Средство, обладающее антигипоксическим действием Российский патент 2024 года по МПК A61K36/36 A61P43/00 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и может быть использовано в качестве антигипоксического средства в терапии различных заболеваний, связанных с нарушением функций дыхательной, сердечно-сосудистой систем, печени, почек, транспортной функции крови, а также при отравлении различными ядами.

Арсенал высокоэффективных противогипоксических средств ограничен и вопросы фармакологической коррекции резистентности к гипоксии остаются актуальными. При гипоксии необратимые изменения и гибель клетки обусловлены нарушением многих метаболических путей в цитоплазме и митохондриях, возникновением ацидоза, активацией свободнорадикального окисления, повреждением биологических мембран, затрагивающим как липидный бислой, так и мембранные белки, включая ферменты [Марышева, В. В. Антигипоксанты аминотиолового ряда / В.В. Марышева // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2008. - Т. 5, № 2. - С. 17-27]. Антигипоксанты рассматриваются как препараты не истощающего механизма действия, снижающие потребности клеток в кислороде и пролонгирующие их жизнеспособность при кислородном голодании различного генеза. Клиническое изучение антигипоксантов показало их эффективность при широком круге патологий с гипоксическими и ишемическими расстройствами: стрессе, острой и подострой дыхательной недостаточности, инсультах, инфарктах, шоке различной этиологии, при выполнении травматичных хирургических операций на органах грудной и брюшной полостей, трансплантации органов, гипоксии плода [Лызиков, А.Н. Перспективы клинического применения антигипоксанта «Бемитил» / А.Н. Лызиков, Э.С. Питкевич, С.Н. Мельник // Проблемы здоровья и экологии. - 2011. - № 1. - С. 7-14].

Наиболее близким по положительному эффекту является Витамин E (α-Токоферола ацетат), обладающий выраженными антигипоксическими свойствами, и относится к веществам, лимитирующим потребление тканей в О₂ (ингибирует процессы свободнорадикального и микросомального окисления, предотвращает образование пероксидов, повреждающих клеточные и субклеточные мембраны) [Сосин, Д. В. Механизмы формирования острой экзогенной гипоксии и возможности ее фармакологической коррекции антигипоксантами / Д. В. Сосин, О Е. Шалаева, А.В. Евсеев, П.Д. Шабанов // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2015. - Т. 13, № 1. - С. 3-24]. α-Токоферол стимулирует синтез гема и гемсодержащих ферментов, улучшает тканевое дыхание, ингибирует синтез холестерина; предупреждает увеличение проницаемости и ломкости капилляров, но является синтетическим препаратом, имеет ряд побочных эффектов и требует соблюдение осторожности в применении при ряде заболеваний [Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. - 16 изд. перераб., испр. и доп. - М.: Новая волна, 2012. - С. 627].

Задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала средств, обладающих антигипоксическим действием из природного растительного сырья.

Для получения предлагаемого средства, индивидуального соединения С-дигликозид апигенина - шафтозида, выделенного из надземной части Lychnis chalcedonica, ключевым этапом было использование многократной экстракции концентрированного этанольного экстракта н-бутанолом с последующим разделением с помощью колоночной адсорбционной хроматографии и препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Поставленная задача решается применением в качестве антигипоксанта индивидуального соединения ряда С-дигликозид апигенина - апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил-8-C-α-L-арабинопиранозид (шафтозид), выделенного из надземной части Lychnis chalcedonica L.

Впервые показано, что средство, содержащее индивидуальное соединение - апигенин-6-C-β-D-глюкопиранозил-8-C-α-L-арабинопиранозид (шафтозид), выделенный из Lychnis chalcedonica, оказывают антигипоксическое действие.

В проанализированной патентной и научно-медицинской литературе сведений о антигипоксическом действии апигенин-6-C-β-D-глюкопиранозил-8-C-α-L-арабинопиранозид - шафтозид, не обнаружено. Антигипоксическое действие апигенин-6-C-β-D-глюкопиранозил-8-C-α-L-арабинопиранозид (шафтозида) явным образом не вытекает из уровня техники в данной области и не является очевидным для специалиста. Экспериментально установлено новое свойство шафтозида и возможность его использования в качестве средства, обладающего антигипоксическим действием в практическом здравоохранении.

В качестве препарата сравнения выбран α-Токоферола ацетат (ЗАО «ЭКОлаб», Россия) - синтетический аналог Витамина E.

Изобретение поясняется следующими фигурами:

фиг. 1 - ВЭЖХ чистого шафтозида, выделенного из Lychnis chalcedonica.

фиг. 2 - УФ-спектр выделенного флавоноида - шафтозида.

Средство, обладающее антигипоксическим действием, представляет собой индивидуальное соединение - апигенин-6-C-β-D-глюкопиранозил-8-C-α-L-арабинопиранозид - флавоноид шафтозид (C₂₆H₂₈O₁₄₎, выделенный из надземной части Lychnis chalcedonica.

Предлагаемое средство получают следующим образом.

Экстракцию воздушно-сухого сырья (200 г) растения лихниса халцедонского Lychnis chalcedonica проводили 70% этиловым спиртом. Затем для удаления экстрагента объединенный экстракт концентрировали при температуре 50°C с помощью вакуумного ротационного испарителя IKA HB 10 digital (Германия). Концентрированный экстракт разбавляли водой до соотношения 1:3 (v:v) и фильтровали. Затем фильтрат очищали от липофильных веществ при помощи н-гексана. Извлечение суммы биологически активных веществ, содержащей экдистероиды, флавоноиды и др. из очищенного фильтрата осуществляют многократной экстракцией н-бутанолом. При этом из водной фракции выпадал осадок желто-коричневого цвета, который отделяли. Контроль содержания БАВ во фракциях осуществляют методом ТСХ. Выход бутанольной фракции составлял 5,8%. В последующем комплекс выделенных соединений подвергали очистке селективной экстракцией системами растворителей этилацетат: этанол в соотношении 5:1 и 3:1. Полученный порошок имел желтоватую окраску. Далее фильтрат подвергали хроматографическому разделению на колонке, заполненной силикагелем марки КСКГ 0,1-0,16 мм (Хроманалит), с использованием подвижных фаз хлороформ: этиловый спирт в соотношении 1:9-1:1. Перекристаллизацию флавоноида проводили 96% этанолом. ВЭЖХ анализ (фиг. 1) свидетельствует о том, что выделенное соединение представляет собой индивидуальный флавоноид с временем удерживания 13.379 мин. Выделенный флавоноид имеет два максимума поглощения, соответствующие двум ароматическим кольцам А и В (фиг. 2, табл. 1). Индивидуальное соединение было идентифицировано методами ВЭЖХ, масс-спектрометрии, ЯМР ¹Н и ¹³С-спектроскопии [11].

Характеристика выделенного индивидуального соединения - апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил-8-C-α-L-арабинопиранозид - флавоноид шафтозид (C₂₆H₂₈O₁₄), представлена в таблице 1. Чистота выделенного индивидуального соединения шафтозида составила 95,49 % [Зибарева Л.Н., Филоненко Е.С., Черняк Е.И., Морозов С.В., Котельников О.А. Флавоноиды некоторых видов растений рода Silene // Химия растительного сырья. 2022. № С. № 3. С. 109-118. Doi:10.14258/jcprm.20220310592].

Таблица 1. Флавоноид Брутто-формула Мол. масса Площадь пика, % Максимум поглощения нм Время удерживания, мин Шафтозид C₂₆H₂₈O₁₄ 564 95.4924 271; 336 13.379

Антигипоксическое действие индивидуального соединения - апигенин-6-C-β-D глюкопиранозил-8-C-α-L-арабинопиранозид (шафтозида) Lychnis chalcedonica было найдено в результате экспериментальных исследований. Эксперименты выполнены на аутбредных мышах линии CDI (самцы) (I категории согласно сертификату) массой 25-31 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга. Работу с экспериментальными животными осуществляли в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (г. Страсбург, 1986).

Для изучения антигипоксического действия была использована модель тканевой гипоксии, вызванной нитропруссидом натрия. В данной методике изучалось влияние вещества на продолжительность жизни животных после однократного введения натрия нитропруссида.

Животные в экспериментах были распределены на следующие группы: контрольная, сравнения, опытная. В контрольной группе животные получали воду очищенную. В группе сравнения использовали раствор α-Токоферола ацетат в дозе 100 мг/кг. Животные опытных групп получали предлагаемые средство - индивидуальное соединение шафтозид в дозах 0,001 мг/кг. Новое вещество и препарат сравнения вводили ежедневно однократно внутрижелудочно в течение 5 дней, последний раз - за 1 час до введения нитропруссида натрия. Натрия нитропруссид вводили внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг в виде водного раствора с последующим наблюдением за состоянием животных до их гибели. Критерием антигипоксантной активности служило статистически значимое увеличение продолжительности жизни животных по сравнению с контрольной группой и группой, получавшей препарат сравнения α-Токоферола ацетат [Аксиненко, С.Г. Тканевая гипоксия, вызванная нитропруссидом натрия и ее коррекция растительными средствами / С.Г. Аксиненко, Т.Н. Поветьева, Н.В. Провалова и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. Прилож. 1. - С. 49-53].

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием программного обеспечения IBM. Вычисляли среднее арифметическое ($$\overline{X}$$), ошибку среднего арифметического (m), значение вероятности (P). Различие двух сравниваемых величин считали достоверным, в случае если вероятность их тождества была меньше 5% (p<0,05). Используя выборочные коэффициенты асимметрии и эксцесса, оценивали степень приближения закона распределения исследуемого признака к нормальному. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента. При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараметрический критерий U-критерий Уилкоксона-Манна-Уитни [Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин - М.: Высшая школа, 1980. - 293 с.]. Использовалась программа «Statistica 6.0».

Пример 1. Определяли антигипоксическое действие флавоноида шафтозида, выделенного из надземной части Lychnis chalcedonica после однократного внутрибрюшинного введения натрия нитропруссида в дозе 25 мг/кг в виде водного раствора с последующим наблюдением за состоянием животных до их гибели. В процессе проведения эксперимента, предлагаемое средство - индивидуальное соединение флавоноид шафтозид, выделенный из надземной части Lychnis chalcedonica, вводили ежедневно однократно внутрижелудочно в течение 5 дней, последний раз - за 1 час до инъекции нитропруссида натрия. Животные в группе сравнения получали раствор α-Токоферола ацетата в дозе 100 мг/кг. Мыши контрольной группы получали растворитель (воду очищенную) в эквивалентном объеме. Антигипоксическое действие исследуемого средства оценивали по продолжительности жизни животных.

В результате проведенного эксперимента было установлено, что наибольшее увеличение продолжительности жизни мышей, в 1,4 раза (на 37%) относительно контроля, происходило под влиянием шафтозида в дозе 0,001 мг/кг, а раствор α-Токоферола ацетата - в 1,2 раза, в сравнении с контролем (на 20%) (таблица 2).

Таблица 2. Группа наблюдения, доза Продолжительность жизни, с Контроль, n=8 488,1±37,1 α-Токоферола ацетат 100 мг/кг, n=7 587,3±18,2* Шафтозид 0,001 мг/кг, n=8 670,6±47,9*

Примечание: различия достоверны при P<0,05 по сравнению * - с контролем.

Таким образом, в результате проведенного эксперимента было установлено, что индивидуальное соединение шафтозид из Lychnis chalcedonica в дозе 0,001 мг/кг проявляет более выраженную антигипоксическую активность, чем препарат сравнения α-Токоферола ацетат.

Предлагаемое в качестве изобретения средство, содержащее индивидуальное соединение - апигенин-6-C-β-D-глюкопиранозил-8-C-α-L-арабинопиранозид (шафтозид) из Lychnis chalcedonica, оказывает антигипоксическое действие.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и может быть использовано в качестве антигипоксического средства. Применение апигенин-6-С-β-D-глюкопиранозил-8-C-α-L-арабинопиранозида, выделенного из надземной части Lychnis chalcedonica, в качестве средства, обладающего антигипоксическим действием. Вышеописанное применение апигенин-6-С-β-D-глюкопиранозил-8-C-α-L-арабинопиранозида является эффективным в качестве средства, обладающего антигипоксическим действием. 2 ил., 2 табл., 1 пр.

Применение апигенин-6-С-β-D-глюкопиранозил-8-C-α-L-арабинопиранозида, выделенного из надземной части Lychnis chalcedonica, в качестве средства, обладающего антигипоксическим действием.