ИММУНОГЕН ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ СЕМЕЙНОЙ ЛОБНО-ВИСОЧНОЙ ДЕМЕНЦИИ (ЛВД) И/ИЛИ БОКОВОГО АМИОТРОФИЧЕСКОГО СКЛЕРОЗА (БАС) Российский патент 2025 года по МПК C07K7/00 A61K39/00 A61P25/28 

Область техники

Настоящее изобретение относится к иммуногену для применения в предотвращении или лечении семейной лобно-височной деменции, ЛВД (FTD) и/или бокового амиотрофического склероза, БАС (ALS), включающему полипептид или состоящему из полипептида, состоящего из дипептидных повторов, а также к иммуногенной композиции, включающей иммуноген, и его применению. Кроме того, раскрыты набор, включающий иммуноген, и способ лечения.

Уровень техники

Нейродегенеративные расстройства обычно классифицируют по характерным белковым отложениям. Кроме того, при ряде нейродегенеративных заболеваний редкие генетические мутации, вызывающие наследственные варианты заболевания, были ассоциированы с генами, кодирующими агрегирующие/откладывающиеся белки, их предшественники или модулирующие их ферменты. Лобно-височная лобарная деменция, ЛВД (FTD) и боковой амиотрофический склероз, БАС (ALS) являются крайними точками спектра пересекающихся нейродегенеративных расстройств, которые в различной степени ассоциированы с деменцией, изменениями личности, языковыми нарушениями и прогрессирующей мышечной слабостью (Josephs et al., 2011; Mackenzie et al., 2010; Rademakers et al., 2012). Исследования БАС и ЛВД резко ускорились после идентификации РНК/ДНК-связывающего белка TDP-43 (Tar ДНК-связывающий белок размером 43 кДа) как распространенного белка отложений (Arai et al., 2011; Neumann et al., 2006) и открытия того, что мутации в TARDBP вызывают семейные варианты обоих заболеваний (Benajiba et al., 2009; Sreedharan et al., 2008). В большинстве случаев БАС и ЛВД наблюдаются цитоплазматические включения, выраженно положительные по фосфорилированному TDP-43, хотя в норме TDP-43 локализуется в основном в ядре. Эти данные также помогли разработать концепцию, согласно которой БАС (ALS) и ЛВД (FTD) являются мультисистемными расстройствами с перекрывающимися клиническими и патологическими характеристиками и сходными функциональными и генетическими причинами (Rademakers et al., 2012; Sieben et al., 2012), которые поэтому классифицируются как FTD-TDP, FRD/ALS-TDP или ALS-TDP. Помимо TDP-43 и давно известного гена SOD1 (супероксиддисмутаза 1), был открыт ряд других генов/факторов риска, связанных с БАС и/или ЛВД, включая FUS («Fused in Sarcoma»), OPTN (оптиневрин), атаксин-2, Chmp2B, VCP (валозин-содержащий белок), TMEM106B, GRN (програнулин), PFN (профилин) и ген C9orf72. Патологические экспансии повторов в C9orf72 были обнаружены примерно у 40% пациентов с семейным БАС и у 20% пациентов с семейной ЛВД. Несмотря на значительную гетерогенность в разных популяциях, экспансия гексануклеотидного повтора GGGGCC в 5'-направлении от кодирующей области C9orf72 является наиболее распространенной известной причиной семейной лобно-височной деменции, ЛВД и бокового амиотрофического склероза, БАС (DeJesus-Hernandez et al. 2011, Renton et al. 2011).

В настоящее время не существует болезнь-модифицирующей терапии для пациентов с C9orf72 или другими формами ЛВД, БАС или комбинированного БАС-ЛВД. Ниже авторы изобретения будем ссылаться на пациентов, несущих мутацию C9orf72 и страдающих БАС, ЛВД или комбинированным БАС и ЛВД, «C9orf72 БАС/ЛВД» (термин «БАС-ЛВД» используется взаимозаменяемо). Согласно современным знаниям, токсичность, связанная с приобретением функции, транскриптов РНК со смысловыми и антисмысловыми повторами и/или нестандартная трансляция обоих транскриптов во всех рамках считывания в пять агрегирующих белков с дипептидными повторами (DPR) (поли-GA/-GP/-GR/-PA и -PR) (Mori, Arzberger et al. 2013, Mori, Weng et al. 2013) являются основными факторами патогенеза. DPR-белки коагрегируют в многочисленные цитоплазматические включения в нейронах. Поли-GA является наиболее распространенным видом DPR и образует амилоидоподобные скрученные ленты, которые, вероятно, являются ядром для коагрегации других DPR-белков, все из которых по отдельности значительно более растворимы (May et al. 2014, Guo et al. 2018). Хотя патогенез заболевания определяют, вероятно, синергетические эффекты, удаления одного компонента может быть достаточно, чтобы остановить или, по крайней мере, задержать прогрессирование заболевания.

Предотвращение экспрессии и трансляции РНК с повторами (GGGGCC)_n путем интратекального введения антисмысловых олигонуклеотидов улучшает поведенческие фенотипы у мышей. (2016). Neuron 90(3): 535-550.). Хотя антисмысловые олигонуклеотиды могут специфически ингибировать синтез новых DPR, они не влияют на уже существующие DPR-белки, которые начинают накапливаться за много лет до начала заболевания (Vatsavayai, S. C., et al. (2016), Brain 139(Pt 12): 3202-3216.). Авторы настоящего изобретения предполагают, что удаление DPR-белков и особенно поли-GA с помощью иммунотерапии является полезным при C9orf72 БАС/ЛВД, поскольку DPR более токсичны, чем сама РНК с повторами, а очищающие антитела могут потенциально выводить уже существующие агрегаты.

Включения поли-GA и других DPR-белков были описаны авторами изобретения и другими специалистами именно для случаев C9orf72 БАС/ЛВД. Включения DPR предшествуют началу заболевания и могут вносить вклад в длительную продромальную стадию с широко распространенной вялотекущей атрофией мозга у пациентов с C9orf72. (Rohrer et al. 2015, Vatsavayai et al. 2016). Данные текущих исследований предполагают, что синергетическое воздействие различных C9orf72-специфических патологических механизмов в конечном итоге запускает заболевание каскадным образом (Edbauer and Haass 2016). Хотя включения поли-GA пространственно не коррелируют с нейродегенерацией или патологией TDP-43 у пациентов с C9orf72, более высокие уровни поли-GA в мозжечке ассоциированы с FTD (Schludi et al. 2015). При индивидуальной экспрессии поли-GA образует скрученные ленты и секвестрирует большие количества протеасом, которые останавливаются в редком в иных случаях переходном состоянии. 2018). Среди различных кандидатных механизмов только индивидуальная экспрессия поли-GA приводит к умеренной патологии TDP-43 in vitro (Khosravi et al. 2016, Nonaka et al. 2018) и в двух моделях на мышах (Zhang et al. 2016, Schludi et al. 2017), что позволяет предположить, что это основной фактор нейродегенерации in vitro. Последние данные, полученные на модели патологии TDP-43 на приматах, предполагают, что каспазы грызунов менее эффективно расщепляют TDP-43 с образованием склонных к агрегации С-концевых фрагментов, что может объяснить отсутствие крупных агрегатов TDP-43 в моделях на мышах C9orf72 и экспериментах по экспрессии DPR в первичных нейронах грызунов (Yin et al., 2019).

В настоящее время разрабатывается несколько подходов к разработке специфической для C9orf72 терапии. (i) Антисмысловые олигонуклеотиды ингибируют экспрессию DPR-белков и являются благоприятными в моделях на трансгенных мышах C9orf72 BAC (Jiang et al. 2016, Gendron et al. 2017). Этот подход требует регулярного введения антисмысловых олигонуклеотидов пациентам на протяжении всей жизни. В настоящее время проводится клиническое исследование фазы 1 (NCT03626012). (ii) Нарушение образования G-квадруплексов в повторах РНК приводит к умеренному снижению экспрессии DPR-белка. 2014, Simone et al. 2018). (iii) Несколько групп сообщили о соединениях, которые препятствуют нестандартной трансляции РНК с повторами в отсутствие стартового кодона ATG, но соединения, описанные в публикациях, вероятно, слишком токсичны для применения у людей. В недавней патентной заявке раскрыты дополнительные более перспективные соединения, такие как метформин (WO2018/195110). (iv) Авторы настоящего изобретения показали, что антитела к поли-GA блокируют агрегацию и распространение поли-GA в клеточных моделях (Zhou et al. 2017), хотя возможность использования таких антител в моделях in vivo до сих пор не была продемонстрирована.

При нейродегенеративных заболеваниях лимитирующим скорость фактором является плохая доставка через гематоэнцефалический барьер. Хотя конструирование антител может увеличить доставку антител с ~0,05 до 0,5% (Yu et al. 2017; Sci Transl Med 6: 261ra154), уровни антител все равно должны быть высокими. Низкий уровень антител и выработка антител против лекарственных средств являются двумя факторами, которые, как известно, ограничивают долгосрочную эффективность при терапии антителами при раковых и воспалительных заболеваниях (Kverneland et al. 2018, Oncoimmunology 7: e1424674; Mazor et al. 2014, Aliment Pharmacol Ther 40: 620-628). Пассивная иммунизация обычно приводит к уровню 100-200 мкг/мл в сыворотке крови, который у людей резко снижается в течение нескольких недель (Landen et al. 2017; Alzheimers Dement (N Y) 3: 339-347; Sevigny et al. 2016, Nature 537: 50-56). Поддержание титра антител в течение длительного периода может быть достигнуто путем активной иммунизации, но это сопряжено с рисками для безопасности, например, нежелательные ответы Т-клеток на активную вакцинацию вызывают побочные эффекты, как это наблюдалось в подгруппе пациентов с БА, иммунизированных пептидами Aβ, которые вызвали тяжелый менингоэнцефалит. 3260-3269; Orgogozo et al. 2003, Neurology 61: 46-54; Schenk et al. 1999, Nature 400: 173-177). Это говорит о том, что необходим тщательный выбор иммуногена.

Осуществление изобретения

Согласно первому аспекту настоящее изобретение обеспечивает иммуноген для применения в предотвращении или лечении семейной лобно-височной деменции, ЛВД, бокового амиотрофического склероза, БАС и/или бокового амиотрофического склероза-лобно-височной деменции (БАС/ЛВД) у пациентов с экспансией повтора C9orf72, включающий полипептид или состоящий из полипептида, состоящего из дипептидных повторов с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из (Gly-Ala)_a, (Gly-Pro)_a, (Gly-Arg)_a, (Pro-Ala)_a и (Pro-Arg)_a,, где a является целым числом от 4 до 25, предпочтительно от 7 до 15, более предпочтительно от 8 до 12.

Согласно второму аспекту настоящее изобретение обеспечивает иммуногенную композицию, включающую или состоящую из: иммуногена первого аспекта настоящего изобретения, фармацевтически приемлемого носителя и/или подходящего(-их) вспомогательного вещества (веществ).

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение обеспечивает иммуногенную композицию согласно второму аспекту изобретения для применения в предотвращении или лечении ЛВД и/или БАС.

Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение обеспечивает набор, включающий иммуноген согласно первому аспекту изобретения или иммуногенную композицию согласно второму аспекту изобретения; и необязательно по меньшей мере один адъювант. Необязательно дополнительно включен контейнер и/или носитель информации, предпочтительно содержащий инструкции для одного или более аспектов настоящего изобретения, с первого по третий и пятого.

Согласно пятому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ лечения или профилактики ЛВД и/или БАС у субъекта, где способ включает введение иммуногена согласно первому аспекту настоящего изобретения или иммуногенной композиции согласно второму аспекту настоящего изобретения.

Согласно шестому аспекту настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую иммуноген в соответствии с первым аспектом изобретения.

Согласно седьмому аспекту настоящее изобретение обеспечивает вектор, включающий нуклеиновую кислоту согласно шестому аспекту изобретения, в котором вектор предпочтительно представляет собой вирусный вектор.

Согласно восьмому аспекту настоящее изобретение обеспечивает иммуноген, включающий

- полипептид, включающий дипептидные повторы или состоящий из дипептидных повторов с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из (Gly-Ala)_a, где a представляет собой целое число от 4 до 25, предпочтительно от 7 до 15, более предпочтительно от 8 до 12; и

- белок-носитель, предпочтительно столбнячный анатоксин (АС), HSP60, гемоцианин Concholepas concholepas (CCH), дифтерийный токсин CRM197, дифтерийный анатоксин (АД), комплекс белков наружной мембраны менингококка (OMPC), овальбумин (ОВА), гемоцианин фисуреллы (KLH) или бычий сывороточный альбумин (БСА),

или состоящий из из вышеперечисленного

где носитель нековалентно или ковалентно связан с полипептидом, предпочтительно посредством спейсера.

Список фигур

Ниже описано содержание чертежей, включенных в настоящее описание. В этом контексте см. также подробное описание изобретения выше и/или ниже.

На фиг. 1 A) представлены стратегия иммунизации и антительный ответ у мышей дикого типа (WT) и экспрессирующих (GA)₁₄₉-CFP трансгенных мышей (ТГ) в качестве модели C9orf72 БАС/ЛВД(Schludi et al. 2017). Указаны возраст мышей (в неделях) и точки иммунизации и взятия крови. Первая иммунизация была проведена в возрасте 8 недель, после чего было сделано пять бустерных инъекций до возраста 28 недель. Поскольку ожидается, что поли-GA будет слабо иммуногенным, мы использовали либо овальбумин в качестве иммуногенной молекулы-носителя (OVA-PEG-(GA)₁₀), которая также поддерживает растворимость (GA)₁₀, либо самоагрегирующий (GA)₁₅ без носителя в качестве иммуногена. Тримерный PEG-спейсер использовали на всех фигурах от 1 до 5. На B) представлено количество антител против GA, индуцированных иммунизацией мышей WT и ТГ (GA)₁₅, (OVA)-PEG-(GA)₁₀ или ФСБ (контроль), измеренное методом ИФА ELISA с использованием антигена GST-(GA)₁₅. Очищенный клон 1A12 антитела мыши к GA использовали в качестве референсного стандарта для абсолютного количественного определения. Значимое увеличение уровня антител против GA наблюдалось у мышей WT и ТГ, иммунизированных (OVA)-PEG-(GA)₁₀, но не свободным от носителя (GA)₁₅. Таким образом, поли-GA без иммуногенного носителя недостаточно для индукции гуморального иммунного ответа даже после многократной бустерной иммунизации. Количество мышей в группе указано в легенде к графику.

На фиг. 2 представлена дополнительная характеризация антисывороток от ТГ-мышей, иммунизированных OVA-PEG-(GA)₁₀, (GA)₁₅ или контролем - ФСБ в соответствии с протоколом на фиг. 1 (сыворотка с 29-й недели). На A) представлены иммуноблоты клеток HEK293, трансфицированных тремя экспрессирующими поли-GA конструкциями и контролем GFP. (GA)₁₄₉-myc и (GA)₁₇₅-GFP экспрессируют поли-GA с синтетического гена с использованием стартового кодона AUG (May et al., Acta Neuropathol 2014). (G₄C₂)₈₀ экспрессирует поли-GA с эндогенной повторяющейся последовательности с 113 нуклеотидами в 5’-направлении от интронной последовательности в отсутствие стартового кодона AUG путем трансляции RAN (Mori et al., EMBO Reports 2016). Сыворотка (разведенная 1:5000) от GA-CFP трансгенных мышей, иммунизированных OVA-PEG-(GA)₁₀, демонстрирует поли-GA специфичность, аналогичную моноклональному антителу 1A12 против GA (WO 2017/114660 A1). В качестве контроля нагрузки используют кальнексин (Enzo Life Sciences, ADI-SPA-860-F). B) Иммуногистохимия срезов от пациента C9orf72 и здорового контроля в молекулярном слое мозжечка. Моноклональные антитела против GA (1A12) и антисыворотка (разведенная 1:500) от вакцинированных OVA-PEG-(GA)₁₀ мышей детектируют цитоплазматические включения нейронов (некоторые отмечены стрелками). Антисыворотка (GA)₁₅ не детектировала специфических агрегатов у пациента C9orf72.

На фиг. 3 показано влияние иммунизации согласно фиг. 1 на двигательные нарушения в модели на трансгенных мышах, сверхэкспрессирующей (GA)₁₄₉-CFP (Schludi et al., 2017, Acta Neuropathol. 2017 Aug;134(2):241-254). Двигательную активность оценивали с помощью еженедельного анализа «ходьбы по балке», начиная с 9-недельного возраста до появления симптомов. Время, необходимое для преодоления жердочки длиной 58 см и толщиной 8 мм в анализе ходьбы по балке, из 4 попыток в течение 2 последовательных недель усредняли для построения графика на A). В случае падения мыши время записывали как 60 секунд. Только иммунизация OVA-PEG-(GA)₁₀ уменьшала двигательные нарушения у трансгенных мышей (ТГ). Мышам WT требовалось одинаковое время для преодоления жердочки независимо от лечения и возраста. ТГ-мышам, получавшим ФСБ, требовалось значительно больше времени для завершения ходьбы по балке, начиная с 15-й недели, что свидетельствует о двигательных нарушениях у этих мышей в соответствии с нашим предыдущим сообщением (Schludi et al., 2017, Acta Neuropathol. 2017 Aug;134(2):241-254). У ТГ-мышей, иммунизированных (OVA)-PEG-(GA)₁₀, наблюдалось первоначальное увеличение времени ходьбы по балке с пиком на 17-й неделе (возможно, из-за более низкого титра антител в этот период), после чего показатели улучшались почти до уровня контрольных мышей (значимо не отличались от группы WT-ФСБ). ТГ-мыши, иммунизированные (GA)₁₅, в целом были такими же, как и ТГ-мыши, обработанные ФСБ. Влияние иммунизации на двигательные нарушения (время ходьбы по балке) соответствовало степени нейровоспаления и количеству нерастворимых агрегатов поли-GA, измеренных в спинном мозге (сравните фиг. 4). Был проведен двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA, апостериорный тест Тьюки. Соответствующие сравнения ТГ-ФСБ с WT-ФСБ, ТГ-OVA-PEG(GA)₁₀ мышей с ТГ-ФСБ и WT-ФСБ приведены с * p<0,05, **, p<0,01, *** p<0,001, Н/З - незначимо. Количество мышей в группе указано в легенде к графику. B) Среднее количество падений на группу для всех попыток в совокупности. Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, апостериорный тест Тьюки **, p<0,01. Количество мышей согласно A).

На фиг. 4 представлено влияние вакцинации на агрегацию поли-GA и активацию микроглии у мышей, умерщвленных после анализа поведения, приведенного на фиг. 3. Посмертный анализ спинного мозга вакцинированных мышей GA-CFP и контрольных мышей. (A, B) Количественный анализ агрегатов поли-GA в спинном мозге с применением иммуногистохимии (анти-GFP ThermoFisher A11122). (C) Иммуноанализ поли-GA из нерастворимой фракции, как описано в источнике: Schludi et al., Acta Neuropathol 2017. Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, апостериорный тест Тьюки *** p<0,001. Количество мышей в группе согласно фиг. 1В. (D-F) Анализ активации микроглии с использованием иммуногистохимии Iba1 (анти-Iba1, Wako 019-19741) в спинном мозге. (B, E и F) Изображения анализировали на срезах спинного мозга с интервалом в 1 мм от n = 3-4 мышей на группу. Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, апостериорный тест Тьюки * p<0,05, *** p<0,001.

На фиг. 5 представлено влияние стратегии иммунизации на A) массу тела иммунизированных мышей (количество мышей в группе согласно фиг. 1) и B) распределение лейкоцитов в селезенке, измеренное методом проточной цитометрии (в конце исследования на 32-й неделе, n = 5-7), указывающие на то, что режим вакцинации не изменял и не ухудшал общее состояние здоровья и иммунную функцию вакцинированных мышей. При использовании двухфакторного ANOVA с апостериорным тестом Тьюки значимых различий обнаружено не было.

На фиг. 6 представлены не-клеточно-автономные эффекты поли-GA на цитоплазматическую неправильную локализацию и агрегацию TDP-43. Флуоресцентно-меченый поли-GA экспрессировали с помощью синтетического гена со стартовым кодоном AUG в донорном компартменте в модели с совместным культивированием.

(A-C) Первичные нейроны гиппокампа трансдуцировали (после 4 дней в течение еще 4 дней, DIV4+4) с GFP или (GA)₁₇₅-GFP, сокращенно GA-GFP на фигуре, и совместно культивировали с необученными первичными нейронами в течение 4 дней. Эндогенные агрегаты TDP-43 и поли-GA на покровных стеклах от донора и реципиента анализировали методом иммунофлуоресценции (с использованием антитела к С-концу TDP-43 от Cosmo Bio Co., Ltd., #TIP-TD-P09). (A) Схематическое изображение экспериментов с совместным культивированием. (B) Цитоплазматическое иммуноокрашивание TDP-43 повышено не только в нейронах, трансдуцированных поли-GA, но и в нетрансдуцированных реципиентных клетках. Стрелками и указателями стрелок показаны клетки с цитоплазматическим TDP-43 в положительных и отрицательных по GFP клетках, соответственно. (C) Автоматизированное количественное определение клеток с цитоплазматическим TDP-43 в трансдуцированных GFP или (GA)₁₇₅-GFP (донор) и нетрансдуцированных (реципиент) нейронах с использованием Columbus Acapella. Клетки с сигналом GFP и без него анализировали отдельно (обозначены +/-). Две группы (GFP-отрицательный донор, GFP-положительный реципиент) были исключены из-за очень высокой скорости преобразования GFP и очень низкой скорости распространения GFP. N = 4 биологических репликата. Отметим, что экспрессия (GA)175-GFP приводила к неправильной локализации TDP-43 даже в соседних клетках без детектируемого сигнала GFP. Диаграмма рассеяния с гистограммами средних значений ± SD. Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с тестом множественных сравнений Тьюки. *** обозначает p<0,001.

(D-F) Модель с совместным культивированием с клетками HeLa, трансфицированными iRFP670 или (GA)₁₇₅-iRFP670 (сокращенно iRFP и GA-iRFP на фигуре) в донорном компартменте и GFP-меченым TDP-43 без сигнала ядерной локализации (TDP-43_ΔNLS-GFP, мутация K95A/K97A/R98A, как описано у Winton et al., 2008) в донорном и реципиентном компартментах для стимулирования агрегации TDP-43. Через день после отдельной трансфекции тщательно промытые покровные стекла совместно культивировали в течение дополнительных суток. (D, E) Иммунофлуоресцентное окрашивание и автоматическое количественное определение числа агрегатов TDP-43_ΔNLS-GFP на клетку в донорном и реципиентном компартментах после трансфекции iRFP670 или (GA)₁₇₅-iRFP670 с использованием ImageJ. N = 3 биологических репликата. Диаграмма рассеяния с гистограммами средних ± SD. Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с тестом множественных сравнений Тьюки. ** обозначает p<0,01, а *** обозначает p<0,001. (F) Анализ на фильтре-ловушке SDS-нерастворимых агрегатов TDP-43_ΔNLS-GFP в донорном и реципиентном компартментах после трансфекции донорных клеток iRFP670 или (GA)₁₇₅-iRFP670. Масштабные линейки : 20 мкм.

На фиг. 7 показано, что антитела против GA блокируют не-клеточно-автономные эффекты поли-GA на неправильную локализацию TDP-43. Первичные нейроны гиппокампа трансдуцировали GFP или (GA)₁₇₅-GFP (сокращенно GA-GFP, DIV4+4 согласно фиг. 6A) и затем совместно культивировали в течение 7 дней с добавлением контроля IgG мыши или антител против GA ( клон 5F2 мыши, Zhou et al., EMBO Mol Med 2017) в концентрации 1 мкг/мл. (A) Конфокальная визуализация показала, что обработка антителами против GA уменьшает индуцированную поли-GA цитоплазматическую неправильную локализацию эндогенного TDP-43 в нейронах гиппокампа как в донорном, так и в реципиентном компартментах. Стрелками и указателями стрелок показаны клетки с цитоплазматическим TDP-43 в GFP-положительных и отрицательных клетках, соответственно. Масштабная линейка: 20 мкм. (B) Автоматизированное количественное определение клеток с цитоплазматическим TDP-43 в клетках, трансдуцированных GFP или (GA)₁₇₅-GFP. Клетки с сигналом GFP и без него анализировались отдельно (обозначены +/-). Как и на фиг. 6C, GFP-отрицательные клетки-доноры и GFP-положительные клетки-реципиенты были исключены из-за высокой скорости преобразования и низкой скорости распространения GFP. N = 4 биологических репликата. Диаграмма рассеяния с гистограммами средних ± SD. Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с тестом множественных сравнений Тьюки. * обозначает p<0,05, а *** обозначает p<0,001. (C) Иммуноблоттинг показывает снижение уровня поли-GA при лечении антителами против GA как в донорном (дон.), так и в реципиентном (рец.) компартменте.

На фиг. 8 представлен анализ транскриптома у дикого типа (WT) и экспрессирующих (GA)₁₄₉-CFP трансгенных мышей (ТГ), иммунизированных OVA-PEG-(GA)₁₀, в сравнении с контролем - ФСБ, согласно фиг. 1. N = 4 животных на группу, за исключением ТГ-ФСБ с N = 3 животных. На A) представлены нормированные уровни экспрессии 164 генов, которые дифференциально экспрессируются у мышей ТГ-ФСБ в сравнении с контролем WT-ФСБ и экспрессию которых в значимой степени восстанавливает иммунизация OVA-PEG-(GA)₁₀. Критериями отсечения являются абсолютное кратное log2 изменение > 0,585 (т.е. изменение в 1,5 раза) и p<0,05 после поправки для множественных сравнений. Анализ проводили с использованием пакета DESeq2 в R. На В) представлена диаграмма Венна для изменений экспрессии при сравнении групп ТГ-ФСБ и WT-ФСБ и генов, на которые повлияла иммунизация OVA-PEG-(GA)₁₀ у трансгенных животных. На C) представлен онтологический анализ дифференциально экспрессируемых генов у мышей ТГ-ФСБ , сравнивая гены, экспрессию которых в значимой степени восстанавливает иммунизация OVA-(GA)₁₀, и невосстановленные гены (абсолютное кратное log2 изменение > 0,585). Размеры точек и градации серого цвета соответствуют фракции дифференциально экспрессируемых генов в каждой категории и скорректированным p-значениям, соответственно. D) Сеть генов, разрегулированных в ТГ-ФСБ и значимо восстановленных в ТГ-OVA-(GA)₁₀.

На фиг. 9 показано благоприятное воздействие иммунизации OVA-PEG-(GA)₁₀ на неправильную локализацию TDP-43 и нейроаксональное повреждение у экспрессирующих (GA)₁₄₉-CFP трансгенных мышей (ТГ) и мышей дикого типа (WT), иммунизированных согласно фиг. 1A. На A) представлены репрезентативные изображения иммунофлуоресценции эндогенного TDP-43 в переднем роге спинного мозга. У ТГ-мышей больше нейронов демонстрируют частичную цитоплазматическую неправильную локализацию TDP-43 (стрелки), которая значительно выше в сравнении с мышами WT и частично устраняется иммунизацией OVA-PEG-(GA)₁₀. Масштабная линейка: 20 мкм. B) представлена количественная оценка клеток с частичной цитоплазматической неправильной локализацией TDP-43. Были проанализированы шесть изображений срезов спинного мозга с интервалом в 1 мм. N = 3 мышей на группу. Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, апостериорный тест Тьюки. * p<0,05, н/з - незначимо. F(_5,12) = 0,6533, p = 0,6650; ТГ-PEG-Ova-(GA)₁₀ в сравнении с ТГ-ФСБ p = 0,0096; ТГ-(GA)₁₅ в сравнении с ТГ-ФСБ p = 0,4215. C) представлен иммуноферментный анализ уровней легкой цепи нейрофиламента (NFL) в спинномозговой жидкости - клинически используемого маркера нейроаксонального повреждения. Образцы были взяты на 25 неделе после 5 иммунизаций мышей дикого типа (WT) и (GA)₁₄₉-CFP экспрессирующих трансгенных мышей (ТГ) в возрасте 8, 12, 16, 20, 24 недель аналогично фиг. 1А. Животных анестезировали путем внутрибрюшинного введения медетомидина (0,5 мг/кг), мидазолама (5 мг/кг) и фентанила (0,05 мг/кг). Спинномозговую жидкость (СМЖ) собирали из большой цистерны в соответствии с ранее опубликованными методами (Schelle et al., Alzheimers Dement 2017). Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, апостериорный тест Тьюки, F(_3,11) = 1,911, p = 0,1862. ** p<0,01. Для сравнения ТГ-Ова-(GA)₁₀ и ТГ-ФСБ p = 0,0081.

На фиг. 10 A) представлены стратегия иммунизации и антительный ответ у мышей дикого типа (WT) и симптоматических экспрессирующих (GA)₁₄₉-CFP трансгенных мышей (ТГ) с использованием OVA-PEG-(GA)₁₀ или KLH-PEG-(GA)₁₀. А) Указаны возраст мышей (в неделях) и точки иммунизации и взятия крови. Первая иммунизация была проведена в возрасте 17 недель (примерно в то время, когда у ТГ-мышей развивается двигательные нарушения, см. фиг. 3A), за которой последовали пять повторных инъекций на 21, 25, 29, 33 и 37 неделе. Сыворотку собирали на 16, 18, 22, 26, 30, 34 и 38 неделях. B) Ответ против GA, измеренный методом ИФА. Конъюгаты овальбумина и KLH индуцируют сопоставимые титры антител против GA около ~400 мкг/мл, аналогично когорте на фиг. 1. N указано на легенде. В модели смешанных эффектов с поправкой Гейссера-Гринхауса и апостериорным тестом Тьюки ответ антител в ТГ-OVA-(GA)₁₀ по сравнению с ТГ-KLH-(GA)₁₀ значимо не отличается. C) Антитела против GA детектированы в спинномозговой жидкости (собранной на 40-й неделе после 6 иммунизаций) в этой когорте иммунизированных OVA-PEG-(GA)₁₀ или KLH-PEG-(GA)₁₀ мышей дикого типа (WT) и экспрессирующих (GA)₁₄₉-CFP трансгенных мышей. Тест Краскела-Уоллиса, * p<0,01, ТГ-Ova-(GA)₁₀ в сравнении с ТГ-ФСБ p = 0,0174, ТГ-KLH-(GA)₁₀ в сравнении с ТГ-ФСБ p = 0,0236 D) представлен иммуноанализ уровней легкой цепи нейрофиламентов (NFL) в спинномозговой жидкости этой когорты мышей, собранной на 40-й неделе после 6 иммунизаций. NFL является клинически используемым маркером нейроаксонального повреждения. Иммунизация KLH-конъюгированным (GA)₁₀ по меньшей мере так же эффективна для подавления нейроаксонального повреждения, как и OVA-конъюгированный антиген. N указано на панели А). Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, апостериорный тест Тьюки, F(_5,36) = 2,818, p = 0,0301. * p< 0,05, *** p< 0,001. Для сравнения ТГ-Ова-(GA)₁₀ и ТГ-ФСБ p = 0,0111, для сравнения ТГ-KLH-(GA)₁₀ и ТГ-ФСБ p = 0,0008.

Подробное описание изобретения

Прежде чем настоящее изобретение будет подробно описано ниже, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку они могут варьировать. Следует также понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значения, хорошо известные специалисту в данной области техники.

В тексте настоящего описания приведены ссылки на несколько документов. Каждый из документов, упоминаемых в настоящем документе (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), выше или ниже в настоящем описании, включены в него посредством ссылок во всей полноте. В настоящем документе ничто не должно быть истолковано как признание того, что изобретение не может быть датировано более ранним числом, чем такое раскрытие, в силу предшествующего изобретения.

Далее будут описаны элементы настоящего изобретения. Эти элементы приведены вместе с конкретными вариантами осуществления, однако следует понимать, что они могут быть скомбинированы любым образом и в любом количестве с получением дополнительных вариантов осуществления. Разнообразным образом описанные примеры и предпочтительные варианты осуществления не должны быть истолкованы как ограничивающие настоящее изобретение исключительно явно описанными вариантами осуществления. Следует понимать, что настоящее описание подтверждает и предусматривает варианты осуществления, которые сочетают явно описанные варианты осуществления с любым количеством раскрытых и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных в настоящей заявке элементов следует считать раскрытыми в описании настоящей заявки, если контекст не указывает на иное.

Определения

Далее приведены некоторые определения терминов, часто используемых в настоящем описании. Эти термины, в каждом случае их использования, в остальной части настоящего описания будут иметь соответствующим образом определенное значение и предпочтительные значения.

Во всем настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, если контекст не требует иного, слово «включать» («содержать») и такие его варианты, как «включает» («содержит») и «включающий» («содержащий»), следует понимать как подразумевающие включение указанного целого числа или шага, или группы целых чисел или шагов, но не исключение любого другого целого числа или шага, или группы целых чисел или шагов.

В настоящем документе «индивид» означает любое млекопитающее, рептилию или птицу, которые могут получить пользу от настоящего изобретения. Предпочтительно индивида выбирают из группы, состоящей из лабораторных животных (например, мышь, крыса или кролик), домашних животных (включая, например, морскую свинку, кролика, лошадь, осла, корову, овцу, козу, свинью, курицу, утку, верблюда, кошку, собаку, черепаху, черепаху, змею или ящерицу) или приматов, включая шимпанзе, бонобо, горилл и человека. В частности, предпочтительно, если «индивид» представляет собой человека.

«Пациент» - это любой реципиент медицинских услуг. Как правило, пациент болен или травмирован, подвержен заболеванию или травме или риску развития заболевания (например, из-за экспансии повтора C9orf72) и, таким образом, нуждается в лечении у врача, помощника врача, дипломированной медсестры, ветеринара или другого медицинского работника. В настоящем документе пациент означает любое млекопитающее, рептилию или птицу, для которых может быть полезно описанное в настоящем документе изобретение. Предпочтительно пациента выбирают из группы, состоящей из лабораторных животных (например, мышь, крыса или кролик), домашних животных (включая, например, морскую свинку, кролика, лошадь, осла, корову, овцу, козу, свинью, курицу, утку, верблюда, кошку, собаку, черепаху, черепаху, змею или ящерицу) или приматов, включая шимпанзе, бонобо, горилл и человека. В частности, предпочтительно, если «пациент» представляет собой человека.

Термин «ткань» в настоящем документе относится к совокупности клеток одного происхождения, которые согласованно выполняют определенную функцию. Примеры ткани включают, но не ограничиваясь перечисленными, нервную ткань, мышечную ткань, костную, хрящевую, соединительную ткань и эпителиальную ткань. Несколько тканей вместе образуют «орган», выполняющий определенную функцию. Примеры органа включают, но не ограничиваясь перечисленными, мозг, мышцы, сердце, кровь, скелет, сустав, печень, почки, желудок и кожу.

В настоящем документе термин «клетка» может относиться либо к прокариотической (например, бактериальной), либо к эукариотической клетке (например, грибной, растительной или животной клетке). Многоклеточные организмы состоят из нескольких типов клеток, дифференцированных для выполнения различных функций в указанном организме. К ним относятся, но не ограничиваясь перечисленными, стволовые клетки, эмбриональные стволовые клетки, клетки нервной системы, клетки крови, клетки иммунной системы, мезенхимальные клетки, эпителиальные клетки, интерстициальные клетки, клетки метаболизма и накопления, клетки желез, клетки внеклеточного матрикса, сократительные клетки, пигментные клетки, зародышевые клетки и опухолевые клетки. Термин «клетка» в настоящем документе также относится к клеткам, удаленным из их естественной среды, таким как изолированные первичные клетки или клеточные линии любого из названных выше типов клеток. Обычно в биотехнологических анализах используются такие клетки, как бактериальная клетка, дрожжевая клетка, изолированная первичная клетка или клеточная линия. В контексте настоящего изобретения выделенные первичные клетки или клеточные линии предпочтительно имеют происхождение от млекопитающих.

Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» используются в настоящем документе взаимозаменяемо. Под молекулой нуклеиновой кислоты понимают полимерную или олигомерную макромолекулу, состоящую из нуклеотидных мономеров. Нуклеотидные мономеры состоят из азотистого основания, пятиуглеродного сахара (такого как, но не ограничиваясь перечисленными, рибоза или 2’-дезоксирибоза) и от одной до трех фосфатных групп. Обычно полинуклеотид образуется за счет фосфодиэфирных связей между отдельными нуклеотидными мономерами. В контексте настоящего изобретения молекулы нуклеиновых кислот включают, но не ограничиваясь перечисленными, рибонуклеиновую кислоту (РНК), дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и их смеси, такие как, например, гибриды РНК-ДНК, а также кДНК, геномную ДНК, рекомбинантную ДНК, кРНК и мРНК. Нуклеиновая кислота может состоять из целого гена или его части, нуклеиновая кислота также может быть микроРНК или малой интерферирующей РНК (миРНК). МикроРНК являются короткими молекулами рибонуклеиновой кислоты (РНК), в среднем всего 22 нуклеотида в длину, которые содержатся во всех эукариотических клетках.

Термин «CpG-олигодезоксинуклеотиды» (CpG ODN) в настоящем документе относится к коротким одноцепочечным молекулам ДНК, которые содержат цитидинтрифосфатный дезоксинуклеотид, за которым следует гуанозинтрифосфатный дезоксинуклеотид. CpG ODN с неметилированными CpG-мотивами действуют как иммуностимуляторы. CpG-мотивы, в частности, неметилированные CpG, являются патоген-ассоциированными молекулярными паттернами из-за их обилия в микробных геномах, но их редкости в геномах позвоночных. CpG-мотив распознается рецепторами распознавания паттернов, такими как Toll-подобный рецептор 9 (TLR9), который конститутивно экспрессируется только в B-клетках и плазмацитоидных дендритных клетках (ПДК) у человека и других высших приматов, действуя таким образом как иммуностимулятор. Синтетические CpG ODN могут отличаться от микробной ДНК тем, что они имеют частично или полностью тиофосфатный остов вместо типичного фосфодиэфирного остова и поли(G)-«хвост» на 3'-конце, 5'-конце или на обоих концах. Модификация остова приводит к повышению устойчивости к нуклеазам, в то время как поли(G)-хвост улучшает поглощение CpG ODN клетками. Многочисленные CpG известны в данной области техники как иммуностимуляторы. CpG ODN, используемые для осуществления настоящего изобретения, предпочтительно являются иммуностимулирующими CpG ODN, используемыми в качестве адъювантов. Предпочтительно CpG ODN представляют собой синтетические CpG ODN с устойчивым к нуклеазам остовом и/или поли(G)-хвостом на 3'- и/или 5'- конце. Предпочтительными CpG ODN являются ODN 2006, ODN 1668, ODN 2007, ODN 2216, ODN D35 и ODN K3, более предпочтительны ODN 2006 и ODN 1668 (Hartmann, G., et al. (2000); J Immunol 164(3): 1617-1624 и Heit, A., et al. (2004), J Immunol 172(3): 1501-1507.).

Термин «открытая рамка считывания» (ORF) относится к последовательности нуклеотидов, которые могут быть транслированы в аминокислоты. Как правило, такая ORF содержит стартовый кодон, последующую область, длина которой обычно кратна 3 нуклеотидам, но не содержит стоп-кодона (TAG, TAA, TGA, UAG, UAA или UGA) в данной рамке считывания. Обычно ORF встречаются в природе или создаются искусственно, т.е. с помощью генно-технологических средств. ORF кодирует пептид, полипептид или белок, где аминокислоты, в которые он может быть транслирован, образуют цепь с пептидными связями.

Термины «экспрессия гена» или «экспрессия» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к процессу, посредством которого генетическая информация используется для синтеза функционального генного продукта. Как правило, такой генный продукт представляет собой пептид, полипептид или белок, или нуклеиновую кислоту, такую как рибосомная РНК (рРНК), транспортная РНК (тРНК) или малая ядерная РНК (мяРНК). Экспрессия генов включает этапы транскрипции, сплайсинга РНК, трансляции и посттрансляционной модификации. Предпочтительно этот термин используется для обозначения синтеза пептида, полипептида или белка. Таким образом, термин «детекция экспрессии» предпочтительно используется для обозначения детекции экспрессии пептида, полипептида или белка. Такая детекция может быть осуществлена известными в данной области техники методами, в частности, с помощью лигандов, специфически связывающихся с пептидом, полипептидом или белком.

Как правило, при синтезе белка последовательность ДНК, кодирующая ген, сначала транскрибируется в мРНК, из которой путем РНК-сплайсинга удаляются интроны, а экзоны соединяются и впоследствии транслируются для получения аминокислотной цепи, которая затем укладывается в белок.

Термин «транскрипция» относится к процессу, в котором определенный сегмент ДНК, как правило, ген, транскрибируется в РНК ферментом РНК-полимеразой. Во время транскрипции последовательность ДНК считывается РНК-полимеразой, которая производит комплементарную антипараллельную цепь РНК. В отличие от репликации ДНК, транскрипция приводит к образованию комплементарной цепи РНК, которая включает урацил (U) во всех случаях, когда в комплементарной цепи ДНК присутствовал бы тимин (T). Если транскрибируемый ген кодирует белок, результатом транскрипции является молекула пре-матричной РНК (мРНК) или мРНК, которая затем транслируется в пептид, полипептид или белок. Альтернативно, транскрибируемый ген может кодировать либо гены некодирующей РНК (такие как микроРНК, linc-РНК (длинная промежуточная некодирующая РНК) и т.д.), либо рибосомальную РНК (рРНК) или транспортную РНК (тРНК), другие компоненты процесса сборки белка, либо другие рибозимы. «Сплайсинг РНК» происходит одновременно или после процесса транскрипции и означает процесс, в ходе которого «интроны», входящие в состав пре-мРНК, удаляются, а «экзоны» ковалентно соединяются.

Термин «интрон» относится к любой нуклеотидной последовательности внутри гена, которая удаляется при сплайсинге РНК. В данной области техники термин «интрон» обычно используется для обозначения как последовательности ДНК в гене, так и соответствующей последовательности в транскрипте РНК, которая удаляется при сплайсинге РНК. Последовательности, которые объединяются в итоговую зрелую РНК после сплайсинга РНК, называются «экзонами». Кроме того, термин «экзон» обычно используется в данной области техники для обозначения как последовательностей ДНК в гене, так и соответствующих последовательностей в транскрипте РНК, которые соединяются во время сплайсинга РНК после удаления интрона.

Рибосомы облегчают процесс «трансляции» мРНК в цепь аминокислот, индуцируя связывание тРНК с комплементарными последовательностями антикодонов с последовательностью мРНК. тРНК несут определенные аминокислоты, которые соединяются в полипептид, когда мРНК проходит через рибосому и «считывается» ею. Как правило, трансляция представляет собой AUG-зависимый процесс, в котором AUG-кодон мРНК (соответствующий ATG-кодону ДНК) распознается как сайт инициации трансляции, в результате чего метионин становится первой аминокислотой в образующейся аминокислотной цепи. Однако существует также AUG-независимый механизм трансляции, например, когда метиониновая тРНК взаимодействует с кодоном, комплементарным только двум нуклеотидам. В вирусах механизм AUG-независимой трансляции включает использование участков внутренней посадки рибосомы (IRES), которые структурно имитируют инициаторную тРНК и манипулируют рибосомами, чтобы инициировать трансляцию в сайте без AUG.

Термин «RAN-трансляция» («Repeat-associated non-AUG translation») относится конкретно к AUG-независимому механизму трансляции нуклеотидных повторов. В строгом смысле считается, что трансляция инициируется непосредственно внутри повтора, но сообщалось, что при некоторых расстройствах, связанных с экспансией повторов, происходит низкоэффективная инициация с кодонов, близких к AUG (например, CUG), в 5’-направлении от области повтора (например, Tabet et al., Nat Commun. 2018 Jan 11;9(1):152; Kearse et al., 2016, Mol Cell. 2016 Apr 21;62(2):314-322), чему может способствовать экспансия повтора. На известном уровне техники было показано, что RAN-трансляция происходит с экзонной РНК, содержащей тринуклеотидные, тетрануклеотидные и пентануклеотидные повторы. В работе, предварявшей настоящее изобретение, было неожиданно показано, что интронная РНК, транскрибируемая с гексануклеотидных повторов, присутствующих в геноме, также может транслироваться с помощью RAN-трансляции. Полипептиды, которые были получены путем RAN-трансляции из таких нуклеотидных повторов, могут (но не обязательно должны) отличаться от пептидов или полипептидов, которые были транслированы AUG-зависимым образом, тем, что в них отсутствует начальный метионин. Например, RAN-трансляцию может облегчать то, что присутствие указанных нуклеотидных повторов способствует образованию шпилечной структуры, которая впоследствии запускает RAN-трансляцию, инициированную внутри или вблизи повтора.

Термины «аминокислотная цепь» и «полипептидная цепь» используются как синонимы в контексте настоящего изобретения.

В контексте настоящего изобретения термин «пептид» относится к короткому полимеру из аминокислот, соединенных пептидными связями. Он содержит те же химические (пептидные) связи, что и белки, но обычно имеет меньшую длину. Самым коротким пептидом является «дипептид», состоящий из двух аминокислот, соединенных одной пептидной связью. Также может существовать трипептид, тетрапептид, пентапептид и т.д. Пептид также может иметь длину до 8, 10, 12, 15, 18 или 19 аминокислот. Пептид имеет амино-конец и карбоксильный конец, если только это не циклический пептид.

В контексте настоящего изобретения термин «дипептидный повтор (DPR)» относится к дипептиду из двух аминокислот, соединенных одной пептидной связью, который дублируется несколько раз с образованием более длинного пептида или полипептида, т.е. дипептидный повтор может включать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000 или более дипептидов, соединенных между собой пептидными связями. Предпочтительно число дипептидных повторов, используемых для иммунизации в настоящем изобретении, находятся в диапазоне от 2 до 30, от 3 до 29, от 3 до 28, от 4 до 27, от 4 до 26, от 4 до 25, от 5 до 24, от 5 до 23, от 5 до 22, от 6 до 21, от 6 до 20, от 6 до 19, от 7 до 18, от 7 до 17, от 7 до 16, от 7 до 15, от 8 до 14, от 8 до 13, от 8 до 12, от 8 до 11 и от 8 до 10, предпочтительно от 4 до 25, более предпочтительно от 7 до 15, еще более предпочтительно от 8 до 12. Для иммунизации антигены DPR синтезируют химическим путем или с использованием ДНК-вектора для ДНК-вакцинации. Очень длинные «дипептидные повторы», обнаруженные у носителей мутации C9orf72, являются продуктами трансляции гексануклеотидных повторов. Значение этого термина более подробно описано ниже. В частности, требуется, чтобы наименьшая единица повтора имела длину шесть нуклеотидов, например, в нуклеотидной последовательности «CGCGCGCGCGCGCGCG» (SEQ ID NO: 001) наименьшей единицей повтора является «CG» и, таким образом, эта последовательность является динуклеотидным повтором. С другой стороны, в нуклеотидной последовательности GGGCCCGGGCCC (SEQ ID NO: 002) наименьшей единицей повтора является «GGGCCC», и, таким образом, это гексануклеотидный повтор. Гексануклеотид, который не содержит стоп-кодона, будет, таким образом, кодировать дипептид, а цепочка повторов таких гексануклеотидов будет кодировать дипептидный повтор. Вследствие вырожденности генетического кода возможно, что нуклеотидная последовательность, отвечающая критериям гексануклеотидного повтора, кодирует дипептид с идентичными аминокислотами, например, наименьшей повторяющейся единицей нуклеотидной последовательности «GGTGGCGGTGGC» (SEQ ID NO: 003) является «GGTGGC», которая кодирует Gly-Gly. Однако предпочтительно, чтобы дипептид включал две разные аминокислоты, например, (Gly-Ala), (Gly-Pro), (Gly-Arg), (Ala-Pro), (Pro-Arg), (Gly-Leu), (Ala-Trp), (Pro-Gly), (Ala-Gln), предпочтительно (Gly-Ala). В противном случае, т.е. если аминокислоты дипептида могут быть идентичными, для пептида длиной шесть аминокислот нельзя определить наличие трех дипептидных повторов, но такая последовательность будет рассматриваться специалистом как гексапептид или шестикратный повтор мономера. Соответственно, термин «дипептидный повтор (DPR)» относится к дипептиду из двух разных аминокислот, соединенных одной пептидной связью, который дублируется несколько раз с образованием более длинного пептида или полипептида, т.е. дипептидный повтор может включать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000 или более дипептидов, соединенных между собой пептидными связями. N-концевая часть DPR-белков, образующаяся в результате потенциальной инициации вблизи AUG перед повтором (GGGGCC)_n, до конца не изучена. Трансляция полноразмерной повторяющейся последовательности может дополнительно приводить к образованию коротких С-концевых удлинений пептидов (Mori et al., Acta Neuropathol. 2013 Dec;126(6):881-93; и Zu et al., PNAS December 17, 2013 110 (51) E4968-E4977). Кроме того, во время повторной трансляции может происходить сдвиг рамки (Tabet et al., Nat Commun. 2018 Jan 11;9(1):152).

Термин «полипептид» относится к одной линейной цепи аминокислот, соединенных между собой пептидными связями, и предпочтительно включает по меньшей мере около 20 аминокислот. Полипептид может быть одной цепью белка, состоящего из более чем одной цепи, или самим белком, если белок состоит из одной цепи.

Термин «белок» относится к молекуле, состоящей из одного или нескольких полипептидов, которые принимают вторичную и третичную структуру, и дополнительно относится к белку, состоящему из нескольких полипептидов, т.е. нескольких субъединиц, образующих четвертичные структуры. К белку иногда присоединяются непептидные группы, которые могут называться простетическими группами, или кофакторами.

«Изолированный пептид», «изолированный полипептид» или «изолированный белок» относится к пептиду, полипептиду или белку, который был извлечен из своего естественного окружения в клетке, так что другие клеточные материалы, обычно находящиеся рядом, уже отсутствуют. В контексте настоящего изобретения пептиды, полипептиды или белки, продуцированные вне их естественной клеточной среды, например, химическим путем или рекомбинантным путем в неприродной среде, также рассматриваются как изолированные пептиды, полипептиды или белки.

Полипептиды или белки (включая производные белков, варианты белков, фрагменты белков, сегменты белков, эпитопы белков и домены белков) могут быть дополнительно модифицированы путем химической модификации. Таким образом, химически модифицированный полипептид может включать химические группы, отличные от остатков, содержащихся в 20 встречающихся в природе аминокислотах. Примеры таких других химических групп включают, без ограничения, гликозилированные аминокислоты и фосфорилированные аминокислоты. Химические модификации полипептида могут обеспечить благоприятные свойства по сравнению с родительским полипептидом, например, что-либо одно или более из повышенной стабильности, увеличенного биологического периода полужизни или повышенной растворимости в воде. Химические модификации включают, без ограничения: пегилирование, гликозилирование негликозилированных исходных полипептидов. Такие химические модификации, применимые к вариантам, используемым в настоящем изобретении, могут происходить ко- или посттрансляционно.

«Антигенный белок», как указано в настоящей заявке, представляет собой полипептид, как определено выше, который содержит по меньшей мере один эпитоп. «Антигенным фрагментом» антигенного белка является частичная последовательность антигенного белка, включающая по крайней мере один эпитоп. Для целей иммунизации релевантны только те части белка, которые вызывают иммунный ответ. Таким образом, конструкция нуклеиновой кислоты не обязательно должна кодировать полноразмерный антигенный белок, как он содержится, например, в больной клетке, раковой клетке или патогене. Достаточно укороченного фрагмента такого белка, если его аминокислотная последовательность включает эпитоп или эпитопы, ответственные за распознавание антигенного белка иммунной системой. Используемый в настоящем документе термин «антиген» относится к любой молекуле или части молекулы, включая, но не ограничиваясь перечисленными, нуклеиновую кислоту, аминокислоту, пептид, полипептид, белок, углевод и липид, с которыми связывается лиганд по настоящему изобретению.

Используемый в настоящем документе термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте, которая является частью антигена, специфически связываемого лигандом согласно настоящему изобретению, предпочтительно антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Эпитопы антигена могут быть конформационными эпитопами или неконформационными, т.е. линейными, эпитопами. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что связывание с первыми, но не со вторыми, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей. Конформационный эпитоп состоит из несмежных участков аминокислотной последовательности антигена. Эти эпитопы взаимодействуют с лигандом за счет особенностей трехмерной поверхности и формы или третичной структуры антигена. Большинство эпитопов являются конформационными. В отличие от них, линейные эпитопы взаимодействуют с лигандом за счет своей первичной структуры. Линейный эпитоп образован непрерывной последовательностью аминокислот антигена. Конформационные эпитопы предпочтительно включают от 8 до 20 несмежных аминокислот, более предпочтительно от 8 до 15 аминокислот. Линейные эпитопы имеют длину от 6 до 20 аминокислот, более предпочтительно от 8 до 15 аминокислот.

Пептиды, полипептиды или белки могут быть детектированы с помощью различных методов, включая, но не ограничиваясь перечисленными, анализ на фильтре-ловушке, вестерн-блоттинг, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммуногистохимическое исследование (ИГХ), иммуноцитохимическое исследование (ИЦХ) и эксклюзионную хроматографию (ЭХ).

«Иммуноокрашивание», которое включает, не ограничиваясь перечисленным, иммуногистохимическое (ИГХ) или иммуноцитохимическое исследование (ИЦХ), представляет собой метод на основе антител для детекции конкретного белка в образце. Термин «иммуноокрашивание» первоначально использовался для обозначения иммуногистохимического окрашивания участков ткани. Однако сейчас иммуноокрашивание охватывает широкий спектр методов, используемых в гистологии, клеточной биологии и молекулярной биологии, в которых применяются методы окрашивания на основе антител. Если на ранних этапах для ИГХ окрашивания использовали флуоресцентные красители, то сейчас чаще используют другие, нефлуоресцентные методы, задействующие ферменты, таких как пероксидаза и щелочная фосфатаза. Эти ферменты способны катализировать реакции, дающие окрашенный продукт, который легко поддается детекции с помощью световой микроскопии. Альтернативно, в качестве меток можно использовать радиоактивные элементы, а иммунореакции можно визуализировать с помощью авторадиографии. Подготовка или фиксация тканей необходима для сохранения морфологии клеток и архитектуры ткани. Неправильная или длительная фиксация может значительно снизить способность антител к связыванию. Многие антигены могут быть успешно продемонстрированы на фиксированных в формалине залитых в парафин участках ткани. Оптимизация методов и времени фиксации, предварительная обработка блокирующими агентами, инкубация антител с высоким содержанием соли, а также оптимизация буферов для отмывки после антител и времени отмывки могут быть важны для получения высококачественного иммуноокрашивания.

«Вестерн-блоттинг» или «иммуноблоттинг», которые используются здесь взаимозаменяемо, позволяют детектировать специфические белки (нативные или денатурированные) из экстрактов, полученных из клеток или тканей, до или после любых этапов очищения. Белки обычно разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза перед переносом на синтетическую мембрану (обычно нитроцеллюлозу или ПВДФ) сухим, полусухим или мокрым методом блоттинга. Затем мембрана может быть исследована с помощью антител методами, аналогичными иммуногистохимическим, но без необходимости фиксации. Детекцию обычно выполняют с использованием антител, связанных с пероксидазой, для катализа хемилюминесцентной реакции. Вестерн-блоттинг является обычным методом молекулярной биологии, который можно использовать для полуколичественного или количественного сравнения уровней белка в разных экстрактах. Разделение по размеру перед блоттингом позволяет измерить молекулярную массу белка при сравнении с известными маркерами молекулярной массы. Вестерн-блоттинг является аналитическим методом, используемым для детекции специфических белков в заданном образце гомогената ткани или экстракта. Он задействует гель-электрофорез для разделения белков по длине полипептида (денатурирующие условия) или по трехмерной структуре белка (нативные/неденатурирующие условия).

Иммуноферментный анализ (ИФА) является диагностическим методом для количественного или полуколичественного определения концентрации белка в плазме крови, сыворотке или экстрактах клеток/тканей в формате многолуночного планшета (обычно 96 лунок на планшет). В целом, белки в растворе адсорбируют на планшетах для ИФА. Антитела, специфически связывающиеся с интересующим белком, используют для зондирования планшета.

«Электронная микроскопия (ЭМ)» может быть использована для изучения детальной микроархитектуры тканей или клеток. «Иммуно-ЭМ» позволяет осуществить детекцию специфические белки в ультратонких срезах тканей. Антитела, меченные частицами тяжелых металлов (например, золота), можно непосредственно визуализировать с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

«Маркером» или «меткой» называется любое вещество, способное указывать на присутствие другого вещества или комплекса веществ. Маркер может быть веществом, которое связано с определяемым веществом или введено в него. Детектируемые маркеры используются в молекулярной биологии и биотехнологии для детекции, например, белка, продукта ферментативной реакции, вторичного мессенджера, ДНК, взаимодействия молекул и т.д. Примеры подходящих маркеров или меток включают флуорофор, хромофор, радиометку, коллоид металла, фермент, хемилюминесцентную или биолюминесцентную молекулу. Примеры флуорофоров включают различные формы зеленого флуоресцентного белка (GFP), такие как EnGFP, RFP, CYP, BFP, YFP, dsRed и др., фикобилипротеины (аллофикоцианин, фикоцианин, фикоэритрин и фикоэритроцианин), флуоресцеин (флуоресцеин изотиоцианат, FITC), родамин (тетраметилродамин изотиоцианат, TRITC) и цианиновые красители (такие как C2, Cy3 Cy5, Cy7). Примеры радиометок включают ³H, ¹⁴C, ³²P, ³³P, ³⁵S, ^99mTc или ¹²⁵I. Примеры ферментов включают люциферазу, бета-галактозидазу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, глюкозооксидазу и уреазу.

Различные типы химических маркеров или меток могут быть конъюгированы с вторичными или первичными антителами и другими молекулами для облегчения их визуализации (т.е. детекции и измерения) различными методами. Радиоизотопы широко использовались в прошлом, но они имеют высокую стоимость, короткий срок хранения, не дают улучшения отношения сигнал / шум и требуют специального обращения и утилизации. Ферменты и флуорофоры в значительной степени заменили радиоактивные изотопы в качестве детектируемых меток для анализов. Ряд достижений в области реагентов и оборудования делает эти новые технологии более универсальными и мощными. Ферментативные метки, такие как пероксидаза хрена (HRP), наиболее часто используются для методов блоттинга, иммуноанализа и иммуногистохимии. Флуоресцентные метки используются преимущественно для визуализации клеток, амплификации и секвенирования нуклеиновых кислот и микрочипов; однако технология флуоресценции быстро развивается для применения во всех типах анализов.

Термин «уровень экспрессии» относится к количеству генного продукта (например, DPR), присутствующего в организме или образце в определенный момент времени. Уровень экспрессии может быть, например, измерен/количественно определен/определен по количеству белка или мРНК, кодирующей белок. Например, уровень экспрессии может быть определен количественно путем нормирования количества интересующего генного продукта (например, DPR), присутствующего в образце, относительно общего количества генного продукта той же категории (общий белок или мРНК) в том же образце или в контрольном образце (например, образце, взятом в то же время у того же индивида или части идентичного размера (веса, объема) того же образца) или путем определения количества интересующего генного продукта в образце определенного размера (вес, объем и т.д.). Уровень экспрессии может быть измерен/количественно определен/детектирован с помощью любого метода, известного в данной области техники, например, методов прямой детекции и количественного определения интересующего генного продукта (таких как масс-спектрометрия) или методов непрямой детекции и измерения интересующего генного продукта, которые обычно работают посредством связывания интересующего генного продукта с одной или несколькими различными молекулами или средствами детекции (например, праймер(ы), зонды, антитела, каркасные белки), специфичными для интересующего генного продукта (например, DPR). Предпочтительно уровень экспрессии определяют на основании белка, а не на основании мРНК.

Используемый в настоящем документе термин «токсичность» относится к степени, в которой соединение/вещество может повредить организм или подструктуру организма, такую как клетка (цитотоксичность), ткань или орган. Соответственно, термин «токсический эффект» относится к повреждающему действию соединения/вещества на организм, орган, ткань или клетку. Соединение может проявлять токсическое действие, поскольку оно повреждает функцию и/или структуру организма, органа, ткани или клетки, что может привести к изменению функции или потере функции определенных элементов или частей организма, органа, ткани или клетки, или даже привести к смерти указанного организма, органа, ткани или клетки. Таким образом, термин «токсичное соединение» относится к веществу, например, нуклеиновой кислоте, пептиду (например, DPR), полипептиду или белку, или химическому веществу или соединению, которое демонстрирует токсическое действие на организм, орган, ткань или клетку.

Токсичность или токсическое действие соединения может быть измерено с помощью одного из различных анализов жизнеспособности, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь перечисленными, анализы на основе формазана (MTT/XTT), анализ на лактатдегидрогеназу (LDH), АТФ-тест, анализ с кальцеином AM, клоногенный анализ, анализ гомодимера этидия, анализ с голубым Эванса, гидролиз диацетата флуоресцеина/окрашивание йодистым пропидием (окрашивание FDA/PI), проточная цитометрия, TUNEL-анализ, анализ с зеленым флуоресцентным белком (GFP), метиловым фиолетовым, йодистым пропидием, трипановым синим или резазурином. Кроме того, окрашивание ДНК может использоваться для дифференциации некротических, апоптотических и нормальных клеток.

Термины «заболевание» и «расстройство» используются здесь взаимозаменяемо и означают ненормальное состояние, в частности, ненормальное медицинское состояние, такое как болезнь или травма, при котором клетка, ткань, орган или индивидуум больше не способны эффективно выполнять свою функцию. Обычно, но необязательно, заболевание ассоциируется с определенными симптомами или признаками, указывающими на наличие такого заболевания. Таким образом, наличие таких симптомов или признаков может указывать на то, что клетка, ткань, орган или человек поражены заболеванием. Изменение этих симптомов или признаков может свидетельствовать о прогрессировании такого заболевания. Прогрессирование заболевания обычно характеризуется усилением или ослаблением таких симптомов или признаков, что может указывать на «ухудшение» или «улучшение» заболевания. «Ухудшение» заболевания характеризуется снижением способности клетки, ткани, органа или человека/пациента эффективно выполнять свою функцию, в то время как «улучшение» заболевания обычно характеризуется повышением способности клетки, ткани, органа или человека/пациента эффективно выполнять свою функцию. Клетка, ткань, орган или индивид, «предрасположенные» к заболеванию, находятся в здоровом состоянии, но особенно подвержены возникновению заболевания, например, из-за генетической предрасположенности, отсутствия вакцинации, плохо развитого или незрелого иммунитета, неудовлетворительного пищевого статуса или тому подобного. Возникновение заболевания еще можно предотвратить с помощью профилактики или предварительного лечения. Клетка, ткань, орган или индивид могут быть «заподозрены в наличии» заболевания, если указанные клетка, ткань, орган или индивид обычно демонстрируют ранние или слабые признаки или симптомы такого заболевания. В этом случае начало заболевания все же можно предотвратить, или его прогрессирование может быть уменьшено или предотвращено с помощью лечения.

В настоящем документе «детектировать», «детектирование» или «детекция» заболевания или расстройства относится к установлению наличия или отсутствия заболевания у пациента. Например, фрагмент, используемый для детекции заболевания, способен определять наличие или отсутствие индикатора заболевания в образце или у индивида или пациента. Например, заболевание может быть детектировано с помощью лиганда или меченого лиганда, взаимодействующего, т.е. связывающегося или образующего комплекс с нуклеиновой кислотой или пептидом, полипептидом или белком, специфичным для заболевания. Заболевание также может быть выявлено с помощью ингибитора, блокирующего механизм действия, лежащий в основе заболевания, и, таким образом, изменяющего симптомы так, чтобы можно было выявить основное заболевание.

В настоящем документе «лечить», «лечение», или «терапия» заболевания или расстройства означает выполнение одного или более из следующего: (a) уменьшение тяжести расстройства; (b) ограничение или предотвращение развития симптомов, характерных для подлежащего лечению расстройства (расстройств); (c) ингибирование ухудшения симптомов, характерных для подлежащего лечению расстройства (расстройств); (d) ограничение или предотвращение рецидива расстройства (расстройств) у индивида, который ранее имел указанное расстройство (расстройства); и (e) ограничение или предотвращение рецидива симптомов у индивидов, которые ранее имели симптомы указанного расстройства (расстройств). Соответственно, терапия лечит заболевание или расстройство или симптомы заболевания или расстройства путем достижения одного или более из вышеуказанных эффектов (a)-(e). Например, заболевание можно лечить путем ингибирования/блокирования механизма действия, лежащего в основе заболевания, например, с помощью соединений, которые ингибируют экспрессию, агрегацию или токсичность (например, воспаление) полипептида/белка, специфичного для заболевания (например, DPR), или путем ингибирования дальнейших процессов, в которые вовлечен данный полипептид/белок. Заболевание также можно лечить путем активации иммунной системы пациента, например, с помощью активной иммунизации, или путем поддержки иммунной системы пациента, например, с помощью пассивной иммунизации.

В настоящем документе «предотвращать», «предотвращающий», «предотвращение» или «профилактика» заболевания или расстройства означает предотвращение возникновения такого заболевания или расстройства у пациента. Соответственно, соединение, обладающее профилактическим действием, предотвращает возникновение заболевания или расстройства у пациента. Например, заболевание или расстройство может быть предотвращено путем иммунизации, например, активной или пассивной иммунизации здорового индивида таким образом, чтобы избежать или отсрочить начало заболевания. Сюда входит облегчение симптомов заболевания в результате профилактического вмешательства. Альтернативно, заболевание или расстройство может быть предотвращено посредством лигандов или ингибиторов, нарушающих функцию молекул или процессов, связанных с заболеванием, например, посредством лигандов или ингибиторов, блокирующих экспрессию или агрегацию полипептида/белка, специфичного для заболевания (например, DPR), или путем ингибирования дальнейших процессов, в которые вовлечен данный полипептид/белок.

Термин «иммунизация» относится к процессу активации, укрепления или усиления иммунной системы человека против агента («вакцины»), который обычно вызывает или провоцирует заболевание или расстройство. Таким образом, иммунизация здорового человека против указанного агента позволяет предотвратить возникновение заболевания или расстройства. Иммунизация пациента, страдающего заболеванием или расстройством, может вылечить данное заболевание или расстройство или предотвратить дальнейшее прогрессирование данного заболевания. Иммунизация может быть достигнута с помощью различных методов, чаще всего иммунизация достигается путем вакцинации здорового человека или пациента, страдающего заболеванием или расстройством.

Термин «пассивная иммунизация» относится к процессу, в котором предварительно синтезированные элементы иммунной системы передаются человеку/пациенту таким образом, что организму не нужно самому вырабатывать эти элементы. Пассивная иммунизация направлена на лечение заболевания или предотвращение прогрессирования заболевания, в частности, в тех случаях, когда пациент не в состоянии бороться с таким заболеванием или расстройством из-за неэффективной иммунной системы (например, неполноценной иммунной системы или нераспознаваемого иммуногена, например, опухоли). Например, антитела (например, антитела животных или гуманизированные антитела, полученные in vitro в культуре клеток), направленные против иммуногена, специфичного для заболевания, или нуклеиновые кислоты, кодирующие такое антитело и обеспечивающие его экспрессию, являются средствами пассивной иммунизации. Термин «активная иммунизация» относится к иммунизации посредством введения в организм чужеродной молекулы (иммуногена), что заставляет сам организм вырабатывать иммунный ответ против иммуногена. Активная иммунизация направлена на профилактику заболевания или предотвращение прогрессирования заболевания, поскольку иммунную систему индивида праймируют/активируют/укрепляют для реакции против указанного иммуногена, что приводит к более эффективному или быстрому иммунному ответу на иммуноген. Принцип, лежащий в основе активной иммунизации, заключается в создании иммунологической «памяти». В контексте нейродегенеративных заболеваний, при которых клеточный антиген (например, DPR) присутствует постоянно, целью активной иммунизации является постоянное поддержание высокого уровня антител путем регулярной иммунизации на протяжении всей жизни. Воздействие на иммунную систему человека, например, вакциной, содержащей иммуноген, специфичный для заболевания, вызывает образование и/или размножение иммунных клеток, которые специфически распознают иммуноген, содержащийся в вакцине. По меньшей мере часть указанных иммунных клеток остается жизнеспособной в течение периода времени, который может длиться до 10, 20 или 30 лет после вакцинации. Если иммунная система индивида снова сталкивается с иммуногеном в течение вышеупомянутого периода времени, иммунные клетки, полученные в результате вакцинации, реактивируются и усиливают иммунный ответ против иммуногена по сравнению с иммунным ответом индивида, который не был стимулирован путем вакцинации и впервые столкнулся с указанным иммуногеном. Во многих случаях однократного введения вакцины недостаточно для получения количества долгоживущих иммунных клеток, которое требуется для эффективной защиты от указанных заболеваний или расстройств. Следовательно, требуется неоднократная стимуляция биологическим составом, специфичным для конкретного заболевания, для установления длительного защитного иммунитета против этого заболевания или для излечения определенного заболевания. Режим введения, включающий неоднократное введение вакцины, направленной против одного и того же заболевания, в настоящем документе называется «режимом вакцинации “прайм-буст”». Режим вакцинации прайм-буст может включать по меньшей мере два введения вакцины или вакцинной композиции, направленной против конкретного патогена, группы патогенов или заболеваний. Первое введение вакцины называется «праймингом», а любое последующее введение той же вакцины или вакцины, направленной против того же возбудителя, что и первая вакцина, называется «бустингом». Предпочтительно используются от 1 до 10, от 2 до 9, от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6, от 2 до 5 бустерных применений. Период времени между праймингом и бустингом предпочтительно составляет 1 неделю, 2 недели, 4 недели, 6 недель или 8 недель. Более предпочтительно, это 4 недели или 8 недель. Если проводят более одного бустинга, то последующий бустинг предпочтительно проводят через 1 неделю, 2 недели, 4 недели, 6 недель или 8 недель после предыдущего бустинга. Более предпочтительно, интервал между любыми двумя бустингами составляет 4 недели или 8 недель. Режимы вакцинации прайм-буст могут быть гомологичными или гетерологичными. В гомологичных схемах прайм-буста и прайминг, и по меньшей мере один бустинг проводят с использованием одного и того же средства введения антигенного белка или его антигенного фрагмента, т.е. прайминг и бустинг проводят с использованием полипептида, или прайминг и бустинг проводят с использованием конструкции нуклеиновой кислоты, содержащейся в одном и том же векторе. Гетерологичный режим прайм-буст включает использование различных средств для прайминга и для бустинга иммунного ответа.

В случаях, когда требуется особенно высокий титр антител, режим бустинга после первоначального применения прайм-буста может быть продолжен в течение всего курса лечения. Для предотвращения заболеваний согласно настоящему изобретению режим бустинга может быть продолжен в течение всей жизни получающих лечение субъектов для предотвращения возможного начала заболевания.

Два или более антигенных белков или их антигенных фрагментов являются «иммунологически идентичными», если они распознаются одним и тем же антителом, Т-клеткой или В-клеткой. Распознавание двух или более иммуногенных полипептидов одним и тем же антителом, Т-клеткой или В-клеткой также известно как «перекрестная реактивность» данного антитела, Т-клетки или В-клетки. Предпочтительно распознавание двух или более иммунологически идентичных полипептидов одним и тем же антителом, Т-клеткой или В-клеткой происходит из-за присутствия идентичных или аналогичных эпитопов во всех полипептидах. Аналогичные эпитопы имеют достаточно общих структурных и/или зарядовых характеристик, чтобы быть связанными Fab-областью одного и того же антитела или рецептора В-клетки или V-областью одного и того же рецептора Т-клетки. Характеристики связывания антитела, рецептора Т-клеток или рецептора В-клеток, предпочтительно, определяются аффинностью связывания рецептора с соответствующим эпитопом. Два иммуногенных полипептида являются «иммунологически идентичными», как понимается в настоящей заявке, если константа аффинности полипептида с более низкой константой аффинности составляет по крайней мере 30%, по крайней мере 40%, по крайней мере 50%, по крайней мере 60%, по крайней мере 70%, по крайней мере 80%, по крайней мере 90%, по крайней мере 95% или по крайней мере 98% от константы аффинности полипептида с более высокой константой аффинности. Методы определения аффинности связывания полипептида с мишенью, такие как равновесный диализ, иммуноферментный анализ (ИФА) или поверхностный плазмонный резонанс, хорошо известны в данной области. Предпочтительно два или более «иммунологически идентичных» полипептидов включают по меньшей мере один идентичный эпитоп. Наиболее сильный эффект вакцинации обычно достигается, если иммуногенные полипептиды состоят из идентичных эпитопов или имеют идентичную аминокислотную последовательность. Термин «вакцина» относится к биологическому препарату, как правило, фармацевтическому, который повышает иммунитет к определенному заболеванию. Указанный препарат может включать один или несколько иммуногенов, специфичных для заболевания, подходящих для вызывания иммунного ответа. В контексте настоящего изобретения указанное соединение может представлять собой полипептид, который по существу идентичен или иммунологически идентичен полипептиду, как указано ниже, включающему указанный дипептидный повтор (DPR). Альтернативно, вакцина может включать конструкцию нуклеиновой кислоты, которая кодирует иммуногенный полипептид, по существу идентичный или иммунологически идентичный полипептиду, включающему указанный дипептидный повтор. В последнем случае предпочтительно, чтобы полипептид экспрессировался у индивида, которого лечат вакциной. В контексте настоящего изобретения указанная конструкция нуклеиновой кислоты может представлять собой вектор.

В настоящем документе термин «вектор» относится к белку или полинуклеотиду или их смеси, которые могут быть введены или способны вводить содержащиеся в них белки и/или нуклеиновую кислоту в клетку. Кроме того, термин «вектор» относится по меньшей мере к одному полинуклеотиду, составленному с препаратом липосом или липидных наночастиц, который способен трансфицировать клетку по меньшей мере одним полинуклеотидом, согласно описанию, например, Geall et al., 2012. В дополнение к полинуклеотиду, кодирующему интересующий ген, в клетку могут быть введены дополнительные полинуклеотиды и/или полипептиды. Добавление дополнительных полинуклеотидов и/или полипептидов, в частности, предпочтительно, если указанные дополнительные полинуклеотиды и/или полипептиды необходимы для введения конструкции нуклеиновой кислоты в клетку или если введение дополнительных полинуклеотидов и/или полипептидов увеличивает экспрессию иммуногенного полипептида, кодируемого конструкцией нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.

В контексте настоящего изобретения предпочтительно, чтобы интересующие гены, кодируемые введенным полинуклеотидом, экспрессировались в клетке после введения вектора или векторов. Примеры подходящих векторов включают, но не ограничиваясь перечисленными, плазмиды, космиды, фаги, вирусы или искусственные хромосомы.

Примеры заболевания включают, но не ограничиваясь перечисленными, неврологические расстройства, воспалительные заболевания, инфекционные заболевания, кожные заболевания, эндокринные заболевания, заболевания кишечника, генетические нарушения, аутоиммунные заболевания, травматические повреждения, заболевания суставов и различные виды рака.

«Неврологические расстройства» относятся к любому расстройству нервной системы, при котором происходят структурные, биохимические или электрические аномалии в головном мозге, спинном мозге или других нервах, которые влияют на ряд симптомов, включая, но не ограничиваясь перечисленными, паралич, мышечную слабость, плохую координацию, потерю чувствительности, судороги, спутанность сознания, боль и измененные уровни сознания. Примеры неврологических расстройств включают, но не ограничиваясь перечисленными, повреждение мозга или отдельных частей мозга (например, повреждение префронтальной коры, лобной доли, теменной доли, височной доли, затылочной доли, мозжечка, гиппокампа, ствола мозга, лимбической системы), дисфункцию мозга или отдельных частей мозга (например, афазия, дизартрия, апраксия, агнозия, амнезия, атаксия) или воспаление мозга (например, энцефалит, вирусный энцефалит, тромбоз кавернозного синуса, абсцесс мозга, амебиаз). «Нейродегенеративные заболевания», такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, спиноцеребеллярная атаксия (SCA), боковой амиотрофический склероз, БАС, лобно-височная деменция, ЛВД, которую невропатологи часто называют лобно-височной лобарной дегенерацией, ЛВЛД (FTLD) и в данном документе используют взаимозаменяемо с БАС. Некоторые пациенты соответствуют диагностическим критериям обоих заболеваний, поэтому им ставят диагноз «боковой амиотрофический склероз - лобно-височная деменция» (БАС-ЛВД), также называемый БАС-ЛВЛД). Клинические и патологические термины ЛВД и ЛВЛД (а также БАС-ЛВД и БАС-ЛВЛД) в настоящей заявке используются как синонимы. Неврологические заболевания также включают заболевания спинного мозга (например, сирингомиелию, сирингобульбию, синдром Морвана, сосудистая миелопатия, синдром Фуа-Алажуанина, компрессию спинного мозга) и воспаление спинного мозга (например, миелит, полиомиелит, демиелинизирующее заболевание, поперечный миелит, тропический спастический парапарез, эпидуральный абсцесс), центральную и/или периферическую невропатию, заболевания черепных нервов (например, невралгию тройничного нерва), двигательные расстройства центральной и/или периферической нервных систем (например, болезнь Паркинсона, БАС, синдром Туретта, рассеянный склероз), нарушения сна (например, бессонницу, гиперсомнию, апноэ во сне, нарколепсию, катаплексию, синдром Клейне-Левина, нарушение циркадного ритма сна, расстройство фазы сна, расстройство фазы сна с задержкой), головную боль (например, мигрень, кластерную, напряжения), нервно-психические заболевания, делирий, деменцию (например, болезнь Альцгеймера, сосудистую деменцию, ЛВД, семантическую деменцию и деменцию с тельцами Леви), инсульт (например, инсульт средней мозговой артерии (MCA), инсульт передней мозговой артерии (ACA), инсульт задней мозговой артерии (PCA), инсульт Фовилля, Мийяра-Гублера, латеральный медуллярный, Вебера, лакунарный), опухоли (например, глиому, менингиому, аденомы гипофиза, опухоли нервной оболочки), комплексный региональный болевой синдром и болезни двигательных нейронов (БДН) (например, БАС, первичный латеральный склероз (ПЛС), прогрессирующую мышечную атрофию (ПМА), прогрессирующий бульбарный паралич (PBP), псевдобульбарный паралич).

«Симптомами» заболевания являются признаки заболевания, заметные для клетки, ткани, органа или индивида, страдающего таким заболеванием, и включают, но не ограничиваясь перечисленными, боль, слабость, болезненность, напряжение, жесткость и спазм клетки, ткани, органа или индивида. «Признаки» или «сигналы» заболевания включают, но не ограничиваясь перечисленными, изменения или перемены, такие как наличие, отсутствие, увеличение или повышение, уменьшение или снижение специфических показателей, таких как биомаркеры или молекулярные маркеры, или развитие, наличие или ухудшение симптомов.

Термины «индикатор» или «биомаркер» используются здесь взаимозаменяемо. В контексте настоящего изобретения «индикатор» может быть определен как вещество в биологической системе, которое используется в качестве индикатора биологического состояния указанной системы. В данной области техники термин «биомаркер» иногда также применяется к средствам для детекции указанных эндогенных веществ (например, антителам, зондам нуклеиновых кислот, системам визуализации). В контексте настоящего изобретения, однако, термин «биомаркер» применяется только к веществу, а не к средствам для детекции. Таким образом, биомаркерами могут быть любые молекулы, присутствующие в живом организме, такие как нуклеиновая кислота (ДНК, мРНК, микроРНК, рРНК и т.д.), белок (рецептор клеточной поверхности, цитозольный белок и т.д.), метаболит или гормон (сахар крови, инсулин, эстроген и др.), молекула, характерная для определенной модификации другой молекулы (например, фрагменты сахаров или фосфорильные остатки в белках, метиловые остатки в геномной ДНК, экспансия нуклеотидных повторов) или вещество, которое было интернализовано организмом, или метаболит такого вещества. Соответственно, заболевание или расстройство может характеризоваться наличием или отсутствием, увеличением или уменьшением такого показателя. Указанный индикатор заболевания может вызывать или не вызывать заболевание.

Показатели наличия и/или прогрессирования заболевания включают «генетические маркеры», такие как нуклеотидные повторы, VNTR (варьирующие по числу звеньев тандемные повторы; например, STR (короткий тандемный повтор), AFLP (полиморфизм длин амплифицированного фрагмента), SSR (простые повторяющиеся последовательности), MLVA), SSLP (полиморфизм длин простой последовательности), RFLP (ПДРФ, полиморфизм длин рестрикционного фрагмента), RAPD (случайная амплификация полиморфной ДНК), SNP (однонуклеотидный полиморфизм), SFP (однофункциональный полиморфизм), DArT (технология анализа на чипах с разнообразными фрагментами, «Diversity Arrays Technology»), RAD-маркеры (ДНК-маркеры, ассоциированные с сайтами рестрикции).

Термин «нуклеотидный повтор» относится к месту в геноме, где короткая нуклеотидная последовательность образует повторяющиеся последовательности из 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидов, то есть динуклеотидов, тринуклеотидов, тетрануклеотидов, пентануклеотидов и гексануклеотидов. В здоровом состоянии количество повторений может варьировать от 1 до 50, т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50. Однако в состоянии болезни может происходить экспансия этих повторов и они могут повторяться гораздо чаще, чем в здоровом состоянии, например, может происходить 30-40-кратная экспансия, что приводит к нескольким сотням повторов, т.е. к 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 1 500, 2 000, 2 500, 3 000, 3 500, 4 000, 4 500, 5 000, 5 500, 6 000, 6 500, 7 000, 7 500, 8 000, 8 500, 9 000, 9 500 или 10 000, или даже большему числу повторений. Соответственно, уровень экспансии динуклеотидов, тринуклеотидов, тетрануклеотидов, пентануклеотидов или гексануклеотидов может быть показателем (и/или причиной) заболевания, такого как, например, неврологическое заболевание, в частности, нейродегенеративное заболевание. Например, экспансия тринуклеотидных повторов (CAG)_n и обратной комплементарной последовательности (CTG)_n в комплементарной нити связана с болезнью Хантингтона, экспансия пентануклеотидных повторов (ATTCT)_n и обратной комплементарной последовательности (AGAAT)_n в комплементарной нити связана со спиноцеребеллярной атаксией SCA10, в то время как экспансия гексануклеотидов (GGGGCC)_n и обратной комплементарной последовательности (CCCCGG)_n в комплементарной нити ассоциирована с подгруппой БАС, ЛВД и (FTD-ALS), а экспансия гексануклеотидов (GGCCTG)_n и обратной комплементарной последовательности (CAGGCC)_n в комплементарной нити ассоциирована со спиноцеребеллярной атаксией SCA36. В принципе, нуклеотидные повторы могут присутствовать в экзоне или интроне гена, могут транскрибироваться или не транскрибироваться и могут транслироваться или не транслироваться в пептид или полипептид.

Нейродегенеративные заболевания БАС, ЛВД и БАС-ЛВД характеризуются тем, что происходит экспансия гексануклеотидных (GGGGCC)_n-повторов, расположенных в 5’-направлении от кодирующей области гена C9orf72. В здоровом состоянии количество «n» GGGGCC-повторов может варьировать от 1 до 19, т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 и 19. В состоянии болезни может происходить экспансия с увеличением числа «n» этих повторов и повторяться гораздо чаще, чем в здоровом состоянии, например, обычно их экспансия может значительно превышать 40-кратную. Было показано, что в некоторых семьях экспансия с 40-50 повторами обособленно связана с заболеванием (Gijselinck et al., Molecular Psychiatry 2016). Повторы промежуточного размера с 20-45 повторами встречаются редко и предположительно являются доброкачественными (Kaivola et al., Neurobiol Aging. 2019). Таким образом, в состоянии болезни экспансия гексануклеотидных повторов может приводить к нескольким сотням повторений гексануклеотидного повтора, т.е. 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1 000, 2 000, 3 000, 4 000, 5 000, 6 000, 7 000, 8 000, 9 000 и 10 000 повторов или более. Точное количество повторов невозможно определить с помощью стандартных методов секвенирования, а о секвенировании с длинными прочтениями сообщалось лишь в нескольких случаях (Ebbert et al., Mol Neurodegener. 2018). Транскрипция геномных GGGGCC-повторов и GGCCCC-повторов в комплементарной цепи ДНК (также называемой антисмысловой цепью) приводит к продуктам транскрипции РНК, которые состоят из GGGGCC- или GGCCCC-повторов с указанными выше номерами. Неожиданным образом, в большинстве рамок считывания трансляция этих транскриптов инициируется с кодонов, не являющихся ATG. Смысловой транскрипт транслируется во всех трех рамках считывания (поли-(Gly-Ala), поли-(Gly-Pro) и поли-(Gly-Arg)). Таким образом, существует 6 рамок считывания, но две из них приводят к DPR, которые идентичны, за исключением потенциальных N- и C-концевых удлинений, а именно поли-(Gly-Pro) DPR. Соответственно, возможны пять следующих разных DPR: поли-(Gly-Ala), поли-(Gly-Pro), поли-(Gly-Arg), поли-(Ala-Pro) и поли-(Pro-Arg). В частности, поли-GA, поли-GP и поли-AP полипептиды обладают высокой гидрофобностью. При индивидуальной экспрессии синтетических генов только поли-GA образует обильные цитоплазматические агрегаты во внутриклеточной среде.

Геномная последовательность области, окружающей гексануклеотидный повтор гена C9orf72, читается следующим образом в референсной последовательности генома GRCh38/hg38 из NCBI (SEQ ID NO: 004)

acgtaacctacggtgtcccgctaggaaagagaggtgcgtcaaacagcgacaagttccgcccacgtaaaagatgacgcttgg

tgtgtcagccgtccctgctgcccggttgcttctcttttgggggcggggtctagcaagagcaggtgtgggtttaggaggtgtgtgttttt

gtttttcccaccctctctccccactacttgctctcacagtactcgctgagggtgaacaagaaaagacctgataaagattaaccagaa

gaaaacaaggagggaaacaaccgcagcctgtagcaagctctggaactcaggagtcgcgcgcta[GGGGCC]_nggggcgt

ggtcggggcgggcccgggggcgggcccggggcggggctgcggttgcggtgcctgcgcccgcggcggcggaggcgcaggc

ggtggcgagtgggtgagtgaggaggcggcatcctggcgggtggctgtttggggttcggctgccgggaagaggcgcgggtaga

agcgggggctctcctcagagctcgacgcatttttactttccctctcatttctctgaccgaagctgggtgtcgggctttcgcctctagc

gactggtggaattgcctgcatccgggccccgggcttcccggcggcggcggcggcggcggcggcgcagggacaagggatgg

ggatctggcctcttccttgctttcccgccctcagtacccgagctgtctccttcccggggacccgctgggagcgctgccgctgcggg

ctcgagaaaagggagcctcgggtactgagaggcctcgcctgggggaaggccggagggtgggcggcgcgcggcttctgcgga

ccaagtcggggttcgctaggaacccgagacggtccctgccggcgaggagatcatgcggg,

где «n» имеет описанные выше предпочтительные и наиболее предпочтительные значения.

В 5’- и 3’-направлении от геномной области повторов расположены дополнительные кодирующие полипептид области, называемые «неповторяющимися областями». Последовательность неповторяющихся областей зависит от геномного расположения области гексануклеотидного повтора. Соответственно, DPR могут также включать дополнительные аминокислотные последовательности на N- и/или C-конце. Полипептид, включающий область дипептидного повтора, также включает дополнительную С-концевую аминокислотную последовательность, кодируемую 3'-геномной областью ниже области повтора. По поводу точного сайта начала или инициации трансляции ведутся дискуссии. В случае RAN-трансляции стартовый сайт может находиться в области повтора или во фланкирующей области. Инициация с неканонического стартового кодона может также привести к образованию N-концевой фланкирующей области, причем самая большая N-концевая область простирается до первого стоп-кодона внутри рамки на 5' конце РНК. Кроме того, в процессе трансляции могут происходить сдвиги рамки считывания внутри повтора. В зависимости от инициации транскрипции RAN-транслируемой мРНК, кодирующей соответствующий DPR, DPR может также включать N-концевую аминокислотную последовательность, кодируемую 5'-геномной областью в 5’-направлении от области повтора. Длина соответствующей неповторяющейся С-концевой аминокислотной последовательности зависит от положения первого стоп-кодона в соответствующей рамке считывания, дающей начало DPR. Таким образом, хотя два заболевания, каждое из которых характеризуется экспансией (GGGGCC)_n повторов в различных геномных регионах, могут приводить к идентичным DPR, С- и/или N-концевые неповторяющиеся области, входящие в состав полипептида, будут отличаться в зависимости от геномного контекста и позволят различать два заболевания, характеризующиеся экспансией геномных гексануклеотидных повторов. Для каждого заболевания, характеризующегося гексануклеотидными повторами, специалист может определить соответствующий 5'- и/или 3'-геномный регион и, таким образом, аминокислотные последовательности, которые могут быть включены со стороны N-конца и/или C-конца DPR. Известные полиморфизмы в 3'-области повтора GGGGCC могут дополнительно вызывать сдвиг рамки в 3'-области.

Аминокислотные последовательности, которые могут быть включены на С-конце DPR, характерные для БАС, ЛВД или БАС-ЛВД , включают

(i) повтор (Gly-Ala): WSGRARGRARGGAAVAVPAPAAAEAQAVASG (SEQ ID NO: 005);

(ii) повтор (Gly-Pro): GRGRGGPGGGPGAGLRLRCLRPRRRRRRRWRVGE (SEQ ID NO: 006) или отсутствие С-концевой последовательности, поскольку за антисмысловым GP-повтором непосредственно следует стоп-кодон;

(iii) повтор (Gly-Arg): GVVGAGPGAGPGRGCGCGACARGGGGAGGGEWVS

EEA ASWRVAVWGSAAGKRRG (SEQ ID NO: 007);

(iv) повтор (Ala-Pro): SARLLSSRACYRLRLFPSLFSSG (SEQ ID NO: 008);

(v) повтор (Pro-Arg): PLARDS (SEQ ID NO: 009).

На основании ближайшего вышестоящего стоп-кодона аминокислотные последовательности, которые могут находиться на N-конце DPR, характерных для БАС, ЛВД или БАС-ЛВД , включают

(i) повтор (Gly-Ala): QALELRSRAL (SEQ ID NO: 010);

(ii) повтор (Gly-Pro): GRESKEEARSPSLVPAPPPPPPPPGSPGPGCRQFHQS

LEAK ARHPASVREMRGKVKMRRALRRAPASTRASSRQPNPKQPPARMPP

PHSPTR HR LRLRRRGRRHRNRSPAPGPPPGPPRPRP (SEQ ID NO: 011);

(iii) повтор (Gly-Arg): RLTRRKQGGKQPQPVASSGTQESRAR (SEQ ID NO: 012);

(iv) повтор (Ala-Pro): GEPPLLPAPLPGSRTPNSHPPGCRLLTHPLATACAS

AAAG AGTATAAPPRARPRARPDH (SEQ ID NO: 013);

(v) повтор (Pro-Arg): SPRRQGPSRVPSEPRLGPQKPRAAHPPAFPQARPLSTRGSL FSSPQRQRSQRVPGKETARVLRAGKQARMQAIPPVARGESPTPSFGQRNERES KNASSSEESPRFYPRLFPAAEPQTATRQDAASSLTHSPPPAPPPPRAQAPQPQPRPGPAPGPAPTT (SEQ ID NO: 014). По поводу точной точки инициации в этой последовательности ведутся дискуссии. Обычная инициация AUG также возможна с выделенного подчеркиванием кодона. Поли-PR также может быть инициирован в обычном стартовом кодоне AUG.

Соответственно, полипептид, образующийся в результате гексануклеотидного повтора в гене C9orf72 в смысловом и/или антисмысловом направлении, может иметь одну из следующих последовательностей от стоп-кодона до стоп-кодона:

(i) SEQ ID NO: 015: qalelrsralGA[GA]_mGAwsgrargrarggaavavpapaaaeaqavasg

(ii) SEQ ID NO: 016. GP[GP]_oGPgrgrggpgggpgaglrlrclrprrrrrrrwrvge

(iii) SEQ ID NO: 017:

greskeearspslvpappppppppgspgpgcrqfhqsleakarhpasvremrgkvkmrralrrapastrassrqpnpkqp

parmppphsptrhrlrlrrrgrrhrnrspapgpppgpprprpGP[GP]_oGP

(iv) SEQ ID NO: 018:

rltrrkqggkqpqpvassgtqesrarGR[GR]_pGRgvvgagpgagpgrgcgcgacarggggagggewvseeaaswrva

vwgsaagkrrg

(v) SEQ ID NO: 019:

geppllpaplpgsrtpnshppgcrllthplatacasaaagagtataapprarprarpdhAP[AP]_qAPsarllssracyrlrlfps

lfssg

(vi) SEQ ID NO: 020:

sprrqgpsrvpseprlgpqkpraahppafpqarplstrgslfsspqrqrsqrvpgketarvlragkqgrgqipipcpcaaaaaaaa

gkpgarmqaippvargesptpsfgqrneresknassseesprfyprlfpaaepqtatrqdaasslthspppappppraqapqpq

prpgpapgpapttPR[PR]_rPRplards.

Где m представляет собой целое число 10 или более, предпочтительно 15, 20 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более; «o» представляет собой целое число 10 или более, предпочтительно 15, 20 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более; «p» представляет собой целое число 10 или более, предпочтительно 15, 20 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более; «q» представляет собой целое число 10 или более, предпочтительно 15, 20 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более; «s» представляет собой целое число 10 или более, предпочтительно 15, 20 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более; «t» представляет собой целое число 10 или более, предпочтительно 15, 20 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более; «u» представляет собой целое число 10 или более, предпочтительно 15, 20 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более; «w» представляет собой целое число 10 или более, предпочтительно 15, 20 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более; «x» представляет собой целое число 10 или более, предпочтительно 15, 20 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более; и «y» представляет собой целое число 10 или более, предпочтительно 15, 20 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более.

Предпочтительно, чтобы С-конец аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NO: 010-014 был соединен пептидной связью с N-концом соответственно указанного DPR. Предпочтительно, DPR включает по крайней мере три смежные, более предпочтительно по крайней мере пять смежных аминокислот, более предпочтительно по крайней мере десять смежных аминокислот из аминокислот согласно SEQ ID NO: 010-014, наиболее предпочтительно всю последовательность аминокислот.

В настоящем документе термин «агрегаты» относится к внутри- или внеклеточному накоплению пептидов, полипептидов (например, DPR) или белков.

Термины «образец» или «представляющий интерес образец» используются здесь взаимозаменяемо и означают часть или фрагмент ткани, органа или индивида, обычно меньшего размера, чем такая ткань, орган или индивид, предназначенный для представления всей ткани, органа или индивида. После анализа образец предоставляет информацию о состоянии тканей, состоянии здоровья или болезни органа или человека. Примеры образцов включают, но не ограничиваясь перечисленными, образцы жидкости, такие как кровь, сыворотка, плазма, синовиальная жидкость, лимфатическая жидкость, спинномозговая жидкость, менингеальная жидкость, жидкость желез, тонкоигольный пунктат и другие жидкости организма (моча, слюна), а также биопсийный образец или твердые образцы, такие как экстракты тканей головного или спинного мозга. Другие примеры образцов включают культуры клеток (например, лимфобласты, полученные от пациента) или культуры тканей.

Анализ образца может быть выполнен на визуальной или химической основе. Визуальный анализ включает, но не ограничивается ими, микроскопическую визуализацию или радиографическое сканирование ткани, органа или индивида, позволяющее оценить образец. Химический анализ включает, не ограничиваясь перечисленным, детекцию присутствия или отсутствия определенных показателей или детекцию изменений их количества или уровня.

Используемый в настоящем документе термин «лиганд» относится к любому веществу или соединению, способному специфически взаимодействовать, например, специфически связываться или образовывать комплекс с указанной молекулой, например, полипептидом согласно настоящему изобретению, включающим или состоящим из дипептидного повтора. Предпочтительными лигандами являются антитела или их антигенсвязывающие фрагменты.

Термин «ингибитор» относится к веществу, например, лиганду, которое блокирует действие другого соединения, например, молекулы рецептора. Как правило, ингибиторы действуют путем связывания с активным сайтом молекулы рецептора или путем взаимодействия с уникальными сайтами связывания, которые обычно не участвуют в регуляции активности молекулы рецептора. Активность ингибитора может быть обратимой или необратимой в зависимости от длительности взаимодействия комплекса ингибитор-рецепторная молекула. Примеры ингибиторов включают, но не ограничиваясь перечисленными, молекулы нуклеиновых кислот, такие как малые интерферирующие РНК (миРНК) или микроРНК, или белки, такие как транскрипционные факторы, молекулы иммуноглобулина, антитела, антителоподобные белки, пептидомиметики, гормоны, цитокины, факторы роста или нейротрансмиттеры.

Термины «специфичное связывание» или «специфически связывающийся» с антигеном означают способность лиганда связываться с антигенной детерминантой антигена с высокой аффинностью. В этом контексте «высокая аффинность» означает, что K_d для взаимодействия ниже 1 x 10^-5 M, предпочтительно ниже 1 x 10^-6 M, более предпочтительно ниже 1 x 10^-7, еще более предпочтительно ниже 1 x 10^-8 M и наиболее предпочтительно ниже 1 x 10^-9 M.

Термины «фармацевтический», «фармацевтическая композиция», «медикамент», «медицинский агент», «агент» и «лекарство» используются здесь взаимозаменяемо, относясь к веществу и/или комбинации веществ, используемых для идентификации, предупреждения или лечения состояния ткани или заболевания.

«Фармацевтически приемлемый» означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или включенный в фармакопею США или другую общепризнанную фармакопею для применения у животных и, конкретнее, у человека.

Термин «активный ингредиент» относится к веществу в фармацевтической композиции или составе, которое является биологически активным, т.е. представляет фармацевтическую ценность. Фармацевтическая композиция может включать один или несколько активных ингредиентов, которые могут действовать совместно или независимо друг от друга. Активный ингредиент может входить в состав в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные свободными аминогруппами, например, полученными из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и соли, образованные свободными карбоксильными группами, например, не ограничиваясь перечисленными, полученными из гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция, железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.

Термин «носитель» в настоящем документе относится к фармакологически неактивному веществу, такому как, не ограничиваясь перечисленными, разбавитель, вспомогательное вещество или основа, с которым вводят терапевтически активный ингредиент. Такие фармацевтические носители могут быть жидкими или твердыми. Жидкие носители включают, но не ограничиваясь перечисленными, стерильные жидкости, такие как солевые растворы в воде и маслах, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов. Физиологический раствор является предпочтительным носителем, если фармацевтическая композиция вводится внутривенно. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны E.W. Martin в руководстве «Remington's Pharmaceutical Sciences».

Подходящие фармацевтические «вспомогательные вещества» включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п.

Термин «белок-носитель» в настоящем документе относится к иммуногенному белку, который используется для повышения ответа иммунной системы на недостаточно иммуногенное в противном случае соединение, например, другой белок/пептид. Белки-носители особенно полезны для небольших соединений, имеющих очень ограниченное число возможных эпитопов, на которые может быть направлен иммунный ответ, или соединений, обладающих очень низкой иммуногенностью. Предпочтительные белки-носители имеют высокое отношение соединения к носителю, что позволяет соединять многочисленные соединения с одним белком-носителем для повышения иммуногенности комплекса антигена с белком-носителем. Различные методы химического сшивания пептидов с белками-носителями известны в данной области техники и обычно включают реакционноспособные сульфгидрильные и/или аминогруппы. Многие из этих систем являются коммерчески доступными (например, ImjectTM от ThermoFisher Scientific). Чаще всего химическое сшивание осуществляют с помощью сульфгидрильной группы в антигене, которая может быть введена путем добавления остатка цистеина к антигенному пептиду, например, C-(GA)₁₀, или через первичную аминогруппу (например, продукты малеимид от Imject™ и этилкарбодиимидгидрохлорид (EDC) Imject™ от ThermoFisher Scientific).

Термин «адъювант» относится к агентам, которые усиливают, стимулируют, активируют, потенцируют или модулируют иммунный ответ на активный ингредиент композиции на клеточном или гуморальном уровне, например, иммунологические адъюванты стимулируют или модулируют ответ иммунной системы на фактический антиген, но сами не обладают иммунологическим эффектом. Примеры таких адъювантов включают неорганические адъюванты (например, неорганические соли металлов, такие как фосфат алюминия или гидроксид алюминия, например, Alhydrogel®, часто называемый квасцами), органические адъюванты (напр. например, сапонины или сквален), адъюванты на масляной основе (например, полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда (предпочтительно монтанид: Montanide ISA 51, Montanide ISA71 VG и Montanide ISA206), цитокины (например. ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-7, ИЛ-12, ИЛ-18, ГМ-КСФ и ИФН-γ), адъюванты в виде частиц (например, иммуностимулирующие комплексы (ISCOM), липосомы или биоразлагаемые микросферы), виросомы, бактериальные адъюванты (например, монофосфорил-липид А (MPL) или мурамиловые пептиды), синтетические адъюванты (например, неионные блок-сополимеры, аналоги мурамиловых пептидов или синтетический липид А) или полинуклеотидные адъюванты (например, олигодезоксинуклеотиды CpG, предпочтительно синтетические CpG ODN). QS-21 представляет собой сапонин, извлеченный из Quillaja saponaria. MF59 представляет собой эмульсию «масло в воде», включающую сквален, полисорбат-80 и сорбитантриолеат. AS03 представляет собой эмульсию «масло в воде», включающую сквален, полисорбат-80 и α-токоферол. AS01 представляет собой комбинацию липосом, MPL и QS21. AS02 представляет собой комбинацию эмульсии «масло в воде», MPL и QS21. AS04 представляет собой комплекс MPL и гидроксида алюминия или фосфата алюминия. IC31 представляет собой комбинацию пептида KLK с олигодезоксинуклеотидом ODN1. Хилтонол (поли-ICLC) представляет собой синтетический комплекс карбоксиметилцеллюлозы, полиинозиновой-полицитидиловой кислоты и поли-L-лизиновой двухцепочечной РНК. Предпочтительными адъювантами являются неполный адъювант Фрейнда (в частности, Montanide ISA 51, Montanide ISA71 VG и Montanide ISA206), хилтонол, квасцы и CpG ODN (в частности, CpG ODN 2006 и CpG ODN 1668).

Фармацевтические средства вводят подходящим для конкретного случая путем введения. Пути введения включают, наряду с прочими, интраназальное введение, внутримышечное введение, подкожное введение, пероральное введение и местное введение.

«Интраназальное введение» представляет собой введение лекарственного средства на слизистую оболочку всего дыхательного тракта, включая легкие. Как правило, лекарственное средство вводят на слизистую оболочку носа. Интраназальное введение осуществляют с использованием инстилляции, спрея или аэрозоля. Предпочтительно указанное введение не включает перфорацию слизистой оболочки механическими средствами, такими как игла.

Термин «внутримышечное введение» означает введение лекарственного средства в любую мышцу индивида или пациента. Предпочтительные внутримышечные инъекции вводятся в дельтовидную, латеральную или вентроглютеальную и дорсоглютеальную области.

Термин «подкожное введение» означает введение лекарственного средства в гиподерму.

Термин «пероральное введение» означает введение лекарственного средства через рот в желудочно-кишечный тракт.

«Местное введение» представляет собой введение лекарственного средства на любой участок кожи без проникновения в кожу иглы или аналогичного устройства. Фармацевтическое средство может также применяться местно на слизистой рта, носа, области половых органов и прямой кишки.

Термины «пресимптоматический» и «продромальный» относятся к очень ранним стадиям заболевания. На пресимптоматической стадии у субъекта отсутствуют какие-либо симптомы заболевания. Предпочтительными примерами пресимптоматических стадий являются субъекты с повышенным риском развития определенного заболевания, у которых еще не проявились какие-либо симптомы этого заболевания. На продромальной стадии заболевания уже присутствуют ранние симптомы заболевания, хотя эти симптомы не являются диагностически специфическими симптомами данного заболевания и могут встречаться и при других заболеваниях.

Варианты реализации

В последующих разделах различные аспекты настоящего изобретения определены более подробно. Каждый определенный таким образом аспект может быть объединен с любым другим аспектом или аспектами, если явно не указано обратное. В частности, любой признак, указанный как предпочтительный или благоприятный, может быть объединен с любым другим признаком или признаками, указанными как предпочтительные или благоприятные.

Согласно первому аспекту настоящее изобретение обеспечивает иммуноген для применения в предотвращении или лечении семейной лобно-височной деменции, ЛВД, бокового амиотрофического склероза, БАС или комбинированного бокового амиотрофического склероза-лобно-височной деменции (БАС-ЛВД ) у пациентов с экспансией повтора C9orf72, включающий полипептид или состоящий из полипептида, состоящего из дипептидных повторов с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из (Gly-Ala)_a, (Gly-Pro)_a, (Gly-Arg)_a, (Pro-Ala)_a и (Pro-Arg)_a, предпочтительно (Gly-Ala)_a, где a является целым числом от 4 до 100. В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения a представляет собой целое число от 4 до 25 или целое число от 7 до 15. В более предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения a представляет собой целое число от 8 до 12.

Иммуноген по первому аспекту настоящего изобретения предназначен для применения в иммунизации. Указанный иммуноген предназначен для инициации иммунного ответа против указанных белков с дипептидными повторами, чтобы предотвратить начало ЛВД и/или БАС, или в случае, если заболевание уже проявилось при лечении указанных заболеваний. Без связи с конкретной теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что иммунный ответ, инициированный иммуногеном, направлен против белков с дипептидными повторами, которые могут образовывать агрегаты, которые являются первопричиной ЛВД и/или БАС у носителей мутации C9orf72. Предполагается, что предотвращение (дальнейшего) образования таких агрегатов предотвращает дальнейшее обострение заболевания и/или обеспечивает полную ремиссию агрегатов DPR и может остановить каскадное развитие заболевания. В частности, авторы настоящего изобретения показали, что экспрессия поли-GA вызывает не-клеточно-автономную цитоплазматическую неправильную локализацию TDP-43 в соседних клетках, которую предотвращает добавление моноклональных антител против GA в анализе с совместным культивированием (см. фиг. 6 и 7). При использовании выраженно иммуногенного антигенного состава поликлональные антитела, полученные в результате активной иммунизации против поли-GA, могут иметь аналогичные эффекты. Удивительным образом, иммуноген по первому аспекту настоящего изобретения приводит к неожиданно высоким титрам антител, превышающим 400 мкг/мл (см. фиг. 1B и фиг. 10A). Такие высокие уровни благоприятны для предполагаемого использования, поскольку антитела должны преодолевать гематоэнцефалический барьер. Так, уровень антител в СМЖ достигает от ~0,1 до 5 мкг/мл (медиана 0,2219 мкг/мл; фиг. 10C), что сравнимо с 1 мкг/мл моноклональных антител, индуцирующим благоприятные эффекты в отношении уровня поли-GA и неправильной локализации TDP-43 в клеточных моделях (фиг. 7 и Khosravi et al., EMBO J 2020, Zhou et al., EMBO Mol Med 2017).

В одном варианте осуществления дипептидные повторы с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из (Gly-Ala)_a, (Gly-Pro)_a, (Gly-Arg)_a, (Pro-Ala)_a и (Pro-Arg)_a, предпочтительно (Gly-Ala)_a, являются агрегированными.

Иммуноген по первому аспекту настоящего изобретения может дополнительно включать аминокислотные последовательности N- и/или C-концевой части полипептида, состоящего из белка с дипептидным повтором. Предпочтительные последовательности включают белки-носители, спейсеры и последовательности, характерные для БАС, ЛВД или БАС-ЛВД , предпочтительно последовательности SEQ ID NO 005-014.

В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения полипептид состоит из (Gly-Ala)_a, где a является целым числом от 4 до 100, предпочтительно от 4 до 25, более предпочтительно от 7 до 15, более предпочтительно от 8 до 12, наиболее предпочтительно от 9 до 11.

В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения полипептид дополнительно включает по меньшей мере одну нестандартную аминокислоту, предпочтительно непротеиногенную аминокислоту, более предпочтительно аминокислоту, выбранную из норлейцина (Nle) и норвалина (Nva). В предпочтительном варианте осуществления нестандартная аминокислота предшествует дипептиду-повтору. Примерный полипептид может иметь последовательность Gly-Nle-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala. Преимуществом использования нестандартной аминокислоты является возможность количественной оценки эффективности сцепления пептида с иммуногенным носителем. Поэтому нестандартные аминокислоты предпочтительно используются в иммуногенах, включающих иммуногенный носитель. Пример полипептида может иметь последовательность KLH-PEG-Gly-Nle-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala.

В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения иммуноген для применения дополнительно содержит белок-носитель. Предпочтительно указанный белок-носитель выбирают из столбнячного анатоксина (АС), HSP60, гемоцианина Concholepas concholepas (CCH), дифтерийного токсина CRM197, дифтерийного анатоксина (АД), комплекса белков наружной мембраны менингококка (OMPC), овальбумина (OVA), гемоцианина фисуреллы (KLH) или бычьего сывороточного альбумина (БСА) Более предпочтительно белок-носитель выбирают из столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина, гемоцианина фисуреллы и овальбумина. Более предпочтительно, белок-носитель представляет собой OVA или KLH. Наиболее предпочтительно белок-носитель представляет собой KLH.

В предпочтительном варианте осуществления используемый иммуноген экспрессируют в виде слитого белка с белком-носителем. Белок-носитель используют для усиления ответа иммунной системы на недостаточно иммуногенное соединение. Это особенно полезно для небольших соединений, имеющих очень ограниченное число возможных эпитопов, на которые может быть направлен иммунный ответ. Предпочтительные белки-носители обеспечивают высокое отношение соединения к носителю, позволяя соединять многочисленные соединения с одним белком-носителем.

В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения белок-носитель нековалентно или ковалентно связан с полипептидом. Связь белка-носителя может быть прямой или через спейсер, введенный между иммуногеном и белком-носителем. Предпочтительно белок-носитель связан через спейсер. Предпочтительным спейсером является PEG-спейсер. Более предпочтительным является PEG-спейсер, содержащий 3 субъединицы PEG. Полиэтиленгликоль (ПЭГ, PEG) является полиэфирным соединением со структурой H-(O-CH2-CH2)_n-OH, где n является целым числом, обозначающим количество субъединиц PEG. Предпочтительные PEG-спейсеры по настоящему изобретению имеют n от 1 до 10, более предпочтительно от n от 2 до 4, наиболее предпочтительно n = 3 (т.е. 3 субъединицы PEG).

В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения белок-носитель связан с С-концом полипептида или спейсера, если последний присутствует.

В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения белок-носитель связан с N-концом полипептида или спейсера, если последний присутствует.

В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения ЛВД, БАС и/или БАС-ЛВД, предотвращение или лечение которых проводят, вызваны экспансией гексануклеотидного повтора (GGGGCC) в 5’-направлении от кодирующей области C9orf72.

В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения иммуноген используют у пресимптоматических носителей экспансии повтора C9orf72 для предотвращения или лечения продромальной стадии ЛВД, БАС и БАС-ЛВД . Длительная продромальная стадия C9orf72 БАС/ЛВД дает возможность применять очень раннее или даже пресимптоматическое лечение известных носителей мутации для достижения максимальной эффективности лечения.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения иммуноген используют у пресимптоматических носителей экспансии повтора C9orf72 для предотвращения или лечения ЛВД, БАС и БАС-ЛВД .

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения иммуноген используют на продромальной стадии ЛВД, БАС и БАС-ЛВД у носителей экспансии повтора C9orf72 для предотвращения или лечения ЛВД, БАС и БАС-ЛВД .

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения иммуноген используют на продромальной стадии ЛВД, БАС и БАС-ЛВД у носителей экспансии повтора C9orf72 для лечения продромальной стадии ЛВД, БАС и БАС-ЛВД .

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения ЛВД, БАС и/или БАС-ЛВД находятся в продромальной стадии.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения ЛВД, БАС и/или БАС-ЛВД находятся в пресимптоматической стадии.

В предпочтительном варианте иммуноген используется в режиме прайм-буст, включающем по меньшей мере одно бустерное применение. Предпочтительно, дозировка составляет 40 мкг пептида, соединенного с белком-носителем (например, KLH или овальбумином), предпочтительно с помощью спейсера, такого как 3 субъединицы PEG. Предпочтительные варианты воплощения включают от 2 до 8, более предпочтительно от 2 до 6, наиболее предпочтительно от 4 до 5 бустерных применений. Режим прайм-буст может быть гомологичным или гетерологичным, предпочтительно гомологичным. В гетерологичном режиме прайм-буст используются разные иммуногены для прайминга и/или бустинга, в то время как в гомологичном режиме прайм-буст используется один и тот же иммуноген. Время между праймингом и/или бустингом иммуногена составляет от 2 до 12 недель, предпочтительно от 3 до 9 недель, более предпочтительно от 4 до 5 недель, наиболее предпочтительно 4 недели.

В предпочтительном варианте иммуноген используется в непрерывном бустерном режиме после первоначального режима прайм-буст. Непрерывный бустерный режим направлен на поддержание постоянно высоких титров антител. Простого присутствия специфических клеток памяти может быть недостаточно для поддержания достаточного иммуногенного ответа на протяжении всей жизни получающего лечение субъекта. Непрерывный бустерный режим позволит получить постоянно высокие титры антител. Предпочтительно, непрерывный бустерный режим применяют до тех пор, пока титры антител не достигнут стабильного плато, и бустерное применение не приведет к дальнейшему увеличению титров антител. Дальнейший бустинг в непрерывном бустерном режиме используют, когда титр антител падает на 10%, 15% или 20% ниже уровня фазы плато. Предпочтительно бустинг требуется не менее двух раз в год, предпочтительно от 4 до 6 раз в год для поддержания высоких титров.

В предпочтительном варианте осуществления непрерывный бустерный режим включает бустерные применения на протяжении всей жизни. Время между бустерными применениями составляет от 1 до 12 месяцев, предпочтительно от 2 до 4 месяцев. Предпочтительным режимом является бустинг каждые два месяца в течение всей жизни.

В предпочтительном варианте осуществления режим бустинга определяет лечащий врач в зависимости от клинических показателей и титра антител против GA, который необходимо регулярно проверять, например, с использованием анализа, показанного на фиг. 1B. Биомаркеры, определяющие уровень поли-GA в СМЖ или с помощью визуализации, также могут быть использованы для управления терапией, но они пока не разработаны.

Согласно второму аспекту настоящее изобретение обеспечивает иммуногенную композицию, включающую или состоящую из иммуногена по первому аспекту настоящего изобретения, фармацевтически приемлемого носителя и/или подходящего вспомогательного вещества (веществ).

В предпочтительном варианте осуществления второго аспекта настоящего изобретения иммуногенная композиция дополнительно включает адъювант. Адъювант, пригодный для осуществления настоящего изобретения, включает любой адъювант, известный в данной области техники, который усиливает иммунный ответ на иммуногенную композицию и/или приводит к более длительному иммунитету, не приводя к иммунному ответу сам по себе. Предпочтительные адъюванты позволяют снизить количество применяемой иммуногенной композиции для получения достаточного иммунного ответа.

Предпочтительно иммуногенная композиция по второму аспекту настоящего изобретения включает адъювант, выбранный из:

- неполного адъюванта Фрейнда (предпочтительно Montanide ISA 51) или родственных составов (предпочтительно Montanide ISA71 VG и Montanide ISA206);

- CpG-олигодезоксинуклеотидов (ODN), предпочтительно CpG ODN 2006 или CpG ODN 1668;

- неорганических адъювантов, предпочтительно гидроксида алюминия (предпочтительно Alhydrogel) или фосфата алюминия;

- органических адъювантов, предпочтительно сапонинов или сквалена, более предпочтительно QS-21;

- эмульсий типа «масло в воде», предпочтительно MF59 или AS03;

- цитокинов, предпочтительно ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-7, ИЛ-12, ИЛ-18, ГМ-КФС или ИФН-γ;

- адъювантов в виде частиц, предпочтительно ИСКОМС, липосом или биоразлагаемых микросфер;

- виросом;

- бактериальных адъювантов, предпочтительно монофосфорил-липида А или мурамиловых пептидов;

- синтетических адъювантов, предпочтительно неионных блок-сополимеров, аналогов мурамилового пептида или синтетического липида А; и

- комбинации перечисленного, предпочтительно AS01, AS02, AS04 или IC31.

В более предпочтительном воплощении адъювант выбирают из: неполного адъюванта Фрейнда (предпочтительно Montanide ISA 51, Montanide ISA71 VG и Montanide ISA206), хилтонола, неорганических адъювантов (предпочтительно гидроксида алюминия или фосфата алюминия) и CpG ODN (предпочтительно CpG ODN 2006 и CpG ODN 1668).

В предпочтительном варианте осуществления адъювант представляет собой неполный адъювант Фрейнда (предпочтительно Montanide ISA 51, Montanide ISA71 VG и Montanide ISA206) в сочетании с CpG ODN (предпочтительно CpG ODN 2006 и CpG ODN 1668).

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение обеспечивает иммуногенную композицию согласно второму аспекту изобретения для применения в предотвращении или лечении ЛВД, БАС и/или БАС-ЛВД , вызванных экспансией гексануклеотидного повтора (GGGGCC) в 5’-направлении от кодирующей области C9orf72.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения ЛВД, БАС и/или БАС-ЛВД находится на продромальной стадии у носителей экспансии повтора C9orf72.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения ЛВД, БАС и/или БАС-ЛВД находится на пресимптоматической стадии у носителей экспансии повтора C9orf72.

Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение обеспечивает набор, включающий иммуноген согласно первому аспекту настоящего изобретения или иммуногенную композицию согласно второму аспекту настоящего изобретения; и необязательно по крайней мере один адъювант. Необязательно далее включает контейнер и/или носитель информации, предпочтительно содержащий инструкции для одного или более из первого, третьего и пятого аспектов настоящего изобретения.

Предпочтительно адъюванты выбирают из:

- CpG-олигодезоксинуклеотидов, предпочтительно CpG 2006 или CpG 1668;

- неорганических адъювантов, предпочтительно гидроксида алюминия или фосфата алюминия;

- органических адъювантов, предпочтительно сапонинов или сквалена, более предпочтительно QS-21;

- эмульсий типа «масло в воде», предпочтительно MF59 или AS03;

- цитокинов, предпочтительно ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-7, ИЛ-12, ИЛ-18, ГМ-КФС или ИФН-γ;

- адъювантов в виде частиц, предпочтительно ИСКОМС, липосом или биоразлагаемых микросфер;

- виросом;

- бактериальных адъювантов, предпочтительно монофосфорил-липида А или мурамиловых пептидов;

- синтетических адъювантов, предпочтительно неионных блок-сополимеров, аналогов мурамилового пептида или синтетического липида А; и

- комбинации перечисленного, предпочтительно AS01, AS02, AS04 или IC31.

Согласно пятому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ лечения или профилактики ЛВД, БАС и/или БАС-ЛВД у субъекта, где способ включает введение иммуногена согласно первому аспекту настоящего изобретения или иммуногенной композиции согласно второму аспекту настоящего изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления пятого аспекта настоящего изобретения ЛВД и/или БАС вызваны экспансией гексануклеотидного повтора (GGGGCC) в гене C9orf72 в 5’-направлении от кодирующей области.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления пятого аспекта изобретения ЛВД, БАС и/или БАС-ЛВД находятся в продромальной стадии у носителей экспансии повтора C9orf72.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения ЛВД, БАС и/или БАС-ЛВД находится на пресимптоматической стадии у носителей экспансии повтора C9orf72.

Согласно шестому аспекту настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую иммуноген в соответствии с первым аспектом изобретения.

Нуклеиновая кислота, кодирующая указанный иммуноген, относится только к иммуногенам, состоящим из полипептидов.

Согласно седьмому аспекту настоящее изобретение обеспечивает вектор, включающий нуклеиновую кислоту согласно шестому аспекту изобретения, где вектор предпочтительно представляет собой вирусный вектор.

Согласно восьмому аспекту настоящее изобретение обеспечивает иммуноген, включающий

- полипептид, включающий дипептидные повторы или состоящий из дипептидных повторов с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из (Gly-Ala)_a, (Gly-Pro)_a, (Gly-Arg)_a, (Pro-Ala)_a и (Pro-Arg)_a, где a представляет собой целое число от 4 до 25, предпочтительно от 7 до 15, более предпочтительно от 8 до 12; и

- иммуногенный белок-носитель, предпочтительно столбнячный анатоксин (АС), HSP60, гемоцианин Concholepas concholepas (CCH), дифтерийный токсин CRM197, дифтерийный анатоксин (АД), комплекс белков наружной мембраны менингококка (OMPC), овальбумин (OVA), гемоцианин фисуреллы (KLH) или бычий сывороточный альбумин (БСА), более предпочтительно OVA, АС, АД и KLH,

или состоящий из вышеперечисленного,

где белок-носитель нековалентно или ковалентно связан с полипептидом, предпочтительно посредством спейсера, более предпочтительно посредством PEG-спейсера. Предпочтительные PEG-спейсеры согласно настоящему изобретению имеют от 1 до 5, более предпочтительно от 2 до 4, наиболее предпочтительно 3 субъединицы PEG.

В предпочтительном варианте осуществления восьмого аспекта настоящего изобретения белок-носитель связан с С-концом полипептида.

В предпочтительном варианте осуществления восьмого аспекта настоящего изобретения белок-носитель связан с N-концом полипептида.

Специалистам в данной области техники будут очевидны различные модификации и вариации настоящего изобретения, не выходящие за рамки объема настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно быть неоправданно ограничено такими конкретными вариантами осуществления. Так, предполагается, что различные модификации описанных способов осуществления настоящего изобретения, которые очевидны для специалистов в соответствующих областях, охвачены настоящим изобретением.

Следующие примеры и фигуры лишь иллюстрируют настоящее изобретение и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения, определяемый прилагаемой формулой изобретения.

Примеры

Наиболее перспективные современные экспериментальные подходы к снижению экспрессии DPR в головном мозге требуют регулярного интратекального введения антисмысловых олигонуклеотидов (Jiang, J., et al. (2016). Neuron 90(3): 535-550; Gendron, T. F., et al. (2017). Sci Transl Med 9(383).) для достижения обширной супрессии экспрессии повтора C9orf72 во всей нервной системе; поэтому они малопригодны для долгосрочного лечения продромальных или пресимптоматических пациентов. Безопасность и эффективность у пациентов до сих пор не доказаны. Используя иммуноген или иммуногенную композицию согласно настоящему изобретению, авторы настоящего изобретения показали, что вакцинация против GA может предотвращать двигательные симптомы в модели поли-GA на мышах, что связано с уменьшением агрегации поли-GA и уменьшением нейровоспаления в ЦНС. Нацеливания на компонент поли-GA может быть достаточно, чтобы остановить или, по крайней мере, значимо задержать патогенный каскад при заболевании C9orf72, поскольку поли-GA является наиболее распространенным DPR-белком у пациентов C9orf72 и напрямую связан с патологией TDP-43, ассоциированной с нейродегенерацией (Khosravi et al., HMG 2017; Nonaka, T., et al. (2018). Hum Mol Genet.). Кроме того, ниже авторы изобретения показывают, что поли-GA вызывает цитоплазматическую неправильную локализацию и агрегацию TDP-43 не-клеточно-автономным образом, что может быть ингибировано моноклональными антителами против GA.

Пример 1: Стратегия иммунизации

Мыши дикого типа (WT) и экспрессирующие (GA)₁₄₉-CFP трансгенные мыши (ТГ), согласно описанию в Schludi et al. 2017, были иммунизированы агрегированными иммуногенами (GA)₁₅ и OVA-PEG-(GA)₁₀. PEG-спейсер состоял из 3 субъединиц PEG. Для связывания малеимида с овальбумином был химически синтезирован цистеинизированный DPR-пептид (C-PEG-(GA)₁₀) (Peptide Specialty Laboratories GmbH, Гельдейберг). PEG-линкер был введен во время синтеза с использованием Fmoc-8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты. Конъюгацию OVA проводили с использованием системы с малеимидом Imject™ (Thermo Scientific). 5 мг пептида C-PEG-(GA)₁₀, растворенного в 500 мкл конъюгационного буфера и 500 мкл мочевины (8M, pH 7,2), смешивали с 5 мг активированного малеимидом Imject™ овальбумина в воде (5-15 моль малеимида на моль овальбумина). После 6 ч инкубации реакционную смесь диализовали в 400 мл ФСБ в течение ночи (отсечка по молекулярной массе 3500). Другие белки-носители могут быть соединены аналогичным образом.

В контрольной группе проводили ложную иммунизацию мышей ФСБ и адъювантом (WT-ФСБ или ТГ-ФСБ ). Иммунизация проводилась в соответствии с протоколом Mackenzie et al. 2013 с дополнительными бустерными иммунизациями (режимы прайм-буст).

Для первой иммунизации 40 мкг OVA-PEG-(GA)₁₀ или (GA)₁₅ смешивали с 5 нмоль олигонуклеотида CpG ODN 1668 (Enzo Life Science) в 200 мкл ФСБ и 250 мкл неполного адъюванта Фрейнда и вводили наполовину внутрибрюшинно и подкожно в возрасте 8 недель. Контрольная группа (ФСБ) получала инъекцию 200 мкл ФСБ и 250 мкл неполного адъюванта Фрейнда вместе с 5 нмоль CpG ODN 1668.

Для пяти бустерных иммунизаций 40 мкг OVA-PEG-(GA)₁₀ или (GA)₁₅ смешивали с 5 нмоль CpG ODN 1668 в 500 мкл ФСБ и вводили половину внутрибрюшинно и половину подкожно на 12, 16, 20, 24 и 28 неделе (см. фиг. 1A).

Пример 2: Иммунный ответ на иммуногены

Поскольку ожидается, что поли-GA имеет слабую иммуногенность, авторы изобретения использовали овальбумин в качестве иммуногенной молекулы-носителя (OVA-PEG-(GA)₁₀), которая также сохраняет по меньшей мере частичную растворимость (GA)₁₀. Однако иммунную систему также стимулирует материал в виде частиц (аналогично вирусам и бактериям), и поэтому авторы изобретения протестировали иммунизацию самоагрегирующим иммуногеном без носителя (GA)₁₅. Результаты изменений в ИФА ELISA с антисыворотками от вакцинированных мышей показали, что иммунизация OVA-PEG-(GA)₁₀ приводила к очень высоким титрам антител против GA у мышей WT и ТГ (см. фиг. 1B), в то время как (GA)₁₅ не индуцировал антитела против GA в сравнении с контролем - ФСБ. Антисыворотки иммунизированных OVA-PEG-(GA)₁₀ мышей детектировали поли-GA, экспрессированный в клетках HEK293 из синтетических генов, инициированных ATG (May et al., 2014) или из конструкции (G₄C₂)₈₀ без ATG (Mori et al., EMBO Reports 2016) (фиг. 2A), аналогично моноклональным антителам против GA. Более того, антисыворотка OVA-PEG-(GA)₁₀ детектировала характерные точечные включения в мозжечке пациентов с C9orf72 (фиг. 2B). Вместе эти данные показывают, что для иммунизации поли-GA необходим сильный иммуногенный носитель, такой как овальбумин или KLH, чтобы генерировать высокоаффинные антитела in vivo.

Пример 3: Терапевтический эффект иммунизации

Всех мышей тестировали один раз в две недели, начиная с 9-недельного возраста, на наличие двигательных нарушений в тесте с ходьбой по балке. Для мышей WT не наблюдалось никаких значимых изменений времени, необходимого для пересечения поднятой балки (длина 58 см, толщина 8 мм) на протяжении всего эксперимента. в отличие от этого, мышам ТГ, получавшим имитацию иммунизации (ТГ-ФСБ ), требовалось значительно больше времени, чтобы пройти по балке, начиная с 15-й недели, что указывает на развитие двигательных нарушений. Некоторые мыши вообще не могли пройти по балке и падали вниз (рис. 3B).

Хотя у вакцинированных OVA-PEG-(GA)₁₀ мышей GA-CFP наблюдалось значительное ухудшение состояния через 17 недель, в более поздние сроки их состояние улучшалось, и их показатели приближались к уровню дикого типа, что свидетельствует о том, что для благоприятного эффекта вакцинации необходим высокий титр антител. Вакцинированные OVA-PEG-(GA)₁₀ ТГ-мыши падали гораздо реже во время ходьбы по балке, чем иммунизированные ФСБ или (GA)₁₅ ТГ-животные . Таким образом, иммунизация OVA-GA является эффективным способом лечения мышей GA-CFP.

Пример 4: Гистологические эффекты иммунизации

Для выяснения способа действия авторы изобретения проанализировали агрегацию поли-GA и активацию микроглии у вакцинированных мышей после умерщвления всех мышей на 32-й неделе. Иммуногистохимия спинного мозга показала типичные агрегаты поли-GA у трансгенных мышей GA-CFP (фиг. 4A). Количественная оценка показала снижение плотности агрегатов поли-GA у вакцинированных OVA-PEG-(GA)₁₀ мышей по сравнению контролем - ФСБ (фиг. 4B). Это было дополнительно подтверждено с помощью иммуноферментного анализа поли-GA (фиг. 4C). В соответствии с отсутствием антительного ответа и отсутствием какого-либо благоприятного эффекта, иммунизация (GA)₁₅ не повлияла на обилие агрегатов поли-GA.

Поскольку снижение количества агрегатов поли-GA было довольно незначительным, авторы изобретения задались вопросом, могут ли антитела преимущественно воздействовать на внеклеточный поли-GA и последующее нейровоспаление. Таким образом, авторы изобретения проанализировали активированную микроглию с помощью иммуногистохимии Iba1. У трансгенных мышей GA-CFP наблюдалась сильная активация микроглии в спинном мозге по сравнению с однопометниками дикого типа (фиг. 4D). Как плотность Iba1-положительной микроглии, так и площадь, окрашенная Iba1, были сильно снижены у иммунизированных OVA-PEG-(GA)₁₀ мышей (фиг. 4E/F). Важно отметить, что активация микроглии у трансгенных мышей OVA-PEG-(GA)₁₀ не отличалась от мышей дикого типа. В целом, вакцинация OVA-PEG-(GA)₁₀ явно снижала агрегацию поли-GA и почти полностью предотвращала активацию микроглии.

Для измерения агрегации нерастворимого поли-GA в спинном мозге ТГ-мышей был проведен иммуноферментный анализ на антитела к GA. Спинной мозг мыши гомогенизировали в буфере RIPA, содержащем 137 мМ NaCl, 20 мМ Трис, pH 7,5, 10% глицина, 1% Triton X 100, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% ДСН, 2 мМ ЭДТА, ингибиторы протеаз и фосфатаз, нуклеазу бензоназу. После центрифугирования гранулы ресуспендировали, гомогенизировали, повторно центрифугировали еще раз в буфере RIPA, чтобы избежать перекрестного загрязнения растворимыми и нерастворимыми фракциями. Нерастворимые гранулы RIPA затем ресуспендировали путем обработки ультразвуком в буфере RIPA, содержащем 3,5 М мочевины (U-RIPA). ИФА ELISA проводили с использованием биотинилированного клона 5F2 антитела против GA в качестве антитела для захвата и антитела с HRP против АТ мыши в качестве антитела для детекции.

Примененная стратегия иммунизации не только предотвращала/лечила двигательные нарушения, но и эффективно снижала агрегацию поли-GA в спинном мозге экспрессирующих (GA)₁₄₉-CFP трансгенных мышей (ТГ), иммунизированных OVA-PEG-(GA)₁₀ (см. фиг. 2B).

Пример 5: Безопасность стратегии иммунизации

Вакцинация против поли-GA приводит к образованию высокоаффинных антител, которые эффективно снижают агрегацию поли-GA и двигательные нарушения без каких-либо побочных эффектов у мышей. Иммунизация не влияла на массу тела (фиг. 5A) и распределение лейкоцитов в селезенке (фиг. 5B), что говорит о том, что режим бустинга не изменял и не нарушал общую иммунную функцию. Белки с поли-GA встречаются только у пациентов с C9orf72 и не имеют критически важной эндогенной функции. Протеом человека не кодирует эндогенные длинные последовательности поли-GA в других белках. Поэтому вакцинация людей будет безопасным и эффективным способом предотвращения или задержки заболевания у бессимптомных носителей мутации и остановки прогрессирования болезни у пациентов с симптомами.

Пример 6: Передача поли-GA от клетки к клетке вызывает цитоплазматическую неправильную локализацию TDP-43

Из экспериментов на животных ясно, что механизмы токсичности в результате приобретения функции при экспансии повтора C9orf72 являются основными патомеханизмами, а DPR-белки играют доминирующую роль. (2015). Science 348(6239): 1151-1154; Jiang, J., et al. (2016). Neuron 90(3): 535-550). Однако нейродегенерация у пациентов с C9orf72 лучше коррелирует с патологией включений TDP-43, также встречающейся при других формах БАС/ЛВД, чем с патологией DPR, но неясно, как экспансия повтора C9orf72 запускает патологию TDP-43 (Mackenzie et al., Acta Neuropathol 2013).

Среди DPR-белков поли-GA наиболее надежно был связан с агрегацией TDP-43, хотя механизм до сих пор неизвестен (Khosravi et al., 2016; Nonaka et al., 2018; Solomon et al., 2018a).

Поскольку TDP-43 и поли-GA лишь периодически коагрегируют в тканях пациента, авторы настоящего изобретения исследовали потенциальные неклеточные автономные эффекты поли-GA на TDP-43 в анализах с совместным культивированием. Основное внимание в указанных анализах было уделено цитоплазматической неправильной локализации и агрегации TDP-43, поскольку это ключевые признаки патологии TDP-43 при БАС/ЛВД.

Первичные нейроны гиппокампа крысы трансдуцировали (протокол в Guo et al., Cell 2018) и культивированы на покровных стеклах с GFP или (GA)₁₇₅-GFP («донорные клетки») с использованием лентивируса (May et al., 2014; Khosravi et al., 2017). Через четыре дня покровные стекла с тщательно промытыми донорными клетками переносили в новую лунку, содержащую необработанные первичные нейроны («реципиентные клетки»), разделенные ~1 мм парафиновыми прокладками (фиг. 6А), и совместно культивировали донорные и реципиентные клетки еще четыре дня. Иммунофлуоресценция донорных клеток показала повышенную цитоплазматическую локализацию TDP-43 в (GA)₁₇₅-GFP по сравнению с трансдуцированными GFP донорными клетками (фиг. 6B/C), о чем авторы настоящего изобретения сообщали ранее (Khosravi et al., 2016). Автоматизированная количественная оценка числа агрегатов поли-GA на клетку (2,23 ± 0,18 (среднее ± SD) в донорном компартменте против 0,70 ± 0,22 в реципиентном компартменте) с помощью ImageJ показала надежную передачу агрегатов (GA)₁₇₅-GFP между нейронами в соответствии с предыдущими результатами (Westergard et al., 2016; Zhou et al., 2017). С помощью автоматизированного анализа изображений отдельных конфокальных срезов с помощью Columbus Acapella версии 2.6.0 цитоплазматический TDP-43 сравнивали в GFP-положительных и GFP-отрицательных клетках (Khosravi et al., 2016). Примечательно, что цитоплазматическая экспрессия TDP-43 была усилена не только в клетках, поглощающих видимые агрегаты (GA)₁₇₅-GFP, но и в нейронах без детектируемого (GA)₁₇₅-GFP, как на донорных, так и на реципиентных покровных стеклах (указатели стрелок на фиг. 6B и количественная оценка на фиг. 6C). Таким образом, высвобождение поли-GA из трансдуцированных нейронов приводит к неправильной локализации TDP-43 в соседних нейронах, предположительно даже при поглощении небольшого количества растворимого или агрегированного поли-GA ниже предела детекции.

Чтобы разграничить влияние поли-GA на ядерно-цитоплазматический транспорт и агрегацию TDP-43, авторы изобретения проанализировали реципиентные клетки, экспрессирующие GFP-меченный TDP-43 человека, лишенный функционального сигнала ядерной локализации (ΔNLS) из-за мутации K95A/K97A/R98A, как описано ранее (Winton et al., 2008). Поскольку TDP-43_ΔNLS высокотоксичен для первичных нейронов, как показано в моделях на мышах (Walker et al., 2015), эти эксперименты с совместным культивированием проводили на клетках HeLa. Донорные клетки совместно трансфицировали TDP-43_ΔNLS-GFP и либо iRFP670, либо GA₁₇₅-iRFP670 (Shcherbakova and Verkhusha, 2013), а реципиентные клетки трансфицировали только GFP-меченным TDP-43_ΔNLS. Через 24 часа после раздельной трансфекции промытые покровные стекла совместно культивировали еще 24 часа перед анализом флуоресценции поли-GA и TDP-43. Поразительным образом, и совместная экспрессия поли-GA, и совместное культивирование с экспрессирующими поли-GA клетками приводила к частичной цитоплазматической агрегации TDP-43_ΔNLS-GFP, демонстрируя, что поли-GA оказывает глубокое клеточно-автономное и не-клеточно-автономное воздействие на агрегацию TDP-43 (фиг. 6D/E). Кроме того, авторы настоящего изобретения подтвердили, что поли-GA индуцировал агрегацию TDP-43_ΔNLS-GFP с помощью анализа на фильтре-ловушке (Mori et al., 2013) клеточных экстрактов из донорных клеток и реципиентных клеток (фиг. 6F). Таким образом, передача небольшого количества поли-GA вызывает неправильную локализацию TDP-43 в клетках в отсутствие легко детектируемой патологии DPR.

Пример 7: Антитела против -GA антитела блокируют не-клеточно-автономные эффекты поли-GA на неправильную локализацию TDP-43.

Авторы настоящего изобретения ранее показали, что моноклональные антитела могут ингибировать передачу поли-GA от клетки к клетке (Zhou et al., 2017), и поэтому предположили, что антитела, образующиеся в результате активной вакцинации, обладают аналогичным эффектом. Поэтому авторы настоящего изобретения исследовали, будут ли антитела против GA подавлять поли-GA-зависимую неправильную локализацию TDP-43. Антитело против GA(1 мкг/мл, клон 5F2, Zhou et al., 2017) или очищенный IgG мыши (1 мкг/мл) в качестве контроля добавляли в модель с совместным культивированием согласно фиг. 6A и анализировали локализацию TDP-43 в донорном компартменте, трансдуцированном поли-GA, и нетрансдуцированном реципиентном компартменте (фиг. 7). Важно отметить, что лечение антителами против GA снижало цитоплазматические уровни TDP-43 в нейронах, обработанных 5F2, в донорном и особенно в реципиентном компартменте, что подтверждает не-клеточно-автономную роль поли-GA в неправильной локализации TDP-43. Более того, обработка антителом против GA специфически снижала уровень поли-GA в обоих компартментах, как показано иммуноблоттингом с анти-GFP антителом (фиг. 7C). В целом, антитела против GA снижают агрегацию и передачу поли-GA, а также цитоплазматическую неправильную локализацию TDP-43.

Пример 8: Иммунизация поли-GA частично способствует восстановлению сигнатур экспрессии нейровоспалительных генов

Для выяснения способа действия активной иммунотерапии изобретатели провели объективный анализ методом РНК-секвенирования спинного мозга экспрессирующих (GA)₁₄₉-CFP трансгенных мышей (ТГ), иммунизированных OVA-PEG-(GA)₁₀ или контролем - ФСБ, и соответствующих контрольных мышей дикого типа (WT). Попарное сравнение не выявило значимых различий между группами дикого типа, но выявило 373 дифференциально экспрессируемых гена для ТГ-ФСБ и WT-ФСБ, и 233 для ТГ-OVA-PEG(GA)₁₀ и ТГ-ФСБ , при 1,5-кратном изменении (log₂ > 0,585) в качестве значения отсечения (Zhou et al., EMBO Mol Med 2020). Тепловая карта изменений экспрессии приведена на фиг. 8A. 164 гена, дифференциально экспрессируемые в случае ТГ-ФСБ, были значительно восстановлены у иммунизированных мышей (фиг. 8B). Экспрессия поли-GA запускала многие иммунные пути, в том числе продуцирование множества цитокинов/хемокинов. Иммунизация OVA-PEG-(GA)₁₀ ослабляла несколько иммунных путей, например, индукцию Ccl4, Grn, Tyrobp и компонентов системы комплемента (C1qc, C5ar1). Онтологический анализ генов (GO) показал обогащение терминами, связанными с иммунной системой и клеточной смертью, как в генах, экспрессия которых восстанавливал OVA-PEG-(GA)₁₀, так и в тех генах, экспрессия которых не была значительно восстановлена (фиг. 8C). Например, GO-термином «положительная регуляция продукции цитокинов» (GO: 0001819) обогащены значимо восстановленные гены (Agt, B2m, C5ar1, Ccl4, Cebpb, Clu, Csf1r, Egr1, Fcer1g, Glmn, Gpsm3, Hspb1, Icosl, Il1r1, Lgals9, Rara, Tgfb1, Tnfrsf1a, Tyrobp), но также и некоторые невосстановленные гены (Adam8, Bcl3, C3, C3ar1, Ccl2, Ccl3, Ccl5, Cd14, Cd84, Clec5a, Crlf2, Cyba, Cybb, Dhx58, Fcgr3, Fgr, Havcr2, Hpse, Il1rn, Il4ra, Irf8, Lpl, Ly9, Mmp12, Naip5, Nfam1, Pf4, Plcg2, Postn, Ptafr, Ptprc, Pycard, Runx1, Sash3, Serpine1, Slc11a1, Sulf1, Tlr1, Tlr2, Tlr7, Tlr9, Tmem173, Trem2). Напротив, термином «внутренний апоптотический сигнальный путь» (GO:0097193) обогащены только восстановленные гены (Cebpb, Clu, Fbxw7, Gpx1, Hmox1, Hspb1, Nfe2l2, Pdcd10, Rnf7, Shisa5, Tnfrsf1a и Tpt1), но не невосстановленные гены. Основанная на онтологическом анализе генов сеть значимо восстановленных генов, связанных с миелоидными клетками и цитокинами, показана на фиг. 8D.

Пример 9: Иммунизация поли-GA уменьшает неправильную локализацию TDP-43 и повреждение нейроновПоскольку в настоящей заявке раскрыто, что поли-GA не-клеточно-автономным образом (фиг. 6) запускает частичную цитоплазматическую неправильную локализацию TDP-43, которая может быть восстановлена in vitro моноклональными антителами против GA (фиг. 7), авторы настоящего изобретения также проанализировали влияние иммунизации антителами против GA (протокол как на фиг. 1A) на уровни цитоплазматического TDP-43 в спинном мозге (фиг. 9A/B). В то время как экспрессирующие (GA)₁₄₉-CFP трансгенные мыши (ТГ), получавшие только ФСБ, демонстрировали значимое увеличение количества клеток с цитоплазматическим TDP-43 по сравнению с животными дикого типа, трансгенные мыши, иммунизированные OVA-PEG-(GA)₁₀, но не (GA)₁₅, демонстрировали снижение уровня цитоплазматического TDP-43 по сравнению с группой ТГ-ФСБ, что позволяет предположить, что антитела против GA, индуцированные иммунизацией, уменьшают вторичную патологию TDP-43, которая является важным коррелятом нейродегенерации при спорадическом БАС/ЛВД, а также C9orf72 БАС/ЛВД (Mackenzie et al., Acta Neuropathol 2013).

Кроме того, авторы настоящего изобретения проанализировали уровень легкой цепи нейрофиламентов (NFL), которая является биомаркером нейроаксонального повреждения при БАС и других заболеваниях (Feneberg et al, 2018; Khalil et al, 2018; Meeter et al, 2016). Действительно, наблюдался значительно сниженный уровень NFL в СМЖ (GA)₁₄₉-CFP трансгенных мышей, иммунизированных OVA-PEG-(GA)₁₀, что свидетельствует об смягчении нейроаксонального повреждения у этих мышей, но не у иммунизированных (GA)₁₅ мышей (фиг. 9C). В целом, вакцинация OVA-PEG-(GA)₁₀ частично предотвращала нейродегенерацию и снижала неправильную локализацию TDP-43 у мышей с поли-GA.

Пример 10. KLH-PEG-(GA)₁₀ и OVA-PEG-(GA)₁₀ вызывают аналогичную благоприятную реакцию

Чтобы сравнить эффекты разных адъювантов, авторы настоящего изобретения иммунизировали GA-CFP-мышей OVA-PEG-(GA)₁₀ или KLH-PEG-(GA)₁₀, начиная примерно с известного начала двигательных симптомов на 17 неделе (ср. фиг. 3A). После шести ежемесячных иммунизаций (фиг. 10A) OVA- и KLH-конъюгированные антигены вызывают сравнимые титры антител против GA (фиг. 10B). Конъюгация с KLH хорошо зарекомендовала себя для иммунизации людей. После окончания исследования у всех мышей на 40-й неделе собирали спинномозговую жидкость для анализа антител против GA в ЦНС и биомаркера нейродегенерации. Антитела против GA явно детектировали в СМЖ для OVA-PEG-(GA)₁₀ или KLH-PEG-(GA)₁₀ (медиана для WT OVA-PEG-(GA)₁₀ 0,9063 мкг/мл, WT KLH-PEG-(GA)₁₀ 0,0541 мкг/мл, ТГ-OVA-PEG-(GA)₁₀ - 0,2809 мкг/мл и ТГ-KLH-PEG-(GA)₁₀ - 0,1291 мкг/мл; медиана для всех образцов в этих группах - 0,2219 мкг/мл), что свидетельствует об успешной доставке антител в ЦНС (фиг. 10C). Важно отметить, что оба режима снижали уровень легкой цепи нейрофиламентов (NFL) в спинномозговой жидкости в степени, аналогичной наблюдаемой в случае пресимптоматического начала вакцинации (ср. фиг. 9C и 10D).

В совокупности, описанные в настоящем документе эксперименты показывают, что иммунизация OVA-PEG-(GA)₁₀ и KLH-PEG-(GA)₁₀ эффективна в модели с (GA)₁₄₉-CFP на мышах и не вызывает явных побочных эффектов, на что указывают нормальные кривые массы тела и нормальные профили лейкоцитов в крови (фиг. 5).

Эффективность in vivo стратегии нацеленной на DPR иммунизации ранее не была раскрыта ни авторами изобретения, ни кем-либо еще. Помимо снижения уровня поли-GA и нейровоспаления, стратегия иммунизации, раскрытая в настоящем документе, также оказывает положительные эффекты in vivo в отношении последующей патологии TDP-43 (фиг. 9A/B), лечение которой моноклональным антителом против GA в клеточных моделях авторы изобретения также впервые раскрыли в настоящем документе (фиг. 7). Недавнее исследование с двумя моноклональными антителами против GA в моделях C9orf72 BAC неожиданным образом показало, что только одно из двух антител продлевает выживаемость, и эффективность не может быть предсказана по аффинности и другим данным in vitro (Nguyen et al. 2020, Neuron 105: 645-662). Полученные авторами настоящего изобретения данные впервые показывают, что активный подход к вакцинации против GA приводит к удивительно высокому титру антител в плазме и значительным титрам в СМЖ, несмотря на прогнозируемую низкую иммуногенность гидрофобного антигена. Кроме того, выявлено благоприятное воздействие на уровень NFL, который в настоящее время является лучшим биомаркером нейродегенерации. Насколько известно авторам настоящего изобретения, это первый случай, когда был показан терапевтический эффект активной иммунизации антителом против GA в модели C9orf72 БАС/ЛВД на животных.

Упоминаемые источники

DeJesus-Hernandez, M. et al., (2011). "Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS." Neuron 72(2): 245-256.

Edbauer, D. and C. Haass (2016). "An amyloid-like cascade hypothesis for C9orf72 ALS/FTD." Curr Opin Neurobiol 36: 99-106.

Gendron, T. F., et al., (2017). "Poly(GP) proteins are a useful pharmacodynamic marker for C9ORF72-associated amyotrophic lateral sclerosis." Sci Transl Med 9(383).

Guo, Q., et al., (2018). "In Situ Structure of Neuronal C9orf72 Poly-GA Aggregates Reveals Proteasome Recruitment." Cell 172(4): 696-705 e612.

Jiang, J., et al., (2016). "Gain of Toxicity from ALS/FTD-Linked Repeat Expansions in C9ORF72 Is Alleviated by Antisense Oligonucleotides Targeting GGGGCC-Containing RNAs." Neuron 90(3): 535-550.

Khosravi, B., et al., (2016). "Cytoplasmic poly-GA aggregates impair nuclear import of TDP-43 in C9orf72 ALS/FTLD." Hum Mol Genet. 2017 Feb 15;26(4):790-800

Mackenzie, I. R., et al., (2013). "Dipeptide repeat protein pathology in C9ORF72 mutation cases: clinico-pathological correlations." Acta Neuropathol 126(6): 859-879.

May, S., et al., (2014). "C9orf72 FTLD/ALS-associated Gly-Ala dipeptide repeat proteins cause neuronal toxicity and Unc119 sequestration." Acta Neuropathol 128(4): 485-503.

Mori, K., et al., (2013). "Bidirectional transcripts of the expanded C9orf72 hexanucleotide repeat are translated into aggregating dipeptide repeat proteins." Acta Neuropathol 126(6): 881-893.

Mori, K., et al., (2013). "The C9orf72 GGGGCC repeat is translated into aggregating dipeptide-repeat proteins in FTLD/ALS." Science 339(6125): 1335-1338.

Nonaka, T., et al., (2018). "C9ORF72 dipeptide repeat poly-GA inclusions promote: intracellular aggregation of phosphorylated TDP-43." Hum Mol Genet. 2018 May 10

Renton, A. E., et al., (2011). "A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD." Neuron 72(2): 257-268.

Rohrer, J. D., et al., (2015). "Presymptomatic cognitive and neuroanatomical changes in genetic frontotemporal dementia in the Genetic Frontotemporal dementia Initiative (GENFI) study: a cross-sectional analysis." Lancet Neurol 14(3): 253-262.

Schludi, M. H., et al., (2017). "Spinal poly-GA inclusions in a C9orf72 mouse model trigger motor deficits and inflammation without neuron loss." Acta Neuropathol. 2017 Aug;134(2):241-254

Schludi, M. H., et al., (2015). "Distribution of dipeptide repeat proteins in cellular models and C9orf72 mutation cases suggests link to transcriptional silencing." Acta Neuropathol 130(4): 537-555.

Simone, R., et al., (2018). "G-quadruplex-binding small molecules ameliorate C9orf72 FTD/ALS pathology in vitro and in vivo." EMBO Mol Med 10(1): 22-31.

Su, Z., et al., (2014). "Discovery of a biomarker and lead small molecules to target r(GGGGCC)-associated defects in c9FTD/ALS." Neuron 83(5): 1043-1050.

Vatsavayai, S. C., et al., (2016). "Timing and significance of pathological features in C9orf72 expansion-associated frontotemporal dementia." Brain 139(Pt 12): 3202-3216.

Zhang, Y. J., et al., (2016). "C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins." Nat Neurosci 19(5): 668-677.

Zhou, Q., et al., (2017). "Antibodies inhibit transmission and aggregation of C9orf72 poly-GA dipeptide repeat proteins." EMBO Mol Med. 2017 May;9(5):687-702

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> DEUTSCHES ZENTRUM FUR NEURODEGENERATIVE ERKRANKUNGEN E.V.

(DZNE)/ ДОЙЧЕС ЦЕНТРУМ ФЮР НОЙРОДЕГЕНЕРАТИВЕ ЭРКРАНКУНГЕН Э.Ф. (ДЦНЭ)

<120> Immunogen for preventing or treating familial frontotemporal

dementia (FTD) and/or amyotrophic lateral sclerosis (ALS)/

Иммуноген для профилактики или лечения семейной лобно-височной

деменции (ЛВД) и/или бокового амиотрофического склероза

(БАС)

<130> 820-3 PCT

<150> EP 19172392.3

<151> 2019-05-02

<160> 21

<170> PatentIn верс.3.5

<210> 1

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

cgcgcgcgcg cg 12

<210> 2

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

gggcccgggc cc 12

<210> 3

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 3

ggtggcggtg gc 12

<210> 4

<211> 888

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> другие признаки

<222> (321)..(327)

<223> гексануклеотидный повтор, который повторяется n раз

<400> 4

acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60

cacgtaaaag atgacgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct gcccggttgc ttctcttttg 120

ggggcggggt ctagcaagag caggtgtggg tttaggaggt gtgtgttttt gtttttccca 180

ccctctctcc ccactacttg ctctcacagt actcgctgag ggtgaacaag aaaagacctg 240

ataaagatta accagaagaa aacaaggagg gaaacaaccg cagcctgtag caagctctgg 300

aactcaggag tcgcgcgcta ggggccgggg cgtggtcggg gcgggcccgg gggcgggccc 360

ggggcggggc tgcggttgcg gtgcctgcgc ccgcggcggc ggaggcgcag gcggtggcga 420

gtgggtgagt gaggaggcgg catcctggcg ggtggctgtt tggggttcgg ctgccgggaa 480

gaggcgcggg tagaagcggg ggctctcctc agagctcgac gcatttttac tttccctctc 540

atttctctga ccgaagctgg gtgtcgggct ttcgcctcta gcgactggtg gaattgcctg 600

catccgggcc ccgggcttcc cggcggcggc ggcggcggcg gcggcgcagg gacaagggat 660

ggggatctgg cctcttcctt gctttcccgc cctcagtacc cgagctgtct ccttcccggg 720

gacccgctgg gagcgctgcc gctgcgggct cgagaaaagg gagcctcggg tactgagagg 780

cctcgcctgg gggaaggccg gagggtgggc ggcgcgcggc ttctgcggac caagtcgggg 840

ttcgctagga acccgagacg gtccctgccg gcgaggagat catgcggg 888

<210> 5

<211> 31

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 5

Trp Ser Gly Arg Ala Arg Gly Arg Ala Arg Gly Gly Ala Ala Val Ala

1 5 10 15

Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ala Gln Ala Val Ala Ser Gly

20 25 30

<210> 6

<211> 34

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 6

Gly Arg Gly Arg Gly Gly Pro Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Leu Arg

1 5 10 15

Leu Arg Cys Leu Arg Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Arg Val

20 25 30

Gly Glu

<210> 7

<211> 54

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 7

Gly Val Val Gly Ala Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Arg Gly Cys Gly

1 5 10 15

Cys Gly Ala Cys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Glu Trp

20 25 30

Val Ser Glu Glu Ala Ala Ser Trp Arg Val Ala Val Trp Gly Ser Ala

35 40 45

Ala Gly Lys Arg Arg Gly

50

<210> 8

<211> 23

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 8

Ser Ala Arg Leu Leu Ser Ser Arg Ala Cys Tyr Arg Leu Arg Leu Phe

1 5 10 15

Pro Ser Leu Phe Ser Ser Gly

20

<210> 9

<211> 6

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 9

Pro Leu Ala Arg Asp Ser

1 5

<210> 10

<211> 10

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 10

Gln Ala Leu Glu Leu Arg Ser Arg Ala Leu

1 5 10

<210> 11

<211> 122

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 11

Gly Arg Glu Ser Lys Glu Glu Ala Arg Ser Pro Ser Leu Val Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Ser Pro Gly Pro Gly Cys Arg

20 25 30

Gln Phe His Gln Ser Leu Glu Ala Lys Ala Arg His Pro Ala Ser Val

35 40 45

Arg Glu Met Arg Gly Lys Val Lys Met Arg Arg Ala Leu Arg Arg Ala

50 55 60

Pro Ala Ser Thr Arg Ala Ser Ser Arg Gln Pro Asn Pro Lys Gln Pro

65 70 75 80

Pro Ala Arg Met Pro Pro Pro His Ser Pro Thr Arg His Arg Leu Arg

85 90 95

Leu Arg Arg Arg Gly Arg Arg His Arg Asn Arg Ser Pro Ala Pro Gly

100 105 110

Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Pro Arg Pro

115 120

<210> 12

<211> 26

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 12

Arg Leu Thr Arg Arg Lys Gln Gly Gly Lys Gln Pro Gln Pro Val Ala

1 5 10 15

Ser Ser Gly Thr Gln Glu Ser Arg Ala Arg

20 25

<210> 13

<211> 59

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 13

Gly Glu Pro Pro Leu Leu Pro Ala Pro Leu Pro Gly Ser Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Ser His Pro Pro Gly Cys Arg Leu Leu Thr His Pro Leu Ala Thr

20 25 30

Ala Cys Ala Ser Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr Ala Thr Ala Ala Pro

35 40 45

Pro Arg Ala Arg Pro Arg Ala Arg Pro Asp His

50 55

<210> 14

<211> 160

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 14

Ser Pro Arg Arg Gln Gly Pro Ser Arg Val Pro Ser Glu Pro Arg Leu

1 5 10 15

Gly Pro Gln Lys Pro Arg Ala Ala His Pro Pro Ala Phe Pro Gln Ala

20 25 30

Arg Pro Leu Ser Thr Arg Gly Ser Leu Phe Ser Ser Pro Gln Arg Gln

35 40 45

Arg Ser Gln Arg Val Pro Gly Lys Glu Thr Ala Arg Val Leu Arg Ala

50 55 60

Gly Lys Gln Ala Arg Met Gln Ala Ile Pro Pro Val Ala Arg Gly Glu

65 70 75 80

Ser Pro Thr Pro Ser Phe Gly Gln Arg Asn Glu Arg Glu Ser Lys Asn

85 90 95

Ala Ser Ser Ser Glu Glu Ser Pro Arg Phe Tyr Pro Arg Leu Phe Pro

100 105 110

Ala Ala Glu Pro Gln Thr Ala Thr Arg Gln Asp Ala Ala Ser Ser Leu

115 120 125

Thr His Ser Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Arg Ala Gln Ala Pro

130 135 140

Gln Pro Gln Pro Arg Pro Gly Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Thr Thr

145 150 155 160

<210> 15

<211> 47

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> ДРУГИЕ ПРИЗНАКИ

<222> (13)..(14)

<223> аминокислоты повторяются m раз

<400> 15

Gln Ala Leu Glu Leu Arg Ser Arg Ala Leu Gly Ala Gly Ala Gly Ala

1 5 10 15

Trp Ser Gly Arg Ala Arg Gly Arg Ala Arg Gly Gly Ala Ala Val Ala

20 25 30

Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ala Gln Ala Val Ala Ser Gly

35 40 45

<210> 16

<211> 40

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> ДРУГИЕ ПРИЗНАКИ

<222> (2)..(3)

<223> аминокислоты повторяются o раз

<400> 16

Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Arg Gly Arg Gly Gly Pro Gly Gly Gly

1 5 10 15

Pro Gly Ala Gly Leu Arg Leu Arg Cys Leu Arg Pro Arg Arg Arg Arg

20 25 30

Arg Arg Arg Trp Arg Val Gly Glu

35 40

<210> 17

<211> 128

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> ДРУГИЕ ПРИЗНАКИ

<222> (122)..(123)

<223> аминокислоты повторяются o раз

<400> 17

Gly Arg Glu Ser Lys Glu Glu Ala Arg Ser Pro Ser Leu Val Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Ser Pro Gly Pro Gly Cys Arg

20 25 30

Gln Phe His Gln Ser Leu Glu Ala Lys Ala Arg His Pro Ala Ser Val

35 40 45

Arg Glu Met Arg Gly Lys Val Lys Met Arg Arg Ala Leu Arg Arg Ala

50 55 60

Pro Ala Ser Thr Arg Ala Ser Ser Arg Gln Pro Asn Pro Lys Gln Pro

65 70 75 80

Pro Ala Arg Met Pro Pro Pro His Ser Pro Thr Arg His Arg Leu Arg

85 90 95

Leu Arg Arg Arg Gly Arg Arg His Arg Asn Arg Ser Pro Ala Pro Gly

100 105 110

Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Pro Arg Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro

115 120 125

<210> 18

<211> 87

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> ДРУГИЕ ПРИЗНАКИ

<222> (29)..(30)

<223> аминокислоты повторяются p раз

<400> 18

Arg Leu Thr Arg Arg Lys Gln Gly Gly Lys Gln Pro Gln Pro Val Ala

1 5 10 15

Ser Ser Gly Thr Gln Glu Ser Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Pro Gly

20 25 30

Arg Gly Val Val Gly Ala Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Arg Gly Cys

35 40 45

Gly Cys Gly Ala Cys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Glu

50 55 60

Trp Val Ser Glu Glu Ala Ala Ser Trp Arg Val Ala Val Trp Gly Ser

65 70 75 80

Ala Ala Gly Lys Arg Arg Gly

85

<210> 19

<211> 88

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> ДРУГИЕ ПРИЗНАКИ

<222> (62)..(63)

<223> аминокислоты повторяются q раз

<400> 19

Gly Glu Pro Pro Leu Leu Pro Ala Pro Leu Pro Gly Ser Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Ser His Pro Pro Gly Cys Arg Leu Leu Thr His Pro Leu Ala Thr

20 25 30

Ala Cys Ala Ser Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr Ala Thr Ala Ala Pro

35 40 45

Pro Arg Ala Arg Pro Arg Ala Arg Pro Asp His Ala Pro Ala Pro Ala

50 55 60

Pro Ser Ala Arg Leu Leu Ser Ser Arg Ala Cys Tyr Arg Leu Arg Leu

65 70 75 80

Phe Pro Ser Leu Phe Ser Ser Gly

85

<210> 20

<211> 196

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> ДРУГИЕ ПРИЗНАКИ

<222> (186)..(187)

<223> аминокислоты повторяются r раз

<400> 20

Ser Pro Arg Arg Gln Gly Pro Ser Arg Val Pro Ser Glu Pro Arg Leu

1 5 10 15

Gly Pro Gln Lys Pro Arg Ala Ala His Pro Pro Ala Phe Pro Gln Ala

20 25 30

Arg Pro Leu Ser Thr Arg Gly Ser Leu Phe Ser Ser Pro Gln Arg Gln

35 40 45

Arg Ser Gln Arg Val Pro Gly Lys Glu Thr Ala Arg Val Leu Arg Ala

50 55 60

Gly Lys Gln Gly Arg Gly Gln Ile Pro Ile Pro Cys Pro Cys Ala Ala

65 70 75 80

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Lys Pro Gly Ala Arg Met Gln Ala Ile

85 90 95

Pro Pro Val Ala Arg Gly Glu Ser Pro Thr Pro Ser Phe Gly Gln Arg

100 105 110

Asn Glu Arg Glu Ser Lys Asn Ala Ser Ser Ser Glu Glu Ser Pro Arg

115 120 125

Phe Tyr Pro Arg Leu Phe Pro Ala Ala Glu Pro Gln Thr Ala Thr Arg

130 135 140

Gln Asp Ala Ala Ser Ser Leu Thr His Ser Pro Pro Pro Ala Pro Pro

145 150 155 160

Pro Pro Arg Ala Gln Ala Pro Gln Pro Gln Pro Arg Pro Gly Pro Ala

165 170 175

Pro Gly Pro Ala Pro Thr Thr Pro Arg Pro Arg Arg Pro Arg Pro Leu

180 185 190

Ala Arg Asp Ser

195

<210> 21

<211> 21

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> ДРУГИЕ ПРИЗНАКИ

<222> (2)..(2)

<223> аминокислота явяется NLE (норлейцином)

<400> 21

Gly Xaa Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala

1 5 10 15

Gly Ala Gly Ala Gly

20

<---

Группа изобретений относится к иммуногену для применения в предотвращении или лечении семейной лобно-височной деменции (ЛВД), бокового амиотрофического склероза (БАС) и/или БАС-ЛВД у пациентов с экспансией повтора C9orf72. Иммуноген включает полипептид, состоящий из дипептидных повторов с последовательностью (Gly-Ala)_a, где a является целым числом от 7 до 15, и иммуногенный белок-носитель. Иммуногенный белок-носитель может быть выбран из столбнячного анатоксина (АС), HSP60, гемоцианина Concholepas concholepas (CCH), дифтерийного токсина CRM197, дифтерийного анатоксина (АД), комплекса белков наружной мембраны менингококка (OMPC), овальбумина (ОВА), гемоцианина фисуреллы (KLH) или бычьего сывороточного альбумина (БСА). Вакцинация против (Gly-Ala) приводит к высокому титру антител в плазме и значительным титрам в СМЖ и лечению пациентов, несущих мутацию C9orf72 и страдающих БАС, ЛВД или БАС-ЛВД. 8 н. и 8 з.п. ф-лы, 10 ил., 10 пр.

1. Применение иммуногена в предотвращении или лечении семейной лобно-височной деменции - ЛВД, бокового амиотрофического склероза - БАС и/или бокового амиотрофического склероза – лобно-височной деменции (БАС-ЛВД) у пациентов с экспансией повтора C9orf72, включающего полипептид, состоящий из дипептидных повторов с последовательностью (Gly-Ala)_a, где a является целым числом от 7 до 15, причем иммуноген дополнительно включает иммуногенный белок-носитель.

2. Применение по п. 1, где иммуногенный белок-носитель выбран из группы, состоящей из столбнячного анатоксина (АС), HSP60, гемоцианина Concholepas concholepas (CCH), дифтерийного токсина CRM197, дифтерийного анатоксина (АД), комплекса белков наружной мембраны менингококка (OMPC), овальбумина (OVA), гемоцианина фисуреллы (KLH) или бычего сывороточного альбумина (БСА).

3. Применение по любому из предыдущих пунктов, где белок-носитель нековалентно или ковалентно связан с полипептидом, необязательно посредством спейсера.

4. Применение по любому из предыдущих пунктов, где спейсер представляет собой PEG-спейсер.

5. Применение по любому из предыдущих пунктов, где ЛВД и БАС вызваны экспансией гексануклеотидного повтора (GGGGCC)_n в 5'-направлении от кодирующей области C9orf72.

6. Применение по любому из предыдущих пунктов, где иммуноген применяют на пресимптоматической или продромальной стадии у носителей экспансии повтора C9orf72 для предотвращения или лечения ЛВД, БАС и БАС-ЛВД.

7. Применение по любому из предыдущих пунктов, где иммуноген используется в режиме «прайм-буст», состоящем из по меньшей мере одного бустерного применения.

8. Иммуногенная композиция для вызывания иммунного ответа у пациентов с экспансией повтора C9orf72, включающая или состоящая из:

- иммуногена, содержащего или состоящего из полипептида, состоящего из:

- дипептидных повторов с последовательностью (Gly-Ala)_a, где a является целым числом от 7 до 15, и

- иммуногенного белка-носителя, выбранного из группы, состоящей из столбнячного анатоксина (АС), HSP60, гемоцианина Concholepas concholepas (CCH), дифтерийного токсина CRM197, дифтерийного анатоксина (АД), комплекса белков наружной мембраны менингококка (OMPC), овальбумина (ОВА), гемоцианина фисуреллы (KLH) или бычьего сывороточного альбумина (БСА);

и

- фармацевтически приемлемого носителя и/или подходящего вспомогательного вещества (веществ).

9. Иммуногенная композиция по п. 8, которая дополнительно включает адъювант.

10. Иммуногенная композиция по п. 9, где адъювант выбран из:

− неполного адъюванта Фрейнда;

− CpG-олигодезоксинуклеотидов;

− Хилтонола (поли-ICLC);

− неорганических адъювантов;

− органических адъювантов;

− эмульсий "масло в воде";

− цитокинов;

− адъювантов в виде частиц;

− виросом;

− бактериальных адъювантов;

− синтетических адъювантов; и

− их комбинаций.

11. Применение иммуногенной композиции по любому из пп. 8-10 в предотвращении или лечении ЛВД, БАС и/или БАС-ЛВД у пациентов с экспансией повтора C9orf72.

12. Набор для применения в вакцинации у пациентов с экспансией повтора C9orf72, включающий иммуноген, содержащий или состоящий из полипептида, состоящего из дипептидных повторов с последовательностью (Gly-Ala)_a, где a является целым числом от 7 до 15, и иммуногенного белка-носителя; или иммуногенную композицию по любому из пп. 8-10 и инструкции по применению для предотвращения или лечения ЛВД, БАС и/или БАС-ЛВД .

13. Способ лечения или предотвращения ЛВД, БАС и/или БАС-ЛВД у субъекта с экспансией повтора C9orf72, который включает введение

(a) иммуногена, включающего полипептид, состоящий из дипептидных повторов с последовательностью (Gly-Ala)_a, где a является целым числом от 7 до 15, причем иммуноген дополнительно включает иммуногенный белок-носитель, или

(b) иммуногенной композиции, содержащей указанный иммуноген и фармацевтически приемлемый носитель и/или подходящее вспомогательное вещество (вещества).

14. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуноген, включающий полипептид, состоящий из дипептидных повторов с последовательностью (Gly-Ala)_a, где a является целым числом от 7 до 15, причем иммуноген дополнительно включает иммуногенный белок-носитель, выбранный из группы, состоящей из столбнячного анатоксина (АС), HSP60, гемоцианина Concholepas concholepas (CCH), дифтерийного токсина CRM197, дифтерийного анатоксина (АД), комплекса белков наружной мембраны менингококка (OMPC), овальбумина (ОВА), гемоцианина фисуреллы (KLH) или бычьего сывороточного альбумина (БСА).

15. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по п. 14.

16. Иммуноген для вызывания иммунного ответа у пациентов с экспансией повтора C9orf72, включающий или состоящий из:

− полипептида, включающего или состоящего из дипептидных повторов с последовательностью (Gly-Ala)_a, где a представляет собой целое число от 7 до 15; и

− иммуногенного белка-носителя, выбранного из группы, состоящей из столбнячного анатоксина (АС), HSP60, гемоцианина Concholepas concholepas (CCH), дифтерийного токсина CRM197, дифтерийного анатоксина (АД), комплекса белков наружной мембраны менингококка (OMPC), овальбумина (ОВА), гемоцианина фисуреллы (KLH) или бычьего сывороточного альбумина (БСА),

где белок-носитель нековалентно или ковалентно связан с полипептидом, необязательно посредством спейсера.