КОМБИНАЦИЯ АНТАГОНИСТА PD-1, ИНГИБИТОРА ТИРОЗИНКИНАЗЫ VEGFR/FGFR/RET И ИНГИБИТОРА CBP/БЕТА-КАТЕНИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА Российский патент 2025 года по МПК A61K31/47 A61K31/53 A61K39/395 A61K45/06 A61P35/00 

Ссылка на перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и включен в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия ASCII, созданная 27 октября 2020 года, имеет название 213597_0005_00_ST25 и размер 31517 байт.

Ссылка на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительными заявками на выдачу патента США№62/927334 и 62/927576, поданными 29 октября 2019 г., содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Область техники настоящего изобретения

Раскрыты комбинированные терапии, полезные для лечения рака. Комбинированная терапия, которая включает антагонист белка запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1), ленватиниб, ингибитор мультирецепторной тирозинкиназы (мульти-RTK), или его фармацевтически приемлемую соль и Е7386, ингибитор СВР/β-катенина, который ингибирует взаимодействие между СВР и β-катенином, или его фармацевтически приемлемую соль. Также раскрыт противоопухолевое терапевтическое средство, содержащее комбинацию анти-PD-1 антитела, ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли и Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

PD-1, как признано, имеет важное значение в иммунной регуляции и поддержании периферической толерантности. PD-1 умеренно экспрессируется на наивных Т-клетках, В-клетках и естественных Т-клетках-киллерах (NKT) и повышающе регулируется передачей сигналов Т/В-клеточного рецептора на лимфоцитах, моноцитах и миелоидных клетках (1).

Два известных лиганда PD-1 PD-L1 (В7-Н1) и PD-L2 (B7-DC) экспрессируются при раке человека, возникающем в различных тканях. В больших наборах выборок, например, рака яичников, почек, толстой кишки, поджелудочной железы, печени и меланомы, было показано, что экспрессия PD-L1 коррелирует с плохим прогнозом и снижает общую выживаемость независимо от последующего лечения (2-13). Подобным образом, было обнаружено, что экспрессия PD-1 на инфильтрирующих опухоль лимфоцитах маркирует дисфункциональные Т-клетки при раке молочной железы и меланоме (14-15) и коррелирует с плохим прогнозом при раке почки (16). Было высказано предположение, что опухолевые клетки, экспрессирующие PD-L1, взаимодействуют с Т-клетками, экспрессирующими PD-1, с ослаблением активации Т-клеток и уклонением от иммунного надзора, тем самым способствуя нарушению противоопухолевого иммунного ответа. Следовательно, антитело, направленное либо против рецептора PD-1, либо против лиганда PD-L1, может ингибировать связывание между ними, что приводит к усилению иммунного действия на опухолевые клетки (23).

Несколько моноклональных антител, которые ингибируют взаимодействие между PD-1 и одним или обоими его лигандами PD-L1 и PD-L2, были одобрены для использования FDA, и дополнительные антитела находятся на стадии клинической разработки для лечения рака. Было высказано предположение, что эффективность таких антител может быть повышена, если их вводить в комбинации с другими утвержденными или экспериментальными терапиями рака, например, лучевой терапией, хирургическим вмешательством, химиотерапевтическими средствами, таргетной терапией, средствами, которые ингибируют другие сигнальные пути, регуляция которых в опухолях нарушена, и другими средствами, повышающими иммунитет.

Пембролизумаб представляет собой анти-PD-1 антитело, которое одобрено в США в качестве монотерапии или в комбинации с некоторыми другими средствами для лечения ряда типов опухолей, включая меланому, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), мелкоклеточный рак легкого (SCLC), плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC), классическую лимфому Ходжкина (cHL), первичную медиастинальную В-крупноклеточную лимфому (PMBCL), уротелиальную карциному, рак с высокой микросателлитной нестабильностью, рак желудка, рак пищевода, рак шейки матки, гепатоцеллюлярную карциному (НСС), карциному из клеток Меркеля (МСС), почечноклеточный рак (RCC) и эндометриальный рак.

Тирозинкиназы участвуют в модуляции передачи сигналов фактора роста и, таким образом, являются важной мишенью для лечения рака. Ленватиниб представляет собой пероральный ингибитор рецепторной тирозинкиназы (RTK), который селективно ингибирует киназную активность рецепторов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (VEGFR1 (FLT1), VEGFR2 (KDR) и VEGFR3 (FLT4)) и рецепторов фактора роста фибробластов (FGF) FGFR1, 2, 3 и 4 в дополнение к другим RTK, связанным с проангиогенным и онкогенным путями (включая рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGF) PDGFRα, KIT и протоонкоген RET (RET)), участвующим в пролиферации опухоли. В частности, ленватиниб обладает новым типом связывания (тип V) с VEGFR2, что подтверждено рентгеноструктурным анализом кристаллов, и, согласно кинетическому анализу, демонстрирует быстрое и сильное ингибирование активности киназы.

Ленватиниб имеет химическое название 4-[3-хлоβ-4-(циклопропиламинокарбонил)аминофенокси]-7-метокси-6-хинолинкарбоксамид и структуру:

Ленватиниб мезилат одобрен в США по меньшей мере (а) для лечения пациентов с местно-рецидивирующим или метастатическим, прогрессирующим, резистентным к радиоактивному йоду дифференцированным раком щитовидной железы, (b) в комбинации с эверолимусом для лечения пациентов с распространенным почечноклеточным раком (RCC) после одной предшествующей антиангиогенной терапии, (с) для лечения первой линии пациентов с неоперабельной гепатоцеллюлярной карциномой (НСС) и (d) в комбинации с пембролизумабом для лечения пациентов с распространенным раком эндометрия без высокой микросателлитной нестабильности (MSI-H) или с дефицитом репарации неспаренных оснований (dMMR), у которых наблюдается прогрессирование заболевания после предшествующей системной терапии и которые не являются кандидатами на радикальное хирургическое вмешательство или облучение. Ленватиниб мезилат находится на стадии клинических исследований для использования в качестве монотерапии или комбинированной терапии с анти-PD-1 антителом для других типов опухолей, включая рак мочевого пузыря, меланому, плоско клеточный рак головы и шеи, уротелиальную карциному, рак молочной железы, рак желудка, рак яичников, колоректальный рак (CRC), глиобластому и рак желчевыводящих путей.

Наблюдали, что некоторые раковые клетки обладают активированным β-катенином посредством сигнала Wnt. Ингибиторы сигнального пути Wnt изучали как противораковые средства, однако, ни один из них не был использован при практическом применении.

Ингибитор СВР/β-катенина, находящийся на стадии клинической разработки в качестве противоопухолевого средства, менее токсичен для человека, чем обычные ингибиторы Wnt, имеющие другие механизмы действия (J. Clin. Oncol. 31, 2013 (suppl, abstr 2501)). В качестве его механизма рассматривают, что после ингибирования связывания между СВР (белок, связывающий CREB) и β-катенином, Р300 с высоким сходством с СВР связывается с β-катенином вместо СВР, и такое изменение подавляет пролиферацию рака и вызывает дифференциацию (The EMBO Journal 2013, 32: 1977-1989).

Было показано, что основным путем рака желчных протоков может быть пролиферация опухоли по пути Wnt-β-катенина, ингибитор СВР/β-катенина, ICG-001, может подавлять пролиферацию опухоли (J. Clin. Invest. 2015 Mar. 2, 125(3): 1269-85. doi: 10.1172/JCI76452).

Обычные ингибиторы Wnt блокируют сигналы на основе механизмов ингибирования продукции лиганда Wnt, блокирования функции рецептора, стимулирования деградации β-катенина и т.п. Из-за таких механизмов в доклинических исследованиях и клинических испытаниях возникают проблемы токсичности, и разработка в основном прекращена. Пути передачи сигналов Wnt являются высококонсервативными путями, ассоциированными с нарушениями и вовлекающими β-катенин. Путь Wnt/β-катенин важен для нормального развития. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что связывание СВР/β-катенина снижает передачу сигналов Wnt, тогда как р300/β-катенин, как полагают, активирует передачу сигналов Wnt.

Кроме того, известно, что β-катенин подавляет активацию Т-клеток путем подавления дифференцировки Т-клеток (J. Immunol. 2011, 186:784-790). Таким образом, полагают, что ингибитор СВР/β-катенина способствует дифференцировке Т-клеток и активации Т-клеток.

Е7386 с химическим названием (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-е][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамид является потенциальным ингибитором СВР/β-катенина, имеющим структуру:

Е7386 может проявлять противоопухолевый эффект отдельно (патенты США 10259817 и 9174998) или в комбинированной терапии с анти-PD-1 антителом (патентная публикация США 2018/0185395) или с ленватинибом (публикация патента Канады 3044658).

В общем, противоопухолевые терапевтические средства часто не эффективны для всех пациентов при индивидуальном введении. Таким образом, были предприняты попытки увеличить показатель излечения таких терапевтических средств путем их комбинирования (22).

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Как раскрыто в настоящем документе, введение комбинации (i) антагониста PD-1, который не представляет собой атезолизумаб, (ii) ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли и (iii) Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли обеспечивает неожиданно превосходный противоопухолевый эффект.

Настоящее изобретение относится к способу лечения рака у индивидуума, который предусматривает введение индивидууму комбинированной терапии, которая содержит антагонист PD-1, который не представляет собой атезолизумаб, ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и Е7386 или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых случаях индивидуумом является человек. Раком может быть солидная опухоль, такая как почечноклеточный рак (RCC), колоректальный рак (CRC), гепатоцеллюлярная карцинома (НСС), меланома, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, не мелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак эндометрия, уротелиальный рак и плоскоклеточный рак головы и шеи. Раком может быть запущенный рак или метастатический рак.

Антагонистом PD-1 согласно способу может быть моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых случаях антагонист представляет собой анти-PD-1 антитело. Антагонистом может быть пембролизумаб или ниволумаб.

В некоторых случаях антагонистом PD-1 согласно способу является пембролизумаб, цемиплимаб или ниволумаб, предпочтительно пембролизумаб. Введение пембролизумаба можно проводить после введения ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли и/или Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли согласно некоторым схемам лечения. В некоторых случаях ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль вводят после пембролизумаба и/или Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли.

Настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума-чело века, у которого диагностирован рак, предусматривающему введение индивидууму комбинированной терапии в течение по меньшей мере 24 недель. Комбинированная терапия включает пембролизумаб, ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и Е7386 или его фармацевтически приемлемую соль. Ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить при дневной дозе 24 мг, 20 мг, 18 мг, 12 мг или 8 мг, в каждом случае как ленватиниб, и пембролизумаб можно вводить при дозе 200 мг Q3W или 400 мг Q6W. Е7386 или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить при дозе в диапазоне от приблизительно 0,01 до 1000 мг/кг массы тела индивидуума в день.

Настоящее изобретение относится к лекарственному средству, содержащему антагонист PD-1, для применения в комбинации с ленватинибом или его фармацевтически приемлемой солью и Е7386 или его фармацевтически приемлемой солью для лечения рака.

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, содержащему ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль, для применения в комбинации с антагонистом PD-1 и Е7386 или его фармацевтически приемлемой солью для лечения рака.

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, содержащему Е7386 или его фармацевтически приемлемую соль, для применения в комбинации с антагонистом PD-1 и ленватинибом или его фармацевтически приемлемой солью для лечения рака.

Настоящее изобретение также относится к применениям терапевтической комбинации для лечения рака, и терапевтическая комбинация включает антагонист PD-1, ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и Е7386 или его фармацевтически приемлемую соль.

Настоящее изобретение также относится к применению антагониста PD-1 для получения лекарственного средства для лечения рака у индивидуума при введении в комбинации с ленватинибом или его фармацевтически приемлемой солью и Е7386 или его фармацевтически приемлемой солью. Настоящее изобретение также относится к применению ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака у индивидуума при введении в комбинации с антагонистом PD-1 и Е7386 или его фармацевтически приемлемой солью. Настоящее изобретение также относится к применению Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака у индивидуума при введении в комбинации с антагонистом PD-1 и ленватинибом или его фармацевтически приемлемой солью.

Настоящее изобретение также относится к применению антагониста PD-1, ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли и Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственных средств для лечения рака у индивидуума. Указанные лекарственные средства могут содержать набор, и набор может также содержать вставку в упаковку, содержащую инструкции для применения антагониста PD-1 в комбинации с ленватинибом или его фармацевтически приемлемой солью и Е7386 или его фармацевтически приемлемой солью для лечения рака у индивидуума.

Во всех способах лечения, лекарственных средствах и применениях антагонист PD-1 ингибирует связывание PD-L1 с PD-1 и предпочтительно также ингибирует связывание PD-L2 и PD-1. В некоторых из вышеуказанных способов лечения, лекарственных средств и применений антагонист PD-1 представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с PD-1 или с PD-L1 и блокирует связывание PD-L1 cPD-1. Например, антагонист PD-1 может представлять собой анти-PD-1 антитело, которое содержит тяжелую цепь и легкую цепь, и где тяжелая и легкая цепи содержат аминокислотные последовательности, показанные на фиг. 6 (SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22). Настоящее изобретение также относится к способу лечения опухоли, который может предусматривать комбинированное использование анти-PD-1 антитела, ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли и Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли.

В некоторых из комбинированных терапий, способов лечения, лекарственных средств и применений индивидуумом является человек и раком является солидная опухоль, и в некоторых случаях солидной опухолью является почечноклеточный рак (RCC), колоректальный рак (CRC), гепатоцеллюлярная карцинома (НСС), меланома, рак мочевого пузыря, уротелиальный рак, рак молочной железы, не мелко клеточный рак легкого (NSCLC), рак эндометрия и плоскоклеточный рак головы и шеи или любой рак, раскрытый в настоящем документе.

Кроме того, любые комбинированные терапии, способы лечения, лекарственные средства и применения могут быть использованы, если тесты на рак дают положительный результат на экспрессию одного или обоих PD-L1 и PD-L2. В других случаях рак имеет повышенную экспрессию PD-L1.

В некоторых из комбинированных терапий, способов лечения, лекарственных средств и применений индивидуумом может быть человек, у которого тест на рак дал положительный результат на PD-L1 человека и рак выбран из группы, состоящей из почечноклеточного рака (RCC), колоректального рака (CRC), гепатоцеллюлярной карциномы (НСС), меланомы, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, не мелкоклеточного рака легкого (NSCLC), рака эндометрия и плоскоклеточного рака головы и шеи. В варианте осуществления рак мочевого пузыря представляет собой уротелиальный рак.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показаны аминокислотные последовательности CDR легкой и тяжелой цепи для иллюстративного анти-PD-1 моноклонального антитела (SEQ ID NO: 1-6).

На фиг. 2 показаны аминокислотные последовательности CDR легкой и тяжелой цепи для другого иллюстративного анти-PD-1 моноклонального антитела (SEQ ID NO: 7-12).

На фиг. 3 показаны аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и тяжелой цепи полной длины для иллюстративного анти-PD-1 моноклонального антитела (SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14).

На фиг. 4 показаны аминокислотные последовательности альтернативных вариабельных областей легкой цепи для иллюстративного анти-PD-1 моноклонального антитела (SEQ ID NO: 15-17).

На фиг. 5А и 5 В показаны аминокислотные последовательности альтернативных легких цепей для иллюстративного анти-PD-1 моноклонального антитела, причем на фиг. 5 А показаны аминокислотные последовательности для легких цепей K09A-L-11 и K09A-L-16 (SEQ ID NO: 18 и 19, соответственно), а на фиг. 5 В показана аминокислотная последовательность легкой цепи K09A-L-17 (SEQ ID NO: 20).

На фиг. 6 показаны аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи для пембролизумаба (SEQ ID NO: 21 и 22, соответственно).

На фиг. 7 показаны аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи для ниволумаба (SEQ ID NO: 23 и 24, соответственно).

На фиг. 8 представлены данные для in vivo терапии мышей при монотерапии каждой из комбинации лекарственных средств терапии тремя лекарственными средствами, терапии двумя лекарственными средствами (ленватиниб + Е7386 и пембролизумаб + ленватиниб) и терапии тремя лекарственными средствами (Е7386 + ленватиниб + пембролизумаб). Представлено как среднее значение ± SE. *: Р<0,05, ****: Р<0,0001 по сравнению с тройной комбинацией при повторном измерении множественного сравнения Даннета с использованием логарифмически преобразованных значений. Ленватиниб представляет собой ленватиниб мезилат.

На фиг. 9 показан относительный объем опухоли в каждой группе, как показано на фиг. 8 на день 29. Данные показаны как среднее значение ±SE.

На фиг. 10А - 10С приведены мышиные клеточные линии, культуральные среды, линии животных и условия, использованные в исследовании, описанном в примере 2.

На фиг. 11 представлены данные, полученные в исследовании, описанном в примере 2. LEN = ленватиниб. PD-1Ab и PD-1=анти-PD-1 антитело. LEN/PD-1=ленватиниб и анти-PD-1 антитело. Е78386=(6S,9aS)-№бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2Н-пиразино[2,1-с][1,2,4]триазин-1(6Н)-карбоксамид. E7386/LEN=Е7386 и ленватиниб. E7386/LENPD-1=Е7386, ленватиниб и анти-PD-1 антитело.

На фиг. 12А-12G показаны каскадные графики, показывающие наилучший средний ответ (%), который определен, как описано в примере 2. На фиг. 12А показаны данные для отсутствия лечения. На фиг. 12В показаны данные для анти-PD-1 антитела (Ab). На фиг. 12С показаны данные для Е7386 при 25 мг/кг. На фиг. 12D показаны данные для ленватиниба при 10 мг/кг. На фиг. 12Е показаны данные для комбинации Е7386 и ленватиниба. На фиг. 12F показаны данные для комбинации ленватиниба и анти-PD-1 антитела. На фиг. 12G показаны данные для комбинации Е7386, ленватиниба и анти-PD-1 антитела. На каждом чертеже клеточные линии указаны для данных. Горизонтальные пунктирные черные линии обозначают SD и PR (верхняя и нижняя линии, соответственно). SD=стабильное заболевание. PR=частичный ответ.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Аббревиатуры. В подробном описании и примерах использованы следующие аббревиатуры:

PD-L2 лиганд 2 белка запрограммированной клеточной смерти, также известный как B7-DC

Определения. Для того, чтобы облегчить понимание способов, композиций и применений, некоторые технические и научные термины конкретно определены ниже. Если иное специально не определено в настоящем документе, все другие технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значение, обычно понятное специалистам в данной области техники.

«Приблизительно» при использовании для модификации численно определенного параметра (например, дозы антагониста PD-1, (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-d][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамида (Е7386) или его фармацевтически приемлемой соли, или ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли, или продолжительности времени лечения при комбинированной терапии, описанной в настоящем документе) означает, что параметр может варьироваться до 10% ниже или выше заявленного числового значения для этого параметра. Например, доза приблизительно 20 мг может варьироваться от 18 до 22 мг.

«Предпочтительно» означает более желательный выбор. Например, при использовании для изменения числового параметра он указывает, что предпочтительный параметр обеспечивает улучшенный результат по сравнению с другим значением параметра. Это значение «предпочтительно» применимо только за пределами Соединенных Штатов Америки. Для Соединенных Штатов Америки любое предложение, в котором используется слово «предпочтительно», следует читать так, как будто термин отсутствует.

При использовании в настоящем документе, включая прилагаемую формулу изобретения, формы единственного числа слов включают их соответствующее множественное число, если из контекста явно не следует иное.

«Введение» и «обработка» применительно к животному, человеку, экспериментальному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической жидкости относится к контакту экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического средства или композиции с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. Обработка клетки предусматривает контакт реагента с клеткой, а также контакт реагента с жидкостью, где жидкость находится в контакте с клеткой. «Введение» и «обработка» также означают обработку in vitro и ex vivo, например, клетки реагентом, диагностическим средством, связывающим соединением или другой клеткой. Термин «субъект» включает любой организм, предпочтительно животное, более предпочтительно млекопитающее (например, крысу, мышь, собаку, кошку и кролика) и наиболее предпочтительно человека.

В контексте настоящего изобретения термин «антитело» относится к любой форме антитела, которая проявляет желаемую биологическую или связывающую активность. Таким образом, он используется в самом широком смысле и конкретно охватывает без ограничения моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), гуманизированные, полностью человеческие антитела, химерные антитела и верблюжьи однодоменные антитела. «Родительские антитела» представляют собой антитела, полученные при воздействии антигена на иммунную систему перед модификацией антител для предполагаемого применения, такой как гуманизация антитела для применения в качестве терапевтического средства для человека.

Как правило, основная структурная единица антитела содержит тетрамер. Каждый тетрамер включает две идентичные пары полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну «легкую» (около 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (около 50-70 кДа). Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельную область приблизительно из 100-110 или более аминокислот, в первую очередь ответственную за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть тяжелой цепи может определять константную область, в первую очередь отвечающую за эффекторную функцию. Обычно легкие цепи человека классифицируют как легкие цепи каппа и лямбда. Кроме того, тяжелые цепи человека обычно классифицируют как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон, а изотип антител определяют как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. В легкой и тяжелой цепях вариабельная и константная области соединены областью «J», состоящей приблизительно из 12 или более аминокислот, при этом тяжелая цепь также включает область «D», состоящую из еще приблизительно 10 аминокислот. См. В общем, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989).

Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь образуют сайт связывания антитела. Таким образом, обычно интактное антитело имеет два сайта связывания. За исключением бифункциональных или биспецифических антител, два сайта связывания, как правило, являются одинаковыми.

Как правило, вариабельные домены как тяжелой, так и легкой цепей содержат три гипервариабельные области, также называемые определяющими комплементарность областями (CDR), которые расположены в пределах относительно консервативных каркасных областей (FR). CDR обычно выровнены по каркасным областям, обеспечивая связывание со специфическим эпитопом. Как правило, от N-конца к С-концу вариабельные домены как легкой, так и тяжелой цепи содержат FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Назначение аминокислот каждому домену, как правило, соответствует определениям Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md., 5^th ed., NIH Publ. No. 91-3242 (1991), Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32: 1-75, Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252: 6609-6616, Chothia, et al, (1987) J Mol. Biol. 196: 901-917 или Chothia, et al., (19S9) Nature 342: 878-883.

В контексте настоящего изобретения термин «гипервариабельная область» относится к аминокислотным остаткам антитела, ответственным за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» или «CDR» (т.е. CDRL1, CDRL2 и CDRL3 в вариабельном домене легкой цепи и CDRH1, CDRH2 и CDRH3 в вариабельном домене тяжелой цепи). См. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (определение областей CDR антитела по последовательности), см. также Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 (определение областей CDR антитела по структуре). В контексте настоящего изобретения термин «каркасные» или «FR» остатки относятся к тем остаткам вариабельного домена, которые не относятся к остаткам гипервариабельной области, определенным в настоящем документе как остатки CDR.

В контексте настоящего изобретения «вариабельные области» или «V-область» означают сегмент цепей IgG, который является вариабельным по последовательности между различными антителами. Он простирается до остатка по Кабату 109 в легкой цепи и 113 в тяжелой цепи.

В контексте настоящего изобретения, если не указано иное, «фрагмент антитела» или «антигенсвязывающий фрагмент» относится к антигенсвязывающим фрагментам антител, т.е. фрагментам антител, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном, связываемым полноразмерным антителом, например, фрагментам, которые сохраняют одну или несколько областей CDR. Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают без ограничения фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂H Fv, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител, например, sc-Fv, нанотела и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Антитело, которое «специфически связывается» с определенным белком-мишенью, представляет собой антитело, которое проявляет предпочтительное связывание с этой мишенью по сравнению с другими белками, но эта специфичность не требует абсолютной специфичности связывания. Антитело считается «специфическим» в отношении предполагаемой мишени, если его связывание определяет наличие целевого белка в образце, например, не дает нежелательных результатов, таких как ложноположительные результаты. Антитела или их связывающие фрагменты будут связываться с белком-мишенью с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза выше, предпочтительно по меньшей мере в десять раз выше, более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз выше и наиболее предпочтительно по меньшей мере в 100 раз выше, чем аффинность с нецелевыми белками. В контексте настоящего изобретения говорят, что антитело специфически связывается с полипептидом, содержащим данную аминокислотную последовательность, например, аминокислотную последовательность зрелой молекулы PD-1 человека или PD-L1 человека, если оно связывается с полипептидами, содержащими эту последовательность, но не связывается с белками, у которых отсутствует эта последовательность.

«Химерное антитело» относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителе, полученном от определенного вида (например, человека) или принадлежащем к определенному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителе, полученном от другого вида (например, мыши) или принадлежащем к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность.

«Человеческое антитело» относится к антителу, которое содержит только последовательности человеческого белка иммуноглобулина. Человеческое антитело может содержать мышиные углеводные цепи, если оно получено у мыши, в мышиной клетке или в гибридоме, полученной из мышиной клетки. Подобным образом, «мышиное антитело» или «крысиное антитело» относится к антителу, которое содержит только мышиные или крысиные последовательности иммуноглобулина, соответственно.

«Гуманизированное антитело» относится к формам антител, которые содержат последовательности нечеловеческих (например, мышиных) антител, а также антител человека. Такие антитела содержат минимальную последовательность, происходящую из нечеловеческого иммуноглобулина. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют петлям нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по существу все FR-области относятся к последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека. Префикс «hum», «hu» или «h» добавляют к обозначениям клонов антител, когда необходимо отличить гуманизированные антитела от родительских антител грызунов. Гуманизированные формы антител грызунов, как правило, содержат те же последовательности CDR, что и родительские антитела грызунов, хотя некоторые аминокислотные замены могут быть включены для повышения аффинности, повышения стабильности гуманизированного антитела или по другим причинам.

«Выделенное антитело» и «выделенный фрагмент антитела» относятся к статусу очистки и в таком контексте означают, что названная молекула по существу не содержит других биологических молекул, таких как нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы или другой материал, такой как клеточный дебрис и среды роста. Как правило, термин «выделенное» не относится к полному отсутствию такого материала или к отсутствию воды, буферов или солей, если только они не присутствуют в количествах, которые существенно мешают экспериментальному или терапевтическому применению связывающего соединения, как описано в настоящем документе.

В контексте настоящего изобретения «Кабат» означает систему выравнивания и нумерации иммуноглобулинов, впервые предложенную Elvin A. Kabat ((1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.).

В контексте настоящего изобретения «моноклональное антитело», или «mAb», или «Mab» относится к популяции по существу гомогенных антител, т.е. молекулы антител, составляющие популяцию, идентичны по аминокислотной последовательности, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Напротив, обычные (поликлональные) препараты антител обычно включают множество различных антител, имеющих разные аминокислотные последовательности в их вариабельных доменах, особенно в их CDR, которые часто специфичны для разных эпитопов. Модификатор «моноклональное» указывает на то, что антитело получено из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует толковать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, используемые в соответствии со способами лечения, лекарственными средствами и раскрытыми применениями, могут быть получены способом на основе гибридомы, впервые описанным Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, или могут быть получены способами рекомбинантной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК (см., например, патент США №4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных в Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 and Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597, например, см. также Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116: 731.

В контексте настоящего изобретения «CDR» или «CDRs» означают определяющую комплементарность область (определяющие комплементарность области) в вариабельной области иммуноглобулина, определенную с использованием системы нумерации Кабата, если не указано иное.

«Противоопухолевый ответ» применительно к больному раком, получающему терапевтическую схему, такую как комбинированная терапия, описанная в настоящем документе, означает по меньшей мере один положительный терапевтический эффект, такой как, например, уменьшение количества раковых клеток, уменьшение размера опухоли, снижение скорости инфильтрации раковых клеток в периферические органы, снижение скорости метастазирования опухоли или роста опухоли или выживаемость без прогрессирования. Положительные терапевтические эффекты при раке можно измерить несколькими путями (см., W.A. Weber, J. Null. Med. 50: 1S-10S (2009), Eisenhauer et al., выше). В некоторых случаях противоопухолевый ответ на комбинированную терапию, описанную в настоящем документе, оценивают с использованием критериев RECIST 1.1 (критерии оценки ответа при солидных опухолях), двумерного irRC (иммуно-зависимые критерии ответа на иммунотерапию) или одномерного irRC. В некоторых случаях противоопухолевый ответ представляет собой любой из SD, PR, CR, PFS или DFS.

«Двумерный irRC» относится к набору критериев, описанных в Wolchok JD, et al. "Guidelines for the evaluation of immune therapy activity in solid tumors: immune-related response criteria," Clin Cancer Res. 15(23): 7412-7420 (2009). В этих критериях используются двумерные измерения опухоли целевых поражений, которые получаются путем умножения самого длинного диаметра и самого длинного перпендикулярного диаметра (см²) каждого поражения.

«Биотерапевтическое средство» означает биологическую молекулу, такую как антитело или слитый белок, которая блокирует передачу сигналов лиганда/рецептора на любом биологическом пути, который поддерживает поддержание и/или рост опухоли или подавляет противоопухолевый иммунный ответ. Классы биотерапевтических средств включают без ограничения антитела к VEGF, рецептору эпидермального фактора роста (EGFR), Her2/neu, рецепторам других факторов роста, CD20, CD40, CD-40L, CTLA-4, ОХ-40, 4-1BB и ICOS.

Термины «рак», «раковое», «опухоль» или «злокачественное» относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают без ограничения почечноклеточный рак (RCC), колоректальный рак (CRC), гепатоцеллюлярную карциному (НСС), меланому, рак мочевого пузыря, такой как уротелиальный рак, рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак эндометрия и плоскоклеточный рак головы и шеи. Другой конкретный пример рака включает почечноклеточный рак (RCC). Еще один конкретный пример рака включает светлоклеточный рак почки. Рак может быть первичным раком, но более вероятно, что он может прогрессировать в стадии рака, включая метастатическое заболевание (например, поражение лимфатических или других органов). Рак, который можно лечить в соответствии с раскрытыми способами лечения, лекарственными средствами и раскрытыми применениями, включает рак, который характеризуются повышенной экспрессией одного или обоих PD-L1 и PD-L2 в тестируемых образцах тканей.

«CBR» или «процент пациентов с улучшением клинических показателей» означает CR + PR + устойчивое SD.

«Химиотерапевтическое средство» представляет собой химическое соединение, полезное для лечения рака. Классы химиотерапевтических средств, которые можно использовать в сочетании с терапевтической комбинацией и ее способами и применениями, описанными в настоящем документе, включают без ограничения алкилирующие агенты, антиметаболиты, ингибиторы киназ, алкалоиды ядовитых растений, цитотоксические/противоопухолевые антибиотики, ингибиторы топоизомеразы, фотосенсибилизаторы, антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), антипрогестероны, понижающие регуляторы рецепторов эстрогена (ERD), антагонисты рецепторов эстрогена, агонисты рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона, антиандрогены, ингибиторы ароматазы, EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), ингибиторы VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), ингибиторы VEGFR (рецептор фактора роста эндотелия сосудов) и антисмысловые олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов, вовлеченных в аномальную пролиферацию клеток или рост опухоли. Химиотерапевтические средства, применимые в раскрытых в настоящем документе способах лечения, включают цитостатические и/или цитотоксические агенты.

В контексте настоящего изобретения «Chothia» означает систему нумерации антител, описанную в Al-Lazikani et al., JMB 273: 927-948 (1997).

Термин «содержащий» или варианты, такие как «содержать», «содержит» или «состоит из», используются во всем описании и формуле изобретения во включающем смысле, т.е. для указания наличия заявленных признаков, но не для исключения присутствия или добавления дополнительных признаков, которые могут существенно улучшить действие или полезность любого из раскрытых способов лечения, лекарственных средств и раскрытых применений, если из контекста не следует иное из-за языка выражения или необходимого значения.

«Консервативно модифицированные варианты» или «консервативная замена» относятся к заменам аминокислот в белке другими аминокислотами, имеющими сходные характеристики (например, заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформацию и жесткость основной цепи и т.д.), такие, что изменения часто могут быть сделаны без изменения биологической активности или другого желаемого свойства белка, такого как антигенная аффинность и/или специфичность. Специалистам в данной области техники известно, что, как правило, замены отдельных аминокислот в несущественных участках полипептида существенно не изменяют биологическую активность (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224 (4th Ed.)). Кроме того, замена структурно или функционально сходных аминокислот с меньшей вероятностью нарушает биологическую активность. Примеры консервативных замен представлены в Таблице 1 ниже.

«Состоит по существу из» и такие варианты, как «состоят по существу из» или «состоящий по существу из», используемые в описании и формуле настоящего изобретения, указывают на включение любых перечисленных элементов или группы элементов, а также на необязательное включение других элементов, аналогичных или отличных от перечисленных элементов, которые существенно не изменяют основные или новые свойства указанного режима дозирования, способа или композиции. В качестве неограничивающего примера можно привести антагонист PD-1, который состоит по существу из указанной аминокислотной последовательности и может также включать одну или несколько аминокислот, включая замены одного или нескольких аминокислотных остатков, которые существенно не влияют на свойства связывающего соединения.

«DCR» или «частота контроля заболевания» означает CR + PR + SD.

«Диагностическое анти-PD-L моноклональное антитело» означает mAb, которое специфически связывается со зрелой формой обозначенного PD-L (PD-L1 или PDL2), которая экспрессируется на поверхности определенных клеток млекопитающих. В зрелом PD-L отсутствует пресекреторная лидерная последовательность, также называемая лидерным пептидом. Термины «PD-L» и «зрелый PD-L» используются в настоящем документе взаимозаменяемо, и следует понимать, что они означают одну и ту же молекулу, если не указано иное или из контекста не очевидно иное.

В контексте настоящего изобретения диагностическое анти-человеческий PD-L1 mAb или анти-hPD-L1 mAb относится к моноклональному антителу, которое специфически связывается со зрелым PD-L1 человека. Молекула зрелого PD-L1 человека состоит из аминокислот 19-290 следующей последовательности:

Конкретными примерами диагностических анти-человеческий PD-L1 mAb, полезных в качестве диагностических mAb для детекции IHC экспрессии PD-L1 в срезах опухолевой ткани FFPE, являются антитело 20С3 и антитело 22С3, которые описаны в международной заявке PCT/US13/075932, поданной 18 декабря 2013 г. и опубликованной как WO 2014/100079 26 июня 2014 г. Другое анти-человеческий PD-L1 mAb, о котором сообщалось, что оно может быть использовано для детекции IHC экспрессии PD-L1 в срезах ткани FFPE (Chen, B.J. et al., Clin. Cancer Res. 19: 3462-3473 (2013)), представляет собой кроличье mAb против человеческого PD-L1, общедоступное от Sino Biological, Inc. (Beijing, P.R. China, номер по каталогу 10084-R015).

«DSDR» или «устойчивый процент пациентов со стабилизацией заболевания» означает SD в течение ≥23 недель.

В контексте настоящего изобретения «каркасная область» или «FR» означает вариабельные области иммуноглобулина, за исключением областей CDR.

«Гомология» относится к сходству последовательностей между двумя полипептидными последовательностями, когда они оптимально выровнены. Когда положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занято одной и той же субъединицей аминокислотного мономера, например, если положение в CDR легкой цепи двух разных Ab занято аланином, то два Ab являются гомологичными в этом положении. Процент гомологии представляет собой количество гомологичных позиций, общих для двух последовательностей, поделенное на общее количество сравниваемых позиций × 100. Например, если 8 из 10 позиций в двух последовательностях совпадают или гомологичны, когда последовательности оптимально выровнены, то эти две последовательности гомологичны на 80%. Как правило, сравнение проводят, когда две последовательности выровнены для получения максимального процента гомологии. Например, сравнение может быть выполнено с помощью алгоритма Basic Local Alignment Search Tool (BLAST^®), который является зарегистрированным товарным знаком Национальной медицинской библиотеки, при этом параметры алгоритма выбирают таким образом, чтобы обеспечить наибольшее совпадение между соответствующими последовательностями по всей длине соответствующих эталонных последовательностей.

Следующие иллюстративные ссылки относятся к алгоритмам BLAST®, часто используемым для анализа последовательностей: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, Gish, W., et al., (1993)Nature Genet. 3: 266-272, Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266: 131-141, Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7: 649-656, Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17: 149-163, Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10: 67-70, ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp.345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC, Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp.353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC, Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219: 555-565, States, D.J., et al, (1991) Methods 3: 66-70, Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300, ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, Karlin, S., et al., (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22: 2022-2039, и Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York.

«Пациент без ответа» при ссылке на специфический противоопухолевый ответ на лечение комбинированной терапией, описанной в настоящем документе, означает, что пациент не проявлял противоопухолевого ответа.

«ORR» или «частота объективного ответа» в некоторых случаях относится к CR + PR, а ORR_{(неделя 24)} относится к CR и PR, измеренным с помощью irRECIST у каждого пациента в когорте после 24 недель лечения ленватиниб мезилатом в комбинации с пембролизумабом.

«Пациент», или «субъект», или «индивидуум» относится к любому отдельному субъекту, для которого желательна терапия или который участвует в клиническом испытании, эпидемиологическом исследовании или используется в качестве контроля, включая людей и ветеринарных пациентов-млекопитающих, таких как крупный рогатый скот, лошади, собаки и кошки.

Антагонисты PD-1. АНти-PD1 антагонисты включают следующее. «Антагонист PD-1» означает любое химическое соединение или биологическую молекулу, которая блокирует связывание PD-L1, экспрессируемого на раковой клетке, с PD-1, экспрессируемым на иммунной клетке (Т-клетке, В-клетке или NKT-клетке), и предпочтительно также блокирует связывание PD-L2, экспрессируемого на раковой клетке, с экспрессируемый иммунной клеткой PD-1. Альтернативные названия или синонимы для PD-1 и его лигандов включают: PDCD1, PD1, CD279 и SLEB2 для PD-1, PDCD1L1, PDL1, В7Н1, В7-4, CD274 и В7-Н для PD-L1, и PDCD1L2, PDL2, B7-DC, Btdc и CD273 для PD-L2. В любом из способов лечения, лекарственных средств и раскрытых применений, в которых лечению подлежит человек, антагонист PD-1 блокирует связывание человеческого PD-L1 с человеческим PD-1 и предпочтительно блокирует связывание как человеческого PD-L1, так и человеческого PD-L2 с человеческим PD-1. Аминокислотные последовательности человеческого PD-1 можно найти в NCBI Locus No.: NP_005009. Аминокислотные последовательности человеческого PD-L1 и PD-L2 можно найти в NCBI Locus No.: NP_054862 и NP_079515, соответственно. Антагонист PD-1 не представляет собой анти-PD-L1 моноклональное антитело атезолизумаб.

Антагонисты PD-1, полезные в любом из способов лечения, лекарственных средств и раскрытых применений, включают моноклональное антитело (mAb) или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с PD-1 или PD-L1 и предпочтительно специфически связывается с человеческим PD-1 или человеческим PD-L1. mAb может быть человеческим антителом, гуманизированным антителом или химерным антителом и может включать человеческую константную область. Человеческая константная область выбрана из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и предпочтительно человеческая константная область представляет собой константную область IgG1 или IgG4. В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент выбирают из группы, состоящей из фрагментов Fab, Fab'-SH, F(ab')₂, scFv и Fv.

Любые моноклональные антитела, которые связываются с полипептидом PD-1, фрагментом полипептида PD-1, пептидом PD-1 или эпитопом PD-1 и блокируют взаимодействие между PD-1 и его лигандом PD-L1 или PD-L2, могут использоваться. Согласно некоторым вариантам осуществления анти-человеческий PD-1 моноклональное антитело связывается с полипептидом PD-1, фрагментом полипептида PD-1, пептидом PD-1 или эпитопом PD-1 и блокирует взаимодействие между PD-1 и PD-L1. Согласно другим вариантам осуществления анти- человеческий PD-1 моноклональное антитело связывается с полипептидом PD-1, фрагментом полипептида PD-1, пептидом PD-1 или эпитопом PD-1 и блокирует взаимодействие между PD-1 и PD-L2. Согласно другим вариантам осуществления анти- человеческий PD-1 моноклональное антитело связывается с полипептидом PD-1, фрагментом полипептида PD-1, пептидом PD-1 или эпитопом PD-1 и блокирует взаимодействие между PD-1 и PD-L1 и взаимодействие между PD-1 и PD-L2.

Любые моноклональные антитела, которые связываются с полипептидом PD-L1, фрагментом полипептида PD-L1, пептидом PD-L1 или эпитопом PD-L1 и блокируют взаимодействие между PD-L1 и PD-1, могут использоваться.

Согласно определенным вариантам осуществления анти- человеческий PD-1 моноклональное антитело выбирают из группы, состоящей из пембролизумаба, ниволумаба, цемиплимаба, пидилизумаба (Патент США №7332582), АМР-514 (MedImmune LLC, Gaithersburg, MD), PDR001 (Патент США №9683048), BGB-A317 (Патент США №8735553) и MGA012 (MacroGenics, Rockville, MD).

Согласно одному варианту осуществления анти-человеческий PD-1 моноклональное антитело представляет собой пембролизумаб. Согласно другому варианту осуществления анти-человеческий PD-1 моноклональное антитело представляет собой ниволумаб. Согласно другому варианту осуществления анти-человеческий PD-1 моноклональное антитело представляет собой цемиплимаб. Согласно другому варианту осуществления анти-человеческий PD-1 моноклональное антитело представляет собой пидилизумаб. Согласно одному варианту осуществления анти-человеческий PD-1 моноклональное антитело представляет собой АМР-514. Согласно другому варианту осуществления античеловеческий PD-1 моноклональное антитело представляет собой PDR001. Согласно другому варианту осуществления анти-человеческий PD-1 моноклональное антитело представляет собой BGB-A317. Согласно другому варианту осуществления античеловеческий PD-1 моноклональное антитело представляет собой MGA012.

Примеры mAb, которые связываются с человеческим PD-1 и полезны в способах лечения, лекарственных средствах и раскрытых применениях, описаны в патентах США №№7488802, 7521051, 8008449, 8354509 и 8168757, в международных патентных публикациях WO2004/004771, WO2004/072286 и WO2004/056875, а также в публикации США №2011/0271358. Конкретные анти-человеческий PD-1 mAb, полезные в качестве антагониста PD-1 в способах лечения, лекарственных средствах и описанных применениях, включают пембролизумаб (также известный как МК-3475), гуманизированное моноклональное антитело IgG4 со структурой, описанной в WHO Drug Information, Vol.27, No. 2, pages 161-162 (2013), которое содержит аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей, показанные на фиг. 6, ниволумаб (BMS-936558), mAb IgG4 человека со структурой, описанной в WHO Drug Information, Vol.27, No. 1, pages 68-69 (2013), которое содержит аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей, показанные на фиг. 7, пидилизумаб, гуманизированное моноклональное антитело, АМР-224 и АМР-514, гуманизированные антитела h409All, h409A16 и h409A17, которые описаны в WO 2008/156712, и АМР-514, который разрабатывается компанией Medhnmune.

Примеры mAb, которые связываются с человеческим PD-L1 и полезны в способах лечения, лекарственных средствах и раскрытых применениях, описаны в WO 2013/019906, WO 2010/07763 4 А1 и патенте США №8383796. Специфические анти-человеческий PD-L1 mAb, полезные в качестве антагониста PD-1 в способах лечения, лекарственных средствах и описанных применениях, включают BMS-936559, цемиплимаб, MEDI4736, MSB0010718C и антитело, которое содержит вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 21, соответственно, из WO 2013/019906.

Другие антагонисты PD-1, полезные в любом из способов лечения, лекарственных средств и раскрытых применений, включают иммуноадгезин, который специфически связывается с PD-1 или PD-L1 и предпочтительно специфически связывается с человеческим PD-1 или человеческим PD-L1, например, слитый белок, содержащий внеклеточную или PD-1-связывающую часть PD-L1 или PD-L2, слитую с константной областью, такой как Fc-область, молекулы иммуноглобулина. Примеры молекул иммуноадгезина, которые специфически связываются с PD-1, описаны в WO 2010/027827 и WO 2011/066342. Конкретные слитые белки, применимые в качестве антагониста PD-1 в способах лечения, лекарственных средствах и применениях, описанных в настоящем документе, включают АМР-224 (также известный как B7-DCIg), который представляет собой слитый белок PD-L2-FC и связывается с человеческим PD-1.

Способы лечения, лекарственные средства и описанные применения предусматривают, что антагонист PD-1 представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит: (a) CDR легкой цепи SEQ ID NO: 1, 2 и 3 и CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 4, 5 и 6, или (b) CDR легкой цепи SEQ ID NO: 7, 8 и 9 и CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 10, 11 и 12.

Способы лечения, лекарственные средства и описанные применения предусматривают, что антагонист PD-1 представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с человеческим PD-1 и содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 13 или ее вариант, и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15 или ее варианта, SEQ ID NO: 16 или ее варианта и SEQ ID NO: 17 или ее варианта. Вариант последовательности вариабельной области тяжелой цепи идентичен эталонной последовательности, за исключением того, что содержит до 17 консервативных аминокислотных замен в каркасной области (т.е. вне CDR) и предпочтительно имеет менее десяти, девяти, восьми, семи, шести или пяти консервативных аминокислотных замен в каркасной области. Вариант последовательности вариабельной области легкой цепи идентичен эталонной последовательности, за исключением того, что содержит до пяти консервативных аминокислотных замен в каркасной области (т.е. вне CDR, и предпочтительно содержит менее четырех, трех или двух консервативных аминокислотных замен в каркасной области.

Антагонист PD-1 для любого из способов лечения, лекарственных средств и описанных применений может представлять собой моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим PD-1 и содержит (а) тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 14, и (b) легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20.

Способы лечения, лекарственные средства и описанные применения предусматривают, что антагонист PD-1 представляет собой моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим PD-1 и содержит (а) тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 14, и (b) легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 18.

В приведенной ниже таблице 2 представлен перечень аминокислотных последовательностей типичных анти-PD-1 mAb для применения в способах лечения, лекарственных средствах и описанных применениях, и последовательности показаны на фиг. 1-5 В.

В контексте настоящего изобретения экспрессия «PD-L1» или «PD-L2 означает любой определяемый уровень экспрессии указанного белка PD-L на клеточной поверхности или указанной мРНК PD-L в клетке или ткани. Экспрессию белка PD-L можно обнаружить с помощью диагностического антитела к PD-L в анализе IHC среза опухолевой ткани или с помощью проточной цитометрии. Альтернативно, экспрессия белка PD-L опухолевыми клетками может быть обнаружена с помощью визуализации с помощью позитронно-эмиссионной томографии (PET) с использованием связывающего агента (например, фрагмента антитела, аффитела и т.п.), который специфически связывается с желаемой мишенью PD-L, например, PD-L1 или PD-L2. Способы обнаружения и измерения экспрессии мРНК PD-L включают ОТ-ПЦР и количественную ОТ-ПЦР в реальном времени.

Описано несколько подходов для количественной оценки экспрессии белка PD-L1 в анализах IHC срезов опухолевой ткани. См., например, Thompson, R.Н., et al., PNAS 101 (49): 17174-17179 (2004), Thompson, R.H. et al., Cancer Res. 66: 3381-3385 (2006), Gadiot, J., et al., Cancer 117: 2192-2201 (2011), Taube, J.M. et al., Sci Transl Med 4: 127-37 (2012), и Toplian, S.L. et al., New Eng. J Med. 366(26): 2443-2454 (2012).

В одном подходе используют простую бинарную конечную точку положительной или отрицательной экспрессии PD-L1, при этом положительный результат определяют с точки зрения процента опухолевых клеток, которые демонстрируют гистологические признаки окрашивания мембраны клеточной поверхности. Срез опухолевой ткани считается положительным по экспрессии PD-L1, если процент составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно 5% от общего числа опухолевых клеток.

В другом подходе экспрессию PD-L1 в срезе опухолевой ткани количественно определяют в опухолевых клетках, а также в инфильтрирующих иммунных клетках, которые преимущественно состоят из лимфоцитов. Процент опухолевых клеток и инфильтрирующих иммунных клеток, которые проявляют окрашивание мембраны, оценивают отдельно как <5%, от 5 до 9%, а затем с шагом 10% доводят до 100%. Для опухолевых клеток экспрессия PD-L1 считается отрицательной, если оценка составляет <5%, и положительной, если оценка составляет ≥5%. Экспрессия PD-L1 в иммунном инфильтрате представлена в виде полуколичественного измерения, называемого скорректированной оценкой воспаления (AIS), которую определяют путем умножения процента клеток с окрашиванием мембраны на интенсивность инфильтрата, которая оценивается как отсутствие (0), легкая (1 балл, редкие лимфоциты), умеренная (2 балла, очаговая инфильтрация опухоли лимфогистиоцитарными агрегатами) или тяжелая (3 балла, диффузная инфильтрация). Срез опухолевой ткани считается положительным по экспрессии PD-L1 иммунными инфильтратами, если AIS составляет ≥5.

Уровень экспрессии мРНК PD-L можно сравнить с уровнями экспрессии мРНК одного или нескольких эталонных генов, которые часто используются в количественной ОТ-ПЦР, таких как убиквитин С.

В некоторых случаях уровень экспрессии PD-L1 (белка и/или мРНК) злокачественными клетками и/или инфильтрирующими иммунными клетками в опухоли определяют как «сверхэкспрессию» или «повышенный» на основании сравнения с уровнем экспрессии PD-L1 (белок и/или мРНК) соответствующего контроля. Например, контрольный уровень экспрессии белка PD-L1 или мРНК может представлять собой уровень, определяемый количественно в незлокачественных клетках того же типа или в срезе соответствующей нормальной ткани (т.е. незлокачественной ткани). Экспрессию PD-L1 в образце опухоли предпочтительно определяют как повышенную, если белок PD-L1 (и/или мРНК PD-L1) в образце по меньшей мере на 10%, 20% или 30% больше, чем в контроле.

«Биоаналог пембролизумаба» означает биологический продукт, произведенный компанией, отличной от Merck & Co., Inc. dba Merck Sharp and Dohme (MSD), и который одобрен регулирующим органом в любой стране для продажи в качестве биоаналога пембролизумаба. Биоаналог пембролизумаба может включать в качестве лекарственного вещества вариант пембролизумаба или антитело с той же аминокислотной последовательностью, что и пембролизумаб.

В контексте настоящего изобретения термин «вариант пембролизумаба» означает моноклональное антитело, содержащее последовательности тяжелой и легкой цепей, идентичные последовательностям пембролизумаба, за исключением наличия трех, двух или одной консервативной аминокислотной замены в положениях, расположенных за пределами CDR легкой цепи, и шесть, пять, четыре, три, две или одну консервативную аминокислотную замену, расположенную за пределами CDR тяжелой цепи, например, варианты положения расположены в областях FR и/или константной области. Другими словами, пембролизумаб и вариант пембролизумаба содержат идентичные последовательности CDR, но отличаются друг от друга наличием консервативных аминокислотных замен не более чем в трех или шести других положениях их полноразмерных последовательностей легкой и тяжелой цепей, соответственно. Вариант пембролизумаба по существу аналогичен пембролизумабу в отношении следующих свойств: аффинность связывания с PD-1 и способность блокировать связывание каждого из PD-L1 и PD-L2 c PD-1.

Определения пациент/рак/ответ. «Критерии ответа RECIST 1.1», используемые в настоящем документе, означают определения, изложенные в Eisenhauer et al., Е.A. et al., Eur. J. Cancer 45: 228-247 (2009) для поражений-мишеней или поражений, не являющихся мишенями, в зависимости от контекста, в котором измеряется ответ.

«Отвечающий пациент», когда речь идет о специфическом противоопухолевом ответе на лечение комбинированной терапией, описанной в настоящем документе, означает, что у пациента проявился противоопухолевый ответ.

«Устойчивый ответ» означает устойчивый терапевтический эффект после прекращения лечения терапевтическим средством или комбинированной терапии, описанной в настоящем документе. В некоторых случаях устойчивый ответ имеет продолжительность, по меньшей мере такую же как продолжительность лечения или по меньшей мере в 1,5, 2,0, 2,5 или 3 раза больше, чем продолжительность лечения.

«Срез ткани» относится к отдельной части или фрагменту образца ткани, например, тонкому срезу ткани, вырезанному из образца нормальной ткани или опухоли.

В контексте настоящего изобретения «лечение» или «лечить» рак означает введение комбинированной терапии антагониста PD-1, ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли и Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли субъекту, страдающему раком, или у которого диагностирован рак, для достижения по меньшей мере одного положительного терапевтического эффекта, такого как, например, уменьшение количества раковых клеток, уменьшение размера опухоли, снижение скорости инфильтрации раковых клеток в периферические органы или снижение скорости метастазирования опухоли или роста опухоли. Положительные терапевтические эффекты при раке можно измерить несколькими путями (см., W.A. Weber, J. Nucl. Med. 50:1S-10S (2009)). Например, в отношении ингибирования роста опухоли, согласно стандартам NCI, Т/С≤42% является минимальным уровнем противоопухолевой активности. АТ/С<10% считается высоким уровнем противоопухолевой активности, при этом Т/С (%) = средний объем опухоли при лечении/средний объем опухоли контролях 100. В некоторых случаях ответ на комбинированную терапию, описанную в настоящем документе, оцениваемый с использованием критериев RECIST 1.1 или irRC (двумерный или одномерный), где лечение достигается комбинацией ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли, (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-с][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамида (Е7386) или его фармацевтически приемлемой соли и антагониста PD-1, представляет собой любой из PR, CR, OR, PFS, DFS и OS. PFS, также называемое «время до прогрессирования опухоли», указывает период времени во время и после лечения, в течение которого рак не развивается, и включает количество времени, в течение которого пациенты испытывали CR или PR, а также количество времени, в течение которого пациенты перенесли SD. DFS относится к продолжительности времени во время и после лечения, в течение которого пациент остается здоровым. OS относится к увеличению ожидаемой продолжительности жизни по сравнению с наивными или не подвергнутыми лечению людьми или пациентами. В некоторых случаях ответ на комбинацию ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли, (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-с][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамида (Е7386) или его фармацевтически приемлемой соли и антагониста PD-1, представляет собой любой из PR, CR, PFS, DFS, OR и OS, которые оценивают с использованием критериев ответа RECIST 1.1. Схема лечения раскрытой комбинацией, которая эффективна для лечения пациента, страдающего раком, может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст и вес пациента, а также способности терапии вызывать противоопухолевый ответ у субъекта. Способы лечения, лекарственные средства и раскрытые применения могут быть не эффективными для достижения положительного терапевтического эффекта у каждого субъекта, они должны быть эффективными для статистически значимого числа субъектов, что определяется любым статистическим тестом, известным в данной области, таким как критерий Стьюдента, критерий chi², U-критерий Манна-Уитни, критерий Крускала-Уоллиса (Н-критерий), критерий Джонкхиера-Терпстра и критерий Уилкоксона.

Термины «схема лечения», «протокол дозирования» и «режим дозирования» используются взаимозаменяемо для обозначения дозы и времени введения каждого терапевтического средства в комбинации ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли, (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-d][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамида (Е7386) или его фармацевтически приемлемой соли и антагониста PD-1.

«Опухоль» при применении к субъекту, у которого диагностирован или подозревается рак, относится к злокачественному или потенциально злокачественному новообразованию или массе ткани любого размера и включает первичные опухоли и вторичные новообразования. Солидная опухоль представляет собой аномальный рост или массу ткани, которая обычно не содержит кист или жидких участков. Различные типы солидных опухолей названы по типу клеток, которые их образуют. Примерами солидных опухолей являются саркомы, карциномы и лимфомы.

«Опухолевая нагрузка», также называемая «опухолевой загрузкой», относится к общему количеству опухолевого материала, распределенного по всему телу. Опухолевая нагрузка относится к общему количеству раковых клеток или общему размеру опухоли (опухолей) по всему телу, включая лимфатические узлы и узкие кости. Опухолевая нагрузка может быть определена различными способами, известными в данной области техники, такими как, например, измерение размеров опухоли (опухолей) при удалении у субъекта, например, с помощью штангенциркуля, или во время нахождения в организме с использованием способов визуализации, например, УЗИ, сканирования костей, компьютерной томографии (КТ) или магнитно-резонансной томографии (МРТ).

Термин «размер опухоли» относится к общему размеру опухоли, который можно измерить как длину и ширину опухоли. Размер опухоли можно определить различными способами, известными в данной области техники, такими как, например, измерение размеров опухоли (опухолей) при удалении у субъекта, например, с помощью штангенциркуля, или во время нахождения в организме с использованием способов визуализации, например, сканирование костей, УЗИ, КТ или МРТ.

«Одномерный irRC» относится к набору критериев, описанных в Nishino М, Giobbie-Hurder A, Gargano М, Suda М, Ramaiya NH, Hodi FS. "Developing a Common Language for Tumor Response to Immunotherapy: Immune-related Response Criteria using Unidimensional measurements," Clin. Cancer Res. 2013, 19(14): 3936-3943). В этих критериях используется самый длинный диаметр (см) каждого поражения.

«Ингибитор мульти-RTK» означает низкомолекулярное соединение, которое ингибирует активность рецепторной тирокинкиназы (RTK) по меньшей мере каждой из следующих RTK: (i) VEGFR2 и (ii) по меньшей мере одного FGFR, выбранного из группы, состоящей из FGFR1, 2, 3 и 4. Типичным ингибитором мульти-RTK является ленватиниб или его фармацевтически приемлемая соль.

β-катенин действует как медиатор передачи сигнала Wnt, связывается с фактором транскрипции Tcf/Lef (фактор Т-клеток/фактор усиления лимфоцитов), способствует экспрессии различных генов (циклин D1, с-Мус и др.), участвующих в передаче сигнала Wnt, и контролирует пролиферацию и дифференцировку клеток (Не et al., 1998 Science 281: 1509-1512, Kolligs et al., Mol. Cell. Biol. 19: 5696-5706, 1999, Crawford et al., Oncogene 18: 2883-2891, 1999, Shtutman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11: 5522-5527, 1999, Tetsu and McCormick, 1999 Nature, 398: 422-426).

СВР (белок, связывающий циклический АМР-ответный элемент (CREB)) напрямую взаимодействует с β-катенином в CREB-связывающем домене и способствует активации транскрипции Tcf/Lef (Ken-Ichi Takemaru and Randall Т. Moon, 2000, J. Cell. Biol. 149(2): 249-254).

Ингибитор СВР/β-катенина не ограничен конкретным образом, при условии, что он ингибирует взаимодействие между СВР и катенином, в частности β-катенином, и согласно варианту осуществления ингибирует связывание β-катенина и СВР, в результате чего экспрессия гена β-катениновым комплексом предпочтительно подавляется.

Ингибирование СВР/β-катенина можно измерить с помощью анализа связывания (анализа радиосвязывания и т.д.), известного как такового, способа репортерного анализа и других подобных анализов in vitro и in vivo. Ингибирование можно подтвердить путем измерения экспрессии гена передачи сигнала Wnt с помощью способа репортерного анализа, описанного в WO 2009/148192.

Ингибитор СВР/β-катенина согласно настоящему изобретению не ограничен конкретным образом, при условии, что он является таким, как описано выше. Предпочтительно это соединение-миметик α-спирали, обладающее ингибирующей активностью в отношении СВР/β-катенин, и его примеры включают соединения-миметики α-спирали, их фармацевтически приемлемые соли и т.п., как описано в WO 2003/031448, WO 2004/093828, WO 2005/116032, WO 2009/148192, WO 2010/044485, WO 2010/128685, WO 2012/115286, и тому подобное. Иллюстративный ингибитор СВР/β-катенина включает (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-с][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамид (Е7386).

Каждый из антагониста PD-1, ленватиниба и Е7386 в комбинированной терапии, описанной в настоящем документе, можно вводить либо отдельно, либо в составе лекарственного средства/состава (также называемого в настоящем документе фармацевтической композицией), который содержит терапевтическое средство и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ и разбавителей в соответствии со стандартной фармацевтической практикой. Каждое терапевтическое средство может быть получено путем составления ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли, анти-PD-1 антитела и/или Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли либо одновременно, либо по отдельности. Кроме того, составы могут быть помещены в одну упаковку для получения так называемого состава в виде набора.

Ленватиниб или его фармацевтически приемлемая соль могут быть получены способом, описанным в ссылке 17. Примеры фармацевтически приемлемой соли включают соли с неорганическими кислотами, соли с органическими кислотами, соли с неорганическими основаниями, соли с органическими основаниями и соли с кислотными или основными аминокислотами. Предпочтительные примеры солей с неорганическими кислотами включают соли с соляной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, азотной кислотой, фосфорной кислотой и т.п. Предпочтительные примеры солей с органическими кислотами включают соли с уксусной кислотой, янтарной кислотой, фумаровой кислотой, малеиновой кислотой, винной кислотой, лимонной кислотой, молочной кислотой, стеариновой кислотой, бензойной кислотой, метансульфокислотой, этансульфокислотой, п-толуолсульфокислотой и т.п.. Предпочтительные примеры солей с неорганическими основаниями включают соли щелочных металлов, такие как соль натрия и соль калия, соли щелочноземельных металлов, такие как соль кальция и соль магния, соль алюминия и соль аммония. Предпочтительные примеры солей с органическими основаниями включают соли с диэтиламином, диэтаноламином, меглумином, N,N-дибензилэтилендиамином и т.п. Предпочтительные примеры солей с кислотными аминокислотами включают соли с аспарагиновой кислотой, глутаминовой кислотой и т.п. Предпочтительные примеры солей с основными аминокислотами включают соли с аргинином, лизином, орнитином и т.п. Более предпочтительными фармацевтически приемлемыми солями являются соли с органическими кислотами и особенно предпочтительными фармацевтически приемлемыми солями являются соли с метансульфоновой кислотой.

Антагонист PD-1, ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль, Е7386 или его фармацевтически приемлемую соль в раскрытой в настоящем документе комбинированной терапии можно вводить одновременно (т.е. в одном и том же лекарственном средстве), в одно и то же время (т.е. в виде отдельных лекарственных средств, вводимых одно за другим в любом порядке) или последовательно в любом порядке. Последовательное введение особенно полезно, когда терапевтические средства в комбинированной терапии находятся в разных лекарственных формах (одно средство представляет собой таблетку или капсулу, а другое средство представляет собой стерильную жидкость) и/или вводятся по разным схемам дозирования, например, химиотерапевтическое средство, которое вводят по меньшей мере ежедневно, и биотерапевтический препарат, который вводят реже, например, один раз в неделю, один раз в две недели или один раз в три недели.

В некоторых случаях ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль вводят до введения антагониста PD-1 и/или ингибитора СВР/β- катенина, в то время как в других случаях ингибитор мульти-RTK вводят после введения антагониста PD-1 и/или Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли.

В некоторых случаях по меньшей мере одно из терапевтических средств в составе комбинированной терапии вводят с использованием того же режима дозирования (доза, частота и продолжительность лечения), который обычно применяется, когда средство используется в качестве монотерапии для лечения того же рака. В других случаях пациент получает меньшее общее количество по меньшей мере одного из терапевтических средств при комбинированной терапии, чем когда средство используют в качестве монотерапии, например, меньшие дозы, меньшая частота дозирования и/или более короткая продолжительность лечения.

Каждое низкомолекулярное терапевтическое средство в комбинированной терапии, раскрытой в настоящем документе, можно вводить перорально в форме твердого состава, такого как таблетка, гранула, мелкая гранула, порошок или капсула, или в форме жидкости, желе, сиропа или т.п. Каждое низкомолекулярное терапевтическое средство в комбинированной терапии, описанной в настоящем документе, можно вводить парентерально, включая внутривенный, внутримышечный, внутрибрюшинный, подкожный, ректальный, местный и чрескожный пути введения.

Раскрытая в настоящем документе комбинированная терапия может применяться до или после операции по удалению опухоли и может применяться до, во время или после лучевой терапии.

В некоторых случаях комбинированную терапию, раскрытую в настоящем документе, вводят пациенту, который ранее не получал лечение биотерапевтическим или химиотерапевтическим средством, т.е. ранее не получал лечение. В других случаях комбинированную терапию назначают пациенту, у которого не удалось добиться стойкого ответа после предшествующей терапии биотерапевтическим или химиотерапевтическим средством, т.е. пациенту, который получал лечение.

Комбинированную терапию, описанную в настоящем документе, обычно используют для лечения опухоли, которая достаточно велика, чтобы ее можно было обнаружить при пальпации или с помощью способов визуализации, хорошо известных в данной области техники, таких как магнитно-резонансная томография (МРТ), ультразвуковое исследование или компьютерная аксиальная томография (CAT).

Раскрытую в настоящем документе комбинированную терапию предпочтительно вводят пациенту-человеку, страдающему раком, показывающим положительный результат на экспрессию PD-L1. Экспрессию PD-L1 определяют предпочтительно с использованием диагностического анти-человеческий PD-L1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в анализе IHC на FFPE или срезе замороженной ткани образца опухоли, взятого у пациента. Как правило, врач пациента назначает диагностический тест для определения экспрессии PD-L1 в образце опухолевой ткани, взятом у пациента, до начала лечения антагонистом PD-1, Е7386 или его фармацевтически приемлемой солью и ленватинибом или его фармацевтически приемлемой солью, но предполагается, что врач может назначить первый или последующие диагностические тесты в любое время после начала лечения, например, после завершения цикла лечения.

Выбор режима дозирования (также называемого в настоящем документе режимом введения) для комбинированной терапии, раскрытой в настоящем документе, зависит от нескольких факторов, включая скорость метаболизма вещества в сыворотке или ткани, уровень симптомов, иммуногенность объекта и доступность целевых клеток, ткани или органа у индивидуума, подлежащего лечению. Предпочтительно режим дозирования максимизирует количество каждого терапевтического средства, доставляемого пациенту, в соответствии с приемлемым уровнем побочных эффектов. Соответственно, величина дозы и частота дозирования каждого биотерапевтического и химиотерапевтического средства в комбинации частично зависят от конкретного терапевтического средства, тяжести подлежащего лечению рака и характеристик пациента. Рекомендации по выбору соответствующих доз антител, цитокинов и малых молекул доступны. См., например, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK, Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY, Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY, Baert et al. (2003) New Engl. J. Med. 348: 601-608, Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341: 1966-1973, Slamon et. al. (2001) New Engl. J. Med. 344: 783-792, Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342: 613-619, Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348: 24-32, Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343: 1594-1602, Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57th Ed.), Medical Economics Company, ISBN: 1563634457, 57th edition (November 2002). Подходящий режим дозирования может быть определен клиницистом, например, с использованием параметров или факторов, известных или предполагаемых в данной области техники, влияющих на лечение или предполагаемым образом влияющих на лечение, и будет зависеть, например, от анамнеза пациента (например, терапии), типа и стадии рака, подлежащего лечению, и биомаркеров ответа на одно или несколько терапевтических средств в комбинированной терапии.

Биотерапевтические средства в комбинированной терапии, описанные в настоящем документе (т.е. антагонист PD-1, ленватиниб или его фармацевтически приемлемая соль и Е7386 или его фармацевтически приемлемая соль), можно вводить путем непрерывной инфузии или дозами с интервалами, например, ежедневно, через день, три раза в неделю или один раз в неделю, две недели, три недели, ежемесячно, раз в два месяца и т.д. Общая недельная доза обычно составляет по меньшей мере 0,05 мкг/кг, 0,2 мкг/кг, 0,5 мкг/кг, 1 мкг/кг, 10 мкг/кг, 100 мкг/кг, 0,2 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2,0 мг/кг, 10 мг/кг, 25 мг/кг, 50 мг/кг массы тела или более. См., например, Yang et al. (2003) New Engl. J. Med. 349: 427-434, Herold et al. (2002) New Engl. J. Med. 346: 1692-1698, Liu et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 61: 451-456, Portielji et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 133-144. Цемиплимаб-rwlc (LIBTAYO®) является другим антагонистом PD-1. Его можно вводить внутривенно, при этом 350 мг вводят в течение 30 минут один раз каждые 3 недели (Q3W).

Доза ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли может быть соответствующим образом выбрана в зависимости от степени выраженности симптомов, возраста, пола и массы тела пациента, разницы в чувствительности, пути, времени введения и интервала введения, типа фармацевтической композиции и/или т.п. Как правило, в случаях, когда пероральное введение осуществляют для взрослого человека (масса тела 60 кг), доза составляет от 1 до 600 мг, предпочтительно от 5 до 400 мг, более предпочтительно от 5 до 200 мг в день. Доза может быть введена за один прием или разделена на меньшие дозы от 2 до 3 раз в день.

В некоторых случаях, когда используют анти-человеческий PD-1 mAb в качестве антагониста PD-1 в комбинированной терапии, режим дозирования будет включать введение анти-человеческий PD-1 mAb при дозе 1, 2, 3, 5 или 10 мкг/кг с интервалами приблизительно 14 дней (±2 дня), или приблизительно 21 дня (±2 дня), или приблизительно 30 дней (±2 дня) на протяжении всего курса лечения. Дозу анти-PD-1-антитела можно соответствующим образом выбрать таким же образом, как указано выше. Как правило, в случаях, когда внутривенное введение проводят взрослому (масса тела 60 кг), доза может составлять 2 мг/кг по схеме 1 раз в 3 недели при 6-ти недельном цикле (всего 2 дозы). Антитело можно вводить в течение от 1 до 10 циклов с соответствующим интервалом.

В других случаях, когда используют анти-человеческий PD-1 mAb в качестве антагониста PD-1 в комбинированной терапии, режим дозирования будет включать введение анти-человеческий PD-1 mAb при дозе от приблизительно 0,005 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг с повышением дозы у одного и того же пациента. Интервал между дозами можно постепенно сокращать, например, приблизительно 30 дней (±2 дня) между первой и второй дозами, приблизительно 14 дней (±2 дня) между второй и третьей дозами. Согласно некоторым вариантам осуществления интервал дозирования будет составлять приблизительно 14 дней (±2 дня) для доз, следующих после второй дозы.

В конкретных случаях субъекту можно вводить внутривенную (IV) инфузию лекарственного средства, содержащую любой из описанных в настоящем документе антагонистов PD-1.

Антагонистом PD-1 в комбинированной терапии в некоторых случаях предпочтительно является ниволумаб, который вводят внутривенно при дозе, выбранной из группы, состоящей из: 1 мг/кг Q2W, 2 мг/кг Q2W, 3 мг/кг Q2W, 5 мг/кг Q2W, 10 мг Q2W, 1 мг/кг Q3W, 2 мг/кг Q3W, 3 мг/кг Q3W, 5 мг/кг Q3W и 10 мг Q3W. Антагонист PD-1 также может представлять собой цемиплимаб-rwlc, вводимый внутривенно при дозе 350 мг Q3W.

Антагонист PD-1 в комбинированной терапии предпочтительно представляет собой пембролизумаб, вариант пембролизумаба или биоаналог пембролизумаба в некоторых случаях, который вводят в жидком лекарственном средстве при дозе, выбранной из группы, состоящей из 1 мг/кг Q2W, 2 мг/кг Q2W, 3 мг/кг Q2W, 5 мг/кг Q2W, 10 мг Q2W, 1 мг/кг Q3W, 2 мг/кг Q3W, 3 мг/кг Q3W, 5 мг/кг Q3W, 10 мг Q3W и эквивалентов фиксированных доз любой из этих доз, как например, 200 мг Q3W и 400 мг Q6W. В некоторых случаях пембролизумаб применяют в виде жидкого лекарственного средства, которое содержит 25 мг/мл пембролизумаба, 7% (масса/объем) сахарозы, 0,02% (масса/объем) полисорбата 80 в 10 мМ гистидиновом буфере с рН 5,5.

В некоторых случаях выбранную дозу пембролизумаба вводят путем внутривенной инфузии в течение периода времени от 25 до 40 минут или приблизительно 30 минут.

Оптимальная доза пембролизумаба в комбинации с ленватинибом или его фармацевтически приемлемой солью (например, ленватиниб мезилат) и ингибитором СВР/β-катенина (например, Е7386) может быть определена путем повышения или деэскалации дозы одного или обоих из этих средств. В некоторых случаях комбинированная терапия содержит 21-дневный цикл лечения, в котором пембролизумаб вводят при дозе 200 мг Q3W внутривенно (или 400 мг Q6W внутривенно), ингибитор СВР/катенина ленватиниб мезилат вводят при дозе (а) 24 мг в день перорально, (b) 20 мг в день перорально или (с) 14 мг в день перорально, в каждом случае как ленватиниб.

Пациента можно лечить сначала дневной дозой ингибитора СВР/β-катенина, 200 мг пембролизумаба Q3W внутривенно (или 400 мг Q6W внутривенно) и 24 мг (в виде ленватиниба) ленватиниб мезилата в день перорально до тех пор, пока не наблюдается по меньшей мере один DLT, а затем дозу ленватиниб мезилата можно уменьшить до 20 или 14 мг (в каждом случае в виде ленватиниба) в день, в то время как доза пембролизумаба может быть продолжена на уровне 200 мг пембролизумаба Q3W (или 400 мг Q6W внутривенно), и ингибитор СВР/β-катенина можно продолжить при той же дневной дозе или уменьшить.

В качестве примера режима дозирования ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить с водой перорально один раз в день, с пищей или без нее, в течение 21-дневных циклов приблизительно в одно и то же время каждый день. Ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль можно применять в виде капсул по 4 и 10 мг (в каждом случае в виде ленватиниба). В первый день (D1) каждого цикла ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить приблизительно в течение 1 часа после завершения введения пембролизумаба и/или Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли. Пембролизумаб можно применять в виде стерильного лиофилизированного порошка белого или почти белого цвета без консервантов в одноразовых флаконах. Каждый флакон можно восстановить и развести для внутривенной инфузии. Каждые 2 мл восстановленного раствора могут содержать приблизительно 50 мг пембролизумаба. В некоторых случаях пембролизумаб можно применять в виде стерильного, не содержащего консервантов, прозрачного или слегка опалесцирующего, бесцветного или слегка желтоватого раствора, который требует разбавления для внутривенной инфузии. Каждый флакон может содержать 100 мг пембролизумаба в 4 мл раствора. Каждый 1 мл раствора может содержать 25 мг пембролизумаба. Пембролизумаб можно вводить при дозе 200 мг в виде 30-минутной внутривенной инфузии при Q3W (например, от 25 до 40 минут, например).

В случаях, когда получают пероральный твердый состав, фармацевтически приемлемый носитель и при необходимости связующее вещество, разрыхлитель, смазывающее вещество, краситель, ароматизатор и/или тому подобное могут быть добавлены к основному компоненту, т.е. соединению или его фармацевтически приемлемой соли, представленной формулой (I), ингибитору СВР/β-катенина и/или анти-PD-1 антителу, с получением после этого таблетки, гранулы, мелкой гранулы, порошка, капсулы или тому подобного согласно обычному способу. Примеры носителя включают лактозу, кукурузный крахмал, белый мягкий сахар, глюкозу, сорбит, кристаллическую целлюлозу и диоксид кремния. Примеры связующего вещества включают поливиниловый спирт, этилцеллюлозу метилцеллюлозу, гуммиарабик, гидроксипропилцеллюлозу и гидроксипропилметилцеллюлозу. Примеры смазывающего вещества включают стеарат магния, тальк и диоксид кремния. Примеры красителей включают оксид титана, полуторный оксид железа, желтый полуторный оксид железа, кошениль, кармин и рибофлавин. Примеры ароматизаторов включают какао-порошок, аскорбиновую кислоту, винную кислоту, масло мяты перечной, борнеол и порошок корицы. При необходимости эти таблетки и гранулы могут быть покрыты оболочкой.

В некоторых случаях пациента лечат комбинированной терапией в течение по меньшей мере 24 недель, например, восемь 3-недельных циклов. В некоторых случаях лечение комбинированной терапией продолжается до тех пор, пока у пациента не появятся признаки PD или CR.

В некоторых случаях пациент выбран для лечения комбинированной терапией, описанной в настоящем документе, если у пациента диагностирован почечноклеточный рак (RCC), колоректальный рак (CRC), гепатоцеллюлярная карцинома (НСС), меланома, рак мочевого пузыря, уротелиальный рак, рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак эндометрия или плоскоклеточный рак головы и шеи.

«Терапевтическое лекарственное средство» или «комбинированная терапия рака» содержит ингибитор контрольной точки иммунного ответа (например, анит-PD-1 антитело), ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и Е7386 или его фармацевтически приемлемую соль. Лекарственное средство может быть составлено таким образом, что каждое из 3 лекарственных средств находится отдельно и вводится отдельно или в комбинации с двумя из трех лекарственных средств или все вместе способом, подходящим для желаемого введения, например, пероральное, трансназальное, через слизистую оболочку, ректальное, вагинальное, местное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутрикожное, подкожное и внутримышечное введение и тому подобное.

Определение дозы и, следовательно, времени введения терапевтически эффективного количества комбинированной терапии рака, содержащей комбинацию ингибитора контрольной точки иммунного ответа, ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли и Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли, находится в компетенции специалистов в данной области техники. Например, начальное эффективное количество можно определить по клеточной культуре или другому анализу in vitro. Доза может быть установлена для создания концентрации в кровотоке или концентрации в тканях, такой как концентрация IC₅₀ и т.п., определяемой анализом клеточной культуры и/или на животной модели.

Способ введения выбирают в зависимости от состояния, подлежащего лечению, и терапевтического лекарственного средства. Ингибитор контрольной точки иммунного ответа, ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и Е7386 или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить различными способами. Например, один или несколько компонентов можно вводить субъекту любым из следующих способов: подкожным, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным и системным введением и, в некоторых случаях, прямой инъекцией в конкретный орган или опухоль и т.п. Ингибитор контрольной точки иммунного ответа, ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и Е7386 или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить одним путем или несколькими путями одновременно или последовательно, как описано в настоящем документе.

Е7386 или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить один раз в день, два раза в день, несколько раз в день или, кроме того, множество раз в день, в зависимости, среди прочего, от показаний к лечению и решения лечащего врача.

Количества ингибитора контрольной точки иммунного ответа, ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли и Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли, необходимые для оказания лечебного эффекта, могут быть определены эмпирически в соответствии с обычными процедурами для конкретного субъекта. Как правило, клетки вводят в фармакологически эффективной дозе при введении субъекту лечения. «Фармакологически эффективное количество» или «фармакологически эффективная доза» относится к количеству, достаточному для получения желаемого физиологического эффекта или способному достичь желаемого результата, такого как уменьшение или устранение одного или нескольких симптомов или признаков нарушения или заболевания и тому подобного для лечения определенного нарушения или болезненного состояния.

Комбинированная терапия может представлять собой комбинацию ингибитора контрольной точки иммунного ответа, ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли и Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли, которую можно дополнительно комбинировать с другими способами лечения рака, например, хирургической резекцией, лучевой терапией, химиотерапией, иммунотерапией и поддерживающей терапией (например, анальгетики, диуретики, антидиуретики, противовирусные препараты, антибиотики, пищевые добавки, лечение анемии, лечение свертывания крови, лечение костей и психопатологическое и психологическое лечение) и тому подобное.

Эти и другие аспекты, раскрытые в данном документе, включая иллюстративные конкретные способы лечения, лекарственные средства и применения, перечисленные ниже, будут очевидны на основании настоящего раскрытия.

Специфические способы лечения, лекарственные средства и применения

[1]. Способ лечения рака у субъекта-человека, предусматривающий введение индивидууму комбинированной терапии, которая содержит:

(i) антагонист белка запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1),

(ii) ленватиниб, имеющий структуру:

или его фармацевтически приемлемую соль и

(iii) (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-с][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамид (Е7386), имеющий структуру:

или его фармацевтически приемлемую соль,

где антагонист PD-1 не представляет собой атезолизумаб.

[2]. Способ по п. [1], где раком является солидная опухоль.

[3]. Способ по п. [1], где рак выбран из группы, состоящей из почечноклеточного рака (RCC), колоректального рака (CRC), гепатоцеллюлярной карциномы (НСС), меланомы, рака мочевого пузыря, рака молочной железы и не мелкоклеточного рака легкого (NSCLC).

[4]. Способ по п. [1], где раком является RCC.

[5]. Способ по любому из пп. [1]-[4], где антагонист PD-1 представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

[6]. Способ по любому из пп. [1]-[5], где антагонист PD-1 представляет собой анти-PD-1 антитело.

[7]. Способ по любому из пп. [1]-[6], где антагонист PD-1 представляет собой пембролизумаб или ниволумаб.

[8]. Способ по любому из пп. [1]-[7], где антагонист PD-1 представляет собой пембролизумаб.

[9]. Способ по любому из пп. [1]-[8], где ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль вводят ежедневно, а пембролизумаб вводят один раз каждые три недели.

[10]. Способ по п. [9], где ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль вводят при дневной дозе 24 мг, 20 мг, 18 мг, 12 мг и 8 мг, а пембролизумаб вводят при дозе 200 мг для взрослых или 2 мг/кг (до 200 мг) для детей, один раз каждые три недели.

[11]. Способ по любому из пп. [1]-[10], где ленватиниб или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой ленватиниб мезилат, и Е7386 или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой Е7386.

[12]. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-с][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамид (Е7386) или его фармацевтически приемлемую соль, где Е7386 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в комбинации с (а) ленватинибом или его фармацевтически приемлемой солью и (b) анти-PD-1 антителом.

[13]. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая анти-PD-1 антитело, где анти-PD-1 антитело вводят в комбинации с (а) ленватинибом или его фармацевтически приемлемой солью и (b) (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-с][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамидом (Е7386) или его фармацевтически приемлемой солью.

[14]. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль, где ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль вводят в комбинации с (а) (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-с][1,2,4]триазин-1(6R)-карбоксамидом (Е7386) или его фармацевтически приемлемой солью и (b) анти-PD-1 антителом.

[15]. Фармацевтическая композиция по любому из пп. [12]-[14], где ленватиниб или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой ленватиниб мезилат, и Е7386 или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой Е7386.

[16]. Фармацевтическая композиция по любому из пп. [12]-[15], где раком является солидная опухоль.

[17]. Фармацевтическая композиция по любому из пп. [12]-[15], где рак выбран из группы, состоящей из почечноклеточного рака (RCC), колоректального рака (CRC), гепатоцеллюлярной карциномы (НСС), меланомы, рака мочевого пузыря, уротелиального рака, рака молочной железы, не мелко клеточного рака легкого (NSCLC), рака эндометрия и плоскоклеточного рака головы и шеи.

[18]. Фармацевтическая композиция по п. [17], где раком является RCC.

[19]. Фармацевтическая композиция по любому из пп. [12]-[18], где антагонист PD-1 представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

[20]. Фармацевтическая композиция по любому из пп. [12]-[18], где антагонист PD-1 представляет собой анти-PD-1 антитело.

[21]. Фармацевтическая композиция по любому из пп. [12]-[20], где антагонист PD-1 представляет собой пембролизумаб или ниволумаб.

[22]. Фармацевтическая композиция по любому из пп. [12]-[21], где антагонист PD-1 представляет собой пембролизумаб.

[23]. Фармацевтическая композиция по любому из пп. [12]-[22], где ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль вводят ежедневно, и антагонист PD-1 представляет собой пембролизумаб и его вводят один раз каждые три недели.

[24]. Фармацевтическая композиция по п. [23], где ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль вводят при дневной дозе 24 мг, 20 мг, 18 мг, 12 мг или 8 мг, а пембролизумаб вводят при дозе 200 мг для взрослых или 2 мг/кг (до 200 мг) для детей один раз каждые три недели.

[25]. Фармацевтическая композиция по любому из пп. [12]-[24], где ленватиниб или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой ленватиниб мезилат, и Е7386 или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой Е7386.

[26]. Применение фармацевтической композиции по любому из пп. [12]-[25] для получения лекарственного средства для лечения рака.

[27]. Фармацевтическая композиция по любому из пп. [12]-[25] для применения для лечения рака.

Общие способы. Стандартные способы молекулярной биологии описаны в Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982 & 1989 2^nd Edition, 2001 3^rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3^rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Wu (1993) Recombinant DNA, Vol.217, Academic Press, San Diego, CA). Стандартные способы также раскрыты в Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, где раскрыто клонирование в бактериальных клетках и мутагенез ДНК (том 1), клонирование в клетках млекопитающих и дрожжах (том 2), гликоконъюгаты и экспрессия белка (том 3) и биоинформатика (том 4).

Описаны способы очистки белка, включая иммунопреципитацию, хроматографию, электрофорез, центрифугирование и кристаллизацию (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol.1, John Wiley and Sons, Inc., New York). Описаны химический анализ, химическая модификация, посттрансляционная модификация, получение слитых белков, гликозилирование белков (см., например, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol.2, John Wiley and Sons, Inc., New York, Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol.3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp.16.0.5-16.22.17, Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO, pp.45-89, Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp.384-391). Описаны продукция, очистка и фрагментация поликлональных и моноклональных антител (Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol.1, John Wiley and Sons, Inc., New York, Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Harlow and Lane, выше). Доступны стандартные методики для характеристики взаимодействий лиганд/рецептор (см., например, Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol.4, John Wiley, Inc., New York).

Могут быть получены моноклональные, поликлональные и гуманизированные антитела (см., например, Sheperd and Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY, Kontermann and Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York, Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp.139-243, Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205, He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029, Tang et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378, Baca et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684, Chothia et al. (1989)Nature 342:877-883, Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499, патент США №6329511).

Альтернативой гуманизации антител является использование библиотек человеческих антител, отображаемых на фагах, или библиотек человеческих антител у трансгенных мышей (Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14: 309-314, Barbas (1995) Nature Medicine 1: 837-839, Mendez et al. (1991) Nature Genetics 15: 146-156, Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21: 371-377, Barbas et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Kay et al. (1996) Phage Display ofPeptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA, de Bruin et al. (1999) Nature Biotechnol. 17: 397-399).

Для получения антител не требуется очистка антигена. Животных можно иммунизировать клетками, несущими представляющий интерес антиген. Затем спленоциты могут быть выделены из иммунизированных животных, и спленоциты могут быть слиты с клеточной линией миеломы с получением гибридомы (см., например, Meyaard et al. (1997) Immunity 7: 283-290, Wright et al. (2000) Immunity 13: 233-242, Preston et al., выше, Kaithamana et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164).

Антитела могут быть конъюгированы, например, с небольшими молекулами лекарственного средства, ферментами, липосомами, полиэтиленгликолем (ПЭГ). Антитела применимы для терапевтических, диагностических целей, набора или других целей и включают антитела, связанные, например, с красителями, радиоизотопами, ферментами или металлами, например, коллоидным золотом (см., например, Le Doussal et al. (1991) J. Immunol 146: 169-175, Gibellini et al (1998) J. Immunol 160:3891-3898, Hsing and Bishop (1999) J. Immunol. 162: 2804-2811, Everts et al. (2002) J. Immunol. 168: 883-889).

Способы проточной цитометрии, включая сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS), доступны (см., например, Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ, Givan (2001) Flow Cytometry, 2^nd ed., Wiley-Liss, Hoboken, NJ, Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Флуоресцентные реагенты, подходящие для модификации нуклеиновых кислот, включая праймеры и зонды нуклеиновых кислот, полипептиды и антитела, для использования, например, в качестве диагностических реагентов, доступны (Molecular Probesy (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).

Описаны стандартные способы гистологии иммунной системы (см., например, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY, Hiatt, etal. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA, Louis, etal. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY).

Доступны программные обеспечения и базы данных для определения, например, антигенных фрагментов, лидерных последовательностей, укладки белков, функциональных доменов, сайтов гликозилирования и выравнивания последовательностей (см., например, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, hie, Bethesda, MD), GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA), DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada), Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742, Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16: 741-742, Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68: 177-181, von Heijne (1983)Eur.J.Biochem. 133: 17-21, von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4683-4690).

В таблице 3 представлено краткое описание последовательностей в перечне последовательностей.

Примеры

Пример 1. Противоопухолевый эффект тройной комбинации Е7386, ленватиниба и анти-PD-1 антитела

Минимальную питательную среду Игла (Е-МЕМ), содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллин/стрептомицин (по 100 единиц/мл каждого), использовали для культивирования мышиной клеточной линии почечноклеточного рака RAG (номер АТСС: CCL-142). Логарифмически растущие клетки собирали из колб с использованием трипсина-ЭДТА. Суспензию клеток центрифугировали для удаления супернатанта. Затем использовали сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) для получения клеточной суспензии с концентрацией 2,5×10⁷ клеток/мл. Суспензию клеток трансплантировали подкожно при дозе 0,1 мл на правую боковую сторону тела каждой из 7-ми недельных мышей (BALB/cAnNCrlCrlj, самки, Charles River Laboratories Japan Inc.). Через восемь (8) дней после трансплантации использовали электронный цифровой штангенциркуль (Digimatic (ТМ) Caliper; Mitutoyo Corporation) для измерения короткого и длинного диаметров представляющей интерес опухоли. Следующие уравнения использовали для расчета объема опухоли TV и RTV.

Уравнение 1: Объем опухоли TV (мм³)=Длинный диаметр (мм) × Короткий диаметр (мм) × Короткий диаметр (мм) / 2.

Уравнение 2: Относительный объем опухоли RTV=TV в день n / TV в день 1.

На основании объемов опухолей в первый день введения производили распределение по группам таким образом, чтобы средние значения объемов опухолей были практически одинаковыми. Раствор ленватиниба с концентрацией 1 мг/мл готовили с использованием 3 мМ HCl и вводили перорально при дозе 0,2 мл/20 г массы тела мыши один раз в день в течение 28 дней. Внутрибрюшинно вводили 0,2 мл образца для введения, содержащего 1,0 мг/мл анти-мышиный PD-1 антитела (клон: RMP1-14, BioXCell, номер по каталогу: ВЕ0146), разведенного PBS (при дозе 200 мкг/мышь) два раза в неделю, всего 8 раз (день 1, день 4, день 8, день 11, день 15, день 18, день 22 и день 25, причем день распределения по группам установлен на день 1). Раствор Е7386 с концентрацией 2,5 мг/мл получали с использованием 0,1 М HCl и вводили перорально при дозе 0,2 мл/20 г массы тела мыши один раз в день в течение 28 дней. Контрольной группе ничего не вводили. Каждую группу, состоящую из 8 мышей, использовали для проведения эксперимента. Два раза в неделю (день 1, день 4, день 8, день 11, день 15, день 18, день 22, день 25 и день 29) определяли соответствующие объемы опухоли (TV) для контрольной группы, группы введения ленватиниба, группы введения анти-мышиный PD-1 антитела, группы введения ленватиниба + анти-мышиный PD-1 антитела, группы введения Е7386 + ленватиниба и группы тройной комбинации. Значения, полученные путем логарифмического преобразования объемов опухоли, использовали для проведения статистического анализа путем повторного измеренного множественного сравнения Даннета. Е7386 представляет собой (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-с][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамид.

На модели подкожной (s.c.) трансплантации RAG тройная комбинация Е7386, ленватиниба и анти-мышиный PD-1 антитела продемонстрировала значительно более высокий противоопухолевый эффект, чем любая из двух комбинаций (например, комбинация ленватиниб + анти-PD-1 антитело или комбинация ленватиниб + Е7386) или каждое средство при введении отдельно в виде монотерапии. Например, на 29-й день группа тройной комбинации имела более чем в 200 раз меньший объем опухоли по сравнению с контрольной группой и группой Е7386. Тройная комбинация имела более чем в 30 раз меньший и в 120 раз меньший объем опухоли по сравнению с группой ленватиниба и группой анти-PD-1 антитела, соответственно. Кроме того, в группе тройной комбинации объем опухоли был более чем в 9 раз меньше и в 17 раз меньше по сравнению с группой комбинации ленватиниб + анти-PD-1-антитело и группой комбинации Е7386 + ленватиниб, соответственно.

Что касается показателя полного ответа, то показатель, наблюдаемый в группе тройной комбинации (ленватиниб, пембролизумаб и Е7386), был выше, чем в других группах лечения (показатель полного ответа: 0, 0, 2, 1,4, 1 и 7 из 8 мышей в контрольной группе, группе ленватиниба, группе анти-PD-1-антитела, группе Е7386, группе ленватиниб + анти-PD-1-антитело, группе Е7386 + ленватиниб и группе тройной комбинации, соответственно).

Ежедневное изменение объема опухоли показано в таблице 4. Кроме того, изменение объема опухоли во времени во время введения и относительный объем опухоли на 29-й день для каждой группы показаны на фиг. 8 и фиг. 9, соответственно.

Пример 2. Противоопухолевый эффект тройной комбинации Е7386, ленватиниба и анти-PD-1 антитела

Для культивирования мышиных клеточных линий использовали различные культуральные среды (см. фиг. 10А-10С, столбец А). Логарифмически растущие клетки собирали из колб с использованием трипсина-ЭДТА. Суспензию клеток центрифугировали для удаления супернатанта. Затем использовали сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) для приготовления клеточной суспензии с определенной концентрацией клеток (см. фиг. 10А-10С, столбец В). Суспензию клеток трансплантировали подкожно при дозе 0,1 мл на правую боковую сторону тела каждой из 7-ми недельных иммунокомпетентных мышей (см. Фиг. 10А-10С, колонка С).

Через несколько дней после трансплантации (см. фиг. 10А-10С, столбец D) электронный цифровой штангенциркуль (Digimatic (ТМ) Caliper; Mitutoyo Corporation) использовали для измерения короткого и длинного диаметров опухоли у животного. Следующие уравнения были использованы для расчета объема опухоли TV и RTV.

Уравнение 1: Объем опухоли TV (мм³) = Длинный диаметр (мм) × Короткий диаметр (мм) × Короткий диаметр (мм)/2.

Уравнение. 2: Относительный объем опухоли RTV=TV в день n / TV в день 1.

На основании объемов опухолей в первый день введения производили распределение по группам таким образом, чтобы средние значения объемов опухолей были практически одинаковыми. Раствор ленватиниба с концентрацией 1 мг/мл готовили с использованием 3 мМ HCl и вводили перорально при дозе 0,2 мл/20 г массы тела мыши один раз в день в течение 28 дней. Внутрибрюшинно вводили 0,2 мл образца для введения, содержащего 1,0 мг/мл анти-мышиный PD-1 антитела (клон: RMP1-14, BioXCell, номер по каталогу: ВЕ0146), разведенного PBS (в дозе 200 мкг/мышь) два раза в неделю в течение 3 или 4 недель (см. фиг. 10А-10С, столбец Е). Раствор Е7386 с концентрацией 2,5 мг/мл готовили с использованием 0,1 М HCl и вводили перорально при дозе 0,2 мл/20 г массы тела мыши один раз в день в течение 3 или 4 недель (см. фиг. 10А-10С, столбец Е). Контрольной группе ничего не вводили. Каждую группу, состоящую из 8 мышей, использовали для проведения эксперимента. Дважды в неделю в течение 3 или 4 недель (см. фиг. 10А-10С, столбец Е) определяли соответствующие объемы опухоли (TV) для контрольной группы, группы введения ленватиниба, группы введения анти-мышиный PD-1 антитела, группа введения ленватиниб + анти-мышиный PD-1 антитело, группа введения Е7386 + ленватиниб и группа тройной комбинированной терапии. Значения, полученные путем логарифмического преобразования объемов опухоли, использовали для проведения статистического анализа путем повторного измеренного множественного сравнения Даннета. Е7386 представляет собой (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-с][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамид.

Как показано на фиг. 11 и фиг. 12А-12G, тройная комбинированная терапия из Е7386, ленватиниба и анти-мышиный PD-1 антитела продемонстрировала более высокий противоопухолевый эффект, чем любая из двух комбинаций (т.е. комбинация ленватиниб + анти-PD-1 антитело или комбинация ленватиниб + Е7386) или каждое средство при введении отдельно в качестве монотерапии.

Относительный объем опухоли (RTV) в момент времени t рассчитывали по следующей формуле:

Уравнение 3: RTV=TV_t/TV_{начальный} × 100%.

Определяли наилучший средний ответ (BestAvgResponse) как минимальное значение среднего (RTV-100%) для t≥8 дней (EQ. 4). Этот показатель отражает сочетание скорости, силы и устойчивости ответа в одном значении. Критерии ответа (mRECIST) адаптировали из критериев RECIST и определяли следующим образом (применяются в указанном порядке): mCR, BestAvgResponse <-95%, mPR, BestAvgResponse <-50%, mSD, BestAvgResponse <30%, mPD, без иной классификации.

Ссылочные источники

1. Sharpe, А.Н, Wherry, E.J., Ahmed R., and Freeman G.J. The function of programmed cell death 1 and its ligands in regulating autoimmunity and infection. Nature Immunology (2007); 8:239-245.

2. Dong H et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat Med. 2002 Aug; 8(8):793-800.

3. Yang et al. PD-1 interaction contributes to the functional suppression of T-cell responses to human uveal melanoma cells in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008 Jun; 49(6 (2008): 49: 2518-2525.

4. Ghebeh et al. The B7-H1 (PD-L1) T lymphocyte-inhibitory molecule is expressed in breast cancer patients with infiltrating ductal carcinoma: correlation with important high-risk prognostic factors. Neoplasia (2006) 8: 190-198.

5. Hamanishi J et al. Programmed cell death 1 ligand 1 and tumor-infiltrating CD8+T lymphocytes are prognostic factors of human ovarian cancer. Proceeding of the National Academy of Sciences (2007): 104: 3360-3365.

6. Thompson RH et al. Significance of B7-H1 overexpression in kidney cancer. Clinical genitourin Cancer (2006): 5: 206-211.

7. Nomi, T. Sho, M., Akahori, Т., et al. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death- 1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clinical Cancer Research (2007); 13:2151-2157.

8. Ohigashi Y et al. Clinical significance of programmed death-1 ligand-1 and programmed death-1 ligand 2 expression in human esophageal cancer. Clin. Cancer Research (2005): 11: 2947-2953.

9. Inman et al. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer (2007): 109: 1499-1505.

10. Shimauchi T et al. Augmented expression of programmed death-1 in both neoplasmatic and nonneoplastic CD4+T-cells in adult T-cell Leukemia/ Lymphoma. Int. J. Cancer (2007): 121:2585-2590.

11. Gao et al. Overexpression of PD-L1 significantly associates with tumor aggressiveness and postoperative recurrence in human hepatocellular carcinoma. Clinical Cancer Research (2009) 15: 971-979.

12. Nakanishi J. Overexpression of B7-H1 (PD-L1) significantly associates with tumor grade and postoperative prognosis in human urothelial cancers. Cancer Immunol Immunother. (2007)56: 1173-1182.

13. Hino et al. Tumor cell expression of programmed cell death-1 is a prognostic factor for malignant melanoma. Cancer (2010): 00: 1-9.

14. Ghebeh H. Foxp3+tregs and B7-H1+/PD-1+T lymphocytes co-infiltrate the tumor tissues of high-risk breast cancer patients: implication for immunotherapy. BMC Cancer. 2008 Feb 23; 8: 57.

15. Ahmadzadeh M et al. Tumor antigen-specific CD8 T cells infiltrating the tumor express high levels of PD-1 and are functionally impaired. Blood (2009) 114: 1537-1544.

16. Thompson RH et al. PD-1 is expressed by tumor infiltrating cells and is associated with poor outcome for patients with renal carcinoma. Clinical Cancer Research (2007) 15: 1757-1761.

17. Публикация патентной заявки США №. 2018-0185395.

18. Канадская заявка №3044658.

19. Патент США 9174998.

20. Патент США 10259817.

21. Keiichi Tamai, et al., "Suppressive expression of CD274 increases tumorigenesis and cancer stem cell phenotypes in cholangiocarcinoma," Cancer Sci. 105(6): 667-674, 2014.

Anthony B. El-Khoueiry, et al., "A phase I first-in-human study of PRI-724 in patients (pts) with advanced solid tumors," J. Clin. Oncol. 31(15_supple(May 20,2013)): abstr 2501.

22. Renée van Amerongen, et al., "Break the loop, escape the cycle?" The EMBO Journal 2013, 32: 1977-1989.

Все ссылочные источники, цитируемые в настоящем документе, включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, запись в базе данных (например, последовательности Genbank или записи GeneID), патентная заявка или патент были специально и отдельно указаны для включения посредством ссылки. Это заявление о включении посредством ссылки предназначено заявителями в соответствии с 37 C.F.R. §1.57(b)(1) для связи с каждой отдельной публикацией, записью в базе данных (например, последовательностями Genbank или записями GeneID), заявкой на патент или патентом, каждое из которых четко обозначено в соответствии с 37 C.F.R. §1.57(b)(2), даже если такое цитирование не находится непосредственно рядом со специальным заявлением о включении посредством ссылки. Включение специальных заявлений о включении посредством ссылки, если таковые имеются, в описание никоим образом не ослабляет это общее заявление о включении посредством ссылки. Цитирование ссылок в настоящем документе не означает признание того, что ссылка относится к известному уровню техники, а также не является признанием содержания или даты этих публикаций или документов.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> МСД Интернатионал ГмбХ

Мерк Шарп энд Доум Корп.

ЭЙСАЙ Р энд Д Менеджмент Ко., Лтд.

<120> КОМБИНАЦИЯ АНТАГОНИСТА PD-1,

ИНГИБИТОРА ТИРОЗИНКИНАЗЫ VEGFR/FGFR/RET

И ИНГИБИТОРА CBP/БЕТА-КАТЕНИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА

<130> 213597-0005-00-WO

<150> US 62/927334

<151> 2019-10-29

<150> US 62/927576

<151> 2019-10-29

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR легкой цепи антитела

<400> 1

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Phe Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR легкой цепи антитела

<400> 2

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR легкой цепи антитела

<400> 3

Gln His Ser Trp Glu Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR тяжелой цепи антитела

<400> 4

Ser Tyr Tyr Leu Tyr

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR тяжелой цепи антитела

<400> 5

Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Ser Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR тяжелой цепи антитела

<400> 6

Arg Asp Ser Asn Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR легкой цепи антитела

<400> 7

Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR легкой цепи антитела

<400> 8

Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR легкой цепи антитела

<400> 9

Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR тяжелой цепи антитела

<400> 10

Asn Tyr Tyr Met Tyr

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR тяжелой цепи антитела

<400> 11

Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR тяжелой цепи антитела

<400> 12

Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 447

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь гуманизированного антитела

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 15

<211> 111

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепь гуманизированного антитела

<400> 15

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 16

<211> 111

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепь гуманизированного антитела

<400> 16

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 111

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепь гуманизированного антитела

<400> 17

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 18

<211> 218

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь гуманизированного антитела

<400> 18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 19

<211> 218

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь гуманизированного антитела

<400> 19

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 20

<211> 218

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь гуманизированного антитела

<400> 20

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 21

<211> 447

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь гуманизированного антитела

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 22

<211> 218

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь гуманизированного антитела

<400> 22

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 23

<211> 440

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys

180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

245 250 255

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

305 310 315 320

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 24

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 25

<211> 290

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> mat_пептид

<222> (19)..(290)

<400> 25

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

-15 -10 -5

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

-1 1 5 10

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

15 20 25 30

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

35 40 45

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

50 55 60

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

65 70 75

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

80 85 90

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

95 100 105 110

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

115 120 125

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

130 135 140

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

145 150 155

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

160 165 170

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

175 180 185 190

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

195 200 205

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

210 215 220

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr

225 230 235

Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys

240 245 250

Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu

255 260 265 270

Glu Thr

<---

Группа изобретений относится к онкологии, в частности к комбинированной терапии рака, экспрессирующего PD-L1, у индивидуума. Способ лечения рака предусматривает введение индивидууму антагониста PD-1, представляющего собой пембролизумаб, ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли и Е7386 или его фармацевтически приемлемой соли. Рак выбран из группы, состоящей из почечноклеточного рака (RCC), колоректального рака (CRC), гепатоцеллюлярной карциномы (HCC), меланомы, рака мочевого пузыря, уротелиального рака, рака молочной железы, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), рака эндометрия и плоскоклеточного рака головы и шеи. Тройная комбинированная терапия из Е7386, ленватиниба и анти-PD-1 антитела демонстрирует более высокий противоопухолевый эффект, чем любая из двух комбинаций: ленватиниб + анти-PD-1 антитело или ленватиниб + Е7386, или каждое средство при введении отдельно в качестве монотерапии. 5 н. и 17 з.п. ф-лы, 12 ил., 4 табл., 2 пр.

1. Способ лечения рака, экспрессирующего PD-L1, у субъекта-человека, предусматривающий введение индивидууму комбинированной терапии, которая содержит:

(i) антагонист белка запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1), который представляет собой анти-PD-1 антитело пембролизумаб,

(ii) ленватиниб, имеющий структуру:

,

или его фармацевтически приемлемую соль; и

(iii) (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-c][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамид (E7386), имеющий структуру:

,

или его фармацевтически приемлемую соль,

причем рак выбран из группы, состоящей из: почечноклеточного рака (RCC), колоректального рака (CRC), гепатоцеллюлярной карциномы (HCC), меланомы, рака мочевого пузыря, уротелиального рака, рака молочной железы, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), рака эндометрия и плоскоклеточного рака головы и шеи.

2. Способ по п. 1, где раком является RCC.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, где ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль вводят ежедневно, а пембролизумаб вводят один раз каждые три недели.

4. Способ по п. 3, где ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль вводят при дневной дозе 24 мг, 20 мг, 18 мг, 12 мг или 8 мг, а пембролизумаб вводят при дозе 200 мг для субъекта-взрослого или 2 мг/кг, но не превышая дозы 200 мг, для субъекта-ребенка один раз каждые три недели.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где ленватиниб или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой ленватиниб мезилат, и E7386 или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой E7386.

6. Применение фармацевтической композиции, содержащей (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-c][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамид (E7386) или его фармацевтически приемлемую соль, для лечения рака, экспрессирующего PD-L1, где E7386 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в комбинации с (a) ленватинибом или его фармацевтически приемлемой солью и (b) анти-PD-1 антителом, которое является пембролизумабом, причем рак выбран из группы, состоящей из: почечноклеточного рака (RCC), колоректального рака (CRC), гепатоцеллюлярной карциномы (HCC), меланомы, рака мочевого пузыря, уротелиального рака, рака молочной железы, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), рака эндометрия и плоскоклеточного рака головы и шеи.

7. Применение фармацевтической композиции, содержащей анти-PD-1 антитело, для лечения рака, экспрессирующего PD-L1, где анти-PD-1 антитело, которое является пембролизумабом, вводят в комбинации с (a) ленватинибом или его фармацевтически приемлемой солью и (b) (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-c][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамидом (E7386) или его фармацевтически приемлемой солью, причем рак выбран из группы, состоящей из: почечноклеточного рака (RCC), колоректального рака (CRC), гепатоцеллюлярной карциномы (HCC), меланомы, рака мочевого пузыря, уротелиального рака, рака молочной железы, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), рака эндометрия и плоскоклеточного рака головы и шеи.

8. Применение фармацевтической композиции, содержащей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль, для лечения рака, экспрессирующего PD-L1, где ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль вводят в комбинации с (a) (6S,9aS)-N-бензил-8-({6-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]пиридин-2-ил}метил)-6-(2-фтор-4-гидроксибензил)-4,7-диоксо-2-(проп-2-ен-1-ил)гексагидро-2H-пиразино[2,1-c][1,2,4]триазин-1(6H)-карбоксамидом (E7386) или его фармацевтически приемлемой солью и (b) анти-PD-1 антителом, которое является пембролизумабом, причем рак выбран из группы, состоящей из: почечноклеточного рака (RCC), колоректального рака (CRC), гепатоцеллюлярной карциномы (HCC), меланомы, рака мочевого пузыря, уротелиального рака, рака молочной железы, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), рака эндометрия и плоскоклеточного рака головы и шеи.

9. Применение по любому из пп. 6-8, где ленватиниб или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой ленватиниб мезилат, и E7386 или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой E7386.

10. Применение по любому из пп. 6-9, где раком является солидная опухоль.

11. Применение по пп. 6-9, где раком является RCC.

12. Применение по п. 11, где раком является запущенный RCC.

13. Применение по п. 11, где раком является метастатический RCC.

14. Применение по любому из пп. 6-13, где индивидуум ранее не получал лечение против метастатического RCC.

15. Применение по любому из пп. 6-13, где ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль вводят ежедневно, и пембролизумаб вводят один раз каждые три недели.

16. Применение по п. 15, где ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль вводят при дневной дозе 24 мг, 20 мг, 18 мг, 12 мг или 8 мг, а пембролизумаб вводят при дозе 200 мг для субъекта-взрослого или 2 мг/кг, но не превышая дозы 200 мг, для субъекта-ребенка один раз каждые три недели.

17. Применение по любому из пп. 6-16, где ленватиниб или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой ленватиниб мезилат, и E7386 или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой E7386.

18. Применение фармацевтической композиции по любому из пп. 6-17, для получения лекарственного средства для лечения рака.

19. Способ или применение по любому из пп. 1-18, где фармацевтически приемлемой солью ленватиниба является ленватиниб мезилат.

20. Способ или применение по любому из пп. 1-14, где рак представляет собой рак эндометрия.

21. Способ или применение по п. 20, где рак представляет собой запущенный рак эндометрия.

22. Способ или применение по п. 20 или 21, где индивидуум не достиг устойчивого ответа после предшествующей терапии химиотерапевтическим средством.