Средство, обладающее ноотропным действием Российский патент 2025 года по МПК A61K36/36 A61K31/352 A61P25/28 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к клинической фармакологии, и может быть использовано в качестве ноотропного средства.

В свете роста стрессовых факторов и социально-экономического напряжения актуально применение ноотропных препараты как в терапии различных заболеваний, так и у здоровых людей [1]. Учитывая важное проявление действия ноотропных препаратов, как активация интеллектуальных и мнестических функций, областью их применения у здоровых людей будет повышение умственной работоспособности в критических ситуациях, состоянии стресса, переутомления и депривации сна, при повышенных физических и интеллектуальных нагрузках [2, 3, 4]. Применяемые в настоящее время ноотропы, полученные путем химического синтеза, требуют применения в течение нескольких недель (эффект развивается постепенно), т.к. фармакологическая активность большинства ноотропных препаратов невысока, сопровождается рядом побочных эффектов (аллергические реакции, раздражительность, бессонница, тошнота, рвота, диарея, боли в животе, лабильность АД) [3, 5]. Средство на основе природного растительного сырья, обладающего ноотропным действием, поможет решить эту проблему

В связи с этим, задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала средств из природного растительного сырья, обладающего ноотропной активностью.

Для получения предлагаемого средства, индивидуального соединения С-дигликозид апигенина - апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил 8-C-α-L арабинопиранозид (шафтозид), выделенного из надземной части Lychnis chalcedonica, ключевым этапом было использование многократной экстракции концентрированного этанольного экстракта н-бутанолом с последующим разделением с помощью колоночной адсорбционной хроматографии и препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Поставленная задача решается применением в качестве ноотропного средства, индивидуального соединения ряда С-дигликозид апигенина - апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил 8-C-α-L арабинопиранозид (шафтозид), выделенный из надземной части Lychnis chalcedonica.

Впервые показано, что средство, индивидуальное соединение - апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил 8-C-α-L арабинопиранозид (шафтозид), выделенный из Lychnis chalcedonica, оказывает ноотропное действие.

В проанализированной патентной и научно-медицинской литературе сведений о ноотропном действии апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил 8-C-α-L арабинопиранозид - шафтозид, не обнаружено. Ноотропное действие апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил 8-C-α-L арабинопиранозид (шафтозида) явным образом не вытекает из уровня техники в данной области и не является очевидным для специалиста. Экспериментально установлено новое свойство шафтозида, а также возможность использования шафтозида в качестве средства, обладающего ноотропной активностью в практическом здравоохранении.

В качестве препарата сравнения выбран ноотропил 400 мг/кг (ЮСБ Фарма С.А. (Бельгия). Является ноотропным средством, который непосредственно воздействует на мозг, улучшая когнитивные (познавательные) процессы, такие как способность к обучению, память, внимание, а также умственную работоспособность [3].

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему фигур:

на фиг. 1 - ВЭЖХ чистого шафтозида, выделенного из Lychnis chalcedonica.

на фиг. 2 - УФ-спектр выделенного флавоноида - шафтозида.

Средство, обладающее ноотропным действием, представляет собой индивидуальное соединение - апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил 8-C-α-L арабинопиранозид - флавоноид шафтозид (C₂₆H₂₈O₁₄₎, выделенный из надземной части Lychnis chalcedonica.

Предлагаемое средство получают следующим образом.

Концентрированный этанольный экстракт, полученный из 200 г лихниса халцедонского, разбавленный дистиллированной водой (1:3), многократно подвергали селективной экстракции органическими растворителями - н-гексан, бутиловый спирт. Выход комплекса веществ, очищенного от пигментов и других сопутствующих веществ, составил 5,8 % от массы сухого сырья. Дальнейшее выделение комплекса флавоноидов проводили растворением системами этилацетат : этанол (5:1 и 3:1 по объему). Полученный комплекс растворяли в 70 % этиловом спирте и подвергали разделению на колонке с силикагелем марки КСКГ 0,1-0,16 мм (Хроманалит). В качестве элюирующих систем использовали смеси хлороформ : этанол (1:9-1:1 по объему). Фракции, обогащенные флавоноидом, по данным ТСХ и ВЭЖХ, объединяли, концентрировали и перекристаллизовывали 96 % этанолом. Идентификацию индивидуального флавоноида провели на основе данных масс-спектрометрии, ЯМР-спектроскопии [6].

Характеристика выделенного индивидуального соединения - апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил 8-C-α-L арабинопиранозид - флавоноид шафтозид (C₂₆H₂₈O₁₄), представлена в таблице 1. Чистота выделенного индивидуального соединения шафтозида составила 95,49 %.

Таблица 1 - Характеристика выделенного индивидуального соединения - апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил 8-C-α-L арабинопиранозид - флавоноид шафтозид

Флавоноид Брутто-формула Мол. масса Площадь пика, % Максимум поглощения нм Время удерживания, мин Шафтозид C₂₆H₂₈O₁₄ 564 95.4924 271; 336 13.379

Ноотропное действие индивидуального соединения - апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил 8-C-α-L арабинопиранозид (шафтозида) Lychnis chalcedonica было найдено в результате экспериментальных исследований. Эксперименты выполнены на аутбредных мышах линии CDI (самцы) (I категории согласно сертификату) массой 29-37 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга. Работу с экспериментальными животными осуществляли в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (г. Страсбург, 1986).

Влияния шафтозида на обучение и память исследовали при выработке и воспроизведении условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) и условного рефлекса с положительным подкреплением в Т-образном лабиринте [7, 8, 9].

В экспериментах животные были распределены на следующие группы: контрольная, сравнения, опытная. Мыши группы контроля получали воду очищенную. В группе сравнения использовали ноотропил в дозе 400 мг/кг. В эксперименте УРПИ животные опытных групп получали предлагаемое средство - индивидуальное соединение шафтозид в дозах 0,001 мг/кг, 0,015 мг/кг, 0,03 мг/кг. Новое вещество и препарат сравнения вводили ежедневно однократно внутрижелудочно в течение 5 дней, последний раз - за 1 час до исследования в экспериментальной установке УРПИ. В эксперименте на модели условного питьевого рефлекса в сложном трёхзвенном Т-образном лабиринте была выбрана одна опытная группа животных, получавшая раствор шафтозида в дозе 0,015 мг/кг, которая в эксперименте УРПИ проявила максимальный ноотропный эффект. Новое вещество и препарат сравнения вводили зондом в желудок в виде раствора в воде очищенной за 1 ч до первого тестирования (побежки). Контрольные животные получали эквивалентное количество воды очищенной. Введение шафтозида и ноотропил начинали с момента лишения животных воды (всего 6 введений). Критерием ноотропной активности при выработке и воспроизведении УРПИ служило статистически значимое, в сравнении с группой контроля и группой, получавшей препарат сравнения ноотропил, количество животных с сохраненным рефлексом пассивного избегания. А в эксперименте условного рефлекса с положительным подкреплением в Т-образном лабиринте критерием ноотропной активности служило статистически значимое, в сравнении с группой контроля и группой, получавшей препарат сравнения ноотропил, уменьшение латентного времени и количества горизонтальных перемещений до первого акта питья, сокращение количества ошибок.

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием программного обеспечения IBM. Вычисляли среднее арифметическое ошибку среднего арифметического (m), значение вероятности (P). Различие двух сравниваемых величин считали достоверным, в случае если вероятность их тождества была меньше 5% (P<0,05). Используя выборочные коэффициенты асимметрии и эксцесса, оценивали степень приближения закона распределения исследуемого признака к нормальному. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента. При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараметрический критерий U-критерий Уилкоксона-Манна-Уитни. Для сравнения результатов экспериментов, где показатели выражались в долях, достоверность определяли с помощью метода углового преобразования Фишера. Значимость различий считали достоверной при P≤0,05 [10]. Использовалась программа «Statistica 6.0».

Пример 1. Влияния предлагаемого средства, содержащего индивидуальное соединение - шафтозид из лихниса халцедонского Lychnis chalcedonica, на обучение и память исследовали при выработке и воспроизведении УРПИ. Водные растворы шафтозида в дозах 0,001 мг/кг, 0,015 мг/кг, 0,03 мг/кг и ноотропила в дозе 400 мг/кг мыши получали внутрижелудочно ежедневно однократно в течение 5 дней, последний раз - за 1 час до исследования в экспериментальной установке УРПИ. Животные группы контроля получали воду очищенную в эквивалентном объеме. Методика УРПИ основана на подавлении врожденного рефлекса предпочтения темного пространства, имеющегося у грызунов [7]. Экспериментальная установка представляла собой камеру, состоящую из двух отсеков: большого - освещенного и малого - темного. Животное помещалось в светлый отсек и вскоре (через 10-20 с), в силу врожденного рефлекса предпочтения темного пространства, переходило в малый отсек, после чего дверка, соединяющая оба отсека, перекрывалась, и на пол темного отсека, состоящего из параллельных чередующихся электродов, подавали электрический ток импульсами продолжительностью 50 Мс, частотой 5 Гц и амплитудой 50 мА. Через 10 с дверку открывали, и животное могло выскочить в светлый отсек с обычным полом. В результате описанной процедуры у животных вырабатывался условный рефлекс избегания темного пространства. При проверке воспроизводимости рефлекса животных помещали в светлый отсек в угол, противоположный от входа в темный отсек, и наблюдали в течение 3-х мин. Регистрировали время первого захода в темный отсек (латентное время захода), суммарное время пребывания в темном отсеке. Выработанным рефлекс считался, если в течение всех 3-х мин наблюдения животное ни разу не посетило темный отсек или латентное время захода превышало 150 с. О качестве рефлекса судили по доле животных с наличием рефлекса. Проверку рефлекса осуществляли через 24 ч, на 7, 14, 21, 28 сутки после выработки. В дни проверки сохранности рефлекса животным вводили растворы шафтозида и ноотропила, чтобы исключить влияние феномена диссоциации.

В результате проведенного эксперимента было установлено, что животные, получавшие предлагаемое средство шафтозид из Lychnis chalcedonica в дозе 0,015 мг/кг, демонстрировали воспроизведение УРПИ в ходе всего исследования на уровне 89-100% (табл. 2). При этом в 14, 21 и 28 сутки сохранность рефлекса была достоверно выше в 1,6, 1,8 и 2,7 раза соответственно относительно показателей контрольной группы. Применение шафтозида в дозах 0,001 мг/кг и 0,03 мг/кг способствовало воспроизведению УРПИ у 100% животных только в 1 и 7 сутки после его выработки. В последующие дни проверки рефлекс у животных угасал. В группе животных, получавших ноотропил, фиксировали сохранность рефлекса на уровне 75-100% вплоть до 21 дня. Но в 28 день после выработки УРПИ памятный след сохранялся только у 50% животных.

Таким образом, предлагаемое средство шафтозид из Lychnis chalcedonica в дозе 0,015 мг/кг в эксперименте при выработке и воспроизведении условного рефлекса пассивного избегания, проявлял более выраженное влияние на обучение и память, чем препарат сравнения ноотропил.

Таблица 2 - Влияние курсового введения шафтозида из лихниса халцедонского Lychnis chalcedonica на сохранность УРПИ у мышей-самцов CDI (X ± m)

Группа наблюдения, доза % животных с сохранившимся рефлексом 24 ч. после выработки 7 суток после выработки 14 суток после выработки 21 суток после выработки 28 суток после выработки 1. Контроль (n=9) 100 89 56 56 33 2. Ноотропил 400 мг/кг (n=8) 75 88 100* 100* 50 3. Шафтозид 0,001 мг/кг (n=9) 100 100 56# 78 56 4. Шафтозид 0,015 мг/кг (n=9) 100 100 89* 100* 89*# 5. Шафтозид 0,03 мг/кг (n=8) 100 88 63# 50# 50 Примечание. р<0,05 в сравнении *с интактным контролем, # с ноотропилом.

Пример 2. Изучение влияния предлагаемого средства, содержащего индивидуальное соединие - шафтозид из лихниса халцедонского Lychnis chalcedonica, на выработку и воспроизведение условного питьевого рефлекса со сложной пространственной ориентировкой проводили в Т-образном лабиринте [8, 9]. Эксперименты выполняли на мышах на фоне водной депривации. Была выбрана одна опытная группа животных, получавшая раствор шафтозида в дозе 0,015 мг/кг, которая в эксперименте УРПИ проявила максимальный ноотропный эффект. Новое вещество и препарат сравнения вводили зондом в желудок в виде раствора в воде очищенной за 1 ч до первого тестирования (побежки). Контрольные животные получали эквивалентное количество воды очищенной. Введение шафтозида и ноотропил начинали с момента лишения животных воды, т.е. всего 6 введений.

Лабиринт представлял собой установку, состоящую из 1 стартовой камеры и 2 систем коридоров, каждая из которых включала в себя по 3 Т-образных колена, спирально соединенных между собой и заканчивающихся целевыми камерами. Процедура обучения выглядела следующим образом: мышей оставляли без воды на одни сутки. Затем в течение 2-х дней каждую мышь дважды в день на 15 мин с интервалом в 1 ч индивидуально помещали в лабиринт, где беспорядочно были расставлены 6 поилок (1 этап обучения). Процесс выработки рефлекса начинался со второго этапа, когда на третий день животное помещалось в стартовую камеру лабиринта, при этом все поилки из последней были убраны. Мышь начинала искать поилку, выходила из стартовой камеры и делала первый поворот в правую или левую часть лабиринта. Направление первого поворота фиксировали и считали предпочтительным направлением поворота для данного животного. Немедленно вслед за этим в целевую камеру, находящуюся в половине лабиринта, противоположной той, в которую мышь повернула в первый раз, ставили поилку. При всех последующих побежках поилку ставили для данной мыши именно в эту целевую камеру. Это делалось для того, чтобы при становлении условного рефлекса исключить влияние предпочтительного направления поворота на процесс обучения. Каждое животное тестировали в лабиринте таким образом в течение 15 мин. В тот же день животное через 1 ч совершало вторую побежку. Так каждая мышь обучалась в течение 5 дней, совершая 10 побежек. Этапы обучения: 1 этап - 1, 2 дни, 2 этап - 3, 4, 5 дни. О качестве обучения судили по сокращению времени достижения поилки, уменьшению количества горизонтальных перемещений до первого акта питья, уменьшению количества ошибок (заходы в неправильные рукава лабиринта и тупики).

Согласно полученным данным, применение индивидуального соединия - шафтозида из лихниса халцедонского Lychnis chalcedonica, способствовало более быстрому, в сравнении с группой контроля, обучению мышей. Это выражалось в достоверном сокращении латентного времени до первого акта питья, уменьшении количества горизонтальных перемещений до первого акта питья и сокращении количества ошибок (табл. 3).

Таблица 3 - Влияние шафтозида из лихниса халцедонского Lychnis chalcedonica на показатели второго этапа обучения при выработке сложного условного питьевого рефлекса у мышей-самцов CDI (X ± m)

Группа наблюдения, доза Латентное время до первого акта питья, с Количество горизонтальных перемещений до первого акта питья Количество ошибок 1. Контроль 324,5±78,3 46,9±10,0 20,6±5,0 2. Ноотропил 400 мг/кг 284,0±70,6 44,3±9,5 19,3±4,8 3. Шафтозид 0,015 мг/кг 139,3±37,6* 23,3±4,1* 8,7±2,1* Примечание: р<0,05 в сравнении *с интактным контролем.

Таким образом, в результате проведенного исследования при выработке и воспроизведении условного питьевого рефлекса со сложной пространственной ориентировкой в Т-образном лабиринте показано, что предлагаемое средство, индивидуальное соединение шафтозид из Lychnis chalcedonica, в дозе 0,015 мг/кг оказывал выраженное влияния на обучение и память.

Предлагаемое в качестве изобретения средство, содержащее индивидуальное соединение – апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил 8-C-α-L арабинопиранозид (шафтозид) из Lychnis chalcedonica, оказывает выраженное положительное влияние на обучение и память, обладает тем самым ноотропным эффектом.

Источники информации

1. Кохан С.Т. Сравнительное влияние растительных средств, обладающих ноотропной активностью / С.Т. Кохан, А.В. Патеюк // Загальна патологія та патологічна фізіологія. - 2012. - Т. 7, № 2. - С. 65-69.

2. Титов Н.В. Современный взгляд на ноотропную терапию / Н.В. Титов // Русский медицинский журнал. - 2007. - № 24. - С. 1846.

3. Машковский М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. - 16 изд. перераб., испр. и доп. - М.: Новая волна, 2012. - С. 116-118.

4. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - С. 276.

5. Лихачев С.А. Применение Пантогама при лечении болезней нервной системы / С.А. Лихачев, В.В. Войтов, Е.А. Кузовкова // Неврология и нейрохирургия. Восточная Европа. - 2012. - № 1. - С. 92-97.

6. Зибарева Л.Н. Растения родов Silene L. и Lychnis L. (Caryophyllaceaeae): состав химических компонентов и биологическая активность / Л.Н. Зибарева, Е.Н. Амосова, С.Г. Крылова и др. - Томск: Издательство Томского государственного университета, 2021. С. 58-60.

7. Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я. Буреш, О. Бурешова, Дж. П. Хьюстон. - М.: Высшая школа, 1991. - 175-177.

8. Азарашвили А.А. Исследование механизмов памяти с помощью физиологически активных веществ / А.А. Азарашвили. - М.: Наука, 1981. С. 53-54.

9. Суслов Н.И. Применение ксенона в медицине / Н.И. Суслов, В.Н. Потапов, М.Н. Шписман и др. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2009. С. 126-136.

10. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин - М.: Высшая школа, 1980. - 293 с.

Изобретение относится к медицине и к клинической фармакологии, и может быть использовано в качестве ноотропного средства. Применение индивидуального соединения – апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил 8-C-α-L арабинопиранозид, выделенного из надземной части Lyсhnis chalcedonica, в качестве ноотропного средства. Вышеописанное применение расширяет арсенал средств на основе природного растительного сырья, обладающих ноотропной активностью. 2 ил., 3 табл., 2 пр.

Применение индивидуального соединения – апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил 8-C-α-L арабинопиранозид, выделенного из надземной части Lychnis chalcedonica, в качестве ноотропного средства.