15 месяцев, 16 месяцев, 17 месяцев или 18 месяцев. Количество доз в серии может составлять 2, 3, 4, 5 или 6. В качестве неограничивающего примера, индивидууму может быть введена первая серия из 5 доз с интервалом в 12 часов, а затем через 14 дней после первой дозы индивидууму может быть введена вторая серия из 5 доз с интервалом в 12 часов. В качестве другого неограничивающего примера, индивидууму вводят две серии доз в течение 8 недель, где первая серия представляет собой дозу, вводимую два раза в неделю в течение двух недель, а вторая серия представляет собой дозу, вводимую три раза в неделю в течение 6 недель.
[0177] В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственный продукт может быть введен по меньшей мере один раз после того, как индивидууму был введен бетаин. Время между введением бетаина и введением лекарственного препарата может составлять 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 13 часов, 14 часов, 15 часов, 16 часов, 17 часов, 18 часов, 19 часов, 20 часов, 21 час, 22 часа, 23 часа, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 13 месяцев, 14 месяцев, 15 месяцев, 16 месяцев, 17 месяцев или 18 месяцев. В качестве неограничивающего примера, лекарственный препарат может быть введен через 14 дней после того, как индивидууму был введен бетаин. В качестве другого неограничивающего примера, индивидууму может быть введен лекарственный продукт в двух дозах после того, как индивидууму был введен бетаин. В качестве другого неограничивающего примера, лекарственный продукт может быть введен через 14 или 15 дней после введения бетаина.
[0178] В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственный продукт может быть введен индивидууму в комбинации с бетаином. В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение бетаина включает самостоятельный прием добавки, отпускаемой без рецепта. В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидууму назначают введение бетаина, например, в виде цистадана. Введение бетаина может включать введение различных добавок или лекарственные препаратов, которые могут включать бетаин-HCl, триметилглицин, безводный бетаин или другие формы. Комбинация бетаина и лекарственного препарата, описанная в настоящей заявке, может быть введена по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15 раз. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственный препарат может быть введен в комбинации с бетаином более 15 раз. Дополнительные комбинированные терапии, которые могут быть назначены пациенту, включают введение лекарственного продукта и по меньшей мере один курс лечения для снижения уровней tHcy, такой как диета с очень низким содержанием белка/Met и/или прием витаминов/добавок.
[0179] В некоторых вариантах осуществления изобретения, дозу лекарственного препарата, вводимого индивидууму, определяют на основе таких характеристик индивидуума, как возраст, пол и масса тела. Так, например, лекарственный препарат может быть приготовлен в лекарственной форме, такой как флакон, где количество лекарственного препарата в лекарственной форме заранее определено исходя из возраста индивидуума, массы индивидуума и/или пола индивидуума. Лекарственный препарат может быть введен в различных лекарственных формах в течение установленного периода времени в зависимости от возраста, массы, пола индивидуума и/или других характеристик для коррекции действия лекарственного препарата на индивидуума с течением времени. Лекарственная форма лекарственного препарата может быть представлена в любом терапевтически эффективном количестве.
[0180] В некоторых вариантах осуществления изобретения, доза лекарственного препарата, вводимого индивидууму, может составлять от приблизительно 0,25 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг.Так, например, доза составляет приблизительно 0,33 мг/кг, приблизительно 0,66 мг/кг, 1,0 мг/кг или 1,5 мг/кг.Альтернативно, доза составляет приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 7 мг/кг и приблизительно 10 мг/кг.Так, например, доза может составлять приблизительно 0,5 мг/кг.Альтернативно, терапевтически эффективное количество представляет собой дозу, выбранную из диапазона от приблизительно 5,0 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг и от приблизительно 10,0 мг/кг до приблизительно 25 мг/кг.Так, например, дозу выбирают из группы, состоящей из: приблизительно 0,25 мг/кг, приблизительно 0,33 мг/кг, приблизительно 0,66 мг/кг, приблизительно 1,00 мг/кг, приблизительно 1,10 мг/кг, приблизительно 1,20 мг/кг, приблизительно 1,30 мг/кг, приблизительно 1,40 мг/кг, приблизительно 1,50 мг/кг, приблизительно 1,60 мг/кг, приблизительно 1,70 мг/кг, приблизительно 1,80 мг/кг, приблизительно 1,90 мг/кг, приблизительно 2,00 мг/кг, приблизительно 3,00 мг/кг, приблизительно 4,00 мг/кг, приблизительно 5,00 мг/кг, приблизительно 6,00 мг/кг, приблизительно 7,00 мг/кг, приблизительно 8,00 мг/кг, приблизительно 9,00 мг/кг, приблизительно 10,0 мг/кг, приблизительно 11,0 мг/кг, приблизительно 12,0 мг/кг, приблизительно 13,0 мг/кг, приблизительно 14,0 мг/кг, приблизительно 15,0 мг/кг, приблизительно 16,0 мг/кг, приблизительно 17,0 мг/кг, приблизительно 18,0 мг/кг, приблизительно 19,0 мг/кг, приблизительно 20,0 мг/кг, приблизительно 21,0 мг/кг, приблизительно 22,0 мг/кг, приблизительно 23,0 мг/кг, приблизительно 24,0 мг/кг, приблизительно 25,0 мг/кг, приблизительно 26,0 мг/кг, приблизительно 27,0 мг/кг, приблизительно 28,0 мг/кг, приблизительно 29,0 мг/кг, приблизительно 30,0 мг/кг, приблизительно 31,0 мг/кг, приблизительно 32,0 мг/кг, приблизительно 33,0 мг/кг, приблизительно 34,0 мг/кг, приблизительно 35,0 мг/кг, приблизительно 36,0 мг/кг, приблизительно 37,0 мг/кг, приблизительно 38,0 мг/кг, приблизительно 39,0 мг/кг, приблизительно 40,0 мг/кг, приблизительно 41,0 мг/кг, приблизительно 42,0 мг/кг, приблизительно 43,0 мг/кг, приблизительно 44,0 мг/кг, приблизительно 45,0 мг/кг, приблизительно 46,0 мг/кг, приблизительно 47,0 мг/кг, приблизительно 48,0 мг/кг, приблизительно 49,0 мг/кг и приблизительно 50,0 мг/кг.Описанные здесь дозы могут быть введены один раз в день или, в некоторых вариантах осуществления изобретения, два раза в день.
[0181] В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственный препарат вводят индивидууму, находящемуся на диете с ограничением метионина. Альтернативно, лекарственный препарат вводят индивидууму, который не находится на диете с ограничением метионина. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственный препарат вводят индивидууму с повышенным уровнем tHcy. В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуумом является пациент с генетически не наследуемой HCU.
[0182] В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственный препарат может быть введен вместе с другим терапевтическим средством для лечения HCU. Используемый здесь термин «совместное введение» означает введение двух или более компонентов. Эти компоненты для совместного введения включают, но не ограничиваются ими, бетаин или витамин B6. Совместное введение означает введение двух или более компонентов одновременно или с промежутком времени между введением, например, в 1 секунду, 5 секунд, 10 секунд, 15 секунд, 30 секунд, 45 секунд, 1 минуту, 2 минуты, 3 минуты, 4 минуты, 5 минут, 6 минут, 7 минут, 8 минут, 9 минут, 10 минут, 11 минут, 12 минут, 13 минут, 14 минут, 15 минут, 16 минут, 17 минут, 18 минут, 19 минут, 20 минут, 21 минуту, 22 минуты, 23 минуты, 24 минуты, 25 минут, 26 минут, 27 минут, 28 минут, 29 минут, 30 минут, 31 минуту, 32 минуты, 33 минуты, 34 минуты, 35 минут, 36 минут, 37 минут, 38 минут, 39 минут, 40 минут, 41 минуту, 42 минуты, 43 минуты, 44 минуты, 45 минут, 46 минут, 47 минут, 48 минут, 49 минут, 50 минут, 51 минуту, 52 минуты, 53 минуты, 54 минут, 55 минут, 56 минут, 57 минут, 58 минут, 59 минут, 1 час, 1,5 часа, 2 часа, 2,5 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 13 часов, 14 часов, 15 часов, 16 часов, 17 часов, 18 часов, 19 часов, 20 часов, 21 час, 22 часа, 23 часа, 1 день, 1,5 дня, 2 дня или 3 дня. В некоторых вариантах осуществления изобретения, промежуток времени между введением двух или более компонентов превышает 3 дня.
[0183] В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственный препарат может быть использован в качестве парентерального средства для длительного введения пациентам посредством подкожной (SC) инъекции с начальным интервалом введения доз один раз в неделю. Так, например, еженедельно вводят 6 доз лекарственного препарата. В некоторых вариантах осуществления изобретения, возраст индивидуума может составлять от 18 до 65 лет.В некоторых вариантах осуществления изобретения, аналогичное лечение может быть проведено индивидууму в возрасте по меньшей мере 16 лет.
[0184] В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение проводят в течение 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней или 6 дней. В некоторых вариантах осуществления изобретения, введение проводят в течение 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, 12 недель, 13 недель, 14 недель. 15 недель, 16 недель, 17 недель, 18 недель, 19 недель, 20 недель, 21 недели, 22 недель, 23 недель, 24 недель, 25 недель, 26 недель, 27 недель, 28 недель, 29 недель, 30 недель, 31 недели, 32 недель, 33 недель, 34 недель, 35 недель, 36 недель, 37 недель, 38 недель, 39 недель, 40 недель, 41 недели, 42 недель, 43 недель, 44 недель, 45 недель, 46 недель, 47 недель, 48 недель, 49 недель, 50 недель, 51 недели или 52 недель.
[0185] В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуумам с дефицитом CBS, включая пациентов с генетически наследуемой HCU или пациентов с генетически не наследуемой HCU с повышенными уровнями tHcy или с дефицитом CBS, вводят различные дозы для лечения, как описано в настоящей заявке, в соответствии с уровнем (уровнями) одного или нескольких метаболических индикаторов или других индикаторов или в зависимости от тяжести или прогрессирования заболевания. Так, например, индивидууму может быть введена доза 20NHS PEG-CBS в пределах предполагаемого диапазона терапевтических доз (например, от 0,25 до 10 мг/кг два раза в день) исходя из определения уровня tHcy у индивидуума или уровня другого метаболического индикатора. Таким образом, индивидуумы могут быть стратифицироваы в соответствии с метаболическими показателями тяжести или прогрессирования заболевания, описанными в настоящей заявке, и им может быть введена дозу 20NHS PEG-CBS в зависимости от тяжести или прогрессирования заболевания.
[0186] В качестве неограничивающего примера может быть определен уровень tHcy у индивидуума с дефицитом CBS. Оцененный уровень tHcy может быть стратифицирован как несколько выше низкого, среднего или высокого уровня.
[0187] В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровни tHcy несколько выше низкого составляют в диапазоне от приблизительно 10 мкмоль/л до приблизительно 50 мкмоль/л, то есть, приблизительно 10 мкмоль/л, приблизительно 15 мкмоль/л, приблизительно 20 мкмоль/л, приблизительно 25 мкмоль/л, приблизительно 30 мкмоль/л, приблизительно 35 мкмоль/л, приблизительно 40 мкмоль/л, приблизительно 45 мкмоль/л или приблизительно 50 мкмоль/л.
[0188] В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровни tHcy несколько выше среднего составляют в диапазоне от приблизительно 50 мкмоль/л до приблизительно 100 мкмоль/л, то есть, приблизительно 50 мкмоль/л, приблизительно 55 мкмоль/л, приблизительно 60 мкмоль/л, приблизительно 65 мкмоль/л, приблизительно 70 мкмоль/л, приблизительно 75 мкмоль/л, приблизительно 80 мкмоль/л, приблизительно 85 мкмоль/л, приблизительно 90 мкмоль/л, приблизительно 95 мкмоль/л или приблизительно 100 мкмоль/л.
[0189] В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровни tHcy несколько выше высокого составляют в диапазоне от приблизительно 100 мкмоль/л или выше, например, от приблизительно 100 мкмоль/л до приблизительно 1000 мкмоль/л или от приблизительно 100 мкмоль/л до приблизительно 500 мкмоль/л; то есть, приблизительно 100 мкмоль/л, приблизительно 110 мкмоль/л, приблизительно 120 мкмоль/л, приблизительно 130 мкмоль/л, приблизительно 140 мкмоль/л, приблизительно 150 мкмоль/л, приблизительно 160 мкмоль/л, приблизительно 170 мкмоль/л, приблизительно 180 мкмоль/л, приблизительно 190 мкмоль/л, приблизительно 200 мкмоль/л, приблизительно 210 мкмоль/л, приблизительно 220 мкмоль/л, приблизительно 230 мкмоль/л, приблизительно 240 мкмоль/л, приблизительно 250 мкмоль/л, приблизительно 260 мкмоль/л, приблизительно 270 мкмоль/л, приблизительно 280 мкмоль/л, приблизительно 290 мкмоль/л, приблизительно 300 мкмоль/л, приблизительно 310 мкмоль/л, приблизительно 320 мкмоль/л, приблизительно 330 мкмоль/л, приблизительно 340 мкмоль/л, приблизительно 350 мкмоль/л, приблизительно 360 мкмоль/л, приблизительно 370 мкмоль/л, приблизительно 380 мкмоль/л, приблизительно 390 мкмоль/л, приблизительно 400 мкмоль/л, приблизительно 410 мкмоль/л, приблизительно 420 мкмоль/л, приблизительно 430 мкмоль/л, приблизительно 440 мкмоль/л, приблизительно 450 мкмоль/л, приблизительно 460 мкмоль/л, приблизительно 470 мкмоль/л, приблизительно 480 мкмоль/л, приблизительно 490 мкмоль/л или приблизительно 500 мкмоль/л.
[0190] В некоторых вариантах осуществления изобретения, дозу 20NHS PEG-CBS в пределах ожидаемого диапазона терапевтических доз (от 0,25 до 10 мг/кг) вводят индивидууму исходя из определения уровня tHcy у индивидуума как несколько выше низкого, среднего или высокого уровня. Так, например, индивидууму может быть введена низкая доза, средняя доза или высокая доза, соответственно. В некоторых вариантах осуществления изобретения, низкая доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 0,25 мг/кг до приблизительно 1,0 мг/кг, то есть, приблизительно 0,25 мг/кг, приблизительно 0,50 мг/кг, приблизительно 0,75 мг/кг или приблизительно 1 мг/кг.В некоторых вариантах осуществления изобретения, средняя доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 1,5 мг/кг, то есть, приблизительно 0,5 мг/кг, 0,75 мг/кг, 1 мг/кг, 1,25 мг/кг или приблизительно 1,5 мг/кг.В некоторых вариантах осуществления изобретения, высокая доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 2 мг/кг, то есть, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 1,25 мг/кг, приблизительно 1,50 мг/кг, приблизительно 1,75 мг/кг или приблизительно 2 мг/кг.В некоторых вариантах осуществления изобретения, высокая доза 20NHS PEG-CBS включает дозу выше приблизительно 2 мг/кг, то есть, приблизительно 2,25 мг/кг, приблизительно 2,50 мг/кг, приблизительно 2,75 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 3,25 мг/кг, приблизительно 3,50 мг/кг, приблизительно 3,75 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, приблизительно 4,25 мг/кг, приблизительно 4,50 мг/кг, приблизительно 4,75 мг/кг или приблизительно 5 мг/кг или выше.
[0191] В некоторых вариантах осуществления изобретения, лекарственный препарат вводят в виде комбинированной терапии с пиридоксином (также называемым витамином B6) и/или с антитромбоцитарной терапией. В некоторых вариантах осуществления изобретения, витамин B12 вводят в виде комбинированной терапии с пиридоксином и/или с антитромбоцитарной терапией. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фолат/фолиевую кислоту вводят в виде комбинированной терапии с пиридоксином и/или с антитромбоцитарной терапией. Соответственно, некоторые варианты описанных здесь способов лечения включают введение лекарственного препарата, описанного в настоящей заявке, вместе с одним или более таких препаратов, как пиридоксин, антитромбоцитарные средства, витамин B12 и/или фолат/фолиевая кислота.
VII. Стратификация пациентов
[0192] Используемый здесь термин «стратификация пациентов» относится к применению клинических, биохимических, молекулярных, поведенческих, когнитивных или других показателей прогрессирования заболевания или тяжести заболевания у пациентов, имеющих HCU или с подозрением на HCU. В некоторых вариантах осуществления изобретения, стратификация пациентов в соответствии с клиническими, биохимическими, молекулярными, поведенческими, когнитивными или другими показателями прогрессирования заболевания или тяжести заболевания включает количественную или качественную регистрацию одного или нескольких клинических, биохимических, молекулярных, поведенческих, когнитивных или других показателей прогрессирования заболевания или тяжести заболевания у пациента или у группы пациентов и ранжирование пациента или группы пациентов по шкале прогрессирования или тяжести заболевания в соответствии с зарегистрированными качественными или количественными показателями для пациента или группы пациентов по сравнению с соответствующими количественными или качественными данными или наблюдениями группы здоровых пациентов (то есть, группы пациентов, которые, как известно, не имеют HCU) и/или контрольной группы пациентов, которые, как известно, имеют HCU. Стратификация пациентов в соответствии с описанными здесь способами может облегчить клиническую диагностику, исследования и/или лечение CSBDH в различных аспектах. Так, например, стратификация пациентов, основанная на клинических, биохимических, молекулярных, поведенческих, когнитивных или других показателях прогрессирования заболевания или тяжести заболевания, описанных в настоящей заявке, может служить критерием для включения индивидуумов в программу клинических испытаний, определения лечебных доз, определения схемы лечения и/или информации о дополнительных способах лечения или терапии, которые могут быть проведены в комбинации с описанными здесь способами ферментной терапии для ослабления симптомов у пациента и/или улучшения качества жизни пациента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуумами, подходящими для их включения в программу эффективной ферментной терапии с использованием лекарственного препарата, описанного в настоящей заявке, являются пациенты с диагнозом HCU, основанным на подтверждении генетической CBS-дефицитной гомоцистинурии с помощью анализа на мутацию гена CBS и на уровне tHcy в плазме, превышающем или равном 80 мкМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуумами, подходящими для их включения в программу клинических испытаний при ферментной терапии с использованием лекарственного препарата, описанного в настоящей заявке, являются пациенты с диагнозом HCU, основанным на подтверждении генетической CBS-дефицитной гомоцистинурии с помощью анализа на мутацию гена CBS и на уровне tHcy в плазме, превышающем или равном 80 мкМ.
[0193] В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуумам с дефицитом CBS вводят различные лечебные дозы, как описано в настоящей заявке, в соответствии с уровнем(ями) одного или нескольких метаболических показателей. Так, например, индивидууму может быть введена доза 20NHS PEG-CBS в пределах предполагаемого диапазона терапевтических доз (например, от 0,25 до 10 мг/кг два раза в день) исходя из оценки уровня tHcy у индивидуума или уровня другого метаболического показателя. Таким образом, индивидуумы могут быть стратифицированы в соответствии с описанными здесь метаболическими показателями тяжести или прогрессирования заболевания, и им может быть введена доза 20NHS PEG-CBS в зависимости от тяжести или прогрессирования заболевания.
[0194] В качестве неограничивающего примера может быть определен уровень tHcy у индивидуума с дефицитом CBS. Оцененный уровень tHcy может быть стратифицирован как уровень несколько выше низкого, среднего или высокого.
[0195] В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровни tHcy несколько выше низкого находятся в диапазоне от приблизительно 10 мкмоль/л до приблизительно 50 мкмоль/л, то есть, приблизительно 10 мкмоль/л, приблизительно 15 мкмоль/л, приблизительно 20 мкмоль/л, приблизительно 25 мкмоль/л, приблизительно 30 мкмоль/л, приблизительно 35 мкмоль/л, приблизительно 40 мкмоль/л, приблизительно 45 мкмоль/л или приблизительно 50 мкмоль/л.
[0196] В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровни tHcy несколько выше среднего находятся в диапазоне от приблизительно 50 мкмоль/л до приблизительно 100 мкмоль/л, то есть, приблизительно 50 мкмоль/л, приблизительно 55 мкмоль/л, приблизительно 60 мкмоль/л, приблизительно 65 мкмоль/л, приблизительно 70 мкмоль/л, приблизительно 75 мкмоль/л, приблизительно 80 мкмоль/л, приблизительно 85 мкмоль/л, приблизительно 90 мкмоль/л, приблизительно 95 мкмоль/л или приблизительно 100 мкмоль/л.
[0197] В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровни tHcy несколько выше высокого находятся в диапазоне от приблизительно 100 мкмоль/л или выше, например, от приблизительно 100 мкмоль/л до приблизительно 1000 мкмоль/л или от приблизительно 100 мкмоль/л до приблизительно 500 мкмоль/л; то есть, приблизительно 100 мкмоль/л, приблизительно 110 мкмоль/л, приблизительно 120 мкмоль/л, приблизительно 130 мкмоль/л, приблизительно 140 мкмоль/л, приблизительно 150 мкмоль/л, приблизительно 160 мкмоль/л, приблизительно 170 мкмоль/л, приблизительно 180 мкмоль/л, приблизительно 190 мкмоль/л, приблизительно 200 мкмоль/л, приблизительно 210 мкмоль/л, приблизительно 220 мкмоль/л, приблизительно 230 мкмоль/л, приблизительно 240 мкмоль/л, приблизительно 250 мкмоль/л, приблизительно 260 мкмоль/л, приблизительно 270 мкмоль/л, приблизительно 280 мкмоль/л, приблизительно 290 мкмоль/л, приблизительно 300 мкмоль/л, приблизительно 310 мкмоль/л, приблизительно 320 мкмоль/л, приблизительно 330 мкмоль/л, приблизительно 340 мкмоль/л, приблизительно 350 мкмоль/л, приблизительно 360 мкмоль/л, приблизительно 370 мкмоль/л, приблизительно 380 мкмоль/л, приблизительно 390 мкмоль/л, приблизительно 400 мкмоль/л, приблизительно 410 мкмоль/л, приблизительно 420 мкмоль/л, приблизительно 430 мкмоль/л, приблизительно 440 мкмоль/л, приблизительно 450 мкмоль/л, приблизительно 460 мкмоль/л, приблизительно 470 мкмоль/л, приблизительно 480 мкмоль/л, приблизительно 490 мкмоль/л или приблизительно 500 мкмоль/л.
[0198] В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидууму вводят дозу 20NHS PEG-CBS в пределах предполагаемого диапазона терапевтических доз (например, от 0,25 до 10 мг/кг два раза в день) на основе оцененного уровня tHcy индивидуума как уровень несколько выше низкого, среднего или высокого. Так, например, индивидууму может быть введена низкая доза, средняя доза или высокая доза, соответственно. В некоторых вариантах осуществления изобретения, низкая доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 0,25 мг/кг до приблизительно 1,0 мг/кг, то есть, приблизительно 0,25 мг/кг, приблизительно 0,50 мг/кг, приблизительно 0,75 мг/кг или приблизительно 1 мг/кг.В некоторых вариантах осуществления изобретения, средняя доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 1,5 мг/кг, то есть, приблизительно 0,5 мг/кг, 0,75 мг/кг, 1 мг/кг, 1,25 мг/кг или приблизительно 1,5 мг/кг.В некоторых вариантах осуществления изобретения, высокая доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 2 мг/кг, то есть, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 1,25 мг/кг, приблизительно 1,50 мг/кг, приблизительно 1,75 мг/кг.или приблизительно 2 мг/кг.В некоторых вариантах осуществления изобретения, высокая доза 20NHS PEG-CBS включает дозу выше приблизительно 2 мг/кг, то есть, приблизительно 2,25 мг/кг, приблизительно 2,50 мг/кг, приблизительно 2,75 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 3,25 мг/кг, приблизительно 3,50 мг/кг, приблизительно 3,75 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, приблизительно 4,25 мг/кг, приблизительно 4,50 мг/кг, приблизительно 4,75 мг/кг или приблизительно 5 мг/кг или выше.
A. Клиническая картина
[0199] В соответствии с «Руководством по диагностике и лечению HCU», такое заболевание следует подозревать у детей с тяжелой или быстро прогрессирующей миопатией, вывихом хрусталика и/или задержкой развития (см. публикацию Morris et al. Guidelines for the diagnosis and management of cystathionine beta-synthase deficiency. J Inherit Metab Dis 2017;40:49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Тесты также необходимо проводить у взрослых с тромбоэмболией и/или вывихом хрусталика, но без других симптомов, а также у пациентов с мультисистемным заболеванием, включая глазные болезни, болезни соединительной ткани, нервно-психические заболевания и сосудистые осложнения (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Morris et al. Guidelines for the diagnosis and management of cystathionine beta-synthase deficiency. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74; Kelly et al. Neurology 2003;60:275-279, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
B. Биохимический анализ
1. Уровни общего гомоцистеина
[0200] Уровни tHcy в плазме определяют по сумме всех видов свободного и связанного гомоцистеина после обработки плазмы восстановителем. У здоровых людей со стабильными пищевыми привычками, уровни tHcy остаются относительно постоянными с течением времени (см. публикации Refsum et al. Clin Chem 2004; 50:3-32; McKinley et al. Clin Chem 2001; 47:1430-1436; каждая из которых в полном объеме включена в нстоящее описание посредством ссылки). Однако, потребление пищи, богатой белком, может повышать уровни tHcy приблизительно на 10% в течение нескольких часов (см. публикацию Verhoef et al. Am J Clin Nutr 2005; 82:553-558, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Исследование у индивидуумов с гипергомоцистеинемией (tHcy>40 мкмоль/л) показало, что индивидуальные уровни tHcy варьировались до 25% в течение периода времени от 4 до 8 месяцев. Однако, не было представлено какой-либо информации о разнообразии рационов, методов анализа и времени отбора проб, что затрудняло интерпретацию данных (см. публикацию Refsum H, Smith AD, Ueland PM et al. Facts and recommendations about total homocysteine determinations: an expert opinion. Clin Chem 2004; 50:3-32, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0201] У групп пациентов, которые не получали добавку с фолатом, соответствующие верхние исходные пределы составляют приблизительно 15 и 20 мкмоль/л, соответственно. Для подтверждения диагноза CBS у новорожденных, ожидаемый уровень tHcy в плазме должен составлять в пределах от 50 до более, чем 100 мкмоль/л, а уровень Met в плазме должен составлять в пределах от 200 до 1500 мкмоль/л (то есть, 3-23 мг/дл) (см. публикацию Sacharow et al. Homocystinuria Caused by Cystathionine Beta-Synthase Deficiency. GeneReviews 2017, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Для подтверждения диагноза CBS у людей более старшего возраста, не прошедших лечение, ожидаемый уровень tHcy в плазме должен составлять более, чем 100 мкмоль/л, а уровень Met в плазме должен составлять более, чем 50 мкмоль/л (то есть, выше 0,7 мг/дл). Ожидается, что у контрольного новорожденного или пожилого человека, уровень tHcy в плазме будет составлять менее 15 мкмоль/л, а уровень Met будет составлять от 10 до 40 мкмоль/л (0,2-0,6 мг/дл).
[0202] В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуумам с повышенным уровнем tHcy и/или дефицитом CBS вводят различные лечебные дозы, как описано в настоящей заявке, в соответствии с уровнем(ями) tHcy. Так, например, индивидууму может быть введена доза 20NHS PEG-CBS в пределах предполагаемого диапазона терапевтических доз (например, от 0,25 до 10 мг/кг) исходя из оценки уровня tHcy у индивидуума. Таким образом, индивидуумы могут быть стратифицированы в соответствии с описанными здесь метаболическими показателями тяжести или прогрессирования заболевания, и им может быть введена доза 20NHS PEG-CBS в зависимости от тяжести или прогрессирования заболевания.
[0203] В качестве неограничивающего примера может быть оценен уровень tHcy у индивидуума с дефицитом CBS. Оцененный уровень tHcy может быть стратифицирован как уровень несколько выше низкого, среднего или высокого.
[0204] В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровни tHcy несколько выше низкого находятся в диапазоне от приблизительно 10 мкмоль/л до приблизительно 50 мкмоль/л, то есть, приблизительно 10 мкмоль/л, приблизительно 15 мкмоль/л, приблизительно 20 мкмоль/л, приблизительно 25 мкмоль/л. L, приблизительно 30 мкмоль/л, приблизительно 35 мкмоль/л, приблизительно 40 мкмоль/л, приблизительно 45 мкмоль/л или приблизительно 50 мкмоль/л.
[0205] В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровни tHcy несколько выше среднего находятся в диапазоне от приблизительно 50 мкмоль/л до приблизительно 100 мкмоль/л, то есть, приблизительно 50 мкмоль/л, приблизительно 55 мкмоль/л, приблизительно 60 мкмоль/л, приблизительно 65 мкмоль/л. L, приблизительно 70 мкмоль/л, приблизительно 75 мкмоль/л, приблизительно 80 мкмоль/л, приблизительно 85 мкмоль/л, приблизительно 90 мкмоль/л, приблизительно 95 мкмоль/л или приблизительно 100 мкмоль/л.
[0206] В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровни tHcy несколько выше высокого находятся в диапазоне от приблизительно 100 мкмоль/л или выше, например, от приблизительно 100 мкмоль/л до приблизительно 1000 мкмоль/л или от приблизительно 100 мкмоль/л до приблизительно 500 мкмоль/л; то есть, приблизительно 100 мкмоль/л, приблизительно 110 мкмоль/л, приблизительно 120 мкмоль/л, приблизительно 130 мкмоль/л, приблизительно 140 мкмоль/л, приблизительно 150 мкмоль/л, приблизительно 160 мкмоль/л, приблизительно 170 мкмоль/л, приблизительно 180 мкмоль/л, приблизительно 190 мкмоль/л, приблизительно 200 мкмоль/л, приблизительно 210 мкмоль/л, приблизительно 220 мкмоль/л, приблизительно 230 мкмоль/л, приблизительно 240 мкмоль/л, приблизительно 250 мкмоль/л, приблизительно 260 мкмоль/л, приблизительно 270 мкмоль/л, приблизительно 280 мкмоль/л, приблизительно 290 мкмоль/л, приблизительно 300 мкмоль/л, приблизительно 310 мкмоль/л, приблизительно 320 мкмоль/л, приблизительно 330 мкмоль/л, приблизительно 340 мкмоль/л, приблизительно 350 мкмоль/л, приблизительно 360 мкмоль/л, приблизительно 370 мкмоль/л, приблизительно 380 мкмоль/л, приблизительно 390 мкмоль/л, приблизительно 400 мкмоль/л, приблизительно 410 мкмоль/л, приблизительно 420 мкмоль/л, приблизительно 430 мкмоль/л, приблизительно 440 мкмоль/л, приблизительно 450 мкмоль/л, приблизительно 460 мкмоль/л, приблизительно 470 мкмоль/л, приблизительно 480 мкмоль/л, приблизительно 490 мкмоль/л или приблизительно 500 мкмоль/л.
[0207] В некоторых вариантах осуществления изобретения, дозу 20NHS PEG-CBS в пределах ожидаемого диапазона терапевтических доз (от 0,25 до 10 мг/кг) вводят индивидууму исходя из оценки уровня tHcy у индивидуума как уровень несколько выше низкого, среднего или высокого. Так, например, индивидууму может быть введена низкая доза, средняя доза или высокая доза, соответственно. В некоторых вариантах осуществления изобретения, низкая доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 0,25 мг/кг до приблизительно 1,0 мг/кг, то есть, приблизительно 0,25 мг/кг, приблизительно 0,50 мг/кг, приблизительно 0,75 мг/кг или приблизительно 1 мг/кг.В некоторых вариантах осуществления изобретения, средняя доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 1,5 мг/кг, то есть, приблизительно 0,5 мг/кг, 0,75 мг/кг, 1 мг/кг, 1,25 мг/кг или приблизительно 1,5 мг/кг.В некоторых вариантах осуществления изобретения, высокая доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 2 мг/кг, то есть, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 1,25 мг/кг, приблизительно 1,50 мг/кг, приблизительно 1,75 мг/кг.или приблизительно 2 мг/кг.В некоторых вариантах осуществления изобретения, высокая доза 20NHS PEG-CBS включает дозу выше приблизительно 2 мг/кг, то есть, приблизительно 2,25 мг/кг, приблизительно 2,50 мг/кг, приблизительно 2,75 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 3,25 мг/кг, приблизительно 3,50 мг/кг, приблизительно 3,75 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, приблизительно 4,25 мг/кг, приблизительно 4,50 мг/кг, приблизительно 4,75 мг/кг или приблизительно 5 мг/кг или выше.
2. Уровни метионина
[0208] Уровни Met от высоких до уровней выше нормы (эталонные диапазоны обычно составляют от 40 до 45 и от 12 до 15 мкмоль/л, соответственно) в сочетании с уровнями Cth от низких до уровней ниже нормы (эталонные диапазоны от 0,05 до 0,08 и от 0,35 до 0,5 мкмоль/л, соответственно) могут оказаться полезными для идентификации HCU от HCU, вызываемой генетическими и алиментарными нарушениями реметилирования Hcy (см. публикации Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74; Stabler et al. JIMD Rep 2013; 11:149-163; Bartl et al., Clin Chim Acta 2014; 437:211-217, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Другой подходящий анализ позволяет определить уровень продуцирования Cth из Hcy и серина в культивируемых фибробластах с использованием радиоактивных или меченных дейтерием субстратов (см. публикации Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74; Kraus JP. Methods Enzymol 1987; 143:388-394; Smith et al., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2012; 911:186-191, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Однако, ферментный анализ не всегда позволяет выявить индивидуумов, чувствительных к пиридоксину и невосприимчивых к нему, при этом, в легких случаях, ферментативная активность может быть нормальной (см. публикацию Alcaide et al. Clin Chim Acta 2015; 438:261-265, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Проведенные совсем недавно экспресс-анализы с использованием стабильных изотопов, позволяющие определить активность CBS, высвобождаемого из органов в плазму, показали 100% чувствительность у пациентов, не отвечающих на пиридоксин, и только 86% чувствительность у пациентов, отвечавших на пиридоксин (см. публикации Alcaide et al. Clin Chim Acta 2015; 438: 261). 265; Krijt et al., J Inherit Metab Dis 2011;34:49-55, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки).
[0209] Уровни метионина ≥600 мкМ, а в некоторых случаях более ≥1000 мкМ, а также уровни диметилглицина (DMG) выше верхней границы нормы (ULN) наблюдаются в значительном количестве даже у пациентов, получающих лечение с соблюдением диеты с ограниченным содержанием природного белка, и/или лечение с использованием смеси L-аминокислот, не содержащей Met, и добавок, включая бетаин, как описано в Примерах 4-5 и продемонстрировано в Таблице 5 и на фиг. 1. Эти данные показали, что современная диета и терапевтическое лечение оказались малоэффективными. В частности, вопреки распространенному мнению, бетаин сам по себе не является адекватным средством для лечения HCU. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять взаимосвязь между реакцией пациента на стандартное лечение и повышенным уровнем метионина, DMG и других биохимических показателей. В некоторых вариантах описанных здесь способов, оценка и мониторинг уровней различных биохимических показателей могут оказаться полезными для идентификации и стратификации индивидуумов с HCU с точки зрения тяжести заболевания и реакции пациента на лечение.
[0210] В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуумам с дефицитом CBS вводят различные лечебные дозы, как описано в настоящей заявке, в соответствии с уровнем(ями) метионина. Так, например, индивидууму может быть введена доза 20NHS PEG-CBS в пределах предполагаемого диапазона терапевтических доз (от 0,25 до 10 мг/кг) исходя из оценки уровня метионина у индивидуума. Таким образом, индивидуумы могут быть стратифицированы в соответствии с описанными здесь метаболическими показателями тяжести или прогрессирования заболевания, и им может быть введена доза 20NHS PEG-CBS в зависимости от тяжести или прогрессирования заболевания.
[0211] В качестве неограничивающего примера может быть оценен уровень tHcy у индивидуума с дефицитом CBS. Оцененный уровень tHcy может быть стратифицирован как уровень несколько выше низкого или высокого. В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровень метионина несколько выше низкого составляет от приблизительно 10 мкмоль/л до приблизительно 100 мкмоль/л, а уровень метионина несколько выше высокого составляет от приблизительно 100 мкмоль/л до приблизительно 500 мкмоль/л или выше приблизительно 150 мкмоль/л.
3. Уровни креатинина
[0212] Уровни креатинина ниже нижнего предела нормы (LLN) могут быть использованы для выявления и стратификации HCU у детей и взрослых пациентов, включая стратификацию на основе реакции пациента на диету с ограничением метионина и/или на введение бетаина и/или витаминной добавки. Снижение уровня креатинина может быть связано с низкой мышечной массой, после ограничения уровня белка у индивидуумов, соблюдающих диету с ограничением белка. Таким образом, уровни креатинина ниже LLN могут быть использованы для мониторинга и стратификации индивидуумов, которым была назначена ограниченная диета и/или индивидуумов, соблюдающих такую диету.
4. Уровни С-реактивного белка
[0213] Уровни высокочувствительного С-реактивного белка (hsCRP) выше ULN могут быть использованы для выявления и стратификации HCU у пациентов, включая стратификацию на основе реакции пациента на диету с ограничением метионина и/или на прием бетаиновой и/или витаминной добавки.
[0214] Низкие уровни активности белка С и/или низкие уровни фибриногена могут быть использованы для выявления и стратификации HCU у пациентов, включая стратификацию на основе реакции пациента на диету с ограничением метионина и/или на прием бетаиновой и/или витаминной добавки.
5. Другие метаболические показатели
[0215] Более точный биохимический анализ с использованием ряда биохимических показателей по отдельности или в комбинации может быть проведен для стратификации пациентов в целях диагностики или лечения HCU (см. Пример 5, Таблицу 5, фиг. 1). В качестве альтернативы, биохимические маркеры могут быть использованы для мониторинга реакции пациента на традиционные методы лечения, не относящиеся к ЕТ. Способы ЕТ-лечения, описанные в настоящей заявке, могут в некоторых случаях корректировать повышение или снижение этих биохимических маркеров за пределы нормальных диапазонов у индивидуумов, находящихся на диете с ограниченным содержанием метионина, или у индивидуумов, принимающих витаминные или бетаиновые добавки. В дополнение к повышенным уровням tHcy и Met и низким уровням цистатионина и общего цистеина, нижеследующие биохимические показатели могут помочь выявить и стратифицировать HCU у индивидуумов, например, на основе реакции пациента на ограниченную диету и/или с применением способов лечения путем приема бетаиновых и витаминных добавок.
[0216] В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровни метионина, уровни DMG, уровни ALT, уровни креатинина, уровни hsCRP и/или уровни активности белка C могут быть использованы по отдельности или в комбинации для выявления и стратификации HCU у пациентов, включая стратификацию на основе ответа пациента на диету с ограничением метионина и/или на введение бетаиновых и/или витаминных добавок. Использование нескольких из этих биохимических показателей может повысить чувствительность и точность диагностики и стратификации. Эти биохимические показатели могут быть дополнительно объединены с биохимическими показателями, которые, как известно, находятся в пределах нормы у пациентов с HCU. Так, например, нормальные уровни аспартатаминотрансферазы (AST), антитромбина III и аполипопротеина А могут быть использованы для дальнейшей идентификации и стратификации пациентов с HCU.
6. Коррекция лечения дефицита CBS по метаболическим показателям
[0217] В некоторых вариантах осуществления изобретения, лечение дефицита CBS, как описано в настоящей заявке, может быть скорректировано по дозе в соответствии с уровнями одного или нескольких метаболических показателей тяжести или прогрессирования заболевания, представленных в настоящей заявке. Так, например, если оценка или определение одного или нескольких метаболических показателей прогрессирования или тяжести заболевания указывает на тяжелое или ярко выраженное прогрессирование дефицита CBS, то при лечении дефицита CBS, препарат 20NHS PEG-CBS может быть введен в низкой дозе, в средней дозе или в высокой дозе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, низкая доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 0,25 мг/кг до приблизительно 1,0 мг/кг, то есть, приблизительно 0,25 мг/кг, приблизительно 0,50 мг/кг, приблизительно 0,75 мг/кг или приблизительно 1 мг/кг.В некоторых вариантах осуществления изобретения, средняя доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 1,5 мг/кг, то есть, приблизительно 0,5 мг/кг, 0,75 мг/кг, 1 мг/кг, 1,25 мг/кг или приблизительно 1,5 мг/кг.В некоторых вариантах осуществления изобретения, высокая доза 20NHS PEG-CBS составляет от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 2 мг/кг, то есть, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 1,25 мг/кг, приблизительно 1,50 мг/кг, приблизительно 1,75 мг/кг.или приблизительно 2 мг/кг.В некоторых вариантах осуществления изобретения, высокая доза 20NHS PEG-CBS включает дозу выше приблизительно 2 мг/кг, то есть, приблизительно 2,25 мг/кг, приблизительно 2,50 мг/кг, приблизительно 2,75 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 3,25 мг/кг, приблизительно 3,50 мг/кг, приблизительно 3,75 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, приблизительно 4,25 мг/кг, приблизительно 4,50 мг/кг, приблизительно 4,75 мг/кг или приблизительно 5 мг/кг или выше.
C. Молекулярная диагностика
[0218] Молекулярно-генетическое тестирование может быть осуществлено либо путем тестирования на один ген, либо на панель из множества генов (см. публикации Yap S. Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. Orphanet Encyclopaedia [serial online] 2005; Sacharow SJ, Picker JD, Levy HL. Homocystinuria Caused by Cystathionine Beta-Synthase Deficiency. GeneReviews 2017; Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74; Katsanis et al. Nat Rev Genet 2013; 14:415-426; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Индивидуумы с высоким риском наличия определенной мутации CBS должны пройти скрининг посредством целевого тестирования одного гена. Однако, это полезно только для отдельных групп с распространенной мутацией CBS (например, 93% индивидуумов с HCU из Катара имеют мутацию p.Arg336Cys; c.1006C>T) и для людей из семей с известным патогенным вариантом. У других пациентов, ген CBS может быть секвенирован, а анализ на делеции/дупликации гена-мишени может быть проведен только в случае обнаружения одного патогенного варианта или его отсутствия. В Таблице 3 представлен неограничивающий список генетических мутаций, которые могут быть использованы для идентификации и стратификации HCU у пациентов.
[0219] Альтернативно, одновременное молекулярное тестирование нескольких генов может быть осуществлено с использованием панели нескольких генов. Используемые методы могут включать анализ последовательности, анализ на делеции/дупликации и другие тесты, не основанные на секвенировании (см. публикациию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Обычно, молекулярно-генетическое тестирование предназначено для групп с высоким риском с ограниченным числом распространенных мутаций (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74; Huemer et al. J Inherit Metab Dis 2015;38:1007-101), каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
D. Тесты на чувствительность к пиридоксину
[0220] В клинике проводятся тесты на чувствительность к пиридоксину, чтобы определить, следует ли назначать добавки пиридоксина пациентам с HCU. Поскольку разные лечебные центры по-разному определяют чувствительность к пиридоксину (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), то классификация пациентов по уровням tHcy, а не по их чувствительности к пиридоксину, является более строгой. Реакция на пиридоксин не является мерой метаболического контроля, а скорее указывает на то, что сохраняется некоторая остаточная активность CBS.
E. Скрининг новорожденных (NBS)
[0221] Обычно, тесты NBS на дефицит HCU проводят путем анализа высушенных пятен крови для определения уровней Met. Альтернативно, оценка уровней tHcy, а не Met, в высушенных пятнах крови для NBS доступна в нескольких Центрах по всему миру. Этот тест используется в качестве теста второго уровня для снижения частоты ложноположительных результатов NBS у индивидуумов с высоким уровнем Met (см. публикацию Turgeon et al. Clin Chem 2010; 56:1686-1695, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) и не используется для повышения чувствительности или снижения частоты ложноотрицательных результатов.
F. Когнитивные функции
[0222] У пациентов с более низкими уровнями tHcy в плазме наблюдаются лучшие показатели исполнительной функции. Набор инструментов NIH или другие методы оценки нейроповеденческих или когнитивных функций могут быть использованы для оценки и стратификации пациентов в соответствии с их когнитивными функциями с течением времени, включая мониторинг реакции на лечение. Корреляции между когнитивными функциями и уровнями tHcy могут быть также использованы для стратификации пациентов (см., например, Таблицу 9, фиг. 3 и фиг. 4). Сниженные уровни tHcy у индивидуума после ЕТ, как описано в настоящей заявке, могут быть использованы в качестве показателя того, что у этого индивидуума будет улучшен результат лечения нейроповеденческих или когнитивных расстройств. С другой стороны, повышенные уровни tHcy могут указывать на то, что индивидуум нуждается или может получить пользу от лечения нейроповеденческих или когнитивных расстройств в комбинации с ET, как описано в настоящей заявке. Так, например, уровни tHcy>50 мкМ,>60 мкМ,>70 мкМ,>80 мкМ,>90 мкМ или>100 мкМ могут быть использованы в качестве порога для оценки и/или мониторинга нейроповеденческой и когнитивной функции и/или в качестве показателя восприимчивости пациента или его потребности в лечении нейроповеденческих или когнитивных расстройств или в лечении пациентов, имеющих HCU или с подозрением на HCU. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лечение нейроповеденческих или когнитивных расстройств включает поддержку, аналогичную той, которая применяется при других проблемах исполнительных функций, таких как ADHD, включая, например, поведенческую терапию, такую как тренинг родителями по обучению поведению детей (BPT) и контроль за поведением в классе (BCM) (см. например, публикации Pelham Jr, William E., and Gregory A. Fabiano. «Evidence-based psychosocial treatments for attention-deficit/hyperactivity disorder» Journal of Clinical Child & Adolescent Psychology 37.1 (2008): 184-214; and Pfiffner, Linda J., and Lauren M. Haack. “Behavior management for school-aged children with ADHD». Child and Adolescent Psychiatric Clinics 23.4 (2014): 731-746, содержание каждой из которых в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки).
G. Стратификация пациентов с генетически не наследуемым заболеванием
[0223] Описанные здесь композиции и способы могут быть использованы для лечения или ослабления осложнений или состояний, ассоциированных с повышенными уровнями tHcy, в том числе у индивидуумов или группы индивидуумов с генетически не наследуемыми заболеваниямиями, ассоциированными с повышенными уровнями tHcy.
[0224] С использованием базы данных Broad Institute GnomAD для консервативного скрининга частоты мутаций CBS, было подсчитано, что в США были выявлены тысячи пациентов с вариантами CBS с потерей функции и/или миссенс-мутациями. По некоторым оценкам, насчитывается более 4000 человек с вариантами CBS с потерей функции и/или миссенс-мутацией, в то время как по другим оценкам насчитывается более 14000 человек с вариантами CBS с потерей функции и/или миссенс-мутацией.
[0225] Тестирование tHcy является распространенным и недорогим способом. По оценкам специалистов, 5 миллионов пациентов в год проходят тестирование на tHcy. От 31000 до 35000 пациентов демонстрируют уровни tHcy более, чем на 2 стандартных отклонения выше среднего. Многие пациенты с повышенным уровнем tHcy имеют в анамнезе диагнозы, которые также связаны с классической HCU, но менее 10% имеют зарегистрированный диагноз HCU или нарушения метаболизма серусодержащих аминокислот.Многие из этих пациентов могут иметь генетически не наследуемые повышенные уровни tHcy.
[0226] Используемый здесь термин «повышенные уровни tHcy» относится к уровням tHcy (то есть, к уровням общего гомоцистеина в плазме), превышающим нормальное среднее значение, ожидаемое для индивидуума исходя из возраста, пола, режима питания или других факторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, у индивидуумов с повышенными уровнями tHcy, такие уровни составляют выше приблизительно 4 мкмоль/л, выше приблизительно 5 мкмоль/л, выше приблизительно 6 мкмоль/л, выше приблизительно 7 мкмоль/л, выше приблизительно 8 мкмоль/л, выше приблизительно 9 мкмоль/л, выше приблизительно 10 мкмоль/л, выше приблизительно 11 мкмоль/л, выше приблизительно 12 мкмоль/л, выше приблизительно 13 мкмоль/л, выше приблизительно 14 мкмоль/л, выше приблизительно 15 мкмоль/л, выше приблизительно 16 мкмоль/л, выше приблизительно 17 мкмоль/л, выше приблизительно 18 мкмоль/л, выше приблизительно 19 мкмоль/л, выше приблизительно 20 мкмоль/л, выше приблизительно 21 мкмоль/л, выше приблизительно 22 мкмоль/л, выше приблизительно 23 мкмоль/л, выше приблизительно 24 мкмоль/л, выше приблизительно 25 мкмоль/л, выше приблизительно 26 мкмоль/л, выше приблизительно 27 мкмоль/л, выше приблизительно 28 мкмоль/л, выше приблизительно 29 мкмоль/л, выше приблизительно 30 мкмоль/л. В некоторых вариантах осуществления изобретения, повышенные уровни tHcy могут достигать 100 мкмоль/л. В некоторых вариантах осуществления изобретения, повышенные уровни tHcy могут быть выше 100 мкмоль/л. Таким образом, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают повышенные уровни tHcy у индивидуума в пределах от приблизительно 4 мкмоль/л до приблизительно 100 мкмоль/л или выше.
[0227] Соответственно, некоторые варианты описанных способов и композиций включают стратификацию группы пациентов на основе повышенного уровня tHcy и отбор индивидуумов из этой группы для лечения заболевания, ассоциированного с повышенными уровнями tHcy, включая лечение и облегчение состояний и осложнений, связанных с повышенными уровнями tHcy. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лечение индивидуумов с повышенными уровнями tHcy позволяет облегчать сопутствующие состояния и осложнения, такие как когнитивные или скелетные патологии, независимо от какой-либо основной патологии, например, дефицита CBS или HCU.
VIII. Фенотипические результаты
[0228] Ретроспективные исследования показали пропорциональную взаимосвязь между уровнями tHcy и результатом лечения. Пациенты с самыми высокими уровнями tHcy (проходившие или не проходившие лечение) имеют более тяжелые симптомы в более раннем возрасте, тогда как пациенты с более низкими уровнями tHcy имеют меньше симптомов и эти симптомы не так быстро прогрессируют (см. публикации Yap S. Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. Orphanet Encyclopaedia [serial online] 2005; Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31, каждая из которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Индивидуумы с повышенным уровнем tHcy обычно имеют задержку развития, тромбоэмболию, тяжелую миопию с последующим вывихом хрусталика, переломы типа остеопороза, марфаноподобное телосложение (в частности, удлинение длинных костей) и/или психические отклонения, такие как трудности с обучением (см. публикации Yap S. Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. Orphanet Encyclopaedia [serial online] 2005; Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74; NORD, Kraus JP. Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. NORD [serial online] 2017, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Что касается спектра дефицита CBS, то некоторые пациенты имеют тяжелое мультисистемное заболевание, начинающееся уже в детстве, тогда как пациенты с менее выраженным повышением уровня Hcy могут оставаться недиагностированными во взрослом возрасте (см. публикациию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Ожидаемая продолжительность жизни заметно снижается у пациентов с сильно повышенным уровнем Hcy, хотя даже пациенты с умеренно повышенным уровнем tHcy страдают множественными негативными клиническими исходами.
[0229] Были получены существенные доказательства, указывающие на причинный эффект повышенных уровней tHcy и негативные клинические исходы в четырех системах, обычно поражаемых у пациентов с HCU (глаза, скелет, сердечно-сосудистую систему и нервную систему). В глазах, часто наблюдаемыми фенотипическими признаками являются: эктопия хрусталика, иридодонез, миопия, а менее часто наблюдаемыми фенотипическими признаками являются: глаукома, атрофия зрительного нерва, дегенерация сетчатки, отслоение сетчатки, катаракта и патология роговицы. В скелетной системе, часто наблюдаемыми фенотипическими признаками являются: остеопороз, двояковогнутые позвонки, сколиоз, увеличение длины длинных костей, неравномерное расширение метафиза, метафизарные спикулы, аномальный размер/аномальная форма эпифизов, линия задержки роста, pes cavus и высокоарочное небо, а менее часто наблюдаемыми фенотипическими признаками являются: арахнодактилия, увеличение костей запястья, возрастная патология костей, килевидная грудь/впалая грудь, вальгусное колено, кифоз и короткая четвертая пястная кость. В сосудистой системе, часто наблюдаемыми фенотипическими признаками являются: закупорка сосудов, покраснение скуловой кости и «мраморная сетчатая кожа». В центральной нервной системе, часто наблюдаемыми фенотипическими признаками являются: когнитивные симптомы, психические расстройства и экстрапирамидные признаки, а менее часто наблюдаемыми фенотипическими признаками являются: эпилептические припадки и аномальная электроэнцефалограмма. В других системах организма, часто наблюдаемыми фенотипическими признаками являются: светлые ломкие волосы, тонкая кожа, жировые изменения в печени, паховая грыжа, миопатия, патологии эндокринной системы, снижение уровня факторов свертывания крови и спонтанная перфорация кишечника.
[0230] Между умеренно повышенными уровнями tHcy и негативными исходами наблюдалась значительная взаимосвязь, но данные также показали, что снижение уровня tHcy положительно влияет на клинические симптомы. Литературы по HCU слишком мало из-за редкости этого заболевания и из-за незначительного количества исследований в этой области, но она дает ценные сведения по увеличению числа клинических исходов в группе индивидуумов с сильно повышенными уровнями Hcy. И наоборот, исследования для более широкой группы индивидуумов выигрывают в результате больших размеров выборки, но с меньшим повышением уровней tHcy. В целом, эти исследования постоянно демонстрируют, что повышенные уровни tHcy являются хорошим прогностическим фактором негативных клинических исходов, и что фармакологическое лечение, направленное на снижение этих уровней, является эффективным.
[0231] Потенциальный результат лечения HCU лекарственным препаратом, описанным в настоящей заявке, заключается в снижении концентрации tHcy в плазме до минимально возможных уровней при сохранении более щадящей диеты, включая более высокие концентрации Met, чем при других методах лечения HCU и методов с использованием других незаменимых аминокислот.У младенцев и детей с HCU, приоритетом является профилактика осложнений, ассоциированных с HCU, и обеспечение надлежащего роста и развития нормального интеллекта (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Jan; 40(1):49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). У пациентов, диагностированных в более позднем возрасте, приоритетом может быть профилактика опасной для жизни тромбоэмболии и минимизация прогрессирования уже выявленных осложнений. Для достижения этих целей, биохимические патологии, связанные с HCU, могут быть устранены и, если это возможно, нормализованы (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis. 2017 Jan; 40(1):49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Опрос, проводимый для сравнения методов диетотерапии пациентов с HCU в 29 центрах в 8 Европейских странах, показал, что в лечебных центрах не было единого мнения относительно целевых диапазонов уровней tHcy в плазме, при этом, медиана рекомендуемого целевого значения составляет менее 55 мкМ и находится в пределах от менее чем 20 до 100 мкМ для 29 Центров (см. публикацию Adam et al. Mol Genet Metab. 2013 Dec; 110(4):454-9, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0232] Пороговое значение, превышающее или равное 80 мкМ для уровней tHcy, и приемлемое для включения в программу лечения, было выбрано здесь во избежание исключения пациентов с предшествующими уровнями tHcy в плазме приблизительно 100 мкМ, учитывая вариабельность для групп индивидуумов 25% в отношении уровней tHcy в плазме, протестированных с перерывами в несколько месяцев (см. публикации Refsum et al. Clin Chem 2004; 50:3-32; Guttormsen et al., J Clin Invest. 1996, 98(9):2174-83; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) чтобы обеспечить уровни, достаточно высокие для обнаружения клинически значимого снижения у небольшого числа пациентов. Вариабельность для групп индивидуумов 25% в отношении уровней tHcy в плазме, протестированных с перерывами в несколько месяцев (см. публикации Refsum et al. Clin Chem 2004; 50:3-32; Guttormsen et al., J Clin Invest. 1996, 98(9):2174-83; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) может быть частично обусловлен изменениями режима питания, приема лекарственных средств или пищевых добавок у пациентов с HCU с течением времени.
[0233] При отсутствии лечения, прогноз для пациентов с HCU, не реагирующих на пиридоксин, является плохим (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В 1985 г. Международное ретроспективное исследование, задокументировавшее патогенез HCU у 629 пациентов и проводимое путем анализа до начала лечения показало, что у 70% пациентов вывих хрусталика возникал к 10-летнему возрасту, а у 85% пациентов, симптомы развивались к 12 годам (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Mudd et al., Skovby F. Disorders of transsulfuration. In: Scriver CL, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, eds. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases, 7 ed., New York: McGraw Hill, 2001, 1279-1327, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). В целом, у 50% больных к 15 годам был рентгенологически определен остеопороз позвоночника, а 23% пациентов, не реагирующих на пиридоксин (4% реагирующих пациентов), умерли к 30 годам (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum. Genet 1985; 37:1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0234] В целом, имеющиеся данные указывают на то, что современные подходы к лечению HCU, включая ограничительную диету и использование пищевых добавок, неэффективны для прекращения прогрессирования заболевания у большинства пациентов. Следовательно, существует почти нерешенная медицинская потребность в разработке хорошо переносимых методов лечения, которые позволяли бы устранять или нормализовать метаболические патологии при HCU и замедлять или прекращать прогрессирование клинических проявлений заболевания.
[0235] Была обнаружена причинно-следственная связь между повышенными уровнями Hcy и ключевыми клиническими исходами, связанными с HCU, включая глазные болезни (в частности, вывих хрусталика), скелетные патологии (в частности, остеопороз), сосудистые патологии (в частности, инсульт и заболевания мелких сосудов) и различные поражения ЦНС (в частности, когнитивной функции). Взаимосвязь между повышенными уровнями tHcy и негативными клиническими исходами и, наоборот, снижением уровней Hcy и улучшением клинических исходов дополнительно подтверждается многочисленными исследованиями, проводимыми для общих групп индивидуумов. В целом, эти клинические данные подчеркивают необходимость ранней диагностики HCU и быстрого лечения для доведения уровней Hcy как можно ближе к норме.
[0236] Хотя не было опубликовано никаких исследований по оценке качества жизни (QoL) пациентов с HCU, однако, неопубликованные отчеты показывают, что пациенты и лица, осуществляющие уход за ними, страдают от психосоциальных последствий соблюдения строго ограниченной и социально изолирующей диеты и крайне обеспокоены длительными клиническими осложнениями заболевания. Неудивительно, что пациенты стремятся по возможности смягчить диету без ущерба для своих долгосрочных перспектив.
[0237] Тесная взаимосвязь между уровнями tHcy и ключевыми клиническими исходами у пациентов с HCU показывает, что изменение уровней tHcy является надежным суррогатным маркером комбинации клинических конечных точек при HCU. Таким образом, изменения уровней tHcy полезны для (i) мониторинга прогрессирования заболевания пациента в клинике и (ii) прогнозирования клинических преимуществ новых методов лечения при клинических испытаниях и (iii) прогнозирования эффективности терапии.
[0238] Уровни tHcy также обеспечивают надежный суррогатный маркер для отбора индивидуумов с генетически не наследуемым дефицитом CBS. В соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, индивидуумы с повышенным уровнем tHcy и/или с дефицитом CBS могут быть подвергнуты лечению с использованием описанного здесь ПЭГилированного лекарственного препарата htCBS C15S для лечения или ослабления симптомов, ассоциированных с повышенным уровнем tHcy, включая глазные, скелетные, сердечно-сосудистые и неврологические симптомы, вызываемые повышением уровней tHcy.
[0239] Так, например, лекарственный препарат нормализует или увеличивает гибкость бедренной артерии у индивидуума по сравнению с ситуацией, которая наблюдалась до введения лекарственного препарата индивидууму. Так, например, у мышей I278T наблюдается значительно более низкая гибкость бедренной артерии по сравнению с мышами дикого типа. Фактически, диета с ограничением Met может приводить к уменьшению диаметра бедренной артерии у мышей I278T по сравнению с обычной диетой как у мышей, получавших лекарственные препараты, так и у мышей, которые их не получали.
[0240] Исследования, ранее проведенные на 3 мышах с моделью заболевания, продемонстрировали, что htCBS C15S эффективен после системного введения, как описано в WO 2017/083327, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки. Эти исследования показали снижение уровня внеклеточного Hcy в плазме и уровня внутриклеточного Hcy в тканях, таких как головной мозг, до 90%. Было замечено, что введение лекарственного препарата приводит к градиенту концентрации с потоком Hcy от более высоких концентраций во внутриклеточном пространстве к более низким концентрациям во внеклеточном пространстве, где лекарственный препарат может его дополнительно обрабатывать. Внеклеточный ПЭГилированный htCBS C15S служит «раковиной» Hcy. Таким образом, лекарственный препарат восстановливает контроль над метаболическим путем Met у животных с моделью HCU.
[0241] Эти исследования также показали, что подкожное введение ПЭГилированного htCBS C15S мышам с моделью HCU корректировало уровни метаболитов, включая повышение уровней Cth и нормализацию уровней Cys. Кроме того, ПЭГилированный htCBS C15S положительно влиял на фенотипическое проявление заболевания у мышей, включая лицевую алопецию, плохую гистологию печени, остеопороз, аномальное телосложение, диабетическую ретинопатию (возможно, вызванную почечным заболеванием) и атрофию желтого пятна и зрительного нерва из-за закупорки сосудов сетчатки или неартериальной ишемической невропатии зрительного нерва, и повышения уровней цитокинов и липидов. ПЭГилированный htCBS C15S также спасал мышей с нокаутом CBS (KO) от ранней гибели (см. публикации Looker et al. Diabetologia 2003; 46:766-772; Pusparajah et al. Front Physiol 2016; 7:200; Gerth et al. J AAPOS 2008;12).:591-596; Stanger et al. Clin Chem Lab Med 2005;43:1020-1025;Cahill et al.Am J Ophthalmol 2003;136:1136-1150;Minniti et al.Eur J Ophthalmol 2014;24:735-743; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Также было замечено, что ПЭГилированный htCBS C15S хорошо переносится без каких-либо токсикологических эффектов, наблюдаемых при постоянном введении доз животным с моделью такого заболевания.
[0242] ПЭГилированный htCBS C15S действует во внеклеточном пространстве и, как ожидается, снижает концентрацию tHcy в плазме независимо от генетики пациентов, сопутствующей терапии или исходного уровня tHcy. Таким образом, подходящая группа для исследования должна включать как пациентов, реагирующих на пиридоксин, так и пациентов, не реагирующих на него.
[0243] У здоровых людей, уровни tHcy находятся в диапазоне приблизительно от 5 до 15 мкМ (см. публикацию OECD по охране окружающей среды и безопасности, где представлена серия принципов стандартной лабораторной практики и мониторинга соблюдения режима лечения №1 ENV/MC/CHEM(98)17 «Принципы стандартной лабораторной практики (пересмотренная в 1997 г. ), которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), и 98% tHcy присутствует в форме дисульфидов или в форме, связанной с белком. Только 2% tHcy существует в виде несвязанного, свободного, восстановленного аминотиола, который может служить субстратом для фермента (см. EMA: Руководство по подтверждению ценности биоаналитического метода, EMEA/CHMP/EWP/192217/2009, версия 1, 21 июля 2011 г.; ATL-15-1419 в соответствии с отчетом об исследованиях Atlanbio под заголовком «ЖХ-МС/МС-определение цистатионина-D4 как препарата, обладающего активностью цистатионин-бета-синтазы в пробах плазмы обезьян, собранных во время исследования 529736», которое в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки). С другой стороны, у пациентов с HCU не только присутствуют уровни tHcy в плазме, которые могут достигать 400 мкМ и более, но также наблюдается резко измененный баланс, при этом уровень свободного гомоцистеина достигает 10-25% от исходных значений tHcy.
[0244] У мышей-моделей, введение ПЭГилированного htCBS C15S приводило к снижению уровня tHcy до 90%. Таким образом, начальные уровни свободного гомоцистеина, доступные для фермента (10-25% от общего количества), не могут быть единственной причиной значительного снижения зарегистрированных уровней tHcy, и ферменту должны быть доступны дополнительные пулы. Так, например, если свободный Hcy становится дефицитным в результате активности ПЭГ-htCBS, то баланс между свободным Hcy и аддуктами Hcy (в форме связанного с белком Hcy или дисульфидов) в плазме изменяется в пользу образования свободного Hcy, который может далее утилизоваться ферментом.
A. Глазные патологии
[0245] Повышенные уровни Hcy являются значительным и независимым фактором риска глазных патологий, а в частности, вывиха хрусталика, у пациентов с HCU и в общей группе. Даже при назначении фармакологических и диетических препаратов, у большинства пациентов с HCU в конечном итоге возникают глазные патологии. Было показано, что снижение уровня Hcy задерживает и, возможно, предотвращает вывих хрусталика у пациентов с HCU (см. публикации Yap S. Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. Orphanet Encyclopaedia [serial online] 2005; Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Martinez-Gutierrez et al. Int Ophthalmol (2011) 31:227-232; Ajith et al. Clin Chim Acta 2015; 450:316-321; Mulvihill et al. J AAPOS 2001; 5:311-315; Marti-Carvajal et al. Cochrane Database Syst Rev 2015;1:CD006612; Sweetser et al. N Engl J Med 2016, 375:1879-1890; Sadiq et al. Semin Ophthalmol 2013; 28:313-320; Wright et al. Homocysteine, folates, and the eye. Eye (Lond) 2008; 22:989-993; Lieberman et al. Am J Ophthalmol 1966, 61:252-255; Harrison et al. Ophthalmology 1998, 105:1886-1890; Ramsey et al. Am J Ophthalmol 1972; 74:377-385; Couser et al. Ophthalmic Genet 2017, 38:91-94; Ghorbanihaghjo et al. Mol Vis 2008, 14:1692-1697; Javadzadeh et al. Mol Vis 2010; 16:2578-2584; Seddon et al. Am J Ophthalmol 2006; 141:201-203; Coral et al. Eye (Lond) 2006; 20:203-207; Axer-Siegel et al. Am J Ophthalmol 2004, 137:84-89; Heuberger et al. Am J Clin Nutr 2002; 76:897-902; Huang et al. Sci Rep 2015; 5:10585; Sen et al. Indian J Clin Biochem 2008; 23:255-257; Yousefi et al. Protein Pept Lett 2013; 20:932-941; Gerth et al. J AAPOS 2008; 12:591-596; Stanger et al. Clin Chem Lab Med 2005, 43:1020-1025; Cahill et al. Am J Ophthalmol 2003, 136:1136-1150; Minniti et al. Eur J Ophthalmol 2014, 24:735-743; Turkcu et al. Medicina (Kaunas) 2013,49:214-218; Vessani et al. Am J Ophthalmol 2003; 136:41-46; Leibovitch et al. J Glaucoma 2003, 12:36-39; Leibovitzh et al. Medicine (Baltimore) 2016;95:e4858; Micheal et al. Mol Vis 2009; 15:2268-2278; Clement et al. J Glaucoma 2009; 18:73-78; Cumurcu et al. BMC Ophthalmol 2006; 6:6; Bleich et al. J Neural Transm (Vienna) 2002;109:1499-1504; Lee et al. Curr Eye Res 2017;1-6; Wang et al. Am J Ophthalmol 2004; 137:401-406; Ganapathy et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2009; 50:4460-4470, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Даже при назначении фармакологических и диетических препаратов, у большинства пациентов с HCU в конечном итоге возникают глазные осложнения. Было показано, что снижение уровня Hcy задерживает и, возможно, предотвращает вывих хрусталика у пациентов с HCU (см. публикацию Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21:738-747, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0246] Одним из наиболее часто встречающихся и самых ранних проявлений HCU является эктопия хрусталика (вывих хрусталика) (см. публикацию Mulvihill et al. J AAPOS 2001; 5:311-315, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Это обычно происходит в возрасте после двух лет и наблюдается приблизительно у 50% пациентов, не прошедших лечение и не реагирующих на пиридоксин, к шести годам, и у 50% пациентов, не прошедших лечение и реагирующих на пиридоксин к 10 годам (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Вывих может быть частичным (подвывих) или полным, и, хотя он может происходить в нижней части или ближе к носу, но, обычно, он бывает двусторонним (см. публикации Mulvihill et al. J AAPOS 2001; 5:311-315; Sweetser et al. N Engl J Med 2016; 375:1879-1890, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки).
[0247] Вывих хрусталика часто следует за периодом быстро прогрессирующей миопии, что может привести к выраженному астигматизму, монокулярной диплопии и снижению остроты зрения (см. публикацию Sadiq et al. Semin Ophthalmol 2013; 28:313-320, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В целом считается, что миопия (более 1 диоптрии [D]) встречается приблизительно у 85% пациентов с HCU, при этом, миопия очень высокой степени (более 5D) поражает от 50 до 76% пациентов. Иридодонез (дрожание радужной оболочки после движения глазного яблока) встречается приблизительно у 56% пациентов, а сферофакия (небольшой сферический хрусталик, имеющий предраположенность к подвывиху) поражает 50% пациентов (см. публикации Yap S. Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. Orphanet Encyclopaedia [serial online] 2005; Mulvihill et al. J AAPOS 2001; 5:311-315, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Другие осложнения, связанные с HCU, включают образование катаракты, хронический витрит (воспаление стекловидного тела) и хориоретинальное воспаление, блокаду зрачка с острой и/или хронической закрытоугольной глаукомой и (у детей) амблиопию (ленивый глаз) (см. публикацию Sadiq et al. Semin Ophthalmol 2013; 28:313-320, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0248] Данные долгосрочного ретроспективного исследования 25 пациентов с HCU в возрасте до 24 лет позволяют предположить, что вывих хрусталика можно предотвратить или по меньшей мере значительно уменьшить и отсрочить у пациентов, у которых уровни tHcy постоянно снижены с раннего возраста (см. публикацию Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998;21:738-747, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Раннее лечение, снижающее уровень Hcy, также ассоциируется со снижением риска общих глазных осложнений, включая прогрессирование миопии. Подтверждающие данные были получены из исследования «случай-контроль» у 32 пациентов с HCU и 25 братьев и сестер в контрольной группе, у которых раннее лечение, снижающее уровень Hcy, было связано со значительным уменьшением глазных осложнений по сравнению с пациентами, которые проходили лечение в более позднем возрасте или не полностью соблюдали рекомендации по лечению (см. публикацию El Bashir et al. JIMD Rep 2015; 21:89-95, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0249] Самое масштабное и самое продолжительное на сегодняшний день исследование глазных заболеваний у 25 пациентов с дефицитом кобаламина С, который также характеризуется повышенным уровнем tHcy, показало, что дегенерация желтого пятна, бледность зрительного нерва, нистагм, косоглазие и сосудистые изменения присутствовали у большинства пациентов.
[0250] Многочисленные исследования пациентов с HCU и населения в целом продемонстрировали взаимосвязь между повышенными уровнями Hcy и различными глазными заболеваниями (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Ajith, Clin Chim Acta 2015; 450:316-321; Mulvihill et al. J AAPOS 2001; 5:311-315; Wright et al. Eye (Lond) 2008;22:989-993, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), включая миопию и вывих хрусталика (см. публикации Yap S. Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. Orphanet Encyclopaedia [serial online] 2005; Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Martinez-Gutierrez et al. Int Ophthalmol 2011; 31:227-232; Suri et al. J Neurol Sci 2014; 347:305-309; Mulvihill et al. J AAPOS 2001; 5:311-315; Lieberman et al. Am J Ophthalmol 1966; 61:252-255; Harrison et al. Ophthalmology 1998; 105:1886-1890; Ramsey et al. Am J Ophthalmol 1972; 74:377-385; Couser et al. Ophthalmic Genet 2017;38:91-94; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), иридодонез (см. публикацию Mulvihill et al. J AAPOS 2001; 5:311-315, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), артериосклероз сетчатки (см. публикацию Ghorbanihaghjo et al. Mol Vis 2008;14:1692-1697, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), возрастную дегенерацию желтого пятна (см. публикаци Javadzadeh et al. Mol Vis 2010; 16:2578-2584; Seddon et al. Am J Ophthalmol 2006; 141:201-203; Coral et al. Eye (Lond) 2006; 20:203-207; Axer-Siegel et al. Am J Ophthalmol 2004;137:84-89, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), возрастную макулопатию (AMD) (см. публикации Heuberger et al. Am J Clin Nutr 2002; 76:897-902; Huang et al. Sci Rep 2015; 5:10585, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки), катаракты (см. публикации Sen et al. Indian J Clin Biochem 2008; 23:255-257; Yousefi et al. Protein Pept Lett 2013; 20:932-941, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки), диабетическую ретинопатию (возможно, вследствие почечного заболевания) (см. публикации Looker et al. Diabetologia 2003; 46:766-772; Pusparajah et al. Front Physiol 2016; 7:200, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки) и атрофию желтого пятна и зрительного нерва из-за окклюзии сосудов сетчатки или неартериальной ишемической невропатии зрительного нерва (см. публикации Gerth et al. J AAPOS 2008; 12:591-596; Stanger et al. Clin Chem Lab Med 2005; 43:1020-1025; Cahill et al. Am J Ophthalmol 2003; 136:1136-1150; Minniti et al. Eur J Ophthalmol 2014; 24:735-743, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0251] Ретроспективное исследование 629 пациентов с HCU показало, что вывих хрусталика обычно происходит в возрасте после двух лет и наблюдается приблизительно у 50% пациентов, не прошедших лечение и не реагирующих на пиридоксин, к шести годам, и у 50% пациентов, не прошедших лечение и реагирующих на пиридоксин к 10 годам (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Самое масштабное и самое продолжительное на сегодняшний день исследование глазных заболеваний у 25 пациентов с дефицитом кобаламина С, который также характеризуется повышенным уровнем tHcy, показало, что дегенерация желтого пятна, бледность зрительного нерва, нистагм, косоглазие и сосудистые изменения присутствовали у большинства пациентов (см. публикацию Brooks et al. Ophthalmology. 2016 Mar; 123(3):571-82, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0252] Многочисленные исследования пациентов с HCU и населения в целом продемонстрировали взаимосвязь между повышенными уровнями Hcy и различными глазными заболеваниями (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Ajith TA, Ranimenon. Clin Chim Acta 2015); 450:316-321; Mulvihill et al. J AAPOS 2001; 5:311-315; Wright et al. Eye (Lond) 2008; 22:989-993; каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки), включая миопию и вывих хрусталика (см. публикации Yap S. Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. Orphanet Encyclopaedia [serial online] 2005; Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Martinez-Gutierrez et al. Int Ophthalmol 2011; 31:227-232; Suri et al. J Neurol Sci 2014; 347:305-309; Mulvihill et al. J AAPOS 2001; 5:311-315; Lieberman et al. Am J Ophthalmol 1966; 61:252-255; Harrison et al. Ophthalmology 1998; 105:1886-1890; Ramsey et al. Am J Ophthalmol 1972; 74:377-385; Couser et al. Ophthalmic Genet 2017;38:91-94; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), иридодонез (см. публикацию Mulvihill et al. J AAPOS 2001; 5:311-315, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), артериосклероз сетчатки (см. публикацию Ghorbanihaghjo et al. Mol Vis 2008;14:1692-1697, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), возрастную дегенерацию желтого пятна (см. публикаци Javadzadeh et al. Mol Vis 2010; 16:2578-2584; Seddon et al. Am J Ophthalmol 2006; 141:201-203; Coral et al. Eye (Lond) 2006; 20:203-207; Axer-Siegel et al. Am J Ophthalmol 2004;137:84-89, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), возрастную макулопатию (AMD) (см. публикации Heuberger et al. Am J Clin Nutr 2002; 76:897-902; Huang et al. Sci Rep 2015; 5:10585, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки), катаракты (см. публикации Sen et al. Indian J Clin Biochem 2008; 23:255-257; Yousefi et al. Protein Pept Lett 2013; 20:932-941, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки), диабетическую ретинопатию (возможно, вследствие почечного заболевания) (см. публикации Looker et al. Diabetologia 2003; 46:766-772; Pusparajah et al. Front Physiol 2016; 7:200, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки) и атрофию желтого пятна и зрительного нерва из-за окклюзии сосудов сетчатки или неартериальной ишемической невропатии зрительного нерва (см. публикации Gerth et al. J AAPOS 2008; 12:591-596; Stanger et al. Clin Chem Lab Med 2005; 43:1020-1025; Cahill et al. Am J Ophthalmol 2003; 136:1136-1150; Minniti et al. Eur J Ophthalmol 2014; 24:735-743, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0253] Исследования, изучающие взаимосвязь между уровнями Hcy и глаукомой, дали противоречивые результаты. Некоторые из них показали положительную связь между уровнями Hcy и глаукомой при нормальном внутриглазном давлении, псевдоэксфолиативной глаукомой (PEXG) и первичной открытоугольной глаукомой (POAG), в то время как другие исследования не показали таких результатов (см. публикации Lieberman et al. Am J Ophthalmol 1966;61:252-255; Turkcu et al. Medicina (Kaunas) 2013;49:214-218; Vessani et al. Am J Ophthalmol 2003;136:41-46; Leibovitch et al. J Glaucoma 2003;12:36-39; Leibovitzh et al. Relationship between homocysteine and intraocular pressure in men and women: A population-based study. Medicine (Baltimore) 2016;95:e4858; Micheal et al. Mol Vis 2009;15:2268-2278; Clement et al. J Glaucoma 2009;18:73-78; Cumurcu et al. BMC Ophthalmol 2006;6:6; Bleich et al. J Neural Transm (Vienna) 2002;109:1499-1504; Lee et al. Curr Eye Res 2017;1-6; Wang et al. Am J Ophthalmol 2004;137:401-406; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Однако, потеря ганглиозных клеток сетчатки (RGC), обычное наблюдаемая у пациентов с глаукомой, была продемонстрирована у мышей с эндогенно повышенными уровнями Hcy, вызванными делецией гена CBS, что указывает на вероятную связь между глаукомой и повышенным уровнем tHcy у пациентов с HCU (см. публикацию Ganapathy et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 2009;50:4460-4470, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
1. Механизм
[0254] Был предложен ряд механизмов для объяснения влияния повышенных уровней Hcy на здоровье глаз (см. публикацию Ajith TA, Ranimenon; Clin Chim Acta 2015; 450:316-321, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Механизмы, объясняющие эффекты повышенного уровня tHcy, включают нарушение функции сосудистого эндотелия, апоптоз ганглиозных клеток сетчатки, изменения внеклеточного матрикса, снижение активности лизилоксидазы и окислительный стресс, а также прямые цитотоксические и провоспалительные эффекты Hcy, которые, по-видимому, способствуют помутнению хрусталика и повреждению зрительного нерва.
[0255] Потенциальные механизмы также включают активацию рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA), что приводит к притоку кальция в клетки и к увеличению продуцирования активных форм кислорода (ROS), которые способствуют образованию катаракты. Эти изменения, наряду с прямыми цитотоксическими эффектами Hcy, могут вызывать повреждение эндотелия, которое инициирует тромбообразование и апоптоз RGC, что приводит к ретинопатии и глаукоме. Также было показано, что повышенные уровни Hcy способствуют повышению уровня асимметричного диметиларгинина (AMDA) и блокируют активность оксид азота-синтазы (NOS), что вызывает сужение сосудов и атрофию зрительного нерва за счет снижения уровня оксида азота (NO). И наконец, накопление гомоцистеинилированных белков на сосудистой стенке может запускать продуцирование антител против Hcy и воспалительные реакции, что будет приводить к фагоцитозу, окислительному стрессу, апоптозу RGC и к изменениям внеклеточного матрикса (ECM). В целом, такие изменения повреждают сосудистую сеть, белки хрусталика и зрительный нерв, что в конечном итоге вызывает нарушение зрения.
[0256] У пациентов с HCU, вывих хрусталика главным образом вызывается дегенеративными изменениями в волокнах связок, а в частности, Cys-богатыми мультидоменными белками ECM, такими как фибриллин-1 (см. публикации Sadiq et al. Semin Ophthalmol 2013; 28:313-320; Hubmacher et al.). al. Biochemistry 2011; 50:5322-5332; Hubmacher et al. J Biol Chem 2005; 280:34946-34955; Hubmacher et al. J Biol Chem 2010; 285:1188-1198; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0257] У здоровых людей, образование многочисленных внутридоменных дисульфидных связей в фибриллине-1 обеспечивает правильную укладку белка, необходимую для сохранения структурной целостности и функционирования. Нити фибриллина-1 могут затем образовывать межцепочечные дисульфидные связи, что приводит к сборке высокомолекулярных мультидоменных белковых агрегатов, известных как микрофибриллы (см. публикации Kinsey et al. J Cell Sci 2008; 121:2696-2704; Hubmacher et al. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:6548-6553, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0258] Этот процесс в значительной степени зависит от взаимодействия между фибриллином-1 и фибронектином (см. публикацию Hubmacher et al. Biochemistry 2011; 50:5322-5332, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Микрофибриллы образуют остов для отложения тропоэластина, что является важным шагом в формировании эластичных волокон, таких как волокна кожи, легких, кровеносных сосудов/артерий, связок и глаза (см. публикацию Hubmacher et al. J Biol Chem 2010; 285:1188-1198, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Важное значение фибриллина-1 было продемонстрировано у пациентов с синдромом Марфана, то есть, состоянием, вызванным мутацией (мутациями) в гене фибриллина 1, при котором дисфункция соединительной ткани ассоциируется с такими симптомами, как вывих хрусталика, пролапс органов, остеопороз и гипермобильность суставов (см. публикации Suk et al., J Biol Chem 2004, 279:51258-51265, Collod-Beroud et al., Hum Mutat, 2003, 22:199-208, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки).
[0259] Исследования in vitro показали, что добавление Hcy к фибриллину-1 нарушало образование дисульфидных связей, что, в свою очередь, приводило к аномальной укладке белка, повышенной восприимчивости к протеолитическому расщеплению и к аномальному образованию внеклеточного матрикса и эластичных волокон (см. публикации Hubmacher et al. J Biol Chem 2010; 285:1188-1198; Whiteman et al., Antioxid Redox Signal 2006; 8:338-346, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Добавление Hcy к дермальным фибробластам человека также было ассоциировано с образованием восстановленных форм фибронектина, которые неоптимально связывались с фибриллином-1, и тем самым предотвращали образование микрофибрилл (см. публикации Hubmacher et al. Biochemistry 2011; 50:5322-5332; Hubmacher et al. J Biol. Chem 2010; 285:1188-1198, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки).
[0260] Помимо вывиха хрусталика, дегенерация волокон связок у пациентов с HCU может приводить к увеличению кривизны хрусталика, миопии хрусталика, астигматизму, отслоению сетчатки, косоглазию, катаракте и иридодонезу (см. публикацию Sadiq et al. Semin Ophthalmol 2013; 28:313-320), которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). При отсутствии лечения, передний вывих хрусталика может вызывать острую глаукому, приводящую к блокаде зрачка. В крайних случаях, полное смещение хрусталика связано с увеличением осевой длины глаза, что, возможно, является реакцией компенсации на нечеткость зрения (см. публикацию Mulvihill et al. J AAPOS 2001; 5:311-315, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0261] Было проведено ретроспективное исследование 25 случаев HCU, выявленных в Ирландии в период с 1971 по 1996 год либо в рамках национальной программы NBS, либо по клинической картине, для изучения влияния терапии, направленной на снижение уровня Hcy, на исход заболевания (см. публикацию Yap et al. J Inherit Metab Dis. 1998; 21:738-747, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В большинстве случаев (24/25), пациенты не реагировали на пиридоксин. Следовательно, лечение большинства пациентов состояло из диеты, не содержащей Met, с добавлением Cys, а также с добавлением витамина B12 и фолата, если это необходимо. Лечение было начато до 6-недельного возраста пациентов и сравнивалось с лечением другой группы, где лечение начиналось после установления диагноза, и с лечением одного контрольного пациента, который никогда не проходил лечение. Средний период наблюдения составлял 14,3 года (от 2,5 до 23,4) в группах, получавших лечение до 6-недельного возраста, и 14,7 года (от 11,7 до 18,8) для остальных пациентов, что в сумме составило 365,7 пациенто-лет лечения. Из 21 пациента, выявленного с помощью NBS, у 18 не наблюдалось осложнений во время лечения. Из этих пациентов, 15/18 имели зрение 20:20, а 3/18 страдали прогрессирующей близорукостью в течение предыдущих двух лет.
[0262] В соответствии с выводами Mudd et al. (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), вывих хрусталика у лиц с поздним диагнозом возникает приблизительно в двухлетнем возрасте. Вывих хрусталика не был зарегистрирован ни у одного из пациентов, прошедших раннее лечение, которые хорошо соблюдали режим терапии. У трех «пациентов, получивших раннее лечение» (имеющих самый высокий уровень fHcy), наблюдалось прогрессировние миопии без вывиха ахрусталика, что, скорее всего, было связано с относительно высокими уровнями fHcy в этой небольшой группе пациентов. Это навело авторов на предположение, что прогрессирующая миопия может быть первым признаком, предшествующим вывиху хрусталика, и плохого соблюдения диеты, несмотря на то, что пациент настаивал на обратном. Прогрессирование миопии у этих пациентов подчеркивает, насколько хрупким является баланс между нейтральными и негативными клиническими исходами для этих пациентов. У всех поздно выявленных пациентов развилась эктопия хрусталика. Это говорит о том, что лечение может отсрочить начало вывиха хрусталика, но не предотвратить его.
[0263] Медианный уровень fHcy в плазме в течение всей жизни был выше у пациентов с миопией, чем у пациентов без нее (18, 18 и 48 мкмоль/л против 11 мкмоль/л, соответственно). В группе, где лечение было начато после постановки диагноза, из трех пациентов, выявленных с помощью NBS, у которых развивались осложнения, ни один не соблюдал диету. В целом, у 6 из 24 пациентов был вывих хрусталика, из них двое имели ранний диагноз, но не соблюдали диету, а четверо имели поздний диагноз, включая одного пациента, которого никогда не проходил лечение. В соответствии с выводами Mudd et al. (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), вывих хрусталика у лиц с более поздним диагнозом (то есть, у пациентов с осложнениями в возрасте после 2 лет) наблюдался в возрасте приблизительно 2 года. На момент публикации исследования, вывих хрусталика не наблюдался ни у одного из ранее получавших лечение пациентов с хорошим соблюдением терапии.
[0264] У пациентов, соблюдающих режим лечения, fHcy поддерживались на уровне, эквивалентном уровню tHcy, то есть, был значительно ниже 120 мкмоль/л. Однако, на момент публикации, все пациенты были моложе 24 лет, и многие из них все еще были детьми. Было показано, что соблюдение диеты с ограничением белка быстро снижалось от подросткового возраста до зрелого возраста. Описанный выше хрупкий баланс предполагает, что умеренное снижение уровней tHcy, достигнутое у этих пациентов, может отсрочить появление симптомов, но не предотвратить их по мере старения этих пациентов.
[0265] Эти результаты (см. публикации Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21:738-747; Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки) были подтверждены данными из аналогичного исследования «случай-контроль», проведенного в Катаре, в котором сообщается об результатах лечения, включая нарушения зрения, в 32 случаях HCU и в 25 контрольных случаях для братьев и сестер (см. публикацию El Bashir et al. JIMD Rep 2015; 21:89-95, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Средний возраст индивидуумов составлял 11,2 года (от 0,6 до 29) и 56% были мужчины. В целом, 9 из 32 случаев (28%) были диагностированы с помощью NBS и подвергались лечению в первый месяц жизни. Остальные были диагностированы в возрасте от 14 до 240 месяцев. Уровни tHcy и Met были значительно ниже у тех индивидууов, у которых диагноз был поставлен с помощью NBS, по сравнению с теми, у кого диагноз был поставлен в клинике. Возможно, это связано с лучшим соблюдением диеты и приема лекарств в раннем возрасте. Ни в одном из 9 случаев, выявленных с помощью NBS, не было проблем со зрением на момент публикации исследования, по сравнению с 18 (78%) в группе с поздним диагнозом (p<0,001 между группами). Однако, как и в Ирландском исследовании, 25 пациентов, описанных выше, имели возраст на время этого исследования от 0,6 до 29 лет, и отдаленные осложнения еще не были известны.
[0266] Сравнение данных Yap и Naughten (см. публикацию Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21:738-747, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) с кривыми Каплана-Мейера, полученными Mudd et al., показало, что доля «рано прошедших лечение» пациентов с вывихом хрусталика и остеопорозом была значительно ниже, чем ожидалось для не прошедших лечение пациентов с HCU (p≤0,001).
[0267] Поэтому повышенный уровень Hcy считается важным и независимым фактором риска глазных осложнений, а в частности, вывиха хрусталика, у пациентов с HCU и в общей группе (например, как показано у Yap et al. и Mudd et al.). Это подчеркивает необходимость ранней диагностики и лечения HCU, а также соблюдения режима лечения пациентом.
B. Скелетные осложнения
[0268] HCU ассоциируется с повышенным риском остеопорозных переломов, что может быть частично связано с низкой минеральной плотностью кости (см. публикации Mudd et al. и Weber et al. Mol Genet Metab 2016; 117:351-354; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0269] Ретроспективный обзор данных 19 пациентов с HCU за 8 лет показал, что низкая минеральная плотность кости (BMD) была распространена как у детей, так и у взрослых пациентов с HCU (см. Weber et al.). Это исследование показало, что прирост костной массы в детстве и подростковом возрасте, то есть, в важный период для формирования скелета, является дефицитным по Hcy и может негативно повлиять на образование конечной костной массы. Это исследование также показало, что даже пациенты, соблюдающие диету, с умеренно повышенным уровнем tHcy, всего в 5 раз превышающим нормальный диапазон, уже имеют клинические патологии скелета в детстве.
[0270] Согласно Mudd et al., у 80% пациентов с HCU развивается остеопороз в возрасте до 30 лет.Кроме того, повышенные уровни Hcy связаны с повышенным риском остеопорозных переломов даже у пациентов без HCU (см. публикации van Meurs et al. N Engl J Med 2004; 350:2033-2041; McLean et al. N Engl J Med 2004;350:2042-2049; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0271] Ретроспективный обзор данных 19 пациентов (9 мужчин в возрасте от 3,5 до 49,2 лет), которым была проведена клиническая денситометрия кости с помощью DXA в период с 2002 по 2010 год, показал, что низкая BMD была распространена как у детей, так и у взрослых пациентов с HCU (см. публикацию Weber et al. Mol Genet Metab 2016; 117:351-354, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Во время первого DXA-сканирования, средний Z-показатель BMD поясничного отдела позвоночника (LS) составлял -1,2±1,3, а общий Z-показатель BMD бедра составлял -0,89±0,4, причем, оба они были значительно ниже 0 (ожидаемый средний Z-показатель у населения в целом) с p=0,002 и 0,02, соответственно. Z-критерий BMD LS при постановке диагноза составлял -1,26±1,4 у пациентов в возрасте до 21 года и -1,06±1,1 у взрослых. В целом, 38% пациентов имели низкую BMD для своего возраста (по Z-показателю ≤ -2). Уровни tHcy и Met были положительно ассоциированы с Z-показателем BMD LS для нескольких моделей линейной регрессии (см. публикацию Weber et al. Mol Genet Metab 2016; 117:351-354, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Средние уровни tHcy для этих 19 индивидуумов составили всего 59,2 мкмоль/л, и большинство из 19 пациентов были детьми. Это исследование позволяет предположить, что прирост костной массы в детстве и в подростковом возрасте, то есть, в важный период для формирования скелета, является дефицитным по Hcy и может негативно повлиять на образование конечной костной массы. Это исследование также показало, что даже пациенты, соблюдающие диету, с умеренно повышенным уровнем tHcy, всего в 5 раз превышающим нормальный диапазон, уже имеют клинические патологии скелета в детстве.
[0272] Проведенные ранее исследования продемонстрировали четкую взаимосвязь между уровнями Hcy и риском переломов у пожилых людей (см. публикации van Meurs et al. N Engl J Med 2004;350:2033-2041; McLean et al. N Engl J Med 2004;350:2042-2049), каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Результаты двух перспективных исследований для групп, включавших 2406 индивидуумов в возрасте ≥55 лет, показали, что скорректированные по возрасту и полу риски переломов увеличивались на 30% при каждом увеличении уровня tHcy на одно стандартное отклонение (см. публикацию van Meurs et al. N Engl J Med 2004;350:2033-2041, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Уровень гомоцистеина в самом высоком возрастном квартиле был связан с увеличением риска переломов в 1,9 раза. Связь между уровнями гомоцистеина и риском переломов не зависела от минеральной плотности костей и других потенциальных факторов риска переломов. Повышенный уровень гомоцистеина был важным и независимым фактором риска остеопорозных переломов у пожилых мужчин и женщин в целом, где такие факторы были аналогичны по величине установленным факторам риска переломов и сердечно-сосудистых заболеваний (см. публикацию van Meurs et al. N Engl J Med 2004;350:2033-2041; которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Кроме того, перспективное исследование в США с участием 825 мужчин и 1174 женщин (исследование HOPE-2) показало, что уровень tHcy в сыворотке крови в верхнем квартиле был связан с 1,9-кратным повышением риска переломов шейки бедра среди женщин и четырехкратным повышением риска переломов шейки бедра среди мужчин по сравнению с риском, наблюдаемым в случае повышения уровней tHcy в сыворотке в самом нижнем квартиле (см. публикацию Sawka et al. Arch Intern Med. 2007 Oct 22;167(19):2136-9, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Связь между уровнями tHcy и риском переломов не зависела от BMD и других потенциальных факторов риска переломов (см. публикации van Meurs et al. N Engl J Med 2004; 350:2033-2041; McLean et al. N Engl J Med 2004, 350: 2042-2049; Sawka et al., Arch Intern Med., 2007 Oct 22;167(19):2136-9, каждая из которых в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки).
[0273] В соответствии с этими результатами, исследование 433 пациентов с инсультом в возрасте старше 65 лет показало, что скорректированные по возрасту показатели заболеваемости, а именно, переломы шейки бедра на 1000 человеко-лет увеличились почти линейно с 2,89 в нижних квартилях уровней Hcy до 27,87 в верхних квартилях (см.). В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что повышенный уровень Hcy является важным и независимым фактором риска остеопорозных переломов у пожилых мужчин и женщин.
[0274] Скелетные патологии отсутствуют при рождении и необычны для младенцев и очень маленьких детей (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Первыми признаками поражения скелета обычно являются вальгусное колено и полая стопа с удлинением длинных костей, то есть, типичным признаком синдрома Марфана, часто развивающегося ближе к половому созреванию (см. публикацию Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74), которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Остеопороз, особенно позвонков и длинных костей, часто встречается у пациентов с HCU и может привести к сколиозу/кифозу и/или коллапсу позвонков (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Weber et al. Mol. Genet Metab 2016;117:351-354; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Другие скелетные патологии могут включать марфаноподобные черты лица, вызванные выступающими верхними зубами и высоким небом, а также деформацией передней стенки грудной клетки, такой как впалая грудь или килевидная грудь (см. публикации Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74; Sweetser et al., N Engl J Med 2016;375:1879-1890; Brenton et al., J Bone Joint Surg Br 1972;54:277-298, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Из-за этих общих характеристик скелета в случае синдрома Марфана и HCU, пациентов с HCU иногда неправильно характеризуют как пациентов с болезнью Марфана.
[0275] Исследование с участием 25 Ирландских пациентов с HCU, наблюдаемых в течение 25 лет, показало, что риск остеопороза был значительно ниже у пациентов, выявленных в результате скрининга новорожденных с хорошим соблюдением режима лечения заболевания, направленного на снижение уровня Hcy (диета, витамины и/или бетаин) по сравнению с пациентами, не соблюдающими режим лечения, или с пациентами с поздним диагнозом (см. Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21:738-747). Подтверждающие доказательства этих результатов были получены в небольшом Корейском исследовании с участием пяти пациентов с HCU с хорошим долгосрочным метаболическим контролем. В этом исследовании, у пациентов, ранее получавших терапию, направленную на снижение уровня Hcy, было меньше скелетных патологий, чем у пациентов с более поздним диагнозом (см. публикацию Lim et al. Osteoporos Int 2013, 24:2535-2538, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). И наконец, в исследовании с использованием мышей с моделью HCU, нормализация уровней tHcy при лечении посредством CBS ET была ассоциирована с профилактикой остеопороза (см. публикацию Majtan et al. Enzyme replacement prevents neonatal death, liver damage, and osteoporosis in murine homocystinuria, FASEB J 2017, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0276] Точные механизмы, приводящие к низкой BMD и хрупкости скелета у пациентов с HCU, до конца не изучены (см. публикации Weber et al. Mol Genet Metab 2016; 117:351-354; Lim JS, Lee DH. Changes in bone mineral density and body composition of children with well-controlled homocystinuria caused by CBS deficiency. Osteoporos Int 2013; 24:2535-2538, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Однако, многие заболевания соединительной ткани у пациентов с HCU напоминают заболевания при синдроме Марфана, то есть, заболевания соединительной ткани, вызванные мутациями в гене фибриллина-1 и характеризующиеся такими признаками, как удлинение длинных костей и переломы по типу остеопороза (см. публикации Hubmacher et al. Biochemistry 2011; 50:5322-5332; Hubmacher et al. J Biol Chem 2010; 285:1188-1198, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Считается, что повышенные уровни Hcy приводят к хрупкости костей и переломам по двум различным механизмам (см. публикацию Behera et al. J Cell Physiol 2016, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Первый механизм приводит к уменьшению прироста костной массы в детстве и подростковом возрасте из-за нарушения сборки фибриллина. Второй механизм приводит к нарушению ремоделирования костей, что приводит к ломкости костей из-за уменьшения образования поперечных связей коллагена (см. публикации Behera et al. J Cell Physiol 2016; Kang et al. J Clin Invest 1973; 52:2571-2578, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). В целом, эти данные свидетельствуют о том, что прирост костной массы в детстве и в подростковом возрасте, то есть, в критический период для формирования скелета, недостаточен у пациентов с HCU, и что это негативно влияет на образование конечной костной массы.
[0277] Кроме того, существует тесная взаимосвязь между уровнями Hcy и риском переломов у пожилых людей (см. публикации van Meurs et al. N Engl J Med 2004; 350:2033-2041; McLean et al. N Engl J Med 2004; 350:2042-2049; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Результаты двух Международных перспективных исследований групп пациентов, включавших 2406 человек в возрасте 55 лет или старше, показали, что уровень гомоцистеина в самом высоком возрастном квартиле был связан с увеличением риска переломов в 1,9 раза. (см. публикацию van Meurs et al. N Engl J Med 2004; 350:2033-2041, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Повышенный уровень гомоцистеина является важным и независимым фактором риска остеопорозных переломов у большинства пожилых мужчин и женщин, где такие факторы аналогичны по величине установленным факторам риска переломов (низкая минеральная плотность костей, когнитивные нарушения, недавние падения) и сердечно-сосудистых заболеваний (см. публикацию van Meurs et al. N Engl J Med 2004; 350:2033-2041, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Кроме того, перспективное исследование 1999 человек в США (исследование HOPE-2) показало, что уровень tHcy в сыворотке крови в верхнем квартиле был ассоциирован с 1,9-кратным увеличением риска переломов шейки бедра у женщин и четырехкратным увеличением риска у мужчин, по сравнению с уровнями tHcy в сыворотке в самом нижнем квартиле (см. публикацию Sawka et al. Arch Intern Med. 2007 Oct 22;167(19):2136-9, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Связь между уровнями tHcy и риском перелома не зависела от BMD и других потенциальных факторов риска перелома (см. публикации van Meurs et al. N Engl J Med 2004; 350:2033-2041; McLean et al. N Engl J Med 2004; 350: 2042-2049; Sawka et al., Arch Intern Med., 2007 Oct 22;167(19):2136-9, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В соответствии с этими результатами, исследование 433 пациентов с инсультом в возрасте>65 лет показало, что скорректированные по возрасту случаи переломов шейки бедра на 1000 человеко-лет увеличивались почти линейно с 2,89 в самых низких квартилях уровней Hcy до 27,87 в самых высоких квартилях. В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что повышенные уровни Hcy является важным и независимым фактором риска остеопорозных переломов у пожилых мужчин и женщин.
[0278] Точные механизмы, приводящие к низкой BMD и хрупкости скелета у пациентов с HCU, до конца не изучены (см. публикации Weber et al. Mol Genet Metab 2016; 117:351-354; Lim JS, Lee DH. Changes in bone mineral density and body composition of children with well-controlled homocystinuria caused by CBS deficiency. Osteoporos Int 2013; 24:2535-2538, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Однако, многие заболевания соединительной ткани у пациентов с HCU напоминают заболевания при синдроме Марфана, то есть, заболевания соединительной ткани, вызванные мутациями в гене фибриллина-1 и характеризующиеся такими признаками, как удлинение длинных костей и переломы по типу остеопороза (см. публикации Brenton et al., J Bone Joint Surg Br 1972, 54:277-298, Hubmacher et al., Biochemistry, 2011, 50:5322-5332, Hubmacher et al., J Biol Chem, 2010, 285:1188-1198, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0279] У здоровых людей, фибриллин-1 вместе с полимерами коллагена и эластина формируют ECM, то есть, структурные остовы для формирования кости, гомеостаза и репарации (см. публикацию Olivieri et al. Fibrogenesis Tissue Repair 2010; 3:24, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Исследования показали, что повышение уровней tHcy может приводить к структурным модификациям фрагментов фибриллина-1, которые предотвращают мультимеризацию и приводят к разрушению фибриллина-1 (см. публикации Hubmacher et al. J Biol Chem 2005; 280:34946-34955; Hubmacher et al. J Biol Chem 2010; 285:1188-1198, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Этот процесс также нарушается гомоцистеинилированием фибронектина, что препятствует образованию комплексов фибронектин-фибриллин, необходимых для мультимеризации фибриллина-1 (см. публикацию Hubmacher et al. Biochemistry 2011; 50:5322-5332, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Такие данные свидетельствуют о том, что повышенные уровни Hcy оказывают негативное влияние на формирование ECM.
[0280] У здоровых людей, сборка фибриллина (то есть, микрофибрилл) играет важную роль в минерализации кости посредством накопления и активации бета-трансформирующего фактора роста (TGF-бета) и белков остеогенеза (BMP) (см. публикации Nistala et al. Ann NY Acad. Sci 2010; 1192:253-256; Nistala et al., J Biol Chem 2010; 285:34126-34133, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Нарушение активации TGF-бета и BMP потенциально может способствовать формированию скелетного фенотипа, наблюдаемого как при синдроме Марфана, так и при HCU, а также может снижать содержание минералов в костях, как это наблюдается при легких формах HCU (см. публикацию Herrmann et al. Clin Chem 2005; 51:2348-2353, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Кроме того, имеются доказательства in vivo и in vitro, что Hcy может ослаблять прочность костей за счет уменьшения образования поперечных связей коллагена (см. публикацию Kang et al. J Clin Invest 1973; 52:2571-2578, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В целом, эти данные свидетельствуют о том, что прирост костной массы в детстве и в подростковом возрасте, то есть, в критический период для формирования скелета, недостаточен у пациентов с HCU, и что это негативно влияет на образование конечной костной массы.
[0281] Повышенные уровни Hcy, помимо их влияния на отложение в костях, увеличивают скорость ремоделирования кости за счет увеличения активности остеокластов (OC) и снижения активности остеобластов (OB) (см. публикации Behera et al. J Cell Physiol 2016; Herrmann et al. Clin Chem 2005; 51:2348-2353; Vacek et al. Clin Chem Lab Med 2013; 51:579-590; Vijayan et al. J Endocrinol 2017; 233:243-255, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Дисбаланс между активностью OB и OC может привоодить к ломкости костей и увеличению частоты переломов. Считается, что механизмы, приводящие к Hcy-опосредованному снижению активности OB, включают снижение кровотока в костях (вследствие снижения доступности NO) (см. публикацию Tyagi et al. Vasc Health Risk Manag 2011; 7:31-35, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) и повышение скорости апоптоза OB (см. публикации Behera et al. J Cell Physiol 2016; Kim et al. Bone 2006; 39:582-590, которые в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Считается, что механизмы, приводящие к повышенной активности OC, включают повышение уровня внутриклеточных ROS, которые усиливают как дифференцировку OC, так и активность OC за счет повышения активности металлопротеиназы матрикса (MMP) (см. публикацию Vacek et al. Clin Chem Lab Med 2013; 51:579-590, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) и подавления апоптоза OC (см. публикации Behera et al. J Cell Physiol 2016; Herrmann et al. Clin Chem 2005; 51:2348-2353; Koh et al. J Bone Miner Res 2006; 21:1003-1011, каждая из которых в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Действительно, недавнее исследование на мышах CD1, получавших диету с высоким содержанием Hcy, показало, что краткосрочное (7 дней) введение Hcy было связано с потерей минеральной плотности тканей (TMD) и увеличением количества OC, тогда как длительное введение Hcy (30 дней) приводило к перепрограммированию OC, к апоптозу и к минерализации, которые восстанавливали TMD, но нарушали биомеханические свойства ткани (см. публикацию Vijayan et al. J Endocrinol 2017; 233:243-255, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0282] Таким образом, повышенные уровни Hcy могут приводить к хрупкости костей и переломам по двум различным механизмам (см. публикацию Behera et al. J Cell Physiol 2016, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Первый механизм приводит к снижению прироста костной массы в детстве и подростковом возрасте из-за нарушения формирования ЕСМ и подавления активации фибриллин-1-ассоциированных TGF-бета и BMP. Второй механизм приводит к нарушению ремоделирования кости, что приводит к ломкости костей, за счет увеличения активности OC и снижения активности OB.
[0283] Повышенные уровни Hcy ассоциируются с повышенным окислительным стрессом в костном микроокружении. Увеличение уровня ROS индуцирует апоптоз остеобластов, и тем самым снижает образование остеобластов. Это усиление окислительного стресса еще больше снижает доступность NO за счет образования супероксид-анионов, что также может снижать костный кровоток и ангиогенез. ROS, образующиеся в результате этого процесса, активируют образование остеокластов посредством слияния моноцитов, что еще больше способствует потере BMD и приводит к остеопорозу.
[0284] Недавнее исследование на новорожденных мышах с нокаутом CBS (KO), которых содержали на стандартном корме для грызунов без ограничения Met, показало, что подкожное введение CBS ET с использованием рекомбинантного ПЭГилированного усеченногоо CBS человека (ПЭГ-CBS) в течение 5 месяцев предотвращало уменьшение минеральной плотности кости у этих животных, а также могло нормализовать эти значения у животных, которых обрабатывали в более позднем возрасте (см. публикацию Majtan et al. Enzyme replacement prevents neonatal death, liver damage, and osteoporosis in murine homocystinuria. FASEB J 2017, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В этом исследовании были предотвращены изменения телосложения, которые характерны как для модели с нокаутом, так и для пациентов с HCU. Как в плазме, так и в тканях нормализовались уровни tHcy и Cys, повышались уровни Cth и повышались отношения SAM/SAH.
[0285] Данные, подтверждающие влияние снижения уровня Hcy на скелетные патологии, были получены из 25-летнего исследования 25 ирландских пациентов с HCU (см. публикацию Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21:738-747, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В этом исследовании, остеопороз (диагностированный с помощью рентгенологического исследования, а не с помощью DXA) присутствовал у одного из трех пациентов, не соблюдающих режим лечения и выявленных с помощью NBS, и у одного из четырех пациентов с поздним диагнозом (в возрасте двух лет). Ни у одного из 18 пациентов, получавших раннее лечение (с 6-недельного возраста), признаков остеопороза выявлено не было.
[0286] Небольшое исследование было проведено в Корее с участием пяти пациентов с HCU (3 мальчика и 3 девочки), и всем им был поставлен диагноз в молодом возрасте (3 во время NBS и 2 в возрасте 7 лет) с хорошим метаболическим контролем в течение 3,4 года (см. публикацию Lim et al. Osteoporos. Int 2013; 24:2535-2538, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Средний уровень tHcy в плазме при постановке диагноза составлял 34,3±52,6 (от 13 до 78,6) мкмоль/л. Met в плазме составлял 716±1347,6 (от 24,3 до 1566) мкмоль/л, и лечение включало диету с низким содержанием Met с добавлением пиридоксина, бетаина и фолиевой кислоты. В группе корейских пациентов, телосложение и BMD для всех пациентов были в пределах нормы, и каких-либо значительных изменений в морфологии скелета с течением времени не наблюдалось. У трех пациентов (60%) был легкий сколиоз позвоночника T-L (углы Кобба 7,3°, 7,6° и 10,3°), и у трех пациентов, четыре раза возникали переломы. Из них, два были вызваны спортивной травмой и один - дорожно-транспортным происшествием. Два случая легкого компрессионного перелома поясничного отдела позвоночника были обнаружены с помощью рентгенографии, и в анамнезе была задокументирована сильная боль в спине. У пациентов с ранним диагнозом было меньше скелетных патлологий, чем у пациентов с более поздним диагнозом. Однако, это исследование показало, что даже у пациентов, которым был поставлен диагноз на ранней стадии с помощью NBS, и которые соблюдали диетическое лечение и имели лишь незначительное или умеренное повышение уровня tHcy, уже в детстве обнаруживались скелетные патологии и множественные переломы.
[0287] В целом. эти данные свидетельствуют о положительном влиянии раннего лечения, снижающего уровень Hcy, на скелетные патологии у пациентов с HCU. Следует отметить, что у пациентов, соблюдавших режим лечения, уровни tHcy были снижены, но не нормализованы, и хотя у этих пациентов было меньше скелетных патологий, однако, в этой преимущественно молодой группе пациентов были отмечены значительные негативные клинические исходы (остеопороз и переломы).
[0288] Настоящие исследования продемонстрировали положительную корреляцию между BMD и Z-показателями, tHcy в плазме и потреблением белка с пищей у пациентов с HCU, что позволяет предположить, что недостаточное потребление белка может играть определенную роль в повышении хрупкости скелета у этих пациентов. Пациенты с уровнями tHcy в плазме<100 мкМ имели гораздо большую хрупкость скелета, чем пациенты с уровнями>100 мкМ (пример 6; фиг. 2). Была выявлена положительная корреляция между уровнями tHcy в плазме и BMD во всех трех исследованных участках кости (коэффициент Пирсона r=0,33-0,51; p<0,03; таблица 8). Более того, более высокая BMD коррелирует с большим общим потреблением белка с пищей. Действительно, хроническое ограничение потребления общего белка для контроля уровня tHcy может увеличить хрупкость скелета у пациента.
[0289] BMD и Z-показатели, оцененные с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DXA), как описано в настоящей заявке (см. Пример 6), могут быть надежной конечной точкой для оценки эффективности лечения у пациентов с HCU. Таким образом, способы лечения, включающие ферментную терапию, описанную в настоящей заявке, могут быть применены для смягчения ограничений диеты пациентов с HCU, что позволяет увеличить потребление белка и улучшить результаты в отношении устранения хрупкости скелета у пациентов. ET, описанная в настоящей заявке, в сочетании с оценкой BMD и Z-показателя может быть проведена для определения переносимости пациентом щадящей диеты и/или потребности в ограниченной диете.
C. Сосудистые осложнения
[0290] Взаимосвязь между HCU и сосудистым заболеванием была впервые продемонстрирована в 1985 г. в эпидемиологическом исследовании у пациентов с умеренным или сильно повышенным уровнем Hcy из-за гомозиготной HCU (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0291] Тромбоэмболия является основной причиной заболеваемости и преждевременной смерти у пациентов с HCU (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Karaca et al. Gene 2014; 534:197-203; Yap S. J Inherit Metab). Dis 2003; 26:259-265, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Общая частота тромбоэмболических осложнений у пациентов, не прошедших лечение HCU, составляет приблизительно 10% в год (см. публикацию Cattaneo M. Semin Thromb Hemost 2006; 32:716-723, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), при этом риск увеличивается после операции и во время или сразу после беременности (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Novy et al. Thromb Haemost 2010; 103:871-873, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Тромбоэмболия может поражать любой кровеносный сосуд, но венозный тромбоз (а в частности, CSVT) встречается чаще, чем артериальный тромбоз у пациентов с HCU (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Karaca et al. Gene 2014; 534:197-203; Eslamiyeh et al., Iran J Child Neurol 2015; 9:53-57; Saboul et al. J Child Neurol 2015; 30:107-112, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Цереброваскулярные нарушения, особенно CSVT, были описаны у младенцев (см. публикацию Mahhale et al. J Pediatr Neurosci. 2017 Apr-Jun; 12(2): 206-207, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), хотя они чаще всего встречаются у молодых взрослых (см. публикацию Yap et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21:2080-2085, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0292] Риск тромбоэмболических осложнений составлял приблизительно 25% в возрасте 16 лет и 50% в возрасте 29 лет.В 1999 г. Hankey и др. сообщили, что все три генетические причины HCU (HCU, дефицит MTHFR и дефицит витамина B12) были связаны с высоким риском преждевременного сердечно-сосудистого (CV) заболевания, поражающего половину всех гомозигот к 30 годам (см. публикацию Hankey et al. Lancet 1999; 354:407-413, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Единственным биохимическим изменением, общим для всех трех нарушений, является повышенный уровень Hcy в сыворотке (часто превышающий 100 мкмоль/л) (см. публикацию Faeh et al. Swiss Med Wkly 2006; 136:745-756, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В нескольких сообщениях описано, каким образом лечение, снижающее уровень tHcy, значительно снижает частоту сосудистых патологий, то есть, основной причины заболеваемости, у пациентов с HCU (см. публикации Yap et al. J Inherit Metab Dis 2001; 24:437-447; Wilcken DE, Wilcken B. The natural history of vascular disease in homocystinuria and the effects of treatment. J Inherit Metab Dis 1997; 20:295-300, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). С тех пор, ряд других исследований продемонстрировал повышенный риск сосудистых осложнений, а в частности венозного тромбоза, у пациентов с HCU (см. публикации Karaca et al. Gene 2014; 534:197-203; Kelly et al. Neurology 2003; 60:275-279; Lussana et al. Thromb Res 2013; 132:681-684; Magner et al. J Inherit Metab Dis 2011; 34:33-37, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0293] Повышенный уровень tHcy в плазме является фактором риска сосудистых заболеваний и важным показателем смертности у пациентов с ишемической болезнью сердца, как с HCU, так и без нее (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Karaca et al. Gene 2014; 534:197-203; Kelly et al. Neurology 2003; 60:275-279; Faeh et al. Swiss Med Wkly 2006; 136:745-756; Boushey et al. JAMA 1995; 274:1049-1057; Clarke R et al. JAMA 2002; 288:2015-2022; Hankey et al. Lancet 1999; 354:407-413; Khan et al. Stroke 2008; 39:2943-2949; Graham et al. The European Concerted Action Project. JAMA 1997; 277:1775-1781; Clarke et al. N Engl J Med 1991; 324:1149-1155; Clarke et al. Ir J Med Sci 1992; 161:61-65; Woodward et al. Blood Coagul Fibrinolysis 2006; 17:1-5; Refsum et al. Annu Rev Med 1998; 49:31-62; Yoo et al. Stroke 1998; 29:2478-2483; Selhub et al. N Engl J Med 1995; 332:286-291; Wald et al. BMJ 2002; 325:1202; Bautista et al. J Clin Epidemiol 2002; 55:882-887; Brattstrom et al. Atherosclerosis 1990; 81:51-60; Lussana et al. Thromb Res 2013; 132:681-684; Casas et al. Lancet 2005; 365:224-232; McCully KS. Am J Pathol 1969; 56:111-128; Magner et al. J Inherit Metab Dis 2011; 34:33-37; Wilcken et al. J Clin Invest 1976; 57:1079-1082; Nygard et al. N Engl J Med 1997; 337:230-236; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Хотя имеются данные о взаимосвязи между уровнями tHcy и риском сердечно-сосудистых заболеваний (см. публикацию Boushey et al. JAMA 1995; 274:1049-1057, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), однако, взаимосвязь между tHcy и инсультом/заболеванием периферических артерий значительно сильнее (см. публикации Clarke et al. JAMA 2002; 288:2015-2022; Khan et al. Stroke 2008; 39:2943-2949; Wald et al. BMJ 2002; 325:1202; Casas et al. Lancet 2005; 365: 224-232; Brattstrom et al. Haemostasis 1989;19 Suppl 1:35-44, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Хотя крупномасштабные исследования (NORVIT, HOPE-2, VITATOPS) у населения в целом сначала показали, что снижение уровней Hcy оказывает незначительное влияние на основные сосудистые патологии и рецидивы сердечно-сосудистых заболеваний, однако, позднее, более конкретный анализ данных ясно показал клинические преимущества снижения tHcy при инсульте.
[0294] Имеются убедительные доказательства того, что снижение уровня Hcy снижает риск инсульта у населения в целом с умеренно повышенными уровнями tHcy (см. публикации Saposnik et al. Stroke 2009; 40:1365-1372; Huo et al. JAMA 2015; 313:1325-1335; Lonn et al. и др. N Engl J Med 2006; 354:1567-1577; Hankey et al. Lancet Neurol 2012; 11:512-520; Spence JD, Lancet Neurol. 2007 Sep;6(9):830-8, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В исследовании HOPE-2 (см. публикацию Saposnik et al. Stroke 2009; 40:1365-1372, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), у 5552 пациентов, незначительное снижение уровней tHcy (3 ммоль/л по сравнению с плацебо) привело к значительному снижению частоты инсульта (снижение относительного риска на 27%, снижение абсолютного риска на 1,3%), что позволяет предположить, что даже небольшое снижение уровня tHcy может быть полезным. Этот эффект был наиболее выражен у пациентов с исходным Hcy в верхнем квартиле, у которых было снижение абсолютного риска на 4,3%. Хотя не ясно, влияет ли снижение Hcy на общие сердечно-сосудистые патологии у пациентов с умеренно повышенным tHcy и без HCU (см. публикацию Marti-Carvajal et al. Cochrane Database Syst Rev 2015;1:CD006612, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки), однако, преимущества такого снижения Hcy в сосудах постоянно демонстрировались у пациентов с HCU (см. публикации Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21:738-747; Eslamiyeh et al. Iran J Child Neurol 2015; 9:53-57; Saboul et al. J Child Neurol 2015; 30:107-112; Yap et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21:2080-2085; Woods et al. BMJ Case Rep 2017; Wilcken et al. J Inherit Metab Dis 1997; 20:295-300; Yap et al. Semin Thromb Hemost 2000; 26:335-340; Ruhoy et al. Pediatr Neurol 2014; 50:108-111, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки).
1. Механизм
[0295] Ряд исследований показал, что повышенные уровни Hcy способствуют развитию атеросклероза или тромбоза посредством механизмов, связанных с окислительным стрессом (см. публикации Faverzani et al. Cell Mol Neurobiol 2017; Nowak et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2017; 37:e41-e52; Vanzin et al. Mol Genet Metab 2011; 104:112-117; Vanzin et al. Gene 2014; 539:270-274; Vanzin et al. Cell Mol Neurobiol 2015;35:899-911; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), включая воспалительную и иммунную активацию посредством NF-kB (см. публикации Rodriguez-Ayala et al. Atherosclerosis 2005; 180:333-340; van Guldener et al. Curr Hypertens Rep 2003; 5:26-31, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Медиальное повреждение, ведущее к тромбозу, как предполагается, вызывается Hcy-опосредованной эндотелиальной дисфункцией (см. публикации Jiang et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005; 25:2515-2521; Hossain et al. J Biol Chem 2003; 278:30317-30327; Cai et al. Blood 2000; 96:2140-2148; Zhang et al. J Biol Chem 2001; 276:35867-35874; Papapetropoulos et al. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106:21972-21977; Szabo et al. Br J Pharmacol 2011; 164:853-865; Chiku et al. J Biol Chem 2009; 284:11601-11612; Wang et al. Antioxid Redox Signal 2010; 12:1065-1077; Saha et al. FASEB J 2016; 30:441-456; Ebbing et al. JAMA 2008; 300:795-804; Bonaa et al. N Engl J Med 2006; 354:1578-1588; Marti-Carvajal et al. Cochrane Database Syst Rev 2015;1:CD006612; Celermajer et al. J Am Coll Cardiol 1993; 22:854-858; Rubba et al. Metabolism 1990; 39:1191-1195; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), активацией путей свертывания крови (см. публикации Spence JD. Int J Stroke. 2016 Oct;11(7):744-7; Fryer et al. Arterioscler Thromb 1993; 13:1327-1333; Lentz et al. J Clin Invest 1991; 88:1906-1914; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) и повышенной дилатацией сосудов. Такие протромботические механизмы аналогичны механизмам, наблюдаемым у пациентов с болезнью Марфана (см. публикации Kelly et al. Neurology 2003; 60:275-279; Tripathi P. International Cardiovascular Forum J 2016; 6:13; van Guldener et al. Curr Hypertens Rep 2003; 5:26-31; Hackam et al. JAMA 2003; 290:932-940; Baumbach et al. Circ Res 2002; 91:931-937; Evangelisti et al. Int J Cardiol 2009; 134:251-254; de Valk et al. Stroke 1996; 27:1134-1136, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0296] Причинно-следственная связь между уровнями tHcy и риском сердечно-сосудистых заболеваний, выявленная в результате мета-анализа данных 27 исследований (более 4000 пациентов), показала высокий риск атеросклероза сосудов сердца, цереброваскулярных и периферических сосудов, а поэтому увеличение Hcy на 5 мкМ приводило к 80% повышению риска для женщин и 60% повышению риска для мужчин (см. публикацию Boushey et al. JAMA 1995; 274:1049-1057, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Мета-анализ данных 30 перспективных или ретроспективных исследований, включающих 5073 случая ишемической болезни сердца (ИБС) и 1113 инсультов, показал, что уровень Hcy на 25% ниже обычного (с поправкой на погрешность регрессионного разбавления) (приблизительно 3 мкмоль/л) был связан с 11% (отношение вероятностей (OR), 0,89; 95% CI, от 0,83 до 0,96) более низким риском ИБС и на 19% (OR, 0,81; 95% CI, 0,69 до 0,95) более низким риском инсульта (см. публикацию Clarke R, et al. JAMA 2002; 288:2015-2022, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0297] Исследование с участием пациентов с ранее диагностированным сосудистым заболеванием и без него продемонстрировало увеличение, после нагрузки Met, уровня Hcy в плазме (с превышением самых высоких значений у сопоставимых здоровых контрольных индивидуумов) у 1/21 индивидуума с ИМ (5%), 14/37 индивидуумов с аорто-подвздошным заболеванием (38%) и 17/53 индивидуумов с цереброваскулярным заболеванием (32%). Это позволяет предположить, что связь между уровнями Hcy и заболеванием периферических артерий (PAD) и инсультом значительно больше, чем связь между уровнями Hcy и ИМ (см. публикацию Brattstrom et al. Haemostasis 1989; которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Независимая тесная связь между уровнями Hcy и инсультом была описана в перспективном исследовании, проведенном в Великобритании у группы из 457 пациентов с инсультом и 179 контрольных индивидуумов из той же группы (см. Khan et al. Stroke 2008; 39:2943-2949). Самые высокие уровни Hcy наблюдались у пациентов с болезнью мелких сосудов (CVD) (16,2 против 11,8 мкмоль/л в контрольной группе без инсульта, p<0,001 после поправки на возраст, пол, сосудистые факторы риска, уровни витаминов и функцию почек). В случаях CVD, самые высокие уровни Hcy наблюдались у лиц с лакунарным инфарктом с конфлюэнтной лейкореей. Кроме того, была выявлена корреляция между уровнем Hcy и тяжестью лейкореи (r=0,225; p<0,001).
[0298] Эти результаты были дополнительно подтверждены в исследовании по менделевской рандомизации, демонстрирующем генетическую связь между полиморфизмами MTHFR, регулирующими метаболизм Hcy, и риском инсульта (см. публикацию Casas et al. Lancet 2005; 365:224-232, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). При поиске в литературе всех соответствующих исследований взаимосвязи между уровнями Hcy и полиморфизмами MTHFR TT и CC, приводящими к риску инсульта, было найдено 111 исследований, проводимых с участием 15635 индивидуумов без сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Средневзвешенная разница уровней Hcy между гомозиготами ТТ и СС составляла 1,93 мкмоль/л (95% CI от 1,38 до 2,47). Исходя из результатов предыдущего мета-анализа перспективных исследований, в которых повышение уровня Hcy в плазме на 5 мкмоль/л соответствовало OR для инсульта 1,59 (от 1,29 до 1,96), повышение уровня Hcy на 1,93 мкмоль/л у здоровых людей с генотипом ТТ давало ожидаемое OR для инсульта 1,20 (от 1,10 до 1,31) (см. публикацию Wald et al. BMJ 2002; 325:1202, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В соответствии с этим результатом, Khan et al. сообщили о 1,26 (1,14 к 1,40) OR в случае инсульта для гомозигот ТТ по сравнению с гомозиготами СС (р=0,29), независимо от возрастной группы, этнической принадлежности или географического местоположения. В целом, эти результаты свидетельствуют о причинной роли повышенных уровней Hcy в патогенезе инсульта у большой группы индивидуумов.
[0299] Является ли умеренное повышение уровня Hcy в сыворотке типичным для пациентов с гетерозиготной HCU вследствие сосудистых заболеваний, было определено в исследованиях, в значительно меньших масштабах, чем исследования, которые проводились у большой группы индивидуумов. Согласно Mudd et al., риск сосудистых заболеваний у пациентов с умеренно повышенными уровями tHcy из-за гетерозиготной HCU (<5% в возрасте 50 лет) аналогичен таковому у большой группы индивидуумов (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1981; 33:883-893, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В соответствии с этим, ультразвуковое исследование индивидуумов с гомозиготной и гетерозиготной HCU выявило нарушение функции эндотелия в системных артериях гомозиготных детей в возрасте четырех лет, в то время как у гетерозиготных взрослых, эндотелиальная функция практически не менялась (см. публикацию Celermajer et al. J Am Coll Cardiol 1993; 22:854-858, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0300] Хотя аналогичное исследование продемонстрировало признаки преждевременного артериального заболевания как в случае гомозиготного, так и гетерозиготного заболевания, однако, у индивидуумов с гомозиготным заболеванием, признаки проявлялись в гораздо более молодом возрасте (19 лет против 45 лет), и тяжесть заболевания была значительно выше (см. публикацию Rubba et al. Metabolism 1990; 39:1191-1195, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0301] В целом, наблюдение пациентов с HCU соответствовало наблюдениям, представленным в ранее приведенных исследованиях, где риск сосудистых заболеваний возрастал с повышением уровня Hcy (см., публикации Boushey et al. JAMA 1995; 274:1049-1057; Clarke et al. JAMA 2002; 288:2015-2022; Khan et al. Stroke 2008; 39:2943-2949; каждая из которых полностью включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0302] Эти результаты свидетельствуют о том, что повышенный уровень Hcy является фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний. Кроме того, было показано, что снижение уровня Hcy значительно снижает риск инсульта у общей группы индивидуумов и у пациентов с HCU.
[0303] Исследования показали, что повышенные уровни Hcy, вызванные HCU, потенциально могут способствовать развитию атеросклероза и/или тромбоза по различным механизмам. К ним относятся молекулярные нарушения, такие как индуцирование окислительного стресса и его последующие эффекты, такие как активация NF-κB (активатор легкой каппа-цепи ядерного фактора активированных В-клеток), фактора транскрипции, регулирующего провоспалительные и другие гены, связанные с повреждением. Различные Hcy-опосредованные эффекты, модулирующие физико-химические свойства сосудистой стенки, такие как эффекты, приводящие к эндотелиальной дисфункции или жесткости артерий, могут способствовать развитию гипертензии, тромбоза или других сосудистых патологий. И наконец, существуют доказательства прямого индуцирования путей свертывания крови посредством Hcy, то есть, более прямого пути, ведущего к тромбозу (см. публикации Faverzani et al. Cell Mol Neurobiol 2017; Hainsworth et al. Biochim Biophys Acta 2016; 1862:1008-1017; Ganguly et al. Nutr J 2015; 14:6; Tripathi P. Molecular and biochemical aspects of homocysteine in cardiovascular diseases. International Cardiovascular Forum J 2016; 6:13; Fryer et al. Arterioscler Thromb 1993; 13:1327-1333; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). После краткого описания молекулярных и биохимических механизмов атеросклероза, в нижеследующих подразделах будут рассмотрены потенциальные механизмы, ведущие к сосудистым заболеваниям у индивидуумов с повышенными уровнями tHcy, в том числе с HCU.
2. Атеросклероз
[0304] Среди наиболее хорошо изученных состояний, ведущих к тромбозу, а следовательно, и к закупорке сосудов, являются атеросклероз, прогрессирующее воспалительное заболевание, поражающее коронарное, мозговое и периферическое кровообращение (см. публикацию Libby et al. Circulation 2005; 111:3481-3488, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). На ранних стадиях, повреждение сосудов приводит к активации эндотелиальных клеток (ЭК), к рекрутингу моноцитов во внутреннюю оболочку сосудов и к активации макрофагов. При этом, формируется воспалительное атеросклеротическое поражение (жировая полоска), вызываемое макрофагами, происходящими от моноцитов, нагруженных липидами («пенистыми клетками») и Т-лимфоцитами. Прогрессирующее накопление липидов формирует липидное ядро, окруженное фиброзной оболочкой. На более поздних стадиях, активированные макрофаги секретируют ферменты, которые ослабляют фиброзную оболочку, что приводит к разрыву бляшки, к кровоизлиянию или к тромбозу и к ишемическим атакам/острому коронарному синдрому. При разрыве бляшки, тканевый фактор подвергается воздействию крови в просвете артерии, что позволяет ему образовывать комплексы с факторами свертывания крови VII/VIIa. Этот процесс инициирует каскад реакций свертывания крови, приводящих к тромбообразованию. Разрушенные бляшки могут приводить либо к пристеночному, либо к окклюзионному тромбозу, вызывая, соответственно, частичную или полную закупорку. Пристеночный тромбоз вызывает симптомы ишемии, такие как нестабильная стенокардия, тогда как окклюзионный тромбоз приводит к острым коронарным синдромам, таким как инфаркт миокарда (ИМ) и инсульт.Цитокины участвуют во всех стадиях атеросклероза и оказывают значительное влияние на его патогенез (см. публикацию Ramji et al. Cytokine Growth Factor Rev 2015; 26:673-685, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Помимо того, что тромбоз является вторичным по отношению к атеросклерозу, он также может активироваться в отсутствие образования бляшек, например, вследствие мерцательной аритмии или прямой активации каскада свертывания крови.
3. Окислительный стресс
[0305] Исследования пациентов с повышенными уровнями Hcy показали, что пациенты, прошедшие лечение, а особенно не прошедшие лечение, были подвержены окислительному стрессу, о чем свидетельствуют измененные биомаркеры, отражающие окислительное повреждение липидов, белков и ДНК в различных тканях (см. публикации Vanzin et al. Mol Genet Metab 2011; 104).:112-117; Vanzin et al. Gene 2014; 539:270-274; Vanzin et al. Cell Mol Neurobiol 2015; 35:899-911, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Окислительный стресс, определяемый как дисбаланс окислительно-восстановительного гомеостаза, играет ключевую роль в таких сосудистых патологиях, как атеросклероз и связанный с ним тромбоз, в патогенезе которых участвуют окислительная модификация липопротеинов низкой плотности, активация эндотелия и инициация сосудистых воспалительных реакций (см. публикацию Nowak et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 2017;37: e41-e52, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Окислительный стресс может быть вызван повышенными уровнями ROS (например, супероксидными (O2-) и гидроксильными (HO-) радикалами и пероксидом водорода (H2O2)) и/или снижением уровня тканевых антиоксидантов (например, супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы) (см. публикации Faverzani et al. Cell Mol Neurobiol 2017; Nowak et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2017; 37: e41-e52, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). У здоровых людей, ROS вырабатываются как побочные продукты нормального окислительного метаболизма. Однако, кроме того, продуцирование ROS запускается такими факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний, как сигаретный дым, употребление алкоголя, гиперхолестеринемия, гипертензия, диабет и повышенные уровни Hcy.
[0306] На молекулярном уровне существует множество механизмов, по которым Hcy может вызывать усиление окислительного стресса, и некоторые из которых обсуждались ранее. Так, например, накопление иммуногенных гомоцистеинилированных белков в сосудистой стенке может способствовать воспалению и, следовательно, образованию ROS (O2-) активированными фагоцитами). Другим потенциальным механизмом является Hcy-индуцированная активация рецепторов NMDA, запускающая сигнальные пути, ведущие к образованию ROS. В микрососудистых ЭК сердца, Hcy индуцирует повышенные уровни NADPH-оксидазы, то есть, ферментов клеточной поверхности, которые, особенно в активированных клетках, продуцируют высокие уровни O2-. Недавнее исследование (см. публикацию Chen et al. Sci Rep.2017 Jul 31;7(1):6932, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) показало, что в мозге крыс с имемией, Hcy индуцирует митохондриальную дисфункцию с ожидаемым в результате увеличением продуцирования ROS. Считается также, что Hcy снижает биодоступность полезного сосудорасширяющего средства NO. O2- реагирует с NO с образованием активных форм азота пероксинитрита, и, действительно, также сообщалось об Hcy-индуцированном увеличении степени нитрования тирозина, индикатора индуцированного пероксинитритом повреждения белка (см. публикацию Tyagi et al. Vasc Health Risk Manag 2011; 7:31-35, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В более широком смысле, тиол-тиоловые взаимодействия с участием Hcy, как ожидается, будут нарушать клеточный окислительно-восстановительный статус, например, посредством потенциального снижения доступности восстановленного глутатиона и даже нарушения сборки и укладки белков.
[0307] В исследовании пациентов с HCU до и после лечения, лечение пиридоксином, фолиевой кислотой, бетаиновыми добавками и добавками витамина B12 ослабляло окислительное повреждение липидов у пациентов, но не изменяло содержание сульфгидрилов или общий антиоксидантный статус, то есть, обоих показателей антиоксидантной способности тканей. Тем не менее, наблюдалась значительная негативная корреляция между содержанием сульфгидрильных групп и уровнями Hcy и позитивная корреляция между уровнями малонового диальдегида, то есть, продукта перекисного окисления липидов, и уровнями Hcy. Это свидетельствует о потенциальной механистической роли Hcy в окислительном повреждении, наблюдаемом при HCU (см. публикацию Vanzin et al. Mol Genet Metab 2011; 104:112-117, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Измененные липидные профили, а в частности, пониженные уровни липопротеинов высокой плотности и обогащение провоспалительными видами липидов, наблюдались в плазме пациентов с HCU, прошедших и не прошедших лечение (см. публикацию Vanzin et al. Cell Mol Neurobiol 2015; 35:899-911, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В другом исследовании сообщалось о значительно большем количестве повреждений ДНК у пациентов с HCU, чем у здоровых людей (см. публикацию Vanzin et al. Gene 2014; 539:270-274, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В целом, эти данные указывают на то, что окислительный стресс участвует в патогенезе повреждения сосудов, связанного с повышенными уровнями Hcy. При этом, не было обнаружено никакой корреляции между уровнями Met и любыми параметрами, связанными с окислительным стрессом, что позволяет предположить, что Met и его производные вносят небольшой вклад в окислительное повреждение при HCU (см. публикацию Vanzin et al. Mol Genet Metab 2011; 104:112-117, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0308] Среди множества других молекулярных эффектов, окислительный стресс связан с активацией NF-κB, группы транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию провоспалительных генов, таких как цитокины, которые, как известно, участвуют в инициации и прогрессировании атеросклероза и тромбоза (см. публикацию Ayala et al., Atherosclerosis 2005; 180:333-340, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Исследования in vitro показали, что Hcy-обработка ЭК активирует NF-kβ посредством продуцирования ROS (см. публикацию van Guldener et al. Curr Hypertens Rep 2003; 5:26-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Помимо модуляции экспрессии генов, химическая модификация клеточных макромолекул при окислительном стрессе может непосредственно влиять на структуру и функцию сосудистой сети и иметь другие локальные или системные эффекты, как обсуждается в нижеследующей части раздела.
4. Изменения в сосудистой стенке
[0309] Эндотелиальная дисфункция обычно определяется как дисбаланс между эндотелиальными факторами, модулирующими сократимость сосудов и релаксацию. Среди этих факторов, NO или «эндотелиальный фактор релаксации» является наиболее известным, в то время как сероводород (H2S) является другим фактором, описанным совсем недавно (см. публикацию Jiang et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005; 25:2515-2521, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В нескольких исследованиях in vitro изучалось влияние Hcy на функцию эндотелия, хотя и с использованием очень высоких уровней Hcy (см. публикации Jiang et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005; 25:2515-2521; Hossain et al. J Biol Chem 2003; 278:30317- 30327; Cai et al. Blood 2000; 96:2140-2148; Zhang et al. J Biol Chem 2001; 276:35867-35874; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В одном из таких исследований сообщалось об ответе неуложенного белка и запрограммированной гибели клеток в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC), обработанных Hcy, хотя концентрации Hcy были в несколько раз выше, чем у пациентов с сильно повышенными уровнями Hcy (см. публикацию Zhang et al. J. Biol Chem 2001; 276:35867-35874, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В других сообщениях, гамма-лиаза Cth (CGL), то есть, фермент, участвующий в метаболизме Cth, продуцировала избыток H2S у пациентов с повышенными уровнями Hcy (см. публикации Papapetropoulos et al. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106:21972-21977; Szabo C et al., Br J Pharmacol 2011, 164:853-865, Chiku et al., J Biol Chem, 2009, 284:11601-11612, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Это наблюдение было важным, поскольку сообщалось, что повышенные уровни H2S значительно увеличивают рост коллатеральных сосудов, плотность капилляров и кровоток в региональныХ тканях (см. публикацию Wang et al. Antioxid Redox Signal 2010; 12:1065-1077, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Однако, высокие уровни Hcy (от 0,002 до 2 мМ) не оказывали существенного влияния на пролиферацию ЭК или уровни фосфо-eNOS in vitro (см. публикацию Saha et al. Cystathionine beta-synthase regulates endothelial function via protein S-sulfhydration. FASEB J 2016; 30:441-456, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В целом, эти результаты указывают на возможную роль Hcy в эндотелиальной дисфункции, хотя еще не ясно, влияет ли Hcy непосредственно на ЭК in vivo из-за высоких уровней Hcy, протестированных in vitro.
[0310] В недавнем фармакологическом и генетическом исследовании, потеря функции CBS в ЭК была связана с 50% снижением клеточного H2S и 400% снижением глутатиона с сопутствующим увеличением уровней ROS в клетках (см. публикацию Saha et al. FASEB J 2016; 30:441-456, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Сайленсинг CBS в ЭК поставил под сомнение фенотипические и сигнальные ответы на фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), и этот эффект усугублялся снижением транскрипции рецептора-2 фактора роста сосудистого эндотелия (VEGFR-2) и нейропилина-1 (NRP-1), то есть, основных рецепторов, регулирующих эндотелиальные функции, такие как ангиогенез. Транскрипционное подавление VEGFR-2 и NRP-1 было опосредовано снижением стабильности белка 1, специфичного к фактору транскрипции (Sp1), мишени сульфгидрирования H2S. Восполнение H2S, но не глутатиона, в ЭК, подвергнутых сайленсингу CBS, приводило к восстанавлению уровней Sp1 и к связыванию Sp1 с промотором VEGFR-2, а также к увеличению уровня экспрессии VEGFR-2 и NRP-1 и к VEGF-зависимой пролиферации и миграции клеток. Это указывает на то, что CBS-посредованное S-сульфгидратирование белка является важным фактором для поддержания здоровья и функционирования сосудов, что подтверждают предыдущие наблюдения, указывающие на то, что у пациентов с HCU наблюдается эндотелиальная дисфункция (см. публикацию Celermajer et al. J Am Coll Cardiol 1993; 22:854-858; Rubba et al.. Metabolism 1990; 39:1191-1195, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), и повышает вероятность того, что пациенты с HCU будут страдать сосудистыми повреждениями дополнительных и других типов в дополнение к типу сосудистого повреждения, наблюдаемому у индивидууов с уровнями Hcy, повышенными по другим причинам.
[0311] Нарушение регуляции эндотелиальной функции или другие эффекты, влияющие на сократимость сосудов, могут приводить к патологиям кровяного давления (КД). Уровень Hcy в плазме был непосредственно связан с КД, а снижение Hcy под действием фолиевой кислоты было ассоциировано со снижением КД (см. публикации Tripathi P. Molecular and biochemical aspects of homocysteine in cardiovascular diseases. International Cardiovascular Forum J 2016; 6:13; Hackam et al. JAMA 2003; 290:932-940, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Хотя механизмы, приводящие к этим эффектам, пока не ясны, однако, уровни Hcy более тесно связаны с систолическим, чем с диастолическим КД. Это говорит о том, что повышенные уровни Hcy увеличивают жесткость артерий. Степень жесткости артерий в значительной степени определяется количеством и функцией клеток гладких мышц (SMC), соотношением коллагена и эластина во внеклеточном матриксе (ECM), качеством коллагена и эндотелиальной функцией (см. публикацию Tripathi P. Molecular and biochemical aspects of homocysteine in cardiovascular diseases. International Cardiovascular Forum J 2016; 6:13, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0312] Потенциально высокие уровни Hcy связаны с повышенной жесткостью артерий из-за повышенной пролиферации SMC, продуцирования коллагена и образования эластиновых волокон (см. публикацию van Guldener et al. Curr Hypertens Rep 2003; 5:26-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Однако, также возможно, что Hcy снижает жесткость артерий, нарушая перекрестное связывание коллагена. В исследовании, проведенном на поросятах, повышение Hcy, вызванное диетой, привело к «синдрому мегаартерий» с гиперпульсацией артерий, систолической (но не диастолической) гипертензией и длительной реактивной гиперемией проводящих артерий с дилатацией аорты (см. публикацию van Guldener et al. Homocysteine and blood pressure. Curr Hypertens Rep 2003; 5:26-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Также наблюдалась фрагментация эластичной пластинки артериальной стенки, коррелирующая с жесткостью аорты.
[0313] В соответствии с этими выводами, исследование, проведенное на мышах с HCU и без нее, показало, что площадь поперечного сечения стенки сосуда была значительно больше у CBS+/--мышей, которым давали контрольный корм (437±22 мкм2), и у CBS+/+-мышей (442±36 мкм2), и у CBS+/--мышей (471±46 мкм2), которым давали корм с высоким содержанием Met, по сравнению с CBS+/+-мышами (324±18 мкм2), которым давали контрольный корм (p<0,05) (см. публикацию Baumbach et al. Structure of cerebral arterioles in cystathionine beta-synthase-deficient mice. Circ Res 2002; 91:931-937, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0314] Во время максимальной вазодилатации, кривые «стресс-деформация» в церебральных артериолах CBS+/--мышей, которым давали контрольный корм, и CBS+/+-мышей и CBS+/--мышей, которым давали корм с высоким содержанием Met, были сдвинуты вправо от кривой для CBS+/+-мышей, которым давали контрольный корм. Это указывало на то, что растяжимость церебральных артериол была выше у мышей с повышенным уровнем tHcy в плазме. Эти результаты свидетельствуют о том, что повышенные уровни Hcy индуцируют гипертрофию сосудов головного мозга и изменяют механику сосудов головного мозга, где оба этих эффекта потенциально способствуют повышению частоты тромбозов, например, инсульта, даже в отсутствии атеросклероза (см. публикацию Baumbach et al. Circ Res 2002; 91:931-937, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0315] Дальнейшее подтверждение влияния повышенного уровня Hcy на вазодилатацию было получено в исследованиях 5 итальянских пациентов с HCU и уровнями tHcy в диапазоне от 193,6 до 342 мкмоль/л (см. публикацию Evangelisti et al. Int J Cardiol 2009; 134:251-254, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). У пациентов были выявлены признаки пролапса клапана сердца в легкой степени и/или регургитации и проявления симптомов соединительной ткани.
5. Тромбоз
[0316] Повышенные уровни Hcy связаны с более высоким риском тромбоза глубоких вен, тромбоза церебрального синуса и тромбоза вен сетчатки (см. публикацию Spence JD. Lancet Neurol. 2007 Sep;6(9):830-8, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), хотя в нескольких исследованиях не удалось найти связь с риском инфаркта миокарда. В соответствии с этими результатами, дополнительные, хотя и небольшие исследования показали, что HCU связана с тромбозом, но не обязательно с атеросклерозом. Визуализация сосудов у пациентов с наследственной гиперхолестеринемией (FH) и HCU показала, что хотя у пациентов с FH отмечалось диффузное и очаговое утолщение сонных артерий и эндотелиальная дисфункция, приводящая к снижению кровотока, однако, у пациентов с HCU редко обнаруживались бляшки в сонных артериях, и они были сходны со здоровым контролем как в отношении средней толщины внутренней оболочки (IMT), так и скорости кровотока в средней мозговой артерии (см. публикацию Rubba et al. Stroke 1994; 25:943-950, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Это исследование позволяет предположить, что типичные атеросклеротические поражения не обязательно должны предшествовать тромбозу при HCU, и что медиальное повреждение, ведущее к тромбозу, может быть также вызвано дилатацией артерий.
[0317] Подтверждением этого наблюдения является исследование, в котором сравнивалась распространенность атеросклероза сонной и бедренной артерии (определяемая по IMT и лодыжечно-плечевому индексу) у 13 пациентов с ферментативно подтвержденной гетерозиготной HCU по сравнению с 12 здоровыми индивидуумами с нормальными результатами теста с нагрузкой Met (см. публикацию de Valk et al., Stroke 1996, 27:1134-1136, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Существенных различий между группами по средним значениям IMT, частотному распределению IMT или IMT в каждом из пяти артериальных сегментов не наблюдалось. Эти результаты можно объяснить тем фактом, что гетерозиготные индивидуумы были слишком молоды (все имели возраст<50 лет) для развития структурных сосудистых изменений. Однако, эти данные также позволяют предположить, что повышенные уровни Hcy могут в первую очередь влиять на каскад реакций свертывания крови, по меньшей мере у более молодых пациентов. Действительно, отчет о трех неродственных пациентах с HCU показал, что у одного пациента случился инсульт из-за внутрипросветного тромбоза, а у другого пациента развилась сердечная или артериальная тромбоэмболия, также без признаков краниоцервикального атеросклероза (см. публикацию Kelly et al. Neurology 2003; 60:275-279, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0318] В соответствии с этими наблюдениями, добавление Hcy в ЭК HUVEC и CV1 необратимо инактивировало антикоагулянты, белок С и тромбомодулин (см. публикацию Lentz et al. J Clin Invest 1991; 88:1906-1914, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Более того, добавление Hcy к культивируемым ЭК человека увеличивало активность прокоагулянтного тканевого фактора в зависимости от времени и концентрации (см. публикацию Fryer et al. Arterioscler Thromb 1993; 13:1327-1333, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0319] В обоих исследованиях, Hcy усиливал пути коагуляции посредством механизма, в котором участвует свободная тиоловая группа. В целом, эти данные подтверждают гипотезу, что нарушения в механизмах свертывания крови в сосудах вносят вклад в повышенный риск сосудистого заболевания у пациентов с HCU, и что это может играть более раннюю роль у пациентов с HCU, еще до того, как влияние Hcy на атеросклероз станет очевидным.
[0320] Снижение уровня Hcy в плазме снижает риск сосудистых осложнений, особенно инсульта, у пациентов с HCU и среди населения в целом.
[0321] Недавние анализы выявили значительную взаимосвязь между повышенным уровнем гомоцистеина и риском инсульта у всех людей (см. публикации Saposnik et al. Stroke 2009; 40:1365-1372; Spence JD. Homocysteine lowering for stroke prevention: Unravelling the complexity of the evidence. Int J Stroke. 2016 Oct;11(7):744-7; Hankey et al. Lancet Neurol 2012; 11:512-520, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0322] В прошлом, польза от лечения, направленного на снижение уровня Hcy у пациентов с повышенным уровнем Hcy, была неоднозначной, при этом, некоторые исследования показали снижение риска сердечно-сосудистого заболевания (см. публикации Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21:738-747; Yap et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21:2080-2085; Wilcken et al. J Inherit Metab Dis 1997; 20:295-300; Yap et al. Semin Thromb Hemost 2000; 26:335-340; Saposnik et al. Stroke 2009; 40:1365-1372; Huo et al. JAMA 2015; 313:1325-1335; Hankey et al. Lancet Neurol 2012; 11:512-520, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), а другие не показали каких-либо преимуществ (см. публикации Marti-Carvajal et al. Cochrane Database Syst Rev 2015;1:CD006612; Ebbing et al. JAMA 2008; 300:795-804; Bonaa et al. N Engl J Med 2006; 354:1578-1588; Liem et al. Heart 2005; 91:1213-1214; Toole et al. JAMA 2004; 291:565-575; B vitamins in patients with recent transient ischemic attack or stroke in the VITAmins TO Prevent Stroke (VITATOPS) trial: a randomized, double-blind, parallel, placebo-controlled trial (see Lancet Neurol 2010; 9:855-865; Albert et al. JAMA 2008; 299:2027-2036, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Во многих из этих испытаний изучалось лечение витаминами и, главным образом, добавками витамина В (В6 и В12) и добавками фолата, для снижения уровня Нсу. Следовательно, результаты исследования зависели от посторонних искажающих результаты факторов, таких как проживание испытуемых в регионах, где практикуется прием пищи, обогащенной фолатом; наличие почечной дисфункции, делающей индивидуумов более уязвимыми к токсичности кобаламина; дефицит витамина B12, связанный с плохим всасыванием, что относительно часто встречается у лиц пожилого возраста, или прием антитромбоцитарных препаратов. В этих недавних анализах учитывались эти смешанные факторы, и был сделан вывод о том, что при учете таких ключевых отклонений, повышенный уровень tHcy увеличивает риск инсульта у индивидуумов в целом (см. публикации Mudd et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000; 20:1704-1706; Spence JD. Int J Stroke. 2016 Oct;11(7):744-7; Spence JD, Clin Chem Lab Med.2013 Mar 1;51(3):633-7, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0323] Терапия, снижающая уровни Нсу, снижает риск инсульта даже у индивидуумов без HCU. В исследованиях HOPE-2 (Исследованиях по профилактике болезней сердца 2), 5522 взрослых в возрасте ≥55 лет с сосудистыми заболеваниями или с сахарным диабетом в анамнезе и по меньшей мере с одним дополнительным фактором риска сердечно-сосудистого заболевания, были рандомизированы для приема витаминной добавки (фолиевой кислоты, витамина B6 и витамина B12) или плацебо в течение 5 лет (см. публикацию Saposnik et al. Stroke 2009; 40:1365-1372, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Средние исходные концентрации Hcy составляли 11,5 мкмоль/л в обеих группах, и пациенты, ежедневно принимавшие витаминную добавку, содержащую>0,2 мг фолиевой кислоты, были исключены из исследования. В целом, снижение Hcy (в среднем на 3,0 мкмоль/л по сравнению с плацебо) было связано со значительным снижением относительного риска инсульта на 27% (абсолютным снижением на 1,3%) (HR 0,75; 95% CI от 0,59 до 0,97) и незначительным снижением частоты ишемического инсульта (HR 0,81; 95% CI 0,60-1,09) и геморрагического инсульта (HR 0,80; 95% CI 0,32-2,02). При анализе подгрупп, относительный риск инсульта был значительно снижен у пациентов с исходными уровнями Hcy в самом верхнем квартиле (снижение абсолютного риска на 4,3%). Наибольший эффект от лечения наблюдался у пациентов в возрасте<69 лет, при этом, в программу испытаний были включены пациенты, проживающие в регионах, где в пищу не добавлялась фолиевая кислота, и пациенты, не принимавшие антитромбоцитарные лекарственные средства или препараты, снижающие содаржание липидов. Таким образом, в исследовании HOPE-2 сообщалось о снижении числа случаев инсульта у индивидууов, получавших витамины группы В, по сравнению с плацебо (отношение рисков (HR) 0,75; 95% CI от 0,59 до 0,97), тогда как риск инфаркта миокарда был одинаковым в обеих лечебных группах (RR 0,98; 95% CI, от 0,85 до 1,14) (см. публикации Saposnik et al. Stroke 2009; 40:1365-1372; Lonn E, Yusuf S, Arnold MJ et al. Homocysteine lowering with folic acid and B vitamins in vascular disease. N Engl J Med 2006; 354:1567-1577, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки).
[0324] В соответствии с результатами исследования HOPE-2, субанализ исследования VITATOPS, в котором участвовали 8164 пациента с недавним инсультом или транзиторной ишемической атакой, и которые были рандомизированы для лечения двойным слепым методом с использованием витаминов В или плацебо в течение среднего периода 3,4 года, показал, что витамины В значительно снижали первичный комбинированный исход (инсульт, инфаркт миокарда (ИМ) или смерть от сосудистых заболеваний) у пациентов, не получавших антитромбоцитарную терапию в начале исследования (17% по сравнению с 21% в группе плацебо; HR 0,76, 0,60-0,96). При этом, не наблюдалось какого-либо значительного эффекта от витаминов В у индивидуумов, получающих антитромбоцитарную терапию (см. публикацию Hankey et al. Antiplatelet therapy and the effects of B vitamins in patients with previous stroke or transient ischemic attack: a post-hoc sub-analysis of VITATOPS, a randomized, placebo-controlled trial. Lancet Neurol 2012; 11:512-520, которая в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). В этом исследовании, уровни tHcy были значительно снижены с 12,4 до 13,7 мкмоль/л в начале исследования до 9,9-10,5 мкмоль/л после витаминной терапии, независимо от того, проходили ли пациенты антитромбоцитарную терапию или нет (p<0,0001 для обеих лечебных групп) (см. публикацию Hankey et al., Lancet Neurol 2012; 11:512-520, которая в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки).
[0325] Считается, что воспалительные каскады вносят вклад в патогенез ишемического инсульта. В испытании Framingham Offspring Study с участием 3224 индивидуумов (см. публикацию Shoamanesh et al. Neurology. 2016 Sep;87(12):1206-11, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) было обнаружено, что повышенные уровни tHcy и трех других маркеров воспаления были тесно связаны с риском ишемического инсульта и улучшали прогностическую способность согласно оценке профиля риска инсульта по Фрамингему.
[0326] Мета-анализ данных исследований VISP и VITATOPS показал, что у пациентов с нормальной функцией почек, ранее не подвергавшихся воздействию высоких доз цианокобаламина, наблюдалась значительная польза от витаминотерапии, включая высокие дозы цианокобаламина (0,78, 0,67-0,90; вероятность взаимодействия p=0,03), тогда как витаминотерапия, включающая прием высоких доз цианокобаламина (в форме витамина B), не влияла на риск инсульта у индивидуумов с нарушением функции почек (RR 1,04, 95% CI от 0,84 до 1,27) (см. публикацию Spence JD. Lancet Neurol. 2007 Sep;6(9): 830-8, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Эти результаты свидетельствуют о потенциально искажающих эффектах цианокобаламина, известного своей нефротоксичностью, ассоциированной с накоплением цианидов у пациентов со значительным нарушением функции почек (см. публикацию Spence JD, Clin Chem Lab Med. 2013 Mar 1; 51(3):633-7, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В соответствии с этим, в исследовании DIVINe (лечение диабета с использованием витаминов, принимаемых при нефропатии), высокие дозы витаминов группы В, включая цианокобаламин в дозе 1000 мкг, были тоскичными и усугубляли снижение eGFR (см. публикации Spence JD. Int J Stroke. 2016 Oct;11(7):744-7; House et al. JAMA 2010; 303: 1603-1609, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). В целом, эти данные подтверждают пользу использования витаминов В, не содержащих цианид, таких как метилкобаламин, вместо цианокобаламина, для снижения уровней Hcy у индивидуумов с высоким риском инсульта, особенно с почечной недостаточностью.
[0327] Токсичность цианокобаламина и цианида также упоминалась в предыдущих исследованиях как искажающие факторы при наличии почечной недостаточности по результатам CSPPT (Китайского исследования по первичной профилактике инсульта (см. публикацию Huo et al. JAMA. 2015 Apr 7;313(13):1325-35), которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Польза от лечения, продемонстрированная при почечной недостаточности в CSPPT, противоречила отсутствию пользы, наблюдаемой в испытаниях DIVINe, VISP и VITOPS, вероятно, из-за лечения цианокобаламином в последних испытаниях.
[0328] Поскольку в Китае, прием большого количества фолиевой кислотой еще не применялся, то влияние добавок фолиевой кислоты на снижение уровня tHcy можно было бы изучить там с участием большой группы индивидуумов. CSPPT представляло собой рандомизированное двойное слепое исследование, проведенное с участием 20702 взрослых индивидууов с гипертензией, но без инсульта или ИМ в анамнезе, и это исследование продемонстрировало, что фолиевая кислота значительно снижает риск первого инсульта (2,7 против 3,4% без фолиевой кислоты, HR 0,79; 95% CI от 0,68 до 0,93), первого ишемического инсульта (2,2 против 2,8% без фолиевой кислоты, HR 0,76; 95% CI от 0,64 до 0,91) и комбинированных сердечно-сосудистых заболеваний (смерть от сердечно-сосудистого заболевания, ИМ и инсульт; 3,1% против 3,9% без фолиевой кислоты, HR 0,80; 95% CI от 0,69 до 0,92). И напротив, между двумя группами не было существенных различий в отношении риска геморрагического инсульта, смертности от всех заболеваний или частоты побочных эффектов. В дополнительном исследовании CSPPT (см. публикацию Xu et al. JAMA Intern Med. 2016 Oct 1;176(10):1443-1450, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), у обоих индивидуумов с почечной недостаточностью или без нее (eGFR ниже 60 мл/мин/1,73 м2) наблюдался благоприятный эффект от фолиевой кислоты, и дополнительное исследование также подтвердило, что в группе, получавшей фолиевую кислоту, было гораздо большее снижение Hcy в сыворотке, чем в группе, не получавшей фолиевую кислоту (1,9 против 0,2 мкмоль/л соответственно, p<0,001).
[0329] В обзоре по Кохрану 2017 г. (см. публикацию Martí-Carvajal et al. Cochrane Database Syst Rev. 2017 Aug 17;8:CD006612, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), где было проанализировано 15 рандомизированных контролируемых испытаний с участием 74422 индивидуумов, сообщалось о небольшой разнице в отношении влияния снижения уровня Hcy с использованием витаминов группы В на инсульт, но не наблюдалось какого-либо влияния на ИМ, смертность от любого заболевания или побочных эффектов. По сравнению с плацебо/стандартным лечением, лечение, снижающее уровень Hcy, ассоциировалось со снижением частоты несмертельных или смертельных инсультов (4,33% против 5,1% для контроля; RR 0,90, 95% CI 0,82-0,99), но не влияло на частоту несмертельных или смертельных ИМ (7,1% против 6,0% для плацебо; относительный риск (RR) 1,02, 95% CI от 0,95 до 1,10) или смерть по любой причине (11,7% против 12,3% для плацебо; RR 1,01, 95% CI от 0,96 до 1,06) в общей группе. Этот обзор позволил пересмотреть три более ранних версии (2009, 2013 и 2015 гг.), где ранее был сделан вывод об отсутствии доказательств, подтверждающих влияние лечения, направленного на снижение уровня Hcy, на сердечно-сосудистые заболевания, хотя обзор 2015 г. указывал на незначительную тенденцию к снижению заболеваемости инсультом (см. публикацию Marti-Carvajal Cochrane Database Syst Rev 2015;1:CD006612, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Надежность доказательств в отношении лечения, снижающего уровень Hcy при инсульте, возросла по мере того, как стали доступны дополнительные исследования.
[0330] В исследованиях, включенных в обзор, использовались различные схемы приема витаминных добавок в качестве терапии для снижения уровня Hcy (см. публикацию Martí-Carvajal et al. Cochrane Database Syst Rev. 2017 Aug 17;8:CD006612, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В Обзоре 2017 года было добавлено три новых испытания к обзору 2015 года. Из общего числа испытаний, в 10 испытаниях использовали пиридоксин плюс витамины B9 (фолат) и B12, в пяти использовали только витамин B9 и в одном из 10, вместо фолиевой кислоты использовали 5-метилтетрагидрофолат.Некоторые испытания включали сопутствующие препараты (как в контрольной группе, так и в группе, получавшей витамины), в 7 испытаниях использовали препараты для снижения уровня липидов, а в одном испытании использовали антигипертензивные средства. В целом, лечение, снижающее уровень Hcy, привело к относительно небольшому снижению средних уровней tHcy. Более того, три исследования были проведены с участием группы, которая получала диету, обогащенную фолиевой кислотой, а два исследования были проведены с участием смешанной группы (одни индивидуумы получали обогащенную диету, а другие - нет), что могло замаскировать эффекты снижения уровня Hcy. Принимая во внимание искажающие факторы, которые могут повлиять на такие исследования, неудивительно, что в более ранних обзорах не было выявлено каких-либо значительных сердечно-сосудистых эффектов от лечения витаминами, а в последнем обзоре сообщалось лишь об умеренном влиянии на инсульт.Также следует отметить, что многие потенциальные причины повышенных уровней Hcy не были изучены в исследованиях, включенных в Кохрановский обзор (см. публикацию Marti-Carvajal et al. Cochrane Database Syst Rev 2015; которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). При этом, могут присутствовать дополнительные факторы, влияющие на патофизиологию, ассоциированную с риском сосудистого заболевания у пациентов с HCU и в более молодом возрасте, чем в общей группе. Примечательно, что даже умеренное снижение уровня Hcy в значительной степени связано со снижением риска инсульта.
[0331] После проведения некоторых из этих анализов, возникает интересный вопрос, почему некоторые исследования указывают на влияние уровней Hcy на инсульт, но не на инфаркт миокарда (ИМ). В связи с этим вопросом, Spence (см. публикацию Spence JD. Lancet Neurol. 2007 Sep;6(9):830-8, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) указал на ключевые различия между инфарктом миокарда и церебральным инфарктом, при этом, церебральный инфаркт тесно связан с тромбозом/эмболией, но тромбоз in situ является следствием разрыва бляшки в коронарной артерии почти во всех случаях инфаркта миокарда. Таким образом, Spence пришел к выводу, что значительная доля инсультов связана с тромботическими процессами, которые могут быть ассоциированы с повышением уровня tHcy.
[0332] Повышенные уровни tHcy могут иметь важное значение не только при кардиоэмболическом инсульте, но также и при атероэмболическом и лакунарном инфаркте. Исследование, проведенное у пожилых пациентов с фибрилляцией предсердий, получавших антикоагулянтную терапию, показало, что высокие уровни tHcy (>90-го процентиля) были связаны с 4,7-кратным увеличением числа ишемических осложнений (см. публикацию Poli et al. J Am Coll Cardiol 2009; 54:999-1002, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Другое исследование с участием пациентов, страдающих криптогенным ишемическим инсультом, показало, что у пациентов с овальным отверстием (фактором риска инфаркта головного мозга), уровни tHcy в плазме были значительно выше, чем у пациентов без этого отверстия (8,9±3 против 7,9±2,6 мкмоль/л, соответственно; p=0,021) (см. публикацию Ozdemir et al. J Neurol Sci 2008; 275:121-127, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). При рассмотрении таких результатов, Spence (см. публикацию Spence, JD. "Homocysteine lowering for stroke prevention: Unravelling the complexity of the evidence" Int J Stroke (2016) Oct; 11(7):744-747, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) предположил, что Hcy влияет в первую очередь на образование красного тромба (фибриновую полимерную сетку с захваченными эритроцитами, которая формируется в условиях стаза), но, при этом, лакунарные инфаркты и бляшки в сонной артерии также в значительной степени связаны с tHcy, поскольку уровни tHcy также были значительно выше у пациентов с микроэмболией при транскраниальном допплеровском исследовании (16,2 против 10,1 ммоль/л), и большинство таких микроэмболий, как полагают, представляют собой агрегаты тромбоцитов, количество которых снижается за счет двойной антитромбоцитарной терапии (см. публикацию Spence, JD. Homocysteine lowering for stroke prevention: Unravelling the complexity of the evidence. Int J Stroke. 2016 Oct; 11(7):744-747, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0333] В исследовании, проведенном у 32 пациентов с HCU (в возрасте от 9 до 66 лет), получавших пиридоксин, фолиевую кислоту и гидроксокобаламин, в общей сложности у 539 пациентов за несколько лет проведения терапии, было зарегистрировано два сосудистых заболевания (смертельная легочная эмболия и ИМ) во время лечения (см. публикацию Wilcken et al. J Inherit Metab Dis 1997, 20:295-300, которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки). Согласно эпидемиологическому исследованию Mudd et al., 21 заболевание ожидалось за тот же период времени без лечения (RR 0,09 (95% CI от 0,02 до 0,38); р=0,0001). Второе исследование, проведенное с участием 84 пациентов из трех стран в возрасте от 2,5 до 70 лет, выявило пять случаев венозной эмболии (VE) у 1314 пациентов за несколько лет проведения терапии, то есть, одну легочную эмболию, два ИМ и две аневризмы брюшной полости (см. публикацию Yap et al. Semin Thromb Hemost 2000; 26:335-340, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Согласно Mudd et al. (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), было выявлено 53 случая VE, как можно было ожидать у пациентов, не прошедших лечение (RR 0,091 (95% CI от 0,043 до 0,190); р<0,001).
[0334] Доказательства, подтверждающие эти результаты, были получены в результате крупномасштабного Международного многоцентрового экспериментального исследования с участием 158 пациентов с HCU (см. публикацию Yap et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21:2080-2085, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), где возраст большинства пациентов составлял от 10 до 30 лет.В этом исследовании наблюдалось 17 сосудистых заболеваний у 12 прошедших лечение пациентов, то есть, три случая легочной эмболии, два случая ИМ, пять случаев тромбоза глубоких вен, три случая нарушения мозгового кровообращения, один случай транзиторной ишемической атаки, один случай тромбоза сагиттального синуса и два случая аневризмы брюшной аорты. Без лечения, в аналогичной группе можно было бы ожидать 112 сосудистых заболеваний (RR 0,09 (95% CI от 0,036 до 0,228); p<0,0001). Это исследование также показало, что даже прошедшие лечение и тщательно наблюдаемые молодые взрослые пациенты с HCU имеют плохие клинические исходы по сравнению с общей группой.
[0335] Повышенный уровень tHcy в плазме является фактором риска сосудистых заболеваний и важным прогностическим фактором смертности у пациентов с CAD, как с CBSD, так и без него (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Karaca et al. Gene 2014; 534:197-203; Kelly et al. Neurology 2003; 60:275-279; Faeh et al. Swiss Med Wkly 2006; 136:745-756; Boushey et al. JAMA 1995; 274:1049-1057; Clarke et al. JAMA 2002; 288:2015-2022; Hankey et al. Lancet 1999; 354:407-413; Khan et al. Stroke 2008; 39:2943-2949; Graham et al. JAMA 1997; 277:1775-1781; Clarke et al. N Engl J Med 1991; 324:1149-1155; Clarke et al. Ir J Med Sci 1992; 161:61-65; Woodward et al. Blood Coagul Fibrinolysis 2006; 17:1-5; Refsum et al. Annu Rev Med 1998; 49:31-62; Yoo et al. Stroke 1998; 29:2478-2483; Selsun et al. N Engl J Med 1995; 332:286-291; Wald et al. BMJ 2002; 325:1202; Bautista et al. J Clin Epidemiol 2002; 55:882-887; Brattstrom et al. Atherosclerosis 1990; 81:51-60; Lussana et al. Thromb Res 2013; 132:681-684; Casas et al. Lancet 2005; 365:224-232; McCully KS. Am J Pathol 1969; 56:111-128; Magner et al. J Inherit Metab Dis 2011; 34:33-37; Wilcken et al. J Clin Invest 1976; 57:1079-1082; Nygard et al. N Engl J Med 1997; 337:230-236, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0336] Из данных о причинно-следственной связи между уровнями tHcy и риском сердечно-сосудистого заболевания (см. публикацию Boushey et al. JAMA 1995; 274:1049-1057, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), самая тесная взаимосвязь была продемонстрирована между tHcy и инсультом или PAD (см. публикации Clarke et al. JAMA 2002; 288:2015-2022; Khan et al. Stroke 2008; 39:2943-2949; Wald et al. BMJ 2002; 325:1202; Casas et al. Lancet 2005; 365:224-232; Brattstrom et al. Haemostasis 1989;19 Suppl 1:35-44, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), включая пациентов с гомозиготными и гетерозиготными мутациями CBS (см. публикацию Rubba et al. Metabolism 1990; 39:1191-1195, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0337] Механизмы, потенциально связывающие повышенный уровень Hcy с повреждением сосудов, являются разнообразными и очень сложными. Несколько исследований выявили окислительный стресс (см. публикации Faverzani et al. Cell Mol Neurobiol 2017; Nowak et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2017; 37: e41-e52; Vanzin et al. Mol Genet Metab 2011; 104:112-117; Vanzin et al. Gene 2014; 539:270-274; Vanzin et al. Lipid, Cell Mol Neurobiol 2015; 35:899-911, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), включая окислительный стресс за счет воспалительной/иммунной активации посредством NF-κB (см. публикации Rodriguez-Ayala et al. Atherosclerosis 2005; 180:333-340; van Guldener et al. Curr Hypertens Rep 2003; 5:26-31, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Хотя такие воспалительные процессы характерны для атеросклероза, однако, типичные атеросклеротические поражения не обязательно должны предшествовать тромботическим нарушениям у пациентов с HCU (см. публикации Rubba et al. Stroke 1994; 25:943-950; de Valk et al. Stroke 1996; 27:1134-1136, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Вместо этого считается, что медиальное повреждение, ведущее к тромбозу, вызвано Hcy-опосредованной эндотелиальной дисфункцией (см. публикации Marti-Carvajal et al. Cochrane Database Syst Rev 2015; 1:CD006612; Celermajer et al. J Am Coll Cardiol 1993; 22:854- 858; Rubba et al. Metabolism 1990; 39:1191-1195; Jiang et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005; 25:2515-2521; Hossain et al. J Biol Chem 2003; 278:30317-30327; Cai et al. Blood 2000, 96:2140-2148, Zhang et al., J Biol Chem, 2001, 276:35867-35874, Papapetropoulos et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106:21972-21977, Szabo et al., Br J Pharmacol, 2011; 164:853-865; Chiku et al., J Biol Chem 2009; 284:11601-11612; Wang et al., Antioxid Redox Signal, 2010; 12:1065-1077; Saha S, et al., FASEB J 2016; 30:441- 456; Ebbing et al. JAMA 2008; 300:795-804; Bonaa et al. N Engl J Med 2006; 354:1578-1588, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), путями усиленной коагуляции (см. публикации Spence JD, Int J Stroke, 2016 Oct;11(7):744-7, Fryer et al. Arterioscler Thro мб 1993; 13:1327-1333; Lentz et al. J. Clin. Invest 1991; 88:1906-1914, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки) и повышенной дилатацией сосудов, аналогичной тромботическим процессам, характерным для пациентов с болезнью Марфана (см. публикации Kelly et al. Neurology 2003; 60:275-279; Tripathi P. Molecular and biochemical aspects of homocysteine in cardiovascular diseases. International Cardiovascular Forum J 2016; 6:13; van Guldener et al. Curr Hypertens Rep 2003; 5:26-31; Hackam et al. JAMA 2003; 290:932-940; Baumbach et al. Circ Res 2002; 91:931-937; Evangelisti et al. Int J Cardiol. 2009; 134:251-254; de Valk et al. Stroke 1996; 27:1134-1136, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В соответствии с наблюдениями эндотелиальной дисфункции у пациентов с HCU, фармакологические и генетические исследования выявили участие CBS-опосредованного S-сульфгидрирования белка в поддержании здоровья и функции сосудов (см. публикацию Celermajer et al. J Am Coll Cardiol 1993; 22:854-858; Rubba et al. Metabolism 1990; 39:1191-1195, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Таким образом, вполне вероятно, что механизмы повреждения сосудов у пациентов с HCU более разнообразны, чем в общей группе пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
[0338] Имеются убедительные доказательства того, что снижение уровня Hcy полезно для снижения риска инсульта у индивидуумов с HCU и без нее (см. публикации Saposnik et al. Stroke 2009; 40:1365-1372; Huo et al. JAMA 2015; 313:1325-1335; Lonn et al. N Engl J Med 2006; 354:1567-1577; Hankey et al. Lancet Neurol 2012; 11:512-520; Spence JD. Lancet Neurol. 2007 Sep;6(9):830-8, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Хотя средние исходные уровни Hcy были относительно низкими в исследованиях, проведенных у индивидуумов в общей группе, однако, снижение частоты инсульта в значительной степени коррелировало с терапией по снижению Hcy, что указывало на преимущества даже небольшого снижения уровней tHcy.
[0339] Обновленные обзоры соответствующих исследований подтверждают положительный эффект лечения, снижающего уровень Hcy при инсульте (см. публикацию Martí-Carvajal et al. Cochrane Database Syst Rev. 2017 Aug 17;8:CD006612, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Искажающие результаты факторы, такие как обогащение фолиевой кислотой, дефицит витамина B12 или почечная дисфункция, делающие пациентов уязвимыми к высоким дозам цианокобаламина, или прием индивидуумами антитромбоцитарных препаратов, затуманивали результаты испытаний. Недавно проведенные анализы показали, что при учете таких факторов, связь между tHcy и риском инсульта была наиболее тесной в общей группе (см. публикацию Spence JD, Clin Chem Lab Med. 2013 Mar 1;51(3):633-7, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Однако, важно отметить, что у пациентов с HCU с гораздо более высокими уровнями tHcy, чем в общей группе, были последовательно продемонстрированы преимущества снижения Hcy при лечении сосудистых заболеваний (см. публикации Yap et al. J Inherit Metab Dis 1998; 21:738-747; Eslamiyeh et al. Iran. J Child Neurol 2015; 9:53-57; Saboul et al. J Child Neurol 2015; 30:107-112; Yap et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21:2080-2085; Woods et al. BMJ Case Rep 2017; 2017; Wilcken et al. J Inherit Metab Dis 1997; 20:295-300; Yap et al. Semin Thromb Hemost 2000; 26:335-340; Ruhoy et al. Pediatr Neurol 2014; 50:108-111, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0340] Эти данные свидетельствуют о том, что повышенный уровень Hcy является фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний, особенно инсульта, у пациентов с HCU и без нее, и что риск сердечно-сосудистых или цереброваскулярных заболеваний можно снизить путем проведения длительной терапии, снижающей уровень Hcy.
[0341] Тромбоэмболия является основной причиной заболеваемости и преждевременной смерти у пациентов с HCU (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Karaca et al. Gene 2014; 534:197-203; Yap S. J Inherit Metab Dis 2003; 26:259-265, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Общая частота тромбоэмболических осложнений у не проходивших лечение пациентов с HCU составляет приблизительно 10% в год (см. публикацию Cattaneo M. Semin Thromb Hemost 2006; 32:716-723, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), при этом, риск увеличивается после хирургического вмешательства. и во время или сразу после беременности (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Novy et al. Thromb Haemost 2010; 103:871-873, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Тромбоэмболия может поразить любой кровеносный сосуд, но венозный тромбоз (в частности, церебральный синовенозный тромбоз (CSVT)) встречается чаще, чем артериальный тромбоз у пациентов с HCU (см. публикации Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31; Karaca et al. Gene 2014; 534:197-203; Eslamiyeh et al., Iran J Child Neurol 2015; 9:53-57; Saboul et al. J Child Neurol 2015; 30:107-112, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0342] Исследование с участием 629 не проходивших лечение пациентов с HCU показало, что из наблюдаемых 253 пациентов с сосудистыми заболеваниями (у 158 пациентов), у 81 (32%) наблюдалось нарушение мозгового кровообращения, у 130 (51%) наблюдалось поражение периферических вен (из них в 32 случаях это приводило к легочной эмболии), у 10 (4%) наблюдался инфаркт миокарда (ИМ), у 28 (11%) были поражения периферических артерий, а четыре пациента (2%) не попали ни в одну из этих категорий (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Цереброваскулярные нарушения, особенно CSVT, были описаны у младенцев (см. публикацию Mahhale et al. J Pediatr Neurosci. 2017 Apr-Jun; 12(2):206-207, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), хотя чаще всего они встречаются у молодых взрослых (см. публикацию Yap et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21:2080-2085, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Сообщалось, что цереброваскулярные заболевания лишь незначительно связаны с категорией пациентов с реакцией на пиридоксин.
[0343] Риск сосудистых осложнений составлял приблизительно 30% у пациентов в возрасте до 20 лет и возрастал до 50% к 30 годам. Однако, такие симптомы могут возникать в любом возрасте, и тромбоз с летальным исходом был описан у младенцев в возрасте до 6 месяцев (см. публикацию Cardo et al. Dev Med Child Neurol 1999; 41:132-135, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). После 10 лет ожидается одно сосудистое заболевание в 25 лет.Обычно, первыми признаками HCU у детей являются когнитивные симптомы, проявляющиеся задержкой развития в течение первого или второго года жизни и/или вывихом хрусталика/миопией в высокой степени. И напротив, у взрослых имеется высокая вероятность сосудистых осложнений.
D. Влияние диеты на фенотипические признаки
[0344] В некоторых вариантах осуществления изобретения, мышей I278T, то есть, мышей с моделью HCU, использовали для оценки долгосрочного воздействия ферментной терапии для лечения HCU с использованием 20NHS PEG-CBS на клинические конечные точки, относящиеся к пациентам-людям. Была оценена эффективность 20NHS PEG-CBS на фоне нормального потребления метионина (REG) и диеты с ограничением Met (MRD), а также при монотерапии MRD. Лечение с использованием 20NHS PEG-CBS может приводить к снижению концентрации гомоцистеина в плазме на 90% и к коррекции обучения/познания, эндотелиальной дисфункции, гемостаза, минерализации костей и фенотипов телосложения, ассоциированных с HCU. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лечение с использованием 20NHS PEG-CBS на фоне MRD нормализовало уровни Hcy в плазме. Было отмечено, что только MRD снижает Hcy в плазме на 67% и корректирует фенотип HCU у мышей I278T. Однако, MRD повышал тревожность и снижал содержание минералов в костях как у мышей I278T, так и у контрольных мышей дикого типа. Таким образом, 20NHS PEG-CBS был очень эффективен для лечения HCU у индивидуумов на фоне REG или диеты с ограничением Met. Фактически, ферментная терапия (ЕТ), проводимая с использованием 20NHS PEG-CBS на фоне нормального потребления Met, давала такаие же результаты, как и в случае диеты с ограничением Met или даже лучшие результаты.
[0345] Подводя итоги, можно сказать, что MRD сама по себе эффективна для коррекции множественных симптомов HCU, несмотря на то, что она не может снизить концентрацию Hcy в плазме ниже рекомендуемого уровня и приводит к повышенной тревожности и снижению минерализации костей. С другой стороны, ферментная терапия, проводимая с использованием 20NHS PEG-CBS, как описано в настоящей заявке, снижала концентрации Hcy в плазме ниже 100 мкМ и корректировала все наблюдаемые симптомы HCU. Кроме того, 20NHS PEG-CBS сохраняет свою эффективность при ограничении Met, обеспечивая полностью нормализованный биохимический профиль в плазме. После экстраполяции этих данных на пациентов, результаты показали, что 20NHS PEG-CBS как единственная пожизненная терапия может быть эффективной для профилактики и коррекции клинических симптомов HCU. Кроме того, лечение с использованием 20NHS PEG-CBS позволяет ослабить ограничения Met в диете и, таким образом, существенно улучшить качество жизни пациентов с HCU и их семей.
E. Неврологические осложнения
[0346] Исследования показали, что раннее снижение уровня Hcy, вызванное диетой с низким содержанием Met, приемом фолиевой кислоты/витаминов группы B и/или терапией пиридоксином и бетаином, может предотвратить, а иногда и обратить вспять, прогрессирование различных неврологических расстройств и обеспечить нормальный IQ у пациентов с HCU (см. публикации El El Bashir et al. JIMD Rep 2015; 21:89-95; Yap et al. J Inherit Metab Dis 2001; 24:437-447; Mech AW, Farah A. Correlation of clinical response with homocysteine reduction during therapy with reduced B vitamins in patients with MDD who are positive for MTHFR C677T or A1298C polymorphism: a randomized, double-blind, placebo-controlled study. J Clin Psychiatry 2016; 77:668-671; Grobe H. Eur J Pediatr 1980; 135:199-203; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Дополнительные доказательства представлены в тематических исследованиях пациентов с HCU, у которых значительное снижение, даже нормализация уровней Hcy приводили к полной или частичной коррекции расстройств ЦНС (см. публикации Yap et al. J Inherit Metab Dis 2001; 24:437-447; Brenton et al. J Child Neurol 2014; 29:88-92; Rezazadeh et al. Child Neurol Open 2014; 1:2329048X14545870; Kaeser et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1969; 32:88-93; Colafrancesco et al. Eur J Pediatr 2015; 174:1263-1266; Yokoi et al. Pediatr Int 2008; 50:694-695; Li et al. Pathology 1999; 31:221-224, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки).
[0347] Связь между повышенными уровнями Hcy и симптомами ЦНС, включая когнитивные симптомы, нейродегенеративные заболевания, эпилептические припадки, дистонию, психоз, когнитивные нарушения, деменцию и депрессию, хорошо задокументирована у пациентов с HCU и в общей группе (см. публикации Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74; Abbott et al. Am J Med Genet 1987; 26:959-969; Mudd et al. Disorders of transsulfuration. In: Scriver CL, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, eds. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7 ed. New York: McGraw Hill; 2001;1279-1327; Hidalgo et al. Eur Child Adolesc Psychiatry 2014; 23:235-238; Smith et al. PLoS One 2010;5: e12244; Seshadri et al. N Engl J Med 2002; 346:476-483; Bottiglieri et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2000; 69:228-232; Bjelland et al. Arch Gen Psychiatry 2003; 60:618-626; Tolmunen et al. Am J Clin Nutr 2004; 80:1574-1578; Kaeser et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1969; 32:88-93; Golimbet et al. Psychiatry Res 2009; 170:168-171; Clarke et al. Arch Neurol 1998; 55:1449-1455; Permoda-Osip et al. Neuropsychobiology 2014; 69:107-111; Oliveira et al. BMJ Case Rep 2016;2016; Troen et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105:12474-12479; Sudduth et al. J Cereb Blood Flow Metab 2013; 33:708-715; Hainsworth et al. Biochim Biophys Acta 2016; 1862:1008-1017; Herrmann et al. Clin Chem Lab Med 2011; 49:435-441; Kim et al. J Nutr 2007; 137:2093-2097; Selhub et al. Am J Clin Nutr 2000; 71:614S-620S; McCaddon et al. Dement Geriatr Cogn Disord 2001; 12:309-313; Smallwood et al. Neuropathol Appl Neurobiol 2012; 38:337-343; Beydoun et al. BMC Public Health 2014; 14:643; Gortz et al. J Neurol Sci 2004; 218:109-114; Health Quality O. Vitamin B12 and cognitive function: an evidence-based analysis. Ont.Health Technol.Assess.Ser.13 (23), 1e45. 2013. Ref Type: Online Source; Salagre et al. Eur Psychiatry 2017; 43:81-91, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Считается, что механизмы, ведущие к расстройствам ЦНС у индивидуумов с повышенными уровнями Hcy, включают tHcy-опосредованное повреждение нейронов (см. публикации Mudd et al. Disorders of transsulfuration. In: Scriver CL, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, eds. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7 ed. New York: McGraw Hill; 2001;1279-1327; Hainsworth et al. Biochim Biophys Acta 2016; 1862:1008-1017; Stefanello et al. Metab Brain Dis 2007; 22:172-182; Toborek et al. Atherosclerosis 1995; 115:217-224, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), повреждение эндотелия сосудов, вызываемое Hcy-опосредованным окислительным стрессом (см. публикацию Vivitsky et al. Am J Physiol Regul IntegrComp Physiol 2004; 287: R39-R46, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), гибель нейронов (см. публикации Yeganeh et al., J Mol Neurosci 2013; 50:551-557; Heider et al. J Neural Transm Suppl 2004;1-13, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки) и ослабленную активность нейронной сети (см. публикацию Gortz et al. J Neurol Sci 2004; 218:109-114, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Считается, что депрессия и судороги, по меньшей мере частично, вызваны Hcy-опосредованным снижением уровней церебрального аденозина с последующим снижением уровня норэпинефрина и допамина (см. публикации Mech et al. J Clin Psychiatry 2016; 77:668-671; Domagala et al. Thromb Res 1997; 87:411-416; Vivitsky et al. Am J Physiol Regul IntegrComp Physiol 2004;287: R39-R46;Folstein et al., Am J Psychiatry 2007:164:861-867, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0348] Эти результаты продемонстрировали значительную корреляцию между уровнями Hcy и повышенным риском нарушений ЦНС у пациентов с HCU. Ранняя терапия, направленная на снижение уровня Hcy, необходима для нормального развития детей с ранним началом HCU, а также для коррекции или устранения нарушений ЦНС у пациентов с диагностированной HCU в более позднем возрасте.
[0349] Исследование 63 пациентов с HCU показало, что у 51% пациентов наблюдались психические расстройства, включая тревогу и эпизодическую депрессию (10%), хронические поведенческие расстройства (например, агрессию и злоупотребление наркотиками или алкоголем) (17%), хронические навязчивые состояния (5%) и расстройства личности (19%) (см. публикацию Abbott et al. Am J Med Genet 1987; 26:959-969, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Психоз может проявляться в подростковом возрасте (см. публикацию Hidalgo et al. Eur Child Adolesc Psychiatry 2014; 23:235-238, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0350] При отсутствии лечения, приблизительно у 90% пациентов, не реагирующих на пиридоксин, возникают трудности с обучением (см. публикацию Mudd et al. Am J Hum Genet 1985; 37:1-31, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), при этом, IQ обычно находится в диапазоне от 10 до 138, со средним значением 57 у индивидуумов, не реагирующих на пиридоксин, по сравнению со значением 79 у пациентов, реагирующих на пиридоксин и не прошедших лечение, и значением 105 у прошедших лечение пациентов, реагирующих на пиридоксин и соблюдающих режим лечения (см. публикацию Yap et al. J Inherit Metab Dis 2001; 24:437-447, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Эпилептические припадки возникают у 20% невосприимчивых пациентов к 12 годам, и сообщалось о нескольких случаях нарушений двигательной активности, не связанных с инфарктом базальных ганглиев, включая синдром «пляшущих глаз», дистонию и болезнь Паркинсона (см. публикации Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40: 49-74; Rezazadeh et al. Child Neurol Open 2014; 1:2329048X14545870, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки).
[0351] Связь между HCU и нейропсихическими симптомами была впервые описана Schimke et al. в 1965 г. (см. публикацию Schimke et al. JAMA 1965; 193:711-719, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Эта связь позже была подтверждена в исследовании, в котором сообщается о психопатологии более чем у 50% пациентов с дефицитом CBS (см. публикацию Abbott et al. Am J Med Genet 1987; 26:959-969, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). С тех пор многочисленные эпидемиологические исследования показали положительную дозозависимую взаимосвязь между даже незначительным повышением уровня tHcy в плазме и риском расстройств ЦНС, включая когнитивные симптомы и нейродегенеративные заболевания (см. публикации Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74); Seshadri et al. N Engl J Med 2002; 346:476-483; Clarke et al. Arch Neurol 1998; 55:1449-1455; Hainsworth et al. Biochim Biophys Acta 2016; 1862:1008-1017; Herrmann et al. Clin Chem Lab Med 2011; 49:435-441; Kim J et al. J Nutr 2007; 137:2093-2097; Selhub et al. Am J Clin Nutr 2000; 71:614S-620S; McCaddon et al. Dement Geriatr Cogn. Disord 2001; 12:309-313; Smallwood et al., Neuropathol Appl Neurobiol 2012; 38:337-343; Beydoun et al., BMC Public Health 2014; 14:643; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В целом, у пациентов с резко повышенным уровнем Hcy (от 50 до 200 мкМ/л) наблюдается острая дисфункция нейронов, включая эпилептические припадки и психоз, тогда как более умеренные уровни Hcy (от 15 до 50 мкМ/л) связаны с когнитивными нарушениями и деменцией (см. публикации Mudd et al. Disorders of transsulfuration. In: Scriver CL, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, eds. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7 ed. New York: McGraw Hill; 2001; 1279-1327; Gortz et al., J Neurol Sci 2004; 218:109-114, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0352] Повышенный уровень Hcy широко признан надежным и независимым фактором риска когнитивных нарушений (см. публикации Smith et al. PLoS One 2010;5: e12244; Seshadri et al. N Engl J Med 2002; 346:476-483, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), начала деменции (см. публикацию Health Quality O. Vitamin B12 and cognitive function: an evidence-based analysis. Ont.Health Technol.Assess.Ser.13 (23), 1e45. 2013. Ref Type: Online Source, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) и болезни Альцгеймера (см. публикацию Seshadri et al. N Engl J Med 2002; 346:476-483, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Кроме того, было показано, что повышенные уровни Hcy (>15 мкмоль/л) присутствуют у 90% пациентов с депрессией (см. публикации Bottiglieri et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2000; 69:228-232; Bjelland et al. Arch Gen Psychiatry 2003; 60:618-626, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки), причем мужчины в верхнем терциле по уровню tHcy более, чем в два раза чаще страдают депрессией, чем мужчины в самом нижнем терциле (см. публикацию Tolmunen et al., Am J Clin Nutr 2004; 80:1574-1578, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). О повышенном уровне Hcy обычно сообщают в случаях шизофрении, рассеянного склероза, болезни Паркинсона, фибромиалгии/синдрома хронической усталости (см. публикации Kaeser et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1969; 32:88-93; Golimbet et al. Psychiatry Res 2009; 170).:168-171; Clarke et al., Arch Neurol 1998; 55:1449-1455; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) и рецидивирующей дистонии без цереброваскулярного заболевания (см. публикацию Sinclair et al. Mov Disord 2006; 21:1780-1782, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Была описана возможная связь между полиморфизмом T833C гена CBS и биполярным расстройством (см. публикацию Permoda-Osip et al. Neuropsychobiology 2014; 69:107-111, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), а недавний метаанализ показал взаимосвязь между повышенными уровнями Hcy и маниями/эутимией у индивидуумов с биполярным расстройством (см. публикацию Salagre et al. Eur Psychiatry 2017; 43:81-91, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Первый известный случай периферической невропатии, связанной с HCU, был недавно описан у 18-летнего мужчины с HCU (см. публикацию Oliveira et al. BMJ Case Rep 2016, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), а летальный случай психоза был описан у 17-летнего подростка с ранее не диагностированной HCU (см. публикацию Hidalgo et al. Eur Child Adolesc Psychiatry 2014; 23:235-238, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0353] Прямые доказательства взаимосвязи между уровнями Hcy и деменцией были получены в исследованиях на животных, у которых введение Hcy было связано с развитием поражений головного мозга (см. публикации Troen et al. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:12474-12479; Sudduth et al. J Cereb). Blood Flow Metab 2013; 33:708-715, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В первом таком исследовании, у самцов мышей C57BL6/J с повышенными уровнями Hcy (вызванными диетой с дефицитом витамина B) были значительно нарушены пространственное обучение и память со значительным разрежением микрососудистого русла гиппокампа без сопутствующего глиоза или нейродегенерации (см. публикацию Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:12474-12479, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Общая длина капилляров гиппокампа обратно коррелировала с латентностью выхода из водного лабиринта Морриса (r=0,757, p<0,001) и с tHcy плазмы (r=0,631, p<0,007). У мышей, получавших диету, богатую Met, наблюдались аналогичные, но менее выраженные эффекты. Эти данные свидетельствуют о том, что повышенные уровни Hcy связаны с разрежением микрососудов головного мозга, приводящим к когнитивной дисфункции в отсутствие нейродегенерации или предшествующей нейродегенерации. Это может объяснить связь между повышенными уровнями Hcy и снижением когнитивных функций у человека.
[0354] Во втором исследовании, здоровым мышам давали корм с дефицитом фолата кислоты, витаминов B6 и B12 и с добавлением Met, чтобы вызвать умеренное повышение уровня Hcy (tHcy в плазме 82,93±3,56 мкмоль/л). У этих мышей наблюдался дефицит пространственной памяти, как было оценено с использованием водного лабиринта с радиальными лучами в течение 2 дней (см. публикацию Sudduth et al. J Cereb Blood Flow Metab 2013; 33:708-715, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). МРТ и гистология выявили значительную частоту микрокровоизлияний. Также наблюдались нейровоспаление и повышенная экспрессия и активность MMP2 и MMP9, то есть, обоих ферментов, участвующих в патогенезе кровоизлияния в мозг.Это позволяет предположить о взаимосвязи между повышенными уровнями Hcy и сосудистой деменцией, например, при болезни Альцгеймера.
[0355] У людей, изменения в белом веществе (признак повреждения сосудов) часто связаны с повышенными уровнями Hcy у людей с HCU (см. публикации El Bashir et al. JIMD Rep 2015; 21:89-95; Vatanavicharn et al. J Inherit Metab). Dis 2008; 31 Suppl 3:477-481; Brenton et al. J Child Neurol 2014; 29:88-92; Ruhoy et al. Pediatr Neurol 2014; 50:108-111; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) и без нее (см. публикации Hogervorst et al. Arch Neurol 2002; 59:787-793; Kloppenborg et al. Neurology 2014; 82:777-783; каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Однако, эти изменения не всегда связаны с признаками инсульта. Кроме того, визуализирующие исследования головного мозга у пациентов с HCU часто показывают признаки атрофии или венозной окклюзии (см. публикацию Vatanavicharn et al. J Inherit Metab Dis 2008; 31 Suppl 3:477-481, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0356] На сканограмме было выявлено диффузное симметричное аномальное усиление сигнала подкоркового белого вещества и, в меньшей степени, более глубокого белого вещества в церебральных полушариях, преимущественно в теменно-затылочных областях.
1. Механизм
[0357] Точные механизмы, с помощью которых повышенные уровни Hcy влияют на неврологическое здоровье, неизвестны. Несколько исследований на животных показали связь между повышенным уровнем tHcy и нейротоксичностью, а также сопутствующими нервными и психическими нарушениями.
[0358] Исследование, проведенное ранее, показало, что очень высокие внутрибрюшинные дозы Hcy индуцировали генерализованный судорожный эпилептический статус у крыс с индуцированными кобальтом поражениями в двигательной коре (см. публикацию Mudd et al. Disorders of transsulfuration. In: Scriver CL, Beaudet AL, Sly WS, Valle D., eds. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases, 7 ed., New York: McGraw Hill, 2001, 1279-1327, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Приступы усиливались при добавлении Met и витамина B, и были получены некоторые доказательства синергетического воздействия пиридоксаль-5'-фосфата и Hcy в отношении блокирования постсинаптического рецептора гамма-аминомасляной кислоты. Более того, обработка Hcy тканей неокортекса грызунов приводила к захвату аденозина в форме AdoHcy (см. публикацию Heinecke et al. J Biol Chem 1987; 262:10098-10103, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Авторы заявили, что аденозин является преимущественно депрессантом при церебральных функциях, и что судорожные состояния и психические изменения, связанные с высокими уровнями Hcy, могут быть опосредованы пониженными уровнями церебрального аденозина.
[0359] Hcy связан как с нейротоксичностью, так и с морфологическими изменениями в головном мозге (см. публикацию Hainsworth et al. Biochim Biophys Acta 2016; 1862:1008-1017, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Так, например, исследования на крысах и кроликах показали, что повреждение нейронов было вызвано Hcy-опосредованным увеличением количества веществ, реагирующих с тиомасляной кислотой (TBARS), индикаторов окислительного стресса (см. публикации Stefanello et al. Metab Brain Dis 2007; 22:172-182; Toborek et al., Atherosclerosis, 1995, 115:217-224, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки). Аналогичное увеличение содержания TBARS в плазме также наблюдалось у людей после перорально введенной нагрузки Met (см. публикацию Domagala et al. Thromb Res 1997; 87:411-416, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Более того, исследование на мышиной модели повышенных уровней Hcy показало, что клеточное повреждение, вызванное окислительным стрессом, может усиливаться у пациентов с HCU, поскольку снижение уровня Cys приводит к снижению уровня нейронного глутатиона, то есть, важного антиоксиданта, синтезируемого из глутамата, Cys и глицина (см. публикацию Vivitsky et al., Am J Physiol Regul IntegrComp Physiol 2004;287: R39-R46, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0360] Инъекция Hcy in vivo в левый желудочек головного мозга крыс вызывала дозозависимую потерю нейронов (см. публикацию Yeganeh et al. J Mol Neurosci 2013; 50:551-557, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), а инкубирование мезэнцефальных тегментальных нейронов у крыс с Hcy приводило к допаминергическим нейритам в меньшей степени и с более короткими промежутками времени (см. публикацию Heider et al. J Neural Transm Suppl 2004; 1-13, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). В обоих исследованиях, эффекты Hcy были ослаблены совместным введением Hcy с антагонистами NMDA и метаботропными рецепторами глутамата, что свидетельствует о опосредованном рецептором глутамата пути индуцированного Hcy повреждения нейронов. Дополнительные доказательства этого пути были получены из исследования, в котором введение Hcy приводило к дозозависимому перокислению липидов в синаптосомах головного мозга крыс (см. публикацию Jara-Prado et al. Neurotox Res 2003; 5:237-243, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). И в этом случае, эффекты ингибировались введением антагониста рецептора NMDA.
[0361] Исследование на спонтанно активных нейронах коры головного мозга эмбрионов крыс показало, что уровни Hcy, превышающие диапазон резкого повышения Hcy, вызывали дозозависимое подавление активности нейронной сети (см. публикацию Gortz et al. J Neurol Sci 2004; 218:109-114) которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Эффекты, наблюдаемые в этом исследовании, не имели клинического значения, поскольку такие завышенные уровни Hcy никогда не достигаются у пациентов с HCU. Однако, умеренное повышение уровня гомоцистеинсульфиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты (окисленных форм Hcy, часто обнаруживаемых у пациентов с повышенными уровнями Hcy) имело аналогичный эффект.В каждом случае, повреждение нейронной сети ингибировалось 2-амино-5-фосфоновалериановой кислотой, что снова указывает на то, что рецептор NMDA является медиатором этой индуцированной Hcy нейронной дисфункции. Эти результаты позволяют предположить, что дисфункция нейронов, связанная с повышенным уровнем Hcy, вероятно, вызвана окисленными формами Hcy, а не самим Hcy.
[0362] Отсутствие когнитивных симптомов, судорог и других нарушений ЦНС у пациентов с синдромом Марфана и другими заболеваниями соединительной ткани свидетельствует о том, что неврологические расстройства у пациентов с HCU не вызваны дефектами ни фибриллина, ни коллагена (см. публикацию Mudd et al. Disorders of transsulfuration. In: Scriver CL, Beaudet AL, Sly WS, Valle D., eds. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases, 7 ed., New York: McGraw Hill, 2001, 1279-1327, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). У пациентов, не прошедших лечение HCU, повышенные уровни SAM и сниженные уровни SAH ингибируют реакции трансметилирования, необходимые для синтеза миелина, что приводит к дальнейшему повреждению нейронов (см. публикацию Mudd et al. Disorders of transsulfuration. In: Scriver CL, Beaudet AL, Sly WS, Valle D., eds. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases, 7 ed., New York: McGraw Hill, 2001, 1279-1327, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Снижение синтеза миелина также может быть вызвано низкими уровнями серина у пациентов с HCU из-за повышенной скорости реметилирования (см. публикацию Orendac et al. J Inherit Metab Dis 2003; 26:761-773, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). И наконец, метаболизм Hcy играет ключевую роль в синтезе моноаминов, обеспечивая метильные группы для продуцирования норэпинефрина и допамина (см. публикации Mech et al. J Clin Psychiatry 2016; 77:668-671; Folstein et al. Am J Psychiatry 2007; 164: 861-867, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Действительно, «гомоцистеиновая гипотеза депрессии» (см. публикацию Folstein et al. Am J Psychiatry 2007; 164:861-867, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) утверждает, что низкие уровни норэпинефрина и допамина, вызванные повышенными уровнями Hcy, являются основной причиной депрессии.
[0363] Электронная микроскопия биоптатов головного мозга крыс показала цереброваскулярные структурные изменения у животных, получавших диету с высоким содержанием Hcy в течение 8 недель. Эти изменения были связаны с высокими уровнями tHcy в плазме (см. публикацию Lee et al. J Nutr 2005; 135:544-548, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Потребление фолиевой кислоты с пищей в течение следующих 8 недель снижало уровень tHcy в плазме до нормального уровня и значительно уменьшило частоту повреждения сосудов. Это свидетельствует о том, что снижение уровня Hcy с помощью добавок фолиевой кислоты может уменьшить неблагоприятное воздействие экспериментально индуцированных повышенных уровней Hcy на эндотелий сосудов.
[0364] В исследовании, проводимом для оценки эффективности и безопасности восстановленных витаминов В в качестве монотерапии у взрослых с сильным депрессивным расстройством (MDD) и HCU по меньшей мере из-за одного полиморфизма MTHFR (N=330), было показано, что лечение комбинацией восстановленных витаминов В значительно снижало уровни tHcy у 131 пациента, прошедшего лечение (82,4%) (среднее снижение в этой подгруппе составило 25%; p<0,001), тогда как у пациентов, получавших плацебо, уровни tHcy продемонстрировали небольшое повышение (см. публикацию Mech et al. J Clin Psychiatry 2016; 77:668-671, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Пациенты, прошедшие лечение, в среднем имели 12-балльное снижение по рейтинговой шкале депрессии Монтгомери-Асберга (MADRS) к 8-й неделе, а 42% достигали полной ремиссии (p<0,001). Дальнейшее клиническое улучшение коррелировало со значительным снижением уровней tHcy у большинства респондентов. Хотя это исследование не проводилось у пациентов с HCU, однако, было продемонстрировало явное преимущество снижения Hcy у индивидуумов с депрессией, что подтверждает «гипотезу участия Hcy в развитии депрессии» (см. публикацию Folstein et al. Am J Psychiatry 2007; 164:861-867, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0365] Преимущества Hcy-снижающей терапии у индивидуумов с психическими симптомами, связанными с HCU, были впервые продемонстрированы в исследовании 12 пациентов с поздним диагнозом (см. публикацию Grobe H. Eur J Pediatr 1980; 135:199-203, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Трое из этих пациентов никогда не проходили эффективное лечение и имели серьезные психические расстройства с преждевременной смертью. Остальные 8 пациентов были в возрасте от 1 до 26 лет (в среднем 13 лет), и у всех у них были психические симптомы, включая раздражительность, ADHD, апатию и психоз. Лечение пиридоксином или диетой с низким содержанием метаболитов с добавлением L-цистина в течение 2-9 лет было связано с поразительным улучшением поведения и интеллектуального развития, что коррелировало с биохимической нормализацией. Авторы подчеркнули необходимость лечения всех пациентов, независимо от возраста на момент постановки диагноза и предшествующего лечения, из-за обратимости и устранения последствий, связанных с HCU и наблюдаемых в данном исследовании.
[0366] Более свежие данные Ирландской программы скрининга использовали для сравнения умственных способностей 23 пациентов с HCU, не реагирующих на пиридоксин (339 пациентов за несколько лет лечения), с умственными способностями 10 здоровых братьев и сестер из контрольной группы (см. публикацию Yap et al. J Inherit Metab Dis 2001, 24:437-447, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Из 23 идентифицированных пациентов, у 19 была диагностирована HCU посредством NBS, и они получали лечение в раннем возрасте (в течение 6 недель после рождения), у двоих заболевание было выявлено поздно (в возрасте 2,2 и 2,9 года), а двое не получали лечения на момент оценки. Всех пациентов лечили смесью синтетических аминокислот, не содержащей Met, с добавлением цистеина и с добавлением витамина B12 и фолата, если это необходимо. Бетаин использовали в течение последних 5 лет в качестве дополнения к лечению пациентов, получавших лечение в раннем возрасте, которые стали плохо соблюдать диету, а также всех пациентов с поздно выявленной HCU.
[0367] В целом, 13 из 19 пациентов в группе, получавшей лечение в раннем возрасте (средний возраст 14,4 года; в диапазоне от 4,4 до 24,9) соблюдали режим лечения (определяемый в течение всей жизни по медиане fHcy в плазме<11 мкмоль/л) и не имели осложнений, в то время как остальные 6 пациентов (средний возраст 19,9 лет, в диапазоне от 13,8 до 25,5 лет), которые плохо соблюдали режим лечения, имели осложнения. Среднее значение IQ по полной шкале (FIQ) составляло 105,8 (от 84 до 120 баллов) в группе соблюдающих режим пациентов по сравнению с 80,8 (от 40 до 103 баллов) в группе с плохим соблюдением режима. Контрольная группа (n=10) со средним возрастом 19,4 года (от 9,7 до 32,9) имела средний FIQ 102 (от 76 до 116). Два поздно выявленных пациента в возрасте 18,9 и 18,8 лет имели FIQ 80 и 102 соответственно, в то время как два пациента, не проходивших лечение, в возрасте 22,4 и 11,7 лет имели FIQ 52 и 53, соответственно. При этом, отсутствовали какие-либо существенные различия между соблюдающими режим пациентами, прошедшими лечение в раннем возрасте и их здоровыми братьями и сестрами (контроль), за исключением FIQ, который был значительно выше у больных братьев и сестер (p=0,0397). Несмотря на относительно небольшие цифры, эти результаты свидетельствуют о том, что раннее лечение с хорошим биохимическим контролем предотвращает когнитивные симптомы.
[0368] Аналогичные результаты были получены в исследовании «случай-контроль», в котором сообщалось о результатах развития нейронов, образования и когнитивных функций в 32 случаях с HCU и 25 контрольных братьев и сестер в Катаре (см. публикацию El Bashir et al. JIMD Rep 2015; 21:89-95, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Средний возраст участников этого исследования составлял 11,2 года (от 0,6 до 29 лет), и 56% из них были мужчинами. По сравнению со здоровыми братьями и сестрами, у больных был более низкий общий IQ (особенно с точки зрения кратковременной памяти, количественных рассуждений и визуально-пространственных областей), а у значительного числа подростков и взрослых пациентов были сопутствующие заболевания, а также поведенческие и эмоциональные расстройства. Из них, в 9 случаях (28%), HCU была диагностирована с помощью NBS и подвергалась лечению в первый месяц жизни. Остальные были диагностированы в возрасте от 14 до 240 месяцев. Уровни tHcy и Met во время лечения были значительно выше у пациентов, диагностированных с помощью NBS, чем у тех, кому был поставлен диагноз в клинике, возможно, из-за лучшего соблюдения диеты и приема лекарств в раннем возрасте. Значительная разница в IQ наблюдалась между ранними и клинически диагностированными пациентами. Хотя различия в языковых областях, посещении специальных школ и доступе к дополнительной поддержке в классе не были статистически значимыми между группами, однако, в группе «клинически выявленных», проблем было явно больше.
[0369] Хотя число обследованных здесь пациентов было невелико, однако, наблюдалась заметная разница между детьми, которым был поставлен диагноз при рождении, и детьми, диагностированными в раннем возрасте. Средний уровень tHcy 115 мкмоль/л в группе с клинически диагнозом был связан с плохими клиническими исходами и очень низким IQ.
[0370] Дополнительные данные о пользе лечения, направленного на снижение Hcy, в случае психопатологического заболевания у пациентов с HCU были получены из ретроспективного обзора данных всех пациентов с HCU, поступивших в Бостонскую детскую больницу с 1963 г. (неопубликованные данные любезно предоставлены M. Almuqbil и др.). Всего было выявлено 19 пациентов с HCU, трое из которых были исключены из анализа из-за возможного наличия метилмалоновой ацидемии (также ассоциированной с психологическими дефектами) в дополнение к HCU. Из оставшихся 16 пациентов, 7 (6 с HCU и один с дефицитом кобаламина (Cbl)) хорошо соблюдали режим лечения в раннем возрасте (четыре на диете, двое на диете плюс бетаин и один на Cbl). Шесть из этих пациентов не имели явных психических симптомов, кроме легкого когнитивного дефицита. И напротив, у 9 пациентов (7 с нечувствительной к пиридоксину HCU и 2 с дефицитом CblG) было плохое или непостоянное соблюдение режима лечения (двое на бетаине и диете, один только на диете, трое на витаминах В и двое на фолиевой кислоте и бетаине). Все 7 пациентов с HCU и плохим соблюдением режима имели психические расстройства, включая депрессию (n=4), параноидальные переживания (n=2), паранойю и бредовый психоз (n=1), тревогу и изменчивость настроения (n=1) и ADHD, которые были ослаблены при хорошем метаболическом контроле (n=1). В двух случаях, пациенты с дефицитом CblG были заметно встревожены или взволнованы. Возраст, пол и когнитивные уровни, по-видимому, не имели существенного различия между психически больными и здоровыми людьми. Эти результаты свидетельствуют о том, что хороший метаболический контроль (снижение Hcy и/или Met) может отсрочить и, возможно, предотвратить появление психических и поведенческих расстройств у пациентов с HCU. Тем не менее, исследование не установило, приводит ли плохо контролируемый HCU к психопатологии, или же коморбидность с самой психопатологией препятствует хорошему соблюдению пациентами режима лечения.
[0371] Связь между повышенными уровнями Hcy и симптомами ЦНС, включая когнитивные симптомы, нейродегенеративные заболевания, эпилептические припадки, дистонию, психоз, когнитивные нарушения, деменцию и депрессию, хорошо задокументированы у пациентов с HCU и без нее (см. публикации Morris et al. J Inherit Metab Dis 2017; 40:49-74; Abbott et al. Am J Med Genet 1987; 26:959-969; Mudd et al. Disorders of transsulfuration. In: Scriver CL, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, eds. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7 ed. New York: McGraw Hill; 2001;1279-1327; Hidalgo et al. Eur Child Adolesc Psychiatry 2014; 23:235-238; Schimke et al. JAMA 1965; 193:711-719; Smith et al. PLoS One 2010;5: e12244; Seshadri et al. N Engl J Med 2002; 346:476-483; Bottiglieri et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2000; 69:228-232; Bjelland et al. Arch Gen Psychiatry 2003; 60:618-626; Tolmunen et al. Am J Clin Nutr 2004; 80:1574-1578; Kaeser et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1969; 32:88-93; Golimbet et al. Psychiatry Res 2009; 170:168-171; Clarke et al. Arch Neurol 1998; 55:1449-1455; Sinclair et al. Mov Disord 2006; 21:1780-1782; Permoda-Osip et al. Neuropsychobiology 2014; 69:107-111; Oliveira et al. BMJ Case Rep 2016;2016; Troen et al. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:12474-12479; Sudduth et al. J Cereb Blood Flow Metab 2013; 33:708-715; Hainsworth et al. Biochim Biophys Acta 2016; 1862:1008-1017; Herrmann et al. Clin Chem Lab Med 2011; 49:435-441; Kim et al. J Nutr 2007; 137:2093-2097; Selhub et al. Am J Clin Nutr 2000; 71:614S-620S; McCaddon et al. Dement Geriatr Cogn Disord 2001; 12:309-313; Smallwood et al. Neuropathol Appl Neurobiol 2012; 38:337-343; Beydoun et al. BMC Public Health 2014; 14:643; Gortz et al. J Neurol Sci 2004; 218:109-114; Health Quality O. Vitamin B12 and cognitive function: an evidence-based analysis. Ont.Health Technol.Assess.Ser.13 (23), 1e45. 2013. Ref Type: Online Source; Salagre et al. Eur Psychiatry 2017; 43:81-91, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Считается, что механизмы, ведущие к расстройствам ЦНС у индивидуумов с повышенными уровнями Hcy, включают tHcy-опосредованное повреждение нейронов (см. публикации Mudd et al. Disorders of transsulfuration. In: Scriver CL, Beaudet AL, Sly WS, Valle D., eds. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases, 7 ed., New York: McGraw Hill, 2001, 1279-1327; Hainsworth et al. Biochim Biophys Acta 2016; 1862:1008-1017; Stefanello et al. 182; Toborek et al. Atherosclerosis 1995; 115:217-224, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), повреждение сосудистого эндотелия, вызванное Hcy-опосредованным окислительным стрессом (см. публикацию Vivitsky et al. Am J Physiol Regul IntegrComp Physiol 2004; 287: R39-R46, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), гибель нейронов (см. публикации Yeganeh et al., J Mol Neurosci 2013; 50:551-557; Heider et al. J Neural Transm Suppl 2004;1-13, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки) и ослабленную активность нейронной сети (см. публикацию Gortz et al. J Neurol Sci 2004; 218:109-114, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки). Считается, что депрессия и судороги, по меньшей мере частично, вызваны Hcy-опосредованным снижением уровня церебрального аденозина с последующим снижением уровня норэпинефрина и допамина (см. публикации Mech et al. J Clin Psychiatry 2016; 77:668-671; Domagala et al. Thromb Res 1997; 87:411-416; Vivitsky et al. Am J Physiol Regul IntegrComp Physiol 2004;287: R39-R46; Folstein et al., Am J Psychiatry 2007: 164:861-867, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0372] Многочисленные исследования на животных с моделями HCU (см. публикацию Lee et al. J Nutr 2005; 135:544-548, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки) и с участием пациентов с HCU (см. публикации El Bashir et al. JIMD Rep 2015; 21:89-95; Yap et al. J Inherit Metab Dis 2001; 24:437-447; Mech et al. J Clin Psychiatry 2016; 77:668-671; Grobe H. Eur J Pediatr 1980; 135:199-203, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки), показали, что раннее снижение уровней Hcy, индуцированое диетой с низким содержанием Met, добавлением фолиевой кислоты/витамина B, и/или терапией пиридоксином/бетаином может предотвратить, а иногда и обратить вспять прогрессирование различных нервных расстройств. Дополнительные доказательства представлены в серии из 6 тематических исследований с участием пациентов с HCU, у которых значительное снижение и даже нормализация уровней Hcy приводило к полной или частичной коррекции нарушений ЦНС (см. публикации Yap et al. J Inherit Metab Dis 2001; 24: 437-447; Brenton et al. J Child Neurol 2014; 29:88-92; Rezazadeh et al. Child Neurol Open 2014; 1:2329048X14545870; Kaeser et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1969; 32:88-93; Colafrancesco et al. et al. Eur J Pediatr 2015; 174:1263-1266; Yokoi et al. Pediatr Int 2008; 50:694-695; Li et al. Pathology 1999; 31:221-224, каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0373] Эти результаты продемонстрировали значительную корреляцию между уровнями Hcy и повышенным риском расстройств ЦНС у пациентов с HCU и в общей группе. Ранняя терапия, направленная на снижение Hcy, необходима для нормального развития детей с ранним началом развития HCU, а также для коррекции или устранения расстройств ЦНС у пациентов с диагностированной HCU в более позднем возрасте.
IX. Определения
[0374] Используемые в настоящем описании артикли «a», «an» и «the», употребляемые с существительными в единственном числе, могут относиться и к существительным во множественном числе, если из контекста описания не следует иное.
[0375] Если указан диапазон значений, то подразумевается, что каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределом этого диапазона и любым другим установленным или промежуточным значением в указанном диапазоне входит в объем настоящего изобретения и указан конкретно. Так, например, если указывается диапазон от 1 мкм до 8 мкм, то подразумевается, что в этот диапазон также входят значения 2 мкм, 3 мкм, 4 мкм, 5 мкм, 6 мкм и 7 мкм, а также значения в диапазоне значений больше или равно 1 мкм и меньше или равно 8 мкм.
[0376] Используемый здесь термин «совместно введенные или «совместное введение» означает введение двух или более терапевтических компонентов, включая фармацевтическую композицию.
[0377] Используемый здесь термин «лекарственный препарат» относится к лекарственной форме фармацевтической композиции, включающей лекарственное вещество человеческого ПЭГилированного усеченного белка CBS с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, 20NHS PEG-CBS).
[0378] Используемый здесь термин «лекарственное вещество» относится к ПЭГилированному белку CBS с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, 20NHS PEG-CBS).
[0379] Используемый здесь термин «негативный клинический исход» относится к нежелательному фенотипическому исходу, возникающему в результате заболевания, расстройства или состояния.
[0380] Используемый здесь термин «рекомбинантный», если он относится, например, к клетке, нуклеиновой кислоте, полипептиду, экспрессионному кластеру или вектору, означает материал или материал, соответствующий природной или нативной форме продукта, который был модифицирован путем введения нового фрагмента или изменения уже существующего фрагмента, или идентичен ему, но был получен или продуцирован из синтетических материалов. Так, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые отсутствуют в нативной (нерекомбинантной) форме клетки (то есть, «экзогенные нуклеиновые кислоты»), или экспрессируют нативные гены, которые так или иначе экспрессируются на другом уровне, а обычно экспрессируются на недостаточном уровне или вообще не экспрессируются.
[0381] Рекомбинантные методы могут включать, например, использование рекомбинантной нуклеиновой кислоты, такой как кДНК, кодирующая белок или антисмысловую последовательность, для встраивания в экспрессионную систему, такую как экспрессионный вектор; с последующим введением полученной конструкции в клетку, так, чтобы эта клетка экспрессировала нуклеиновую кислоту и белок, если это необходимо. Рекомбинантные методы также включают лигирование нуклеиновых кислот с кодирующими или промоторными последовательностями из разных источников в один экспрессионный кластер или вектор для экспрессии слитого белка, конститутивной экспрессии белка или индуцируемой экспрессии белка.
[0382] Используемые здесь термины «субъект», «индивидуум» или «пациент» являются синонимами и относятся к позвоночному, а предпочтительно к млекопитающему. Используемый здесь термин «млекопитающее» относится к человеку, но не ограничиваются им.
[0383] Используемый здесь термин «генетически не наследуемый», если он употребляется в отношении индивидуума, пациента и/или группы пациентов, относится к одному или нескольким индивидуумам, у которых отсутствует или не был диагностирован генетически наследуемый дефицит цистатионин-β-синтазы (например, отсутствие миссенс-мутации или мутации с потерей функции в одном или нескольких аллелях гена CBS). Так, например, индивидуумами с генетически не наследуемыми повышенными уровнями tHcy являются индивидуумы, у которых уровни tHcy превышают нормальный диапазон, ожидаемый в зависимости от возраста, пола, режима питания и других факторов, но у которых отсутствует или не был диагностирован генетический дефицит в одном или более аллелях гена CBS; то есть, отсутствует генетически наследуемая HCU.
[0384] Используемый здесь термин «ассоциированный» относится к взаимосвязи с развитием или проявлением заболевания, состояния или фенотипа. Ассоциация может быть обусловлена, но не ограничивается ими, генами, ответственными за функции «домашнего хозяйства», изменение которых может служить основой для развития различных заболеваний и состояний, а именно, состояний, которые являются частью пути, вовлеченного в конкретное заболевание, состояние или фенотип, и состояний, которые косвенно способствуют проявлению заболевания, состояния или фенотипа.
[0385] Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый наполнитель» или «фармацевтически приемлемый носитель» относится к наполнителю, который необязательно может быть включен в композиции согласно изобретению и который не вызывает значительных неблагоприятных токсикологических эффектов у пациента. В частности, в данном случае, это относится к наполнителю, который можно вводить в организм индивидуума-млекопитающего в комбинации с активным соединением (в данном случае, с ПЭГилированным htCBS или «20NHS PEG-CBS») без значительных неблагоприятных токсикологических эффектов для индивидуума.
[0386] Используемые здесь термины «адъювант», «разбавитель» или «носитель» означают любое вещество, которое, само по себе не является терапевтическим средством и используется в качестве носителя для доставки терапевтического средства, и является подходящим для введения индивидууму, например, млекопитающему, или которое добавляют в фармацевтическую композицию для улучшения ее свойств при употреблении или хранении или для обеспечения или облегчения приготовления унифицированной лекарственной формы композиции в виде отдельного продукта, такого как капсула или таблетка, подходящая для перорального введения. Термины «адъювант», «разбавитель» или «носитель» охватывают «наполнители», включая «фармацевтически приемлемые наполнители», «носители», «растворители» и т.п., которые также используются в настоящей заявке. Вспомогательные вещества и носители включают любые вещества, известные специалистам в данной области, например, любую жидкость, гель, растворитель, жидкий разбавитель, солюбилизатор или т.п., которые являются нетоксичными и не оказывают негативного воздействия на другие компоненты композиции. Введение может означать пероральное введение, ингаляцию, энтеральное введение, кормление или инокуляцию путем внутривенной инъекциии. Наполнители могут включать стандартные фармацевтические наполнители, а также могут включать любые компоненты, которые могут быть использованы для приготовления пищевых продуктов и напитков для потребления человеком и/или животными, составов кормов или приманок или других пищевых продуктов.
[0387] Используемый здесь термин «лекарственное средство» или «активный агент» или любой другой аналогичный термин означает любой химический или биологический материал или соединение, включая пептиды, подходящие для их введения способами, уже известными специалистам в данной области, и/или способами, изложенными в настоящей заявке, где указанные средства индуцируют желаемый биологический или фармакологический эффект, который может включать, но не ограничивается ими: (1) профилактическое воздействие на организм и предотвращение нежелательного биологического эффекта, такого как профилактика инфекции, (2) ослебление состояния, вызванного заболеванием, например, облегчение боли или воспаления, вызванного заболеванием, и/или (3) облегчение, ослабление или полное устранение заболевания в организме. Такой эффект может быть локальным, например, он может обеспечивать местный анестезирующий эффект, или он может быть системным.
[0388] Используемый здесь термин «приблизительно», в частности, в отношении данного количества, охватывает отклонения в пределах плюс или минус пять процентов.
[0389] Используемый здесь термин «терапевтически эффективное количество» применительно к композиции согласно изобретению относится к нетоксичному, но достаточному количеству активного агента (или композиции, содержащей активный агент) для обеспечения желаемого уровня в кровотоке или на участке его действия в организме (например, внутри клетки) индивидуума, подлежащего лечению, и/или для обеспечения желаемого физиологического, биофизического, биохимического, фармакологического или терапевтического ответа, такого как снижение степени тяжести гомоцистинурии. Требуемое точное количество может варьироваться от индивидуума к индивидууму и будет зависеть от множества факторов, таких как активный агент, активность композиции, используемое устройство для доставки, физические характеристики композиции, предполагаемое использование пациентом (то есть, количество доз, вводимых в день), а также от особенностей пациента, таких как вид, возраст и общее состояние здоровья индивидуума, тяжесть состояния, подлежащего лечению, дополнительные лекарственные средства, принимаемые индивидуумом, способ введения и т.п.Эти факторы и особенности могут быть легко определены специалистом в данной области на основании представленной здесь информации. Соответствующее «эффективное количество» в каждом конкретном случае может быть определено специалистом в данной области путем проведения рутинных экспериментов исходя из представленной здесь информации.
[0390] Используемый здесь термин «нуклеиновая кислота» может означать РНК или ДНК и включать информационную РНК, синтетические РНК и ДНК, кДНК и геномную ДНК. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и, если она является одноцепочечной, то она может представлять собой кодирующую цепь или некодирующую (антисмысловую, комплементарную) цепь.
[0391] Используемый здесь термин «мутант» представляет собой мутантный белок, полученный или сконструированный для изменения свойств или функций, ассоциированных с гликозилированием, стабилизацией белка и/или связыванием лиганда.
[0392] Используемые здесь термины «нативный» или «дикого типа» по отношению к данной клетке, полипептиду, нуклеиновой кислоте, признаку или фенотипу относятся к форме, в которой они обычно встречаются в природе.
[0393] Используемые здесь термины «белок», «полипептид», «олигопептид» и «пептид» имеют свое общепринятое значение, употребляются здесь как синонимы и означают полимер, состоящий по меньшей мере из двух аминокислот, ковалентно связанных амидной связью, независимо от длины или посттрансляционной модификации (например, гликозилирования, фосфорилирования, липидизации, миристоилирования, убихитинизации и т.п.). Кроме того, описанные здесь полипептиды не ограничиваются какой-либо определенной длиной. В это определение входят D- и L-аминокислоты и смеси D- и L-аминокислот.Этот термин не относится к постэкспрессионным модификациям полипептида или исключает эти модификации, например, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п., а также другие модификации, которые известны специалистам в данной области и встречаются или не встречаются в природе. Полипептид может представлять собой целый белок или его подпоследовательность. Полипептиды также могут представлять собой аминокислотные подпоследовательности, включающие эпитопы, то есть, антигенные детерминанты, в значительной степени ответственные за иммуногенные свойства полипептида и способные вызывать иммунный ответ.
[0394] Используемый здесь термин «положение, соответствующее...» и т.п.относится к представляющему интерес положению (то есть, к номеру основания или к номеру остатка) в молекуле нуклеиновой кислоты или в белке относительно положения в другой эталонной молекуле нуклеиновой кислоты или белка. Соответствующие положения могут быть определены путем сравнения и выравнивания последовательностей для максимизации количества совпадающих нуклеотидов или остатков, например, таким образом, чтобы идентичность между последовательностями составляла более 90%, более 95%, более 96%, более 97%, более 98% или более 99%. Затем представляющему интерес положению присваивается номер, соответствующий эталонной молекуле нуклеиновой кислоты. Так, например, если конкретный полиморфизм в Gene-X встречается в нуклеотиде 2073 SEQ ID NO: X, то для идентификации соответствующего нуклеотида в другом аллеле или изоляте, последовательности выравнивают, а затем идентифицируют положение, которое совпадает с положением 2073. Поскольку различные аллели могут иметь разную длину, то положение, обозначающемое 2073, может и не быть нуклеотидом 2073, а вместо этого может представлять собой положение, которое «соответствует» положению в эталонной последовательности.
[0395] Используемый здесь термин «длительное введение» относится к введению фермента CBS, htCBS или мутанта htCBS (например, с мутацией C15S), конъюгированного с фрагментом ПЭГ, в течение периода времени 6 недель или более. Термин «длительное непрерывное лечение» относится к многократному введению фермента CBS, htCBS или мутанта htCBS (например, с мутацией C15S), конъюгированного с фрагментом ПЭГ, на протяжении всего курса исследования с помощью подкожной инъекции или имплантированного осмотического насоса.
[0396] В настоящей заявке описаны способы лечения гомоцистинурии и/или дефицита CBS с помощью ферментной терапии (ET) с применением описанного здесь лекарственного препарата, включающего ПЭГилированный усеченный человеческий белок CBS с заменой в положении аминокислоты 15 цистеина на серин.
[0397] Подробное описание одного или нескольких вариантов осуществления изобретения приводится ниже. Хотя для осуществления или тестирования в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены любые материалы и способы, подобные или эквивалентные описанным здесь материалам и способам, однако, предпочтительными материалами и способами являются материалы и способы, представленные в настоящей заявке. Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания. В описании настоящего изобретения, формы единственного числа также могут охватыать и формы множественного числа, если из контекста явно не следует иное. Если это не оговорено особо, то все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют общепринятое значение, понятное специалистам в области, к которой относится изобретение. В случае возникновения разночтений, следует отдать предпочтение описанию, изложенному в настоящей заявке.
[0398] Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано на нижеследующих неограничивающих примерах.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Обзор исследования патогенеза и характеристик пациентов
[0399] CBS-HCY-NHS-01 представляет собой текущее многоцентровое (в 8 центрах) Международное экспериментальное перспективное исследование патогенеза («NHS») HCU, в котором приняли участие 55 детей (5-17 лет) и взрослых (в возрасте>18 лет) для характеризации клинического течения HCU у пациентов, проходящих лечение текущего заболевания в клинике в течение 3 лет, чтобы понять, как гомоцистинурия прогрессирует с течением времени, и разработать новые способы лечения пациентов, страдающих гомоцистинурией. В исследовании CBS-HCY-NHS-01 оценивают диапазон концентраций в плазме общего Hcy (tHcy) и родственных метаболитов серы, а также вариабельность клинических последствий заболевания. Были проведены промежуточные анализы, где были оценены характеристики пациентов, когнитивные нарушения и скелетные патологии. Наблюдаемые характеристики пациентов представлены в Таблице 1.
Дети (<18 лет), N (%)
Взрослые (≥18 лет), N (%)
23 (42%)
32 (58%)
Белый
Афроамериканец
Испанец или латиноамериканец
Не испанец
3 (6%)
6 (11%)
46 (84%)
Да
Нет
25 (46%)
Да
Нет
35 (64%)
Окончание средней школы
Окончание высшей школы
Окончание колледжа/специального колледжа
Степень магистра
Степень профессионализма
Неизвестно
21%
41%
14%
3%
7%
Взрослые (≥18 лет)
Дети(<18 лет)
144 [35-298]
Взрослые (≥18 лет)
Дети (<18 лет)
20 (91%)
18 (95%)
Взрослые (≥18 лет)
Дети (<18 лет)
15 (47%)
17 (74%)
Взрослые (≥18 лет)
Дети (<18 лет)
19 (76%)
21 (91%)
Взрослые (≥18 лет)
Дети (<18 лет))
21 (84%)
20 (87%)
$ Один индивидуум сделал только 1 визит.
[0400] В этом исследовании патогенеза приняли участие 55 пациентов с HCU. Среднее время исследования составило 12,2 месяца на момент промежуточного анализа. Заболевание поражает оба пола почти одинаково (55% мужчин, 45% женщин). В этом исследовании, пациенты с HCU были молодыми (средний возраст: 21 год); 42% были детьми (моложе 18 лет) и 58% были взрослыми пациентами. В этой группе, медиана ИМТ находится в пределах нормы (21,5 кг/м2). Половина пациентов (51%; 65% детей; 41% взрослых) была диагностирована на первом году жизни (моложе 1 года). 36% пациентов имели HCU в семейном анамнезе. Медианный уровень tHcy в плазме составлял 95 мкМ (74 мкМ для детей; 104 мкМ для взрослых), что соответствовало недостаточному лечению основного заболевания. У 95% детей уровень tHcy превышал верхнюю границу нормы (ULN), а у 82%, уровень tHcy составлял>50 мкМ (82%). Уровни tHcy почти у половины (45%) детей составляли>100 мкМ. Все (100%) взрослые пациенты имели уровни tHcy выше ULN, 93% имели уровни tHcy>50 мкМ, а 77% имели уровни tHcy>100 мкМ (77%). На основании 3-дневных дневников соблюдения диеты, которые записывались перед каждым визитом в клинику, большинство пациентов (93%; 95% детей; 91% взрослых) придерживались обычной диеты с ограничением белка, и большинство из них принимали смесь L-аминокислот, не содержащую Met (58%; 74% детей; 47% взрослых). Большинство пациентов (83%; 91% детей; 76% взрослых) принимали добавки витамина В. Большинство пациентов (85%; 87% детей; 84% взрослых) принимали бетаин (Таблица 1).
Пример 2. NHS - Офтальмологические дефекты
[0401] В анамнезе, у пациентов часто были диагнозы эктопии хрусталика. В крупнейшем ретроспективном исследовании, проведенном на сегодняшний день, у 85% пациентов с HCU развилось это состояние к 20 годам (Mudd SH, et al. The natural history of homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. Am J Hum Genet. 1985;37(1):1-31). И напротив, только 19% взрослых и 9% детей в этой лечебной группе имели это состояние (см. Таблицу 2), что позволяет предположить, что ограниченная диета, добавка витамина B и добавка бетаина могут быть эффективными средствами ослабления офтальмологических дефектов, несмотря на то, что это заболевание не было полностью вылечено, на что указывал средний уровень tHcy в плазме.
N=55
(5-17 лет)
N=23
(≥18 лет)
N=32
Пример 3. NHS - Мутации гена CBS
[0402] Анализ мутаций в гене CBS участников исследования показал 26 уникальных мутаций, выявленных у 48 пациентов, из которых 16 пациентов были гомозиготами, а 32 пациента были смешанными гетерозиготами. Мутации ДНК и полученные мутантные белки CBS представлены в Таблице 3 в соответствии со стандартной номенклатурой генетических мутаций, описанных в публикации Ogino, Shuji, et al. «Standard mutation nomenclature in molecular diagnostics: practical and educational challenges» The Journal of molecular diagnostics 9.1 (2007): 1-6, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки. Пациентами с генетически наследуемой HCU являются пациенты с мутацией в гене CBS, включая, но не ограничиваясь ими, любую из мутаций, показанных в Таблице 3.
Пример 4. NHS - Уровни tHcy
[0403] Уровни tHcy определяли при каждом посещении (Таблица 4). У большинства пациентов (96%), уровни tHcy в плазме в 5-40 раз превышали ULN 14 мкМ для детей старше 12 лет и ULN 9,6 мкМ для детей 0-12 лет.Вариабельность между индивидуумами была умеренной. В целом, пациенты с низкими уровнями tHcy при визите 1 обычно имели низкие уровни tHcy на протяжении всего исследования (и наоборот) (Поправка Пирсона R=0,6294). Еще большие вариабельности между визитами, наблюдаемые у некоторых пациентов, могут быть связаны с изменением режима питания/соблюдения режима терапии между визитами, что подчеркивает проблему правильного соблюдения пациентами режима ограниченной диеты и приема пищевых добавок.
Пример 5. NHS - Другие метаболические показатели
[0404] В ходе исследования были определены различные лабораторные значения (см. фиг. 1 и Таблицу 5). Были обнаружены высокие уровни tHcy и Met, а также низкие уровни цистатионина и общего цистеина, которые являются отличительными признаками заболевания, несмотря на то, что большинство пациентов соблюдали стандартное лечение (диету с ограничением белка, и прием добавок с витамином В и бетаином). Уровни метионина>1000 мкМ наблюдались у 11% пациентов (14% детей, 10% взрослых) и ≥600 мкМ у 33% пациентов (36% детей, 33% взрослых). Как и ожидалось, наблюдались высокие уровни бетаина, витаминов B12 и B6, поскольку большинство пациентов принимали эти добавки. Уровни диметилглицина (DMG) выше ULN наблюдались у 76% пациентов, что могло привести к более высокому риску острого инфаркта миокарда у некоторых пациентов (Svingen et al., 2013). Уровни ALT выше ULN наблюдались у 37% пациентов (52% детей, 28% взрослых). Уровни креатинина ниже нижнего предела нормы (LLN) наблюдались у 43% пациентов (74% детей, 21% взрослых), и это может быть связано с низкой мышечной массой, вызванной ограничением потребления белка. Уровни hsCRP выше ULN наблюдались у 35% протестированных пациентов (N=40; тесты проводили только у пациентов в возрасте ≥13 лет, а наблюдались только пациенты в возрасте ≥18 лет). Низкие уровни активности белка С наблюдались у 28% пациентов, а низкие уровни фибриногена наблюдались у 31% пациентов (N=29; оба теста проводили только у пациентов ≥13 лет, а наблюдались только пациенты ≥18 лет).
[0405] Нормальные уровни наблюдались для: AST (89% пациентов) (все обследованные пациенты); антитромбина III (83% пациентов) и аполипопротеина А (93% пациентов) (эти лабораторные показатели были исследованы только у пациентов ≥13 лет); специфичной для костей щелочной фосфатазы (97% пациентов), CTX в сыворотке (95% пациентов) и P1NP (87% пациентов) (эти лабораторные параметры были исследованы только у пациентов старше 18 лет).
[0406] Дополнительные лабораторные значения представлены на фиг. 1, где в столбцах указано количество пациентов с высоким/нормальным/низким лабораторным значением.
hsCRP*>2x ULN
10 (25%)
0 (0%)**
9 (31%)**
**Возраст для одного пациента не указан.
[0407] В Таблице 5 и на фиг. 1 было продемонстрировано, что помимо tHcy, метионин, цистатионин, DMG, ALT, креатинин, hsCRP, активность белка C, фибриноген, ALT-SGPT, бетаин, цистатионин, витамин B6 плазмы, общий цистеин и витамин B12 и т.п.могут оказаться полезными в качестве метаболических индикаторов тяжести или прогрессирования заболевания или иным образом указывают на тяжесть или прогрессирование заболевания у индивидуума. Эти характеристики пациентов показывают, что, несмотря на то, что эти пациенты наблюдались и лечились в Центрах передового опыта и им прописывали обычную диету с ограничением белка и/или смесь L-аминокислот без Met и добавки, у многих пациентов, значения tHcy в плазме в 5-40 раз превышали ULN для tHcy, при этом, у этих пациентов наблюдались гиперметионинемия (≥6000 мкМ) (у 33% пациентов: 36% детей, 33% взрослых), нарушение зрения, признаки воспаления, нарушение белкового обмена и/или дисфункция печени. Эти данные указывают на то, что современные диетические и терапевтические способы лечения малоэффективны, и/или что большинство пациентов не могут соблюдать режим лечения, что приводит к повышению уровней tHcy даже у пациентов, которые часто наблюдаются в Центрах передового опыта. В частности, эти данные также указывают на то, что бетаин не приводит к надлежащему снижению уровней tHcy при HCU и, следовательно, бетаин, сам по себе не является адекватным лечением HCU, вопреки распространенному мнению. Кроме того, в этом исследовании были выявлены новые мутации гена CBS (Таблица 3) и новые лабораторные маркеры или метаболические индикаторы тяжести или прогрессирования заболевания (Таблица 5 и фиг. 1), которые, как ожидается, будут полезны для диагностики HCU, мониторинга прогрессирования заболевания, наблюдения за соблюдением режима лечения пациентом, наблюдения за реакцией на лечение, оценки качества жизни, адаптации методов лечения к конкретным профилям у пациентов, а также для клинических испытаний, проводимых для определения эффективности новых методов лечения.
Пример 6. NHS - Хрупкость скелета
[0408] Плотность костной массы (BMD) оценивалась на исходном уровне и через 1 год в трех участках (в бедре, в поясничном отделе позвоночника и во всем теле) с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DXA) с использованием денситометров Hologic или General Electric/Lunar. BMD и Z-показатели (количество стандартных отклонений от среднего значения BMD для контрольной группы, нормализованные по возрасту и полу) были вычислены для каждого участка. Z-показатель от -1 до -2,5 указывает на остеопению, а Z-показатель ниже -2,5 указывает на остеопороз. Уровни tHcy определяли в плазме, а среднее потребление общего белка (г/день) рассчитывали на основе записей о приеме пищи за 3 дня. Общее потребление белка определяли как сумму общего природного белка из рациона и белка из смеси L-аминокислот, не содержащей Met, если пациент принимал такую смесь. Корреляции между BMD и tHcy или диетическим белком рассчитывали с использованием коэффициента корреляции Пирсона (R). В Таблице 6 показаны процентные ранги, связанные с различными Z-показателями.
[0409] Данные BMD были доступны для 43 пациентов. Медианный Z-показатель был отрицательным как для взрослых, так и для детей во всех участках тела (Таблица 7), что указывает на хрупкость скелета. 46% взрослых и 53% детей имели плотность кости ниже 15-го процентиля (Z-показатель ≤-1) по меньшей мере в одном участке (Таблица 7). Результаты BMD и Z-баллы были стабильными в течение 12 месяцев для каждого пациента (N=15-20; корреляция между визитом 1 и визитом 3 для BMD в каждом участке: Коэффициент Пирсона R=0,94 до 0,97; p<0,0001).
(45,8%)
(52,6%)
(33,3%)
(43,5%)
(21,1%)
(45,9%)
(52,6%)
(38,9%)
[0410] Пациенты с уровнем tHcy в плазме<100 мкМ имели гораздо большую хрупкость скелета, чем пациенты с уровнем>100 мкМ (фиг. 2). Отмечалась положительная корреляция между уровнями tHcy в плазме и BMD во всех трех участках (коэффициент Пирсона от 0,33 до 0,51; p<0,03; Таблица 8). Эти данные показали, что BMD улучшается при большем потреблении общего пищевого белка, о чем свидетельствует положительная корреляция между BMD во всех трех участках и общим потреблением пищевого белка (коэффициент Пирсона=0,55-0,76; p<0,011; Таблица 8). Существует положительная корреляция между BMD во всех трех участках и С-реактивным белком (hsCRP) (коэффициент Пирсона=0,36-0,39; p<0,051; Таблица 8), то есть, маркером воспаления, что позволяет предположить, что воспаление может быть связано с высоким уровнем tHcy или с повышенным потреблением белка.
[0411] Эти данные показали, что у большинства пациентов с HCU, несмотря на относительно молодой возраст, наблюдается хрупкость скелета, что подтверждает прошлые исследования (Parrot F, et al. J Inherit Metab Dis. Osteoporosis in late-diagnosed adult homocystinuric patients. 2000;23:338-40; Weber DR, et al. Low bone mineral density is a common finding in patients with homocystinuria. Med Genet Metab. 2016;117:351-4). Для каждого пациента, результаты BMD и Z-показатели были стабильными в течение 12 месяцев. Таким образом, BMD и Z-показатели, оцененные с помощью DXA, можно считать надежной конечной точкой для оценки эффективности исследуемого лечения в будущих клинических испытаниях у пациентов с HCU. Здоровье костей в этой группе коррелирует с более высоким общим потреблением белка с пищей и более высокими уровнями tHcy, что позволяет предположить, что, при постоянном ограничении общего потребления белка для регуляции уровня tHcy, у пациентов может повышаться хрупкость скелета.
[0412] В целом, пациенты с HCU имеют большую хрупкость скелета, чем здоровые индивидуумы. Однако, как обсуждалось выше, у пациентов с более высокими уровнями tHcy наблюдалась положительная корреляция с костной массой. Соответственно, скелетные симптомы у индивидуумов с повышенными уровнями tHcy, в том числе у индивидуумов с генетически не наследуемым дефицитом CBS, можно лечить с применением описанных здесь способов облегчения скелетных симптомов, связанных с повышенными уровнями tHcy.
Пример 7. NHS - Познавательные способности
[0413] Предыдущие исследования продемонстрировали связь между общим Hcy (tHcy) в течение жизни как ключевым индикатором интеллектуальных функций при HCU (Al-Dewik N, et al. Natural history, with clinical, biochemical and molecular characterization, of classical homocystinuria in the Qatari population. J Inherit Metab Dis. 2019; April 10; Yap S, et al. The intellectual abilities of early-treated individuals with pyridoxine-nonresponsive homocystinuria due to cystathionine β-synthase deficiency. J Inher Metabol Dis. 2001;24(4):437-47). В современной литературе отсутствует описание профилей сильных или слабых когнитивных функций, а также отсутствует данные об исследованиях взаимосвязи проксимальных биомаркеров HCU и когнитивных способностей.
[0414] Исполнительные функции относятся к набору нисходящих психических процессов, которые требуют усилий и необходимы для концентрации внимания (Diamond А. Executive functions Annu Rev Psychol. 2013; 64:135-68). Исполнительная функция особенно чувствительна к изменениям физического здоровья и является хорошим кандидатом для оценки ассоциации с биомаркерами тяжести HCU. В отличие от общего интеллекта, исполнительные функции можно улучшить путем терапии (Diamond, 2013). Когнитивную функцию оценивали на исходном уровне и через каждые 6 месяцев с использованием нормализованной по возрасту панели когнитивных функций NIH Toolbox (NIHCB), в которой оценивают речь, рабочую память, эпизодическую память, скорость обработки информации, смену установок и тормозной контроль (Weintraub S, et al. Cognition assessment using the NIH Toolbox. Neurol 2013:80(11):S54-64; Weintraub et al. NIH Toolbox Cognition Battery (CB): introduction and pediatric data. Monogr Soc Res Child Dev. 2013;78(4):1-15). В анализе использовались средние баллы посещений. Были доступны данные о пациентах с визитами от 1 по 5. Уровни tHcy измеряли в плазме. Корреляции между когнитивной функцией и tHcy, Cys и Met вычисляли с использованием коэффициента корреляции Пирсона (r).
[0415] Данные о когнитивных функциях были доступны для 51 пациента. Общая когнитивная функция пациентов с HCU была серьезно нарушена (медиана Составного анализа общего интеллекта на уровне 20-го процентиля; 21-го процентиля для взрослых и 14-го процентиля для детей). Области познания, которые были затронуты, включали Составной анализ «подвижного» интеллекта», исполнительную функцию, память и скорость обработки информации. Составной анализ «подвижного» интеллекта» представляет собой суммарную оценку памяти, исполнительных функций и скорости обработки информации. Этот составной анализ включает оценку способности к новому обучению и к обработке информации. В настоящем исследовании было обнаружено, что медиана составного анализа «подвижного» интеллекта» находится в 10-м процентиле. Исполнительная функция представляет собой подавление склонности к автоматическим реакциям и способность переключать поведение в зависимости от требований задачи. Она включает смещение установок и тормозной контроль. Медиана исполнительной функции в настоящем исследовании оказалась на уровне 18-го процентиля для смещения установок и 9-го процентиля для тормозного контроля. Память представляет собой способность удерживать информацию в краткосрочном буфере и манипулировать ею, а также способность получать, хранить и извлекать информацию. Она включает рабочую память и эпизодическую память. Медианная память в настоящем исследовании оказалась на уровне 24-го процентиля для рабочей памяти и 32-го процентиля для эпизодической памяти. Скорость обработки информации представляет собой умственную эффективность при восприятии информации. Медианная скорость обработки информации в настоящем исследовании оказалась на уровне 24-го процентиля.
[0416] Функция обработки речи (восприимчивый словарный запас и чтение) и области познания, отражающие прошлое обучение и знания (Составной анализ «кристаллизованного» интеллекта»), были в пределах нормы.
[0417] Результаты NIH Toolbox были постоянными от визита к визиту (CV<10% для большинства пациентов). Внутриклассовые корреляции (ICC) варьировались от 0,73 (тормозной контроль) до 0,89 (Составной анализ общего интеллекта) за исключением эпизодической памяти с ICC 0,64. Первоначальная валидация NIH Toolbox рассматривает ICC от 0,4 до 0,74 адекватными, а выше 0,75 - превосходными. На фиг. 3 указаны медианные и квартильные баллы NIH Toolbox для протестированных когнитивных функций.
[0418] Были определены корреляции между познанием и другими параметрами. Уровни tHcy негативно коррелировали с общим когнитивным процессом (Составной анализ общего интеллекта) (r=-0,32; p=0,023; Таблица 9); то есть, чем выше уровень tHcy, тем ниже показатель когнитивных функций. Тормозной контроль представляет собой область, на которую больше всего влияют уровни tHcy (r=-0,33; p=0,019; Таблица 9).
[0419] Хотя общая когнитивная функция пациентов с HCU, как правило, была серьезно нарушена (r=-0,32; p=0,023; Таблица 9), однако, эти нарушения усиливались с повышением уровня tHcy. У пациентов с уровнями tHcy>100 мкМ, в целом когнитивные функции были намного хуже, чем у пациентов с tHcy ≤100 мкМ, во всех областях познания. При сравнении пациентов с tHcy ≤100 мкМ с пациентами с tHcy>100 мкМ, домены тормозного контроля и восприимчивого словарного запаса показали наиболее статистически значимые различия (фиг. 4). И напротив, уровни Met в плазме негативно коррелировали с общим когнитивным процессом (r=-0,28; p=0,049; Таблица 9), что свидетельствует о том, что уровни как tHcy, так и Met должны поддерживаться как можно ближе к норме. Уровни Cys позитивно коррелировали с общим когнитивным процессом (r=0,37; p=0,008; Таблица 9).
[0420] Пациенты с более низкими уровнями tHcy в плазме лучше справлялись с показателями исполнительных функций, что расширяло предыдущие исследования, показывающие, что регуляция уровней tHcy необходима для поддержания интеллектуальных функций в среднем диапазоне (Walter JH, et al. Strategies for the treatment of cystathionine β-synthase deficiency: the experience of the Willink Biochemical Genetics Unit over the past 30 years. Eur. J. Pediatr. 1998;157(2):S71-6; Yap et al. 2001, Al-Dewik et al. 2019).
[0421] Это исследование продемонстрировало, что NIH Toolbox является надежным инструментом, который проиллюстрировал его потенциальную ценность для анализа когнитивных функций с течением времени у пациентов с HCU, включая мониторинг реакции на лечение.
[0422] Результаты этого исследования имеют практическое значение для лечения HCU. Было показано, что нейропсихологическая оценка является важным компонентом медицинской помощи пациентам с HCU, и оценка исполнительных функций (включая тормозные реакции) должна быть включена в эту оценку. Для детей с HCU следует рассмотреть возможность поддержки, аналогичную той, что используется для детей с другими проблемами исполнительных функций, такими как ADHD.
[0423] Выявление специфических когнитивных нарушений при HCU дает ключ для будущих исследований, посвященных нервным системам, на которые влияет HCU. Так, например, активация дорсальной передней поясничной коры ассоциируется с мониторингом противоречивой информации, что является центральным элементом тормозной реакции при проведении испытаний по постановке задач с использованием лабиринтов с ответвлениями (Botvinick MM, et al. Conflict Monitoring and anterior cingulate cortex: update. Trends Cog Sci. 2004;8(12):539-46).
[0424] Значительная корреляция между уровнем tHcy и когнитивными симптомами показывает, что уровень tHcy является надежным индикатором когнитивных нарушений. Соответственно, когнитивные симптомы у индивидуумов с повышенными уровнями tHcy, включая индивидуумов с генетически не наследуемым дефицитом CBS, можно лечить с применением способов, описанных в настоящей заявке, для ослабления когнитивных симптомов, ассоциированных с повышенными уровнями tHcy.
Пример 8. Подтверждение эффективности методов количественного определения tHcy
[0425] Существующие процедуры количественного определения метаболитов, таких как гомоцистеин, метионин, цистеин и т.п., ассоциированные с дефицитом CBS, включая процедуры, описанные в предыдущих примерах, а также в Таблице 5 и на фиг. 1, требуют выделения плазмы из проб цельной крови перед анализом. Эта процедура требует сложного оборудования и экспертных технических знаний для анализа любого заданного метаболита, начиная с пробы крови индивидуума. Поэтому необходимо разработать недорогостоящие и эффективные проверенные методы сбора и подготовки проб крови пациентов для количественного анализа. Такие проверенные методы сократят затраты и время, необходимое для диагностики пациентов с дефицитом CBS, например, это позволит брать пробы крови у пациентов на дому без необходимости их посещения Испытательного Центра. Эти методы также позволят отдельным индивидуумам и медицинским экспертам более эффективно отслеживать состояние болезни в режиме реального времени и проводить мониторинг лечения путем отправления нескольких проб непосредственно из дома. Кроме того, такая проверенная диагностика и диагностические методы могут позволить индивидуумам надежно брать пробы крови дома для мониторинга уровней метаболитов без помощи медицинского работника. Домашний отбор проб включает сбор и обработку пробы крови для количественного анализа, например, с использованием таких устройств, как игла для прокола пальца и устройство для отделения плазмы (PSD). Текущий стандарт для количественного определения общего гомоцистеина в плазме основан на уровнях tHcy, измеренных с помощью ЖХ-МС/МС. Соответственно, необходимы альтернативные диагностические методы для сбора и подготовки проб цельной крови для анализа методом ЖХ-МС/МС. Один из таких альтернативных методов включает сбор сухих пятен крови («DBS»). Альтернативно или дополнительно, могут быть использованы PSD. Способы сбора и анализа уровней метаболитов с помощью подходов DBS и PSD описаны, например, в заявках WO 2014150900 и US 20120318971, описание которых в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки. Однако, эти альтернативные методы никогда не проверялись, а их надежность и ценность для таких применений в домашних условиях, как домашний отбор проб или домашнее тестирование самими индивидуумами, не оценивались. Таким образом, уровни общего гомоцистеина у индивидуумов оценивали с применением метода PSD, как описано в WO 2014150900, и сравнивали с традиционным методом ЖХ-МС/МС с отделением плазмы. Результаты представлены в Таблице 10, где «метод PSD» относится к подходу PSD, описанному в WO 2014150900, а «метод ЖХ-МС/МС» относится к традиционному подходу ЖХ-МС/МС с отделением плазмы.
[0426] Был проведен простой линейный регрессионный анализ для оценки корреляции между образцами, протестированными с применением метода PSD и традиционного метода ЖХ-МС/МС. Оптимальная линия имела наклон 1,096 (1/наклон=0,912) со стандартной ошибкой наклона 0,0804 (95% доверительные интервалы наклона составляют от 0,9302 до 1,263). Эти результаты показали значительную корреляцию и подтвердили надежность метода PSD при количественном определении tHcy в пробах крови отдельных индивидуумов.
Эквиваленты и объем применения
[0427] Специалистам в данной области известно или они могут самостоятельно установить с применением не более, чем рутинных экспериментов, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления изобретения, в соответствии с описанием, представленным в настоящей заявке. Объем настоящего раскрытия не ограничивается вышеприведенным описанием, а лишь изложен в прилагаемой формуле изобретения.
[0428] Артикли используемые в формуле изобретения, такие, как «a», «an» и «the», могут употребляться для обозначения одного или более, чем одного объекта, если это не оговорено особо или явно не противоречит контексту изобретения. Формула изобретения или описание изобретения, которые включают союз «или» между одним или несколькими членами группы, удовлетворяют нужным критериям, если один, несколько или все члены группы присутствуют, используются или иным образом имеют отношение к данному препарату или процессу, если это не оговорено особо или из контекста не следует иное. Раскрытие изобретения включает варианты осуществления изобретения, в которых ровно один член группы присутствует, используется или иным образом имеет отношение к данному препарату или способу. Раскрытие изобретения включает варианты осуществления изобретения, в которых более одного или вся группа членов присутствует, используется или иным образом имеет отношение к данному препарату или способу.
[0429] Следует также отметить, что термин «содержащий» является «открытым» и допускает, но не требует включения дополнительных элементов или стадий. Если используется термин «содержащий», то объем этого термина также охватывает понятие «состоящий из».
[0430] Если указаны диапазоны, то в них включены и конечные точки. Кроме того, следует отметить, что, если это не оговорено особо или если это не следует из контекста и компетенции специалиста в данной области, то значения, выраженные в виде диапазонов, могут принимать любое конкретное значение или включать поддиапазон в пределах указанных диапазонов в различных вариантах осуществления изобретения до десятых долей нижнего предела диапазона, если из контекста явно не следует иное.
[0431] Кроме того, следует отметить, что любой конкретный вариант осуществления изобретения, относящийся к известному уровню техники, может быть явно исключен из любого одного или нескольких пунктов формулы изобретения. Поскольку считается, что такие варианты осуществления изобретения известны специалистам в данной области, то они могут быть исключены, даже если исключение прямо не указано в настоящей заявке. Любой конкретный вариант композиций согласно изобретению (например, любой антибиотик, терапевтический или активный ингредиент, любой способ производства, любой способ применения и т.п.) может быть исключен из любого одного или нескольких пунктов формулы изобретения по любой причине, независимо от того, относится ли он к известному уровню техники или нет.
[0432] Следует отметить что используемые здесь слова употребляются лишь для описания, а не ограничения, и что в пределах объема прилагаемой формулы изобретения могут быть сделаны изменения, не выходящие за рамки истинного объема и существа изобретения в его более широких аспектах.
[0433] Хотя настоящее изобретение было описано достаточно подробно и с некоторыми деталями в отношении нескольких описанных вариантов осуществления изобретения, однако, не предполагается, что оно должно быть ограничено какими-либо такими подробностями или такими вариантами или любым конкретным вариантом осуществления изобретения, но оно должно толковаться со ссылками на прилагаемую формулу изобретения, чтобы обеспечить максимально широкое толкование такой формулы изобретения с учетом уровня техники и, следовательно, чтобы обеспечить эффективный охват предполагаемого объема изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> SELLOS-MOURA, MARCIA
BUBLIL, EREZ M.
GLAVIN, FRANK
<120> ТЕРАПИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЕРМЕНТА ЦИСТАТИОНИН-БЕТА-СИНТАЗЫ ДЛЯ
ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ПОВЫШЕННЫМИ УРОВНЯМИ ГОМОЦИСТЕИНА
<130> 2089.1006PCT
<140> PCT/USXXXX/XXXXXX
<141> 2020-09-03
<150> 62/983,862
<151> 2020-03-02
<150> 62/895,230
<151> 2019-09-03
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 412
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 1
Pro Ser Glu Thr Pro Gln Ala Glu Val Gly Pro Thr Gly Ser Pro His
1 5 10 15
Arg Ser Gly Pro His Ser Ala Lys Gly Ser Leu Glu Lys Gly Ser Pro
20 25 30
Glu Asp Lys Glu Ala Lys Glu Pro Leu Trp Ile Arg Pro Asp Ala Pro
35 40 45
Ser Arg Cys Thr Trp Gln Leu Gly Arg Pro Ala Ser Glu Ser Pro His
50 55 60
His His Thr Ala Pro Ala Lys Ser Pro Lys Ile Leu Pro Asp Ile Leu
65 70 75 80
Lys Lys Ile Gly Asp Thr Pro Met Val Arg Ile Asn Lys Ile Gly Lys
85 90 95
Lys Phe Gly Leu Lys Cys Glu Leu Leu Ala Lys Cys Glu Phe Phe Asn
100 105 110
Ala Gly Gly Ser Val Lys Asp Arg Ile Ser Leu Arg Met Ile Glu Asp
115 120 125
Ala Glu Arg Asp Gly Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile Ile Glu Pro
130 135 140
Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Gly Leu Ala Leu Ala Ala Ala Val Arg
145 150 155 160
Gly Tyr Arg Cys Ile Ile Val Met Pro Glu Lys Met Ser Ser Glu Lys
165 170 175
Val Asp Val Leu Arg Ala Leu Gly Ala Glu Ile Val Arg Thr Pro Thr
180 185 190
Asn Ala Arg Phe Asp Ser Pro Glu Ser His Val Gly Val Ala Trp Arg
195 200 205
Leu Lys Asn Glu Ile Pro Asn Ser His Ile Leu Asp Gln Tyr Arg Asn
210 215 220
Ala Ser Asn Pro Leu Ala His Tyr Asp Thr Thr Ala Asp Glu Ile Leu
225 230 235 240
Gln Gln Cys Asp Gly Lys Leu Asp Met Leu Val Ala Ser Val Gly Thr
245 250 255
Gly Gly Thr Ile Thr Gly Ile Ala Arg Lys Leu Lys Glu Lys Cys Pro
260 265 270
Gly Cys Arg Ile Ile Gly Val Asp Pro Glu Gly Ser Ile Leu Ala Glu
275 280 285
Pro Glu Glu Leu Asn Gln Thr Glu Gln Thr Thr Tyr Glu Val Glu Gly
290 295 300
Ile Gly Tyr Asp Phe Ile Pro Thr Val Leu Asp Arg Thr Val Val Asp
305 310 315 320
Lys Trp Phe Lys Ser Asn Asp Glu Glu Ala Phe Thr Phe Ala Arg Met
325 330 335
Leu Ile Ala Gln Glu Gly Leu Leu Cys Gly Gly Ser Ala Gly Ser Thr
340 345 350
Val Ala Val Ala Val Lys Ala Ala Gln Glu Leu Gln Glu Gly Gln Arg
355 360 365
Cys Val Val Ile Leu Pro Asp Ser Val Arg Asn Tyr Met Thr Lys Phe
370 375 380
Leu Ser Asp Arg Trp Met Leu Gln Lys Gly Phe Leu Lys Glu Glu Asp
385 390 395 400
Leu Thr Glu Lys Lys Pro Trp Trp Trp His Leu Arg
405 410
<210> 2
<211> 551
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Pro Ser Glu Thr Pro Gln Ala Glu Val Gly Pro Thr Gly Cys Pro
1 5 10 15
His Arg Ser Gly Pro His Ser Ala Lys Gly Ser Leu Glu Lys Gly Ser
20 25 30
Pro Glu Asp Lys Glu Ala Lys Glu Pro Leu Trp Ile Arg Pro Asp Ala
35 40 45
Pro Ser Arg Cys Thr Trp Gln Leu Gly Arg Pro Ala Ser Glu Ser Pro
50 55 60
His His His Thr Ala Pro Ala Lys Ser Pro Lys Ile Leu Pro Asp Ile
65 70 75 80
Leu Lys Lys Ile Gly Asp Thr Pro Met Val Arg Ile Asn Lys Ile Gly
85 90 95
Lys Lys Phe Gly Leu Lys Cys Glu Leu Leu Ala Lys Cys Glu Phe Phe
100 105 110
Asn Ala Gly Gly Ser Val Lys Asp Arg Ile Ser Leu Arg Met Ile Glu
115 120 125
Asp Ala Glu Arg Asp Gly Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile Ile Glu
130 135 140
Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Gly Leu Ala Leu Ala Ala Ala Val
145 150 155 160
Arg Gly Tyr Arg Cys Ile Ile Val Met Pro Glu Lys Met Ser Ser Glu
165 170 175
Lys Val Asp Val Leu Arg Ala Leu Gly Ala Glu Ile Val Arg Thr Pro
180 185 190
Thr Asn Ala Arg Phe Asp Ser Pro Glu Ser His Val Gly Val Ala Trp
195 200 205
Arg Leu Lys Asn Glu Ile Pro Asn Ser His Ile Leu Asp Gln Tyr Arg
210 215 220
Asn Ala Ser Asn Pro Leu Ala His Tyr Asp Thr Thr Ala Asp Glu Ile
225 230 235 240
Leu Gln Gln Cys Asp Gly Lys Leu Asp Met Leu Val Ala Ser Val Gly
245 250 255
Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Ile Ala Arg Lys Leu Lys Glu Lys Cys
260 265 270
Pro Gly Cys Arg Ile Ile Gly Val Asp Pro Glu Gly Ser Ile Leu Ala
275 280 285
Glu Pro Glu Glu Leu Asn Gln Thr Glu Gln Thr Thr Tyr Glu Val Glu
290 295 300
Gly Ile Gly Tyr Asp Phe Ile Pro Thr Val Leu Asp Arg Thr Val Val
305 310 315 320
Asp Lys Trp Phe Lys Ser Asn Asp Glu Glu Ala Phe Thr Phe Ala Arg
325 330 335
Met Leu Ile Ala Gln Glu Gly Leu Leu Cys Gly Gly Ser Ala Gly Ser
340 345 350
Thr Val Ala Val Ala Val Lys Ala Ala Gln Glu Leu Gln Glu Gly Gln
355 360 365
Arg Cys Val Val Ile Leu Pro Asp Ser Val Arg Asn Tyr Met Thr Lys
370 375 380
Phe Leu Ser Asp Arg Trp Met Leu Gln Lys Gly Phe Leu Lys Glu Glu
385 390 395 400
Asp Leu Thr Glu Lys Lys Pro Trp Trp Trp His Leu Arg Val Gln Glu
405 410 415
Leu Gly Leu Ser Ala Pro Leu Thr Val Leu Pro Thr Ile Thr Cys Gly
420 425 430
His Thr Ile Glu Ile Leu Arg Glu Lys Gly Phe Asp Gln Ala Pro Val
435 440 445
Val Asp Glu Ala Gly Val Ile Leu Gly Met Val Thr Leu Gly Asn Met
450 455 460
Leu Ser Ser Leu Leu Ala Gly Lys Val Gln Pro Ser Asp Gln Val Gly
465 470 475 480
Lys Val Ile Tyr Lys Gln Phe Lys Gln Ile Arg Leu Thr Asp Thr Leu
485 490 495
Gly Arg Leu Ser His Ile Leu Glu Met Asp His Phe Ala Leu Val Val
500 505 510
His Glu Gln Ile Gln Tyr His Ser Thr Gly Lys Ser Ser Gln Arg Gln
515 520 525
Met Val Phe Gly Val Val Thr Ala Ile Asp Leu Leu Asn Phe Val Ala
530 535 540
Ala Gln Glu Arg Asp Gln Lys
545 550
<210> 3
<211> 1656
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 3
atgccgtcag aaaccccgca ggcagaagtg ggtccgacgg gttgcccgca ccgtagcggt 60
ccgcattctg caaaaggcag tctggaaaaa ggttccccgg aagataaaga agccaaagaa 120
ccgctgtgga ttcgtccgga cgcaccgtca cgctgtacct ggcagctggg tcgtccggca 180
agcgaatctc cgcatcacca tacggctccg gcgaaaagtc cgaaaattct gccggatatc 240
ctgaagaaaa ttggtgacac cccgatggtt cgtatcaaca aaatcggcaa aaaattcggt 300
ctgaaatgcg aactgctggc taaatgtgaa tttttcaatg cgggcggttc cgtgaaagat 360
cgtatctcac tgcgcatgat tgaagatgct gaacgcgacg gcaccctgaa accgggtgat 420
acgattatcg aaccgacctc tggcaacacg ggtatcggtc tggcactggc ggcggcagtc 480
cgtggttatc gctgcattat cgtgatgccg gaaaaaatga gctctgaaaa agttgatgtc 540
ctgcgtgctc tgggcgcgga aattgttcgt accccgacga atgcccgctt cgacagtccg 600
gaatcccatg tgggtgttgc atggcgcctg aaaaacgaaa tcccgaattc gcacattctg 660
gatcagtatc gtaacgctag caatccgctg gcgcattacg ataccacggc cgacgaaatc 720
ctgcagcaat gtgatggcaa actggacatg ctggtcgctt ctgtgggtac cggcggtacc 780
attacgggca tcgcgcgtaa actgaaagaa aaatgcccgg gctgtcgcat tatcggtgtg 840
gatccggaag gcagtattct ggcggaaccg gaagaactga accagaccga acaaaccacg 900
tatgaagttg aaggcatcgg ttacgatttt attccgaccg tcctggatcg cacggtggtt 960
gacaaatggt tcaaaagcaa tgacgaagaa gcctttacct tcgcacgtat gctgatcgct 1020
caggaaggtc tgctgtgcgg tggttcagca ggttcgacgg tcgcagtggc agttaaagct 1080
gcgcaggaac tgcaagaagg tcaacgttgt gtcgtgattc tgccggattc tgttcgcaac 1140
tacatgacca aatttctgag tgaccgttgg atgctgcaaa aaggcttcct gaaagaagaa 1200
gatctgaccg agaaaaaacc gtggtggtgg cacctgcgcg tgcaggaact gggtctgtcc 1260
gcaccgctga ccgttctgcc gaccatcacg tgcggccata cgattgaaat cctgcgtgaa 1320
aaaggttttg atcaggcccc ggttgtcgac gaagcaggcg tgattctggg tatggttacc 1380
ctgggtaaca tgctgagttc cctgctggcg ggcaaagtgc aaccgagcga tcaggttggt 1440
aaagtcatct acaaacaatt caaacagatt cgtctgaccg atacgctggg ccgcctgtcg 1500
cacatcctgg aaatggacca tttcgcgctg gttgtgcacg aacagattca ataccatagc 1560
accggcaaat catcgcagcg ccaaatggtc tttggtgtcg tgacggccat tgatctgctg 1620
aatttcgtgg ccgcacaaga acgtgaccag aaataa 1656
<210> 4
<211> 413
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 4
Met Pro Ser Glu Thr Pro Gln Ala Glu Val Gly Pro Thr Gly Cys Pro
1 5 10 15
His Arg Ser Gly Pro His Ser Ala Lys Gly Ser Leu Glu Lys Gly Ser
20 25 30
Pro Glu Asp Lys Glu Ala Lys Glu Pro Leu Trp Ile Arg Pro Asp Ala
35 40 45
Pro Ser Arg Cys Thr Trp Gln Leu Gly Arg Pro Ala Ser Glu Ser Pro
50 55 60
His His His Thr Ala Pro Ala Lys Ser Pro Lys Ile Leu Pro Asp Ile
65 70 75 80
Leu Lys Lys Ile Gly Asp Thr Pro Met Val Arg Ile Asn Lys Ile Gly
85 90 95
Lys Lys Phe Gly Leu Lys Cys Glu Leu Leu Ala Lys Cys Glu Phe Phe
100 105 110
Asn Ala Gly Gly Ser Val Lys Asp Arg Ile Ser Leu Arg Met Ile Glu
115 120 125
Asp Ala Glu Arg Asp Gly Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile Ile Glu
130 135 140
Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Gly Leu Ala Leu Ala Ala Ala Val
145 150 155 160
Arg Gly Tyr Arg Cys Ile Ile Val Met Pro Glu Lys Met Ser Ser Glu
165 170 175
Lys Val Asp Val Leu Arg Ala Leu Gly Ala Glu Ile Val Arg Thr Pro
180 185 190
Thr Asn Ala Arg Phe Asp Ser Pro Glu Ser His Val Gly Val Ala Trp
195 200 205
Arg Leu Lys Asn Glu Ile Pro Asn Ser His Ile Leu Asp Gln Tyr Arg
210 215 220
Asn Ala Ser Asn Pro Leu Ala His Tyr Asp Thr Thr Ala Asp Glu Ile
225 230 235 240
Leu Gln Gln Cys Asp Gly Lys Leu Asp Met Leu Val Ala Ser Val Gly
245 250 255
Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Ile Ala Arg Lys Leu Lys Glu Lys Cys
260 265 270
Pro Gly Cys Arg Ile Ile Gly Val Asp Pro Glu Gly Ser Ile Leu Ala
275 280 285
Glu Pro Glu Glu Leu Asn Gln Thr Glu Gln Thr Thr Tyr Glu Val Glu
290 295 300
Gly Ile Gly Tyr Asp Phe Ile Pro Thr Val Leu Asp Arg Thr Val Val
305 310 315 320
Asp Lys Trp Phe Lys Ser Asn Asp Glu Glu Ala Phe Thr Phe Ala Arg
325 330 335
Met Leu Ile Ala Gln Glu Gly Leu Leu Cys Gly Gly Ser Ala Gly Ser
340 345 350
Thr Val Ala Val Ala Val Lys Ala Ala Gln Glu Leu Gln Glu Gly Gln
355 360 365
Arg Cys Val Val Ile Leu Pro Asp Ser Val Arg Asn Tyr Met Thr Lys
370 375 380
Phe Leu Ser Asp Arg Trp Met Leu Gln Lys Gly Phe Leu Lys Glu Glu
385 390 395 400
Asp Leu Thr Glu Lys Lys Pro Trp Trp Trp His Leu Arg
405 410
<210> 5
<211> 413
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
усеченный полипептид человеческого мутантного CBS C15S
<400> 5
Met Pro Ser Glu Thr Pro Gln Ala Glu Val Gly Pro Thr Gly Ser Pro
1 5 10 15
His Arg Ser Gly Pro His Ser Ala Lys Gly Ser Leu Glu Lys Gly Ser
20 25 30
Pro Glu Asp Lys Glu Ala Lys Glu Pro Leu Trp Ile Arg Pro Asp Ala
35 40 45
Pro Ser Arg Cys Thr Trp Gln Leu Gly Arg Pro Ala Ser Glu Ser Pro
50 55 60
His His His Thr Ala Pro Ala Lys Ser Pro Lys Ile Leu Pro Asp Ile
65 70 75 80
Leu Lys Lys Ile Gly Asp Thr Pro Met Val Arg Ile Asn Lys Ile Gly
85 90 95
Lys Lys Phe Gly Leu Lys Cys Glu Leu Leu Ala Lys Cys Glu Phe Phe
100 105 110
Asn Ala Gly Gly Ser Val Lys Asp Arg Ile Ser Leu Arg Met Ile Glu
115 120 125
Asp Ala Glu Arg Asp Gly Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile Ile Glu
130 135 140
Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Gly Leu Ala Leu Ala Ala Ala Val
145 150 155 160
Arg Gly Tyr Arg Cys Ile Ile Val Met Pro Glu Lys Met Ser Ser Glu
165 170 175
Lys Val Asp Val Leu Arg Ala Leu Gly Ala Glu Ile Val Arg Thr Pro
180 185 190
Thr Asn Ala Arg Phe Asp Ser Pro Glu Ser His Val Gly Val Ala Trp
195 200 205
Arg Leu Lys Asn Glu Ile Pro Asn Ser His Ile Leu Asp Gln Tyr Arg
210 215 220
Asn Ala Ser Asn Pro Leu Ala His Tyr Asp Thr Thr Ala Asp Glu Ile
225 230 235 240
Leu Gln Gln Cys Asp Gly Lys Leu Asp Met Leu Val Ala Ser Val Gly
245 250 255
Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Ile Ala Arg Lys Leu Lys Glu Lys Cys
260 265 270
Pro Gly Cys Arg Ile Ile Gly Val Asp Pro Glu Gly Ser Ile Leu Ala
275 280 285
Glu Pro Glu Glu Leu Asn Gln Thr Glu Gln Thr Thr Tyr Glu Val Glu
290 295 300
Gly Ile Gly Tyr Asp Phe Ile Pro Thr Val Leu Asp Arg Thr Val Val
305 310 315 320
Asp Lys Trp Phe Lys Ser Asn Asp Glu Glu Ala Phe Thr Phe Ala Arg
325 330 335
Met Leu Ile Ala Gln Glu Gly Leu Leu Cys Gly Gly Ser Ala Gly Ser
340 345 350
Thr Val Ala Val Ala Val Lys Ala Ala Gln Glu Leu Gln Glu Gly Gln
355 360 365
Arg Cys Val Val Ile Leu Pro Asp Ser Val Arg Asn Tyr Met Thr Lys
370 375 380
Phe Leu Ser Asp Arg Trp Met Leu Gln Lys Gly Phe Leu Lys Glu Glu
385 390 395 400
Asp Leu Thr Glu Lys Lys Pro Trp Trp Trp His Leu Arg
405 410
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ЛЕЧЕНИЕ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ АНТИ-NKG2A СРЕДСТВ | 2015 |
|
RU2721271C2 |
| КОМБИНАЦИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ АГОНИСТА ОХ40 И АГОНИСТА 4-1ВВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА | 2017 |
|
RU2748949C2 |
| СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ФЕКСАПОТИДА ТРИФЛУТАТА ПРИ ЛЕЧЕНИИ СНМП | 2020 |
|
RU2825641C2 |
| КОМБИНАЦИЯ АНТАГОНИСТА PD-1 И ЭРИБУЛИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА | 2016 |
|
RU2737216C2 |
| УЛУЧШЕНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПОСРЕДСТВОМ ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРА VIII | 2019 |
|
RU2799048C2 |
| СТАБИЛЬНЫЕ СОСТАВЫ АНТИТЕЛ ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА ПРОГРАММИРУЕМОЙ СМЕРТИ PD-1 ЧЕЛОВЕКА И ОТНОСЯЩИЕСЯ К НИМ СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ | 2012 |
|
RU2563346C2 |
| ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ДОЗИРОВАНИЕ НЕЙРЕГУЛИНА ИЛИ ЕГО ПОДПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ | 2019 |
|
RU2719199C1 |
| СПОСОБЫ, ТЕРАПИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО НОВООБРАЗОВАНИЯ | 2021 |
|
RU2831425C1 |
| СПОСОБЫ МОДУЛИРОВАНИЯ CART-КЛЕТОК | 2017 |
|
RU2774232C2 |
| СПОСОБЫ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ АЛЛЕРГИИ ПОСРЕДСТВОМ ВВЕДЕНИЯ АНТАГОНИСТА IL-4R | 2017 |
|
RU2777328C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу лечения дефицита CBS у индивидуума, включающему определение уровня метаболического показателя тяжести заболевания или прогрессирования заболевания у индивидуума, где метаболическим показателем тяжести заболевания или прогрессирования заболевания является общий гомоцистеин (tHcy), и введение индивидууму терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей лекарственное вещество, содержащее выделенный белок цистатионин-β-синтазы (CBS), и где индивидуумом является пациент с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy, или пациент с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с дефицитом CBS. Изобретение обеспечивает способ лечения индивидуумов с дефицитом CBS и/или повышенными уровнями tHcy, у которых не была диагностирована HCU или не была выявлена ее генетическая предрасположенность. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 10 табл., 8 пр.
1. Способ лечения дефицита CBS у индивидуума, включающий:
a. определение уровня метаболического показателя тяжести заболевания или прогрессирования заболевания у индивидуума, где метаболическим показателем тяжести заболевания или прогрессирования заболевания является общий гомоцистеин (tHcy); и где
уровень tHcy несколько выше низкого составляет от 10 мкмоль/л до 50 мкмоль/л,
уровень tHcy несколько выше среднего составляет от 50 мкмоль/л до 100 мкмоль/л, и
уровень tHcy несколько выше высокого составляет от 100 мкмоль/л до 500 мкмоль/л; и
b. введение индивидууму терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей:
i. лекарственное вещество, содержащее выделенный белок цистатионин-β-синтазы (CBS), включающий SEQ ID NO: 1, ковалентно связанный с по меньшей мере одной молекулой ПЭГ размером 20 кДа, функционализированой NHS эфиром; и
ii. фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или адъювант,
где индивидуумом является пациент с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с повышенными уровнями tHcy, или пациент с генетически не наследуемым заболеванием, ассоциированным с дефицитом CBS, и где терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции включает
низкую дозу, содержащую приблизительно от 0,25 мг/кг до приблизительно 1,0 мг/кг лекарственного вещества, введенного субъекту в соответствии с уровнем tHcy несколько выше низкого,
среднюю дозу, содержащую приблизительно от 0,5 мг/кг до приблизительно 1,5 мг/кг лекарственного вещества, введенного субъекту в соответствии с уровнем tHcy несколько выше среднего, или
высокую дозу, содержащую приблизительно от 1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг лекарственного вещества, введенного субъекту в соответствии с уровнем tHcy несколько выше высокого.
2. Способ по п. 1, где определение уровня метаболического показателя тяжести заболевания или прогрессирования заболевания у индивидуума включает взятие пробы крови или пробы плазмы у индивидуума; оценку уровня одного или более метаболических показателей тяжести заболевания или прогрессирования заболевания в этой пробе и сравнение уровня одного или более метаболических показателей тяжести заболевания или прогрессирования заболевания с уровнем того же метаболического показателя в контрольной пробе, взятой у здорового индивидуума.
| US 10265387 B2, 23.04.2019 | |||
| MORRIS A.A | |||
| et al., Guidelines for the diagnosis and management of cystathionine beta-synthase deficiency, J Inherit Metab Dis., 2017, v | |||
| Приспособление с иглой для прочистки кухонь типа "Примус" | 1923 |
|
SU40A1 |
| Способ смешанной растительной и животной проклейки бумаги | 1922 |
|
SU49A1 |
| WO 2018195006 A1, 25.10.2018 | |||
| US 20180187154 A1, 05.07.2018 | |||
| БАРАНОВ А.А | |||
| и др., Гомоцистинурия у детей, Вопросы современной педиатрии, 2017, т | |||
| Устройство для электрической сигнализации | 1918 |
|
SU16A1 |
| Прибор для вычерчивания конических сечений | 1922 |
|
SU457A1 |
