Способ применения гидроксихлорохина и его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания (варианты) Российский патент 2025 года по МПК A61K31/4706 A61K9/08 A61K9/127 A61K9/20 A61P35/00 

Группа изобретений относится к области медицины, онкологии, нанотехнологии и биотехнологии, а именно к способам направленной доставки в опухолевые клетки химиотерапевтических лекарственных препаратов в сочетании с соединением – гидроксихлорохином или его производными, увеличивающими интернализацию (проникновение в клетку) и эндосомальный выход (высвобождение внутри клетки) препаратов в клетках раковой опухоли человека.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В настоящее время описаны онкопатологии, которые занимают второе место в мире среди причин смертности и уступают только сердечно-сосудистым заболеваниям. Химиотерапия с использованием химиотерапевтических препаратов и препаратов таргетной терапии является одним из основных подходов к лечению онкозаболеваний. Главными проблемами при использовании низкомолекулярных химиотерапевтических и таргетных препаратов является плохая переносимость, необходимость использования высоких доз препарата, развитие лекарственной устойчивости. Успехи в области нанотехнологии и появление наноразмерных носителей для доставки цитостатиков в опухоль преимущественно за счёт механизма увеличенной проницаемости и удержания (EPR-эффект) привело к созданию множества потенциальных средств доставки цитостатиков [1]. Потенциально, данные носители должны приводить к более эффективному накоплению цитостатика в области опухоли, при этом уменьшать его накопление в здоровых тканях, что позволило бы снижать выраженность нежелательных реакций. Липосомы были одними из первых наноразмерных носителей, и ряд липосомальных препаратов для доставки цитостатиков (например, Taxol®, Caelyx®) были одобрены для медицинского применения. Однако, несмотря на более высокую безопасность и сопоставимую эффективность липосомальных препаратов по сравнению со свободными цитостатиками [2], липосомы имеют низкую биосовместимость и быстро подвергаются клиренсу клетками ретикулоэндотелиальной системы [3]. Кроме того, после интернализации липосом в целевую клетку, большая часть упакованного цитостатика остаётся в эндосомальном компартменте клетки и не выходит в цитоплазму, что снижает эффективность данного носителя [4].

Одной из динамично развивающихся областей наномедицины в последние годы являются бислойные липидные частицы. К бислойным липидным частицам относятся секретируемые частицы (внеклеточные везикулы, экзосомы EV) и экзосом-подобные частицы/везикулы emNV). Ряд препаратов на основе бислойных липидных частиц в настоящее время проходят клинические испытания [5]. Применение бислойных липидных частиц на практике особенно актуально в связи с их высокой биосовместимостью, безопасностью, стабильностью, способностью преодолевать биологические барьеры, возможностью программирования поверхности для таргетной доставки содержимого [6]. Тем не менее, аналогично липосомальным препаратам, основным барьером для доставки с использованием бислойных липидных частиц является захват в эндосомальном компартменте, значительно снижающий их эффективность [6].

Секретируемые частицы (внеклеточные бислойные липидные частицы, EV) являются одной из наиболее изученных биологических платформ для направленной доставки [7], и недавно секретируемые частицы EV были использованы в клинических испытаниях для терапии онкопатологий [8]. Частицы EV представляют собой протеолипидные наночастицы, которые образуются из эндосомального компартмента и секретируются клеткой после слияния с мультивезикулярными тельцами. Данные частицы EV имеют схожие биологические свойства с клетками, из которых они были получены, включая тропизм к опухолям [9]. Частицы EV могут секретироваться практически любыми клетками [10–12] и могут быть загружены различными терапевтическими молекулами, включая низкомолекулярные препараты [5] и биологические препараты [13]. Основным недостатком секретируемых частиц является дороговизна и большая длительность их производства, а также сложность загрузки препаратов в данные частицы без нарушения их структуры [14]. Исследования секретируемых частиц проводятся с 1960-х годов, и данные наночастицы являются золотым стандартом в области систем биологической доставки, а также считаются иммунологически безопасными [15].

Из уровня техники известны следующие источники информации.

В опубликованной патентной заявке США US20160137716A1 (Samir El Andaloussi, Huddinge (SE)), 19.05.2016 [32] описано использование ряда секретируемых частиц (экзосом и микрочастиц) и методы их производства для терапии различных заболеваний, в том числе онкопатологий. Описаны везикулы для терапевтической доставки, например, экзосомы или микровезикулы, содержащие полипептидные конструкции, способы получения указанных везикул для терапевтической доставки, фармацевтические композиции и их медицинское использование. Терапевтические полипептидные конструкции, содержащиеся во внеклеточных везикулах доставки, позволяют секвестрировать интересующие молекулы-мишени для лечения, например, нейровоспалительных заболеваний и рака.

Недостатком технического решения является то, что не рассматривается загрузка терапевтических молекул в данные носители, а также проблема эндосомального выхода упакованного содержимого.

Патент AU2018365299B2 (Evox Therapeutics Ltd), 16.05.2019 [33] включает описание необходимости введения белковых молекул, необходимых для эндосомального выхода внутри клеток-мишеней. Техническое решение относится к лекарственным средствам на основе внеклеточных везикул (EV), в которых EV содержат терапевтические средства на основе нуклеиновых кислот, такие как м-РНК, кольцевые РНК, mi-РНК, sh-РНК, кольцевые РНК и/или молекулы ДНК. Терапевтические средства на основе нуклеиновых кислот загружают в частицы EV с использованием белка для увеличения загрузки в частицы EV и облегчения высвобождения внутри клеток-мишеней.

Недостатком технического решения является то, что их включение в состав секретируемых частиц является технологически сложным и дорогостоящим. Также недостатком является, что использование известного способа дополнительно не увеличивает цитотоксическую активность химиопрепаратов.

В последние годы всё большее распространение получает технология экзосом-подобных частиц (emNV), которые синтезируются путем экструзии клеточной суспензии через серию фильтров с уменьшающимся диаметром пор [16]. В результате формируются частицы, представляющие собой клеточный цитозоль, окружённый клеточной мембраной. Данные частицы схожи по физико-химическим и биологическим свойствам с секретируемыми везикулами, и также могут быть получены практически из любого типа клеток [17]. В отличие от производства секретируемых частиц, производство emNV не требует длительного культивирования клеток и большого количества среды для культивирования. Суммарный выход частиц не зависит от состояния клеток-продуцентов и значительно превышает выход секретируемых частиц при производстве из одинакового количества клеток [17]. Аналогично другим наноносителям, при интернализации в клетку содержимое emNV секвестрируется в эндосомальном компартменте, и для обеспечения терапевтического действия упакованных молекул необходим их эндосомальный выход.

Известен патент на изобретение KR 10-0390332 (Yoo Oh-Young (KR)) от 27.06.2015 [34], в котором описана противораковая композиция, состоящая из противораковых (доксорубицин и цисплатин) и противомалярийных препаратов (гидроксихлорохин, хлорохин и примахин). Композиция предназначена для снижения минимального IC50 противоопухолевых препаратов и ингибирования развития лекарственной устойчивости раковых клеток, вызванной противоопухолевыми препаратами, тем самым усиливая действие противоопухолевых препаратов. Показано использование гидроксихлорохина в качестве противоракового средства для местного применения, который проявляет цитотоксическое действие по отношению к раковым клеткам, не влияя на нормальные клетки, и который должен вводиться непосредственно в раковые клетки.

Недостатком технического решения является отсутствие комбинирования противораковых препаратов с перспективными носителями (бислойными липидными частицами, липосомами, полимерными либо другими частицами), что ограничивает эффективность действия цитотоксических препаратов, а также увеличивает потенциальную токсичность химиотерапевтических препаратов в отношении здоровых тканей. Данная композиция показала отсутствие токсического действия на здоровые ткани только при местном введении (непосредственно в опухоль).

Известен патент на полезную модель RU 42953 U1 (Закрытое акционерное общество "Вектор-Медика" (RU)), 27.12.2004, [35], в котором описана липосомальная нанокапсула с доксорубицином. Липосомальная нанокапсула с доксорубицином представляет собой полую сферу, образованную двухслойной липидной оболочкой из фосфотидилхолина и димиристоилфосфотидилглицерина, содержащую внешний и внутренний гидрофильные липидные слои, между которыми расположена гидрофобная область двухслойной липидной оболочки, причем, нанокапсула дополнительно включает лактозу, распределенную во внешнем и внутреннем гидрофильных липидных слоях и внутреннем объёме сферы, и лекарственное средство доксорубицин, положительно заряженные молекулы которого расположены на поверхностях внешнего и внутреннего гидрофильных липидных слоев и прикреплены к отрицательно заряженным участкам молекул димиристоилфосфотидилглицерина. Внутренний и внешний гидрофобные слои липидной оболочки дополнительно содержат фосфотидилэтаноламин, ковалентно связанный с полиэтиленгликолем 2000, причем, гибкие гидрофильные цепи молекул полиэтиленгликоля расположены на поверхностях внешнего и внутреннего гидрофильных липидных слоев при следующем содержании всех компонентов липосомальной нанокапсулы (мг/мл): Фосфотидилхолин 1,36-13,6, Димиристоилфосфотидилглицерин 1,19-11,9, Лактоза 25,0-200,0, фосфотидилэтаноламин, ковалентно связанный с полиэтиленгликолем 2000 0,51-5,10, доксорубицин 1,0-5,0. Полезная модель обеспечивает создание такой липосомальной формы доксорубицина, которая увеличивает время её циркуляции в кровяном русле в несколько раз.

Недостатком технического решения является отсутствие способов увеличения эндосомального выхода (внутриклеточного высвобождения) упакованного химиопрепарата, сниженную цитотоксическую активность химиопрепарата по отношению к опухолевым клеткам. Кроме того, указанные синтетические липосомальные нанокапсулы имеют более низкую биосовместимость по сравнению с биологическими бислойными липидными частицами.

Известен источник информации – заявка на патент на изобретение US20200297631A1 (The University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC (US)), 24.09.2020, [36], взятый за наиболее близкий аналог (прототип) в котором описаны композиции, содержащие экзосомы и биологические агенты, и способы использования композиций для доставки биологических агентов к клеткам и субъектам.

Недостатком наиболее близкого аналога (в отношении заявленного технического результата) является отсутствие методов увеличения эндосомального выхода, в результате чего эффективность внутриклеточного высвобождения упакованного химиотерапевтического препарата может снижаться, что вызывает снижение эффективности действия препарата в целом и требует введения более высоких доз препарата.

В результате проведенного анализа уровня техники можно сделать вывод о том, что предлагаемая группа изобретений может быть признана соответствующей критериям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень» до даты испрашиваемого приоритета.

Целью предлагаемого технического решения является создание способов, позволяющих значительно увеличить эффективность противоопухолевых препаратов, внесенных (упакованных) в бислойные липидные частицы для доставки в организм пациента, при использовании более низких доз химиопрепаратов со сниженным токсическим действием на здоровые ткани.

Техническими результатами от реализации заявленной группы изобретений являются:

- увеличение цитотоксической активности химиопрепаратов, доставляемых в составе бислойных липидных частиц, за счет применения по новому назначению гидроксихлорохина и его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания,

- увеличение эффективности доставки лекарственного препарата в очаг ракового заболевания,

- увеличение эффективности действия химиотерапевтического лекарственного препарата,

- усиление цитотоксичности используемого химиотерапевтического препарата в отношении целевых клеток, что потенциально позволяет использовать более низкие дозы цитотоксичных веществ (химиотерапевтических препаратов),

- увеличение эндосомального выхода цитотоксических препаратов, упакованных в бислойные липидные частицы,

- повышение эффективности разрушения опухолевых клеток,

- расширение арсенала способов направленной доставки химиотерапевтических препаратов, включая цитостатиков и препаратов таргетной терапии, в опухолевые клетки с более высокой эффективностью.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для достижения технического результата, а также устранения недостатков имеющихся аналогов и прототипа, заявителем предложены способы применения гидроксихлорохина и его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания. Группа изобретений объединена единым изобретательским замыслом.

В настоящей группе изобретений описаны способы применения гидроксихлорохина или его производных для доставки химиотерапевтических препаратов, содержащихся в бислойных липидных частицах, и способы доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания, например, в гепатоцеллюлярную карциному, опухоль молочной железы, предстательной железы, поджелудочной железы, опухоль головы, опухоль шеи, опухоль головного мозга, глиобластомы, глиомы, рак легких, рак органов пищеварения, рак желудка, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак кожи или рак глаз.

Указанные технические результаты достигаются совокупностью существенных признаков, представленной в формуле изобретения.

В одной неограничивающей реализации изобретения предложен вариант способа применения гидроксихлорохина или его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания, включающий:

- получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосомы EV;

и/или получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосом-подобные частицы emNV;

- внесение химиотерапевтического лекарственного препарата, в качестве которого используют доксорубицин, фторурацил, паклитаксел, циклофосфамид или препараты таргетной терапии, в бислойные липидные частицы от 1 до 1×10¹² молекул химиотерапевтического лекарственного препарата на бислойную липидную частицу;

- внесение бислойных липидных частиц, содержащих химиотерапевтический лекарственный препарат, в раствор гидроксихлорохина или в раствор его производных, выбираемых из хлорохина или мефлохина, в концентрации от 5 мкМ до 100 мкМ;

- введение пациенту раствора в дозе 0,1 – 100 мг/кг веса, содержащего гидроксихлорохин или его производные, и бислойные липидные частицы, содержащие химиотерапевтический лекарственный препарат.

В другой неограничивающей реализации изобретения предложен вариант способа применения гидроксихлорохина или его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания, включающий:

- получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосомы EV;

и/или получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосом-подобные частицы emNV;

внесение химиотерапевтического лекарственного препарата, в качестве которого используют доксорубицин, фторурацил, паклитаксел, циклофосфамид или препараты таргетной терапии, в бислойные липидные частицы в количестве от 1 до 1×10¹² молекул химиотерапевтического лекарственного препарата на бислойную липидную частицу;

- внесение гидроксихлорохина или его производных, выбираемых из хлорохина или мефлохина, в бислойные липидные частицы до содержания гидроксихлорохина или его производных в бислойных липидных частицах в концентрации 5-100 мкМ;

- введение пациенту полученных бислойных липидных частиц, содержащих химиотерапевтический лекарственный препарат и содержащих гидроксихлорохин или его производные.

В другой неограничивающей реализации изобретения предложен вариант способа применения гидроксихлорохина или его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания, включающий:

- получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосомы EV;

и/или получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосом-подобные частицы emNV;

- внесение химиотерапевтического лекарственного препарата, в качестве которого используют доксорубицин, фторурацил, паклитаксел, циклофосфамид или препараты таргетной терапии, в бислойные липидные частицы в количестве от 1 до 1×10¹² молекул химиотерапевтического лекарственного препарата на бислойную липидную частицу;

- введение пациенту бислойных липидных частиц, содержащих химиотерапевтический лекарственный препарат, и введение пациенту гидроксихлорохина или его производных, выбираемых из хлорохина или мефлохина.

В основе предлагаемого изобретения лежит использование двух основных типов бислойных липидных частиц (EV и/или emNV) для доставки низкомолекулярного цитостатика доксорубицина (и других лекарственных препаратов, применяемых в онкологии) в сочетании с обработкой препаратом гидроксихлорохином (HCQ), либо его производными, эти препараты разрешены для медицинского применения. HCQ обладает лизосомотропными свойствами, ингибирует эндолизосомальное закисление, увеличивает осмотическое давление в эндосомах и подавляет активность системы Р-гликопротеина [18]. В ряде исследований HCQ продемонстрировал увеличение цитотоксичности в сочетании с несколькими синтетическими наночастицами небиологического происхождения [19,20]. Проведено сравнение эффективности доставки низкомолекулярного химиотерапевтического препарата доксорубицина после его загрузки в частицы EV и emNV без дополнительной обработки или с обработкой нецитотоксичными дозами гидроксихлорохина (HCQ). При использовании бислойных липидных частиц совместно с HCQ авторами было показано, что HCQ вызывает дестабилизацию эндолизосом, может значительно увеличить интернализацию частиц и высвобождение упакованного доксорубицина. В совокупности, это приводит к повышению цитотоксичности препарата.

В этой связи авторами разработаны способы применения гидроксихлорохина или его производных (хлорохина, пиперахина, тафенохина, примахина, мефлохина) для доставки химиотерапевтических препаратов, например, доксорубицина, сунитиниба, фторурацила, цисплатина, циклофосфамида и др., препаратов для таргетной терапии, в составе бислойных липидных частиц, способы их доставки в организм пациента.

Существуют варианты данного изобретения, в которых бислойные липидные частицы представляют собой экзосом-подобные частицы с экспонированными на поверхности таргетирующими лигандами (экспонирование может осуществляться методом генетической инженерии, клик-химии, пост-синтетической модификации с использованием липофильных якорных фрагментов или другим методом), выделенные из безопасного охарактеризованного источника (мезенхимальных стромальных клеток).

Существуют варианты данного изобретения, в которых используемый низкомолекулярный препарат представляет собой препарат доксорубицин, упаковываемый в бислойные липидные частицы. В других вариантах изобретения, в бислойные липидные частицы могут быть использованы другие цитотоксические соединения, включающие (а) анкилирующие агенты, такие как цисплатин, карбоплатин, дакарбазин, хлорамбуцил, оксалиплатин, темозоломид, (б) антиметаболиты, такие как 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, капецитабин, гемцитабин, метотрексат, (в) противоопухолевые антибиотики, такие как эпирубицин, даунорубицин, идарубицин, адриамицин, (г) противоопухолевые антибиотики, не являющиеся антрациклинами, такие как блеомицин, митоксантрон, митомицин-С, актиномицин D, (д) ингибиторы топоизомеразы, такие как топотекан, иринотекан, этопозид, тенипозид, митоксантрон, (е) ингибиторы митоза, такие как доцетаксел, паклитаксел, винбластин, винкристин, (ж) винкаалкалоиды, такие как винбластин, винкристин, (з) таксаны, такие как доцетаксел или (и) глюкокортикостероиды (метилпреднизолон, преднизон, дексаметазон) или (к) препараты таргетной терапии, например,обатоклакс, навитоклакс, госсипол, ингибиторы PARP (инипариб, олапариб), ингибиторы PI3K (перифозин), ингибиторы VEGFR-2 (алатиниб), AH-152, ингибиторы BRAF (вемурафениб, дабрафениб, LGX88), ингибиторы MEK (траметиниб, MEK162), ингибиторы CDK (PD-0332991, LEE011), ингибиторы Hsp90, салиномицин, винтафолид, ингибиторы серин-треонин киназы темсиролимус (торисел), эверолимус (афинитор), вемурафениб (зелбораф), траметиниб (мекинист), дабрафениб (тафинлар) или аналоги этих лекарственных препаратов.

Существуют варианты данного изобретения, в которых гидроксихлорохин используется для совместного введения с загруженными бислойными липидными частицами в нетоксичной дозе для создания в целевой области, где локализован очаг ракового заболевания, эффективных концентраций 5-100 мкM. Также гидроксихлорохин может быть загружен в бислойные липидные частицы совместно с цитотоксическим препаратом для доставки очаг ракового заболевания и увеличения эффективности противоопухолевой терапии.

Технические результаты достигаются за счёт использования бислойных липидных частиц с высокой биосовместимостью (внеклеточных экзосом EV или экзосом-подобных частиц emNV), которые загружаются необходимым цитотоксическим препаратом и служат для его направленной доставки. Благодаря высокой способности преодолевать биологические барьеры, включая мембраны опухолевых клеток, низкомолекулярные препараты в составе бислойных липидных частиц (биологических везикул) значительно более эффективно проникают в опухолевые клетки по сравнению со свободным препаратом. Это позволяет частицам эффективно разрушать опухолевые клетки при использовании относительно более низких концентраций упакованных цитостатиков. Естественный тропизм биологических везикул, полученных из мезенхимальных стромальных клеток, либо использование таргетирующих лигандов на поверхности наночастиц позволяет еще более значительно повышать концентрацию упакованных цитостатиков в опухолевой ткани, при этом снижать концентрацию цитостатиков в клетках здоровых тканей. Таким образом, может снижаться выраженность нежелательных лекарственных реакций при использовании частиц для системного введения. Дополнительное использование низких доз гидроксихлорохина в соответствии с настоящим изобретением (за счёт дополнительного введения или совместной упаковки в частицы вместе с цитотоксическим препаратом) значительно увеличивает эффективность системы и эффективность цитотоксического действия за счёт ряда механизмов, включая усиление проникновения препарата в целевые клетки и увеличение эндосомального выхода (внутриклеточного высвобождения препарата). Следствием этого становится обеспечиваемое настоящим изобретением увеличение гибели опухолевых клеток.

В одном примере реализации изобретения предложен способ по любому из предложенных вариантов способа, включающий получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосомы EV, методом их выделения из культуральной среды мезенхимальных стромальных клеток (МСК), выделенных из таких источников, как костный мозг, жировая ткань, пуповинная кровь, плацента, соединительные ткани, кожа или их производные, включая генно-модифицированные аналоги, производных индуцированных плюрипотентных клеток, включая генетически-модифицированные клетки с удаленными или внесенными генетическими последовательностями, обеспечивающими их неиммуногенные свойства или свойства продукции дополнительных белков и/или РНК.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ по любому из предложенных вариантов способа, включающий получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосомы EV, методом их выделения из клеток HEK293 или их модификации T, F или генно-модифицированные аналоги, включая генетически-модифицированные клетки с удаленными или внесенными генетическими последовательностями, обеспечивающими их неиммуногенные свойства или свойства продукции дополнительных белков и/или РНК.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ по любому из предложенных вариантов способа, включающий получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосом-подобные частицы emNV, методом экструзии клеточной массы через фильтры или наслаиванием компонентов клеточной массы на терапевтический агент, при этом клетки выбирают из мезенхимальных стромальных клеток (МСК), выделенных из таких источников как костный мозг, жировая ткань, пуповинная кровь, плацента, соединительные ткани, кожа или их производные, включая генно-модифицированные аналоги, производных индуцированных плюрипотентных клеток, включая генетически-модифицированные клетки с удаленными или внесенными генетическими последовательностями, обеспечивающими их неиммуногенные свойства или свойства продукции дополнительных белков и/или РНК или клеток HEK293 или их модификации T, F или генно-модифицированные аналоги.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ по любому из предложенных вариантов способа, в котором внесение химиотерапевтического лекарственного препарата в бислойные липидные частицы осуществляют методом инкубации или методом экструзии или методом заморозки-разморозки или методом пермеабилизации клеточной мембраны или методом обработки поверхностно-активными соединениями или методом электропорации (нуклеофекции), в том числе с помощью микропульсов. Под химиотерапией понимается лечение злокачественных новообразований с помощью препаратов, подавляющих пролиферацию опухолевых клеток или необратимо повреждающих их. Таргетными препаратами являются химиопрепараты, действующие преимущественно на опухолевые клетки и практически не воздействующие на здоровые ткани.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ по любому из предложенных вариантов способа, в котором в качестве химиотерапевтического лекарственного препарата используют препараты таргетной терапии, такие как мезилат иматиниба, гефитиниб, эрлотиниб, Сорафениб, сунитиниб, дезатиниб, лапатиниб, нилотиниб, бортезомиб, тамоксифен, tofacitinib, кризотиниб, обатоклакс, навитоклакс, госсипол, ингибиторы PARP инипариб и олапариб, ингибитор PI3K перифозин, ингибитор VEGFR-2 алатиниб, ингибиторы BRAF вемурафениб и дабрафениб, ингибитор MEK траметиниб, ингибиторы Hsp90 салиномицин, винтафолид, ингибиторы серин-треонин киназы темсиролимус, эверолимус, или аналоги этих лекарственных препаратов.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ по любому из предложенных вариантов способа, в котором дополнительно вводят в бислойные липидные частицы (а) анкилирующие агенты, такие как цисплатин, карбоплатин, дакарбазин, хлорамбуцил, оксалиплатин, темозоломид, (б) антиметаболиты, такие как 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, капецитабин, гемцитабин, метотрексат, (в) противоопухолевые антибиотики, такие как эпирубицин, даунорубицин, идарубицин, адриамицин, (г) противоопухолевые антибиотики, не являющиеся антрациклинами, такие как блеомицин, митоксантрон, митомицин-С, актиномицин D, (д) ингибиторы топоизомеразы, такие как топотекан, иринотекан, этопозид, тенипозид, митоксантрон, (е) ингибиторы митоза, такие как доцетаксел, паклитаксел, винбластин, винкристин, (ж) винкаалкалоиды, такие как винбластин, винкристин, (з) таксаны, такие как доцетаксел или (и) глюкокортикостероиды, такие как метилпреднизолон, преднизон, дексаметазон.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ по любому из предложенных вариантов способа, в котором раковое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, опухоль головы, опухоль шеи, опухоль головного мозга, глиобластомы, глиомы, рак легких, рак органов пищеварения, рак желудка, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак кожи или рак глаз.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ по любому из предложенных вариантов способа, в котором бислойные липидные частицы, представляющие собой экзосомы EV и экзосом-подобные частицы emNV, включают экспонированные на их поверхности таргетирующие лиганды.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ, в котором таргетирующие лиганды представляют собой пептиды, аптамеры, лиганды, рецепторы, антитела, нанотела, высоко- и низкомолекулярные соединения.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ, в котором экспонирование (в т.ч. экспрессию) на поверхность бислойных липидных частиц emNV осуществляют с помощью генетических методов, в том числе с помощью экспрессии генетических конструктов, которые обеспечивают экспрессию белков и пептидов на поверхности бислойных липидных частиц с экспонированием на внешней мембране. Генетические конструкты представляют собой ДНК-векторы, интегрированные в хромосому клеток упаковочной линии или находящиеся во внехромосомной (эписомальной) форме и кодирующие экспрессию мембранного белка клетки человека, слитого с таргетирующей молекулой.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ, в котором экспонирование на внешней поверхности бислойных липидных частиц осуществляют с помощью химического метода клик-химия или использования аптамеров, низко- и высокомолекулярных соединений.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ, в котором рецепторы представляют собой рецепторы, специфичные к опухолевым клеткам и тканям, рецепторы жирных кислот, такие как FFA1, FFA4, рецепторы альбумина, такие как Fcnr, SPARC, Gp30, Gp18, рецепторы глюкозы, такие как GLUT-1, GLUT-4, GLUT-5, рецепторы scavenger receptor A, MSR1, CD204, FcIIIgamma в нативном виде либо в виде слитого либо химерного конструкта для заякоривания рецептора в мембране бислойных липидных частиц либо химически-модифицированные варианты рецепторов.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ по любому из предложенных вариантов способа, в котором размер бислойных липидных частиц составляет от 30 нм до 150 нм.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ по любому из предложенных вариантов способа, в котором гидроксихлорохин или его производные используют в виде инъекционного раствора.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ, в котором гидроксихлорохин или его производные используют в виде таблеток.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ, в котором осуществляют введение пациенту бислойных липидных частиц, содержащих химиотерапевтический лекарственный препарат, в дозе 1×10¹⁰ – 1×10³⁰ бислойных липидных частиц на кг веса человека.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен способ, в котором осуществляют введение пациенту бислойных липидных частиц, содержащих химиотерапевтический лекарственный препарат и гидроксихлорохин или его производные, в дозе 1×10¹⁰ – 1×10³⁰ бислойных липидных частиц на кг веса человека.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР, ТАБЛИЦ, ИНЫХ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Изобретение иллюстрируются следующими графическими материалами.

На фигуре 1 показана характеризация частиц EV и emNV. Фотографии EV (а) и emNV (б), полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии (шкала – 200 нм); (в) средний диаметр и (г) дзета-потенциал EV/emNV, данные получены методом динамического светорассеивания. (д) Вестерн-блот маркеров CD81, CD9, Hsp70, CD63 и β-актина в белковых экстрактах EV, emNV и клеток-продуцентов HEK293T.

На фигуре 2 показан анализ полидисперсности образцов EV и emNV, данные динамического светорассеивания.

На фигурах 3-9 показана интернализация и терапевтические свойства частиц EV и emNV без дополнительной обработки или с обработкой HCQ.

На фигуре 3а) показан относительный выход частиц по уровню белка (измерение по методу Бредфорд).

На фигуре 3б) показана эффективность загрузки доксорубицина в EV и emNV, данные спектрофотометрии (λ=480 нм); (Фиг. 4) анализ дестабилизации лизосом под действием HCQ с использованием флуоресцентного красителя LysoTracker (снижение флуоресценции красителя в группе HCQ в сравнении с контролем).

На фигуре 5 показан процент клеток, положительных по флуоресценции доксорубицина.

На фигуре 6а) показано высвобождение инкапсулированного доксорубицина (внутриклеточное накопление доксорубицина) при обработке EV и emNV с и без обработки HCQ.

На фигуре 6б) показана интернализация EV и emNV, меченных красителем ExoGlow, с и без обработки HCQ.

На фигуре 7 представлены флуоресцентные фотографии клеток HEK293T, обработанных наночастицами, мечеными ExoGlow (шкала – 100 µм).

На фигуре 8 показан анализ жизнеспособности клеток HEK293T c различной обработкой.

На фигуре 9 показан процент клеток, позитивных по активированной каспазе-3. * p<0.05; *** p<0.001; **** p<0.0001, ns – не значимо.

На фигуре 10 приведен анализ средней интенсивности флуоресценции доксорубицина в клетках HEK293T в различных группах обработки, данные проточной цитометрии.

На фигуре 11 показана жизнеспособность опухолевых клеточных линий, обработанных EV, загруженными доксорубицином с и без обработки HCQ. (a) Клетки HepG2 и (b) клетки SKBR3. *** p<0.001; **** p<0.0001.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения и общая терминология

Далее будут приведены ссылки на определенные варианты осуществления изобретения, примеры которых проиллюстрированы предлагаемым способом и устройством. Подразумевается, что изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем настоящего изобретения, как определено в формуле изобретения.

Специалисту в данной области известны многие способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, которые могут быть использованы при практическом осуществлении настоящей группы изобретений.

Настоящее изобретение не ограничивается изложенными в данном документе способами и материалами. В случае, если один или несколько из включенных литературных ссылок, патентов и аналогичных материалов отличается от или противоречит данной заявке, включая, в частности, определенные термины, использование терминов, описанные приемы и т.п., преимущественную силу имеет настоящая заявка.

Далее следует принять во внимание, что определенные признаки изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления изобретения, могут быть представлены также совместно в одном варианте. И наоборот, разнообразные признаки изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления изобретения, могут быть представлены отдельно или в любой подходящей подкомбинации.

Если представлен диапазон значений, то следует понимать, что каждое промежуточное значение, до десятых долей единицы нижнего предела, если из контекста явно не следует иное между верхней и нижней границами этого диапазона и любые другие указанные или промежуточные значения в этом установленном интервале охватываются настоящим изобретением. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны, что также входит в объем изобретения, с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Когда указано, что диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любое из обоих включенных пределов, также входят в объем изобретения.

Использование терминов в единственном числе в контексте описания изобретения должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в данном документе или явно не противоречит контексту.

Термины «состоящий из», «имеющий», «включающий» и «содержащий» следует толковать как неограничивающие термины, т.е. означающие «включая, но не ограничиваясь», если не указано иное.

Использование любых и всех примеров или иллюстративного языка (например, «такой как»), представленных в данном документе, предназначено просто для лучшего описания изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если иное не заявлено.

Никакие формулировки в описании не следует истолковывать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического применения изобретения.

Здесь описаны варианты осуществления этого изобретения, включая лучший из известных изобретателям способа осуществления изобретения. Разновидности этих вариантов осуществления могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения предшествующего описания. Авторы ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие варианты в зависимости от обстоятельств, и авторы предполагают, что изобретение будет реализовано на практике иначе, чем конкретно описано в данном документе. Соответственно, это изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты признаков, изложенных в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено действующим законодательством. Более того, любая комбинация вышеописанных признаков во всех их возможных вариациях охватывается изобретением, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту.

Для описания настоящего изобретения используются следующие термины.

Все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют такое значение, какое обычно понимается специалистами в области, к которой относится изобретение, если не указано иное. Все патенты и публикации, на которые имеются ссылки в данном документе, полностью включены в изобретение посредством ссылки.

Сокращения, используемые в настоящем описании, включая приведенные в иллюстративных схемах и последующих примерах, хорошо известны среднему специалисту.

Некоторые из терминов и сокращений используют как нижеследующие:

Алкилирующие антинеопластические агенты – это высокореактивные соединения, обладающие противоопухолевой активностью, механизм действия которых основан на присоединении алкильной группы к ДНК.

Бислойные липидные частицы – частицы биологического происхождения размером 30-150 нм, сформированные из клеточных мембран и секретируемые практически всеми клетками человека, а также получаемые из клеток человека различными методами (экструзией клеточной массы, азотной кавитацией клеточной суспензии и др.). Далее по тексту могут упоминаться как биологические наночастицы, наночастицы, частицы, везикулы.

Доксорубицин (Dox) – это противоопухолевое средство, цитотоксический антрациклиновый антибиотик, выделенный из культуры Streptomyces peucetius var. caesius. Цитотоксическое действие доксорубицина в отношении злокачественных клеток и его токсические эффекты на различные органы обусловлены интеркаляцией нуклеотидных оснований и способностью доксорубицина связываться с липидами клеточной мембраны

Гидроксихлорохин (HCQ) – это противомалярийный препарат, производное 4-аминохинолина (торговая марка: «Плаквенил», «Иммард»)

Производные гидроксихлорохина – это хлорохин, пиперахин, тафенохин, примахин, мефлохин

Интернализация - это проникновение в клетку частиц через клеточную мембрану по механизмам эндоцитоза либо трансцитоза.

Клетки HEK293 – это клеточная линия, полученная из эмбриональных почек человека, или их модификации T, F или генно-модифицированные аналоги, включая генетически-модифицированные клетки с удаленными или внесенными генетическими последовательностями, обеспечивающими их неиммуногенные свойства или свойства продукции дополнительных белков и/или РНК.

Клик-химия – это  химические реакции, приспособленные для быстрого и надёжного получения химических веществ путём соединения между собой отдельных маленьких элементов

МСК – мезенхимальные стромальные клетки (МСК), выделенные из разных источников (костный мозг, жировая ткань, пуповинная кровь, плацента, соединительные ткани, кожа) либо их производные, включая генно-модифицированные аналоги, производных индуцированных плюрипотентных клеток, включая генетически-модифицированные клетки с удаленными или внесенными генетическими последовательностями, обеспечивающими их неиммуногенные свойства или свойства продукции дополнительных белков и/или РНК.

Таргетирующие лиганды – это лиганды, расположенные на поверхности частиц и наночастиц, которые обеспечивают целевую доставку в целевые клетки, ткани, органы, очаги воспаления, опухолевого роста, метастазирования либо поврежденных тканей, и могут представлять собой пептиды (цепочечные молекулы, состоящие из нескольких до 50 остатков аминокислот, соединенных между собой амидными связями), аптамеры, лиганды, рецепторы, антитела, интратела (антитела, взаимодействующие с целевыми внутриклеточными белками), нанотела (антитела, включающие единственный вариабельный домен), высоко- и низкомолекулярные соединения (карбогидраты: фруктоза, леван, глюкоза и ее производные, манноза и ее производные, аденозин; аминокислоты: глицин, аргинин, триптофан, аланин, лизин, аргинин; витамины: рибофлавин, биотин, тиамин, витамин В12, фолиевая кислота, метотрексат; а также анизамид, анакардовая кислота, фенилборовая кислота).

ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия

Пермеабилизация – это обработка клеток либо бислойных липидных частиц химическими агентами, повышающими проницаемость клеточных мембран, не вызывающая снижения жизнеспособности и метаболической активности клеток либо целостности бислойных липидных частиц.

Экзосомы EV – это бислойные липидные частицы размером 30-150 нм для доставки в очаг ракового заболевания низкомолекулярного цитостатика доксорубицина и других химиотерапевтических лекарственных препаратов или препаратов для таргетной терапии в сочетании с обработкой препаратом гидроксихлорохином (HCQ), далее по тексту упоминаемые как: секретируемые частицы, внеклеточные секретируемые везикулы, секретируемые везикулы, внеклеточные везикулы EV (Extracellular Vesicles), протеолипидные наночастицы, которые образуются из эндосомального компартмента и секретируются клеткой после слияния с мультивезикулярными тельцами.

Экзосом-подобные частицы emNV - это бислойные липидные частицы размером 30-150 нм для доставки в очаг ракового заболевания низкомолекулярного цитостатика доксорубицина и других химиотерапевтических лекарственных препаратов или препаратов для таргетной терапии в сочетании с обработкой препаратом гидроксихлорохином (HCQ), далее по тексту упоминаемые как: экзосом-подобные везикулы, экзосом-подобные наночастицы, emNV (Еxosome-mimetic nanovesicles).

DLS – Dynamic Light Scattering (динамическое светорассеивание).

EPR – Enhanced Permeability and Retention (эффект увеличенной проницаемости и удержания).

FBS – Fetal Bovine Serum (эмбриональная бычья сыворотка).

HCQ – гидроксихлорохин.

NTA – Nanoparticle Tracking Assay (Анализ траектории наночастиц).

PBS – Phosphate Buffered Saline (фосфатно-солевой буфер).

Заявленные способы применения гидроксихлорохина и его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания включают получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосомы EV и/или получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосом-подобные частицы emNV. При этом азмер бислойных липидных частиц составляет от 30 нм до 150 нм.

Далее осуществляют внесение химиотерапевтического лекарственного препарата в бислойные липидные частицы от 1 до 1×10¹² молекул химиотерапевтического лекарственного препарата на бислойную липидную частицу.

Далее осуществляют внесение бислойных липидных частиц, содержащих химиотерапевтический лекарственный препарат, в раствор гидроксихлорохина или в раствор его производных 5 мкМ до 100 мкМ.

Далее осуществляют введение пациенту раствора, содержащего гидроксихлорохин или его производные, и бислойные липидные частицы, содержащие химиотерапевтический лекарственный препарат, в дозе 0,1 – 100 мг/кг веса.

В другом варианте осуществления способа применения гидроксихлорохина и его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания одновременно с внесением химиотерапевтического лекарственного препарата в бислойные липидные частицы осуществляют внесение гидроксихлорохина или его производных до содержания гидроксихлорохина или его производных в бислойных липидных частицах в диапазоне 5-100 мкМ. После чего осуществляют введение пациенту полученных бислойных липидных частиц, содержащих химиотерапевтический лекарственный препарат и содержащих гидроксихлорохин или его производные.

В другом варианте осуществления способа доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания, в полученные бислойные липидные частицы, представляющие собой экзосомы EV и/или экзосом-подобные частицы emNV, вносят химиотерапевтический лекарственный препарат в бислойные липидные частицы в количестве от 1 до 1×10¹² молекул химиотерапевтического лекарственного препарата на бислойную липидную частицу. После чего осуществляют введение пациенту бислойных липидных частиц, содержащих химиотерапевтический лекарственный препарат, и отдельно введение пациенту гидроксихлорохина или его производных.

Бислойные липидные частицы, представляющие собой экзосомы EV, могут получать методом их выделения из культуральной среды мезенхимальных стромальных клеток (МСК), выделенных из таких источников, как костный мозг, жировая ткань, пуповинная кровь, плацента, соединительные ткани, кожа или их производные, включая генно-модифицированные аналоги, производных индуцированных плюрипотентных клеток, включая генетически-модифицированные клетки с удаленными или внесенными генетическими последовательностями, обеспечивающими их неиммуногенные свойства или свойства продукции дополнительных белков и/или РНК.

Бислойные липидные частицы, представляющие собой экзосомы EV, могут получать методом их выделения из клеток HEK293 или их модификации T, F или генно-модифицированные аналоги, включая генетически-модифицированные клетки с удаленными или внесенными генетическими последовательностями, обеспечивающими их неиммуногенные свойства или свойства продукции дополнительных белков и/или РНК.

Бислойные липидные частицы, представляющие собой экзосом-подобные частицы emNV, могут получать методом экструзии клеточной массы через фильтры или наслаиванием компонентов клеточной массы на терапевтический агент, при этом клетки выбирают из мезенхимальных стромальных клеток (МСК), выделенных из таких источников как костный мозг, жировая ткань, пуповинная кровь, плацента, соединительные ткани, кожа или их производные, включая генно-модифицированные аналоги, производных индуцированных плюрипотентных клеток, включая генетически-модифицированные клетки с удаленными или внесенными генетическими последовательностями, обеспечивающими их неиммуногенные свойства или свойства продукции дополнительных белков и/или РНК или клеток HEK293 или их модификации T, F или генно-модифицированные аналоги.

Внесение химиотерапевтического лекарственного препарата в бислойные липидные частицы могут осуществлять методом инкубации или методом экструзии или методом заморозки-разморозки или методом пермеабилизации клеточной мембраны или методом обработки поверхностно-активными соединениями или методом электропорации (нуклеофекции), в том числе с помощью микропульсов.

При этом в качестве химиотерапевтического лекарственного препарата могут использовать доксорубицин, фторурацил, паклитаксел, циклофосфамид или препараты таргетной терапии, такие как мезилат иматиниба (гливек, STI-571), гефитиниб (Иресса, ZD1839), эрлотиниб (Tarceva), Сорафениб (Nexavar), сунитиниб (сутент), дезатиниб (Sprycel), лапатиниб (Tykerb), нилотиниб (Tasigna), бортезомиб/Velcade, тамоксифен, tofacitinib, кризотиниб, обатоклакс, навитоклакс, госсипол, ингибиторы PARP (инипариб, олапариб), ингибиторы PI3K (перифозин), ингибиторы VEGFR-2 (алатиниб), AH-152, ингибиторы BRAF (вемурафениб, дабрафениб, LGX88), ингибиторы MEK (траметиниб, MEK162), ингибиторы CDK (PD-0332991, LEE011), ингибиторы Hsp90, салиномицин, винтафолид, ингибиторы серин-треонин киназы темсиролимус (торисел), эверолимус (афинитор), вемурафениб (зелбораф), траметиниб (мекинист), дабрафениб (тафинлар) или аналоги этих лекарственных препаратов.

Раковое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, опухоль головы, опухоль шеи, опухоль головного мозга, глиобластомы, глиомы, рак легких, рак органов пищеварения, рак желудка, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак кожи или рак глаз.

Бислойные липидные частицы, представляющие собой экзосомы EV и экзосом-подобные частицы emNV, могут включать экспонированные на их поверхности таргетирующие лиганды, представлящие собой пептиды, аптамеры, лиганды, рецепторы, антитела, интратела, нанотела, высоко- и низкомолекулярные соединения.

Осуществляют введение пациенту бислойных липидных частиц, содержащих химиотерапевтический лекарственный препарат или дополнительно гидроксихлорохин или его производные, в дозе 1×10¹⁰ – 1×10³⁰ бислойных липидных частиц на кг веса человека.

Заявленные способы доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания осуществляются аналогично описанным выше способам применения гидроксихлорохина и его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания

В вышеуказанных вариантах способов доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания осуществляют введение пациенту бислойных липидных частиц, гидроксихлорохина или его производных парентерально, перорально, делают инъекцию в очаг заболевания, наносят на кожу, слизистые оболочки или с помощью эндоскопических методов.

Материалы и методы

2.1. Культура клеток

HEK-293T, клетки гепатомы человека HepG2 и клетки рака молочной железы человека SKBR3 культивировали в среде DMEM (ПанЭко, Москва, Россия) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (Cytiva, Логан, Юта, США), 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Оксфорд, Великобритания). Клетки культивировали при 37°C при 5% CO₂. Для экспериментов по интернализации доксорубицина с репортерной системой каспаз клетки HEK-293T высевали на 12-луночные планшеты с ~60% конфлуентностью в день трансфекции. Активацию каспазы-3 анализировали в клетках HEK-293T, трансфицированных плазмидой ZipGFP-Casp3 (Addgene #81241) [21]. Трансфекцию проводили следующим образом: плазмидную ДНК добавляли к раствору NaCl (раствор А). Параллельно готовили раствор Б, содержащий полиэтиленимин в растворе NaCl, инкубировали в течение 10 мин и осторожно смешивали с раствором А. Полученный раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин и затем добавляли к клеткам. На следующий день после трансфекции культуральную среду удаляли, а клетки осторожно дважды промывали в фосфатном буфере и добавляли полную среду. Для анализа жизнеспособности клеток клетки высевали в 96-луночные планшеты с ~30% конфлуентностью.

2.2. Выделение бислойных липидных частиц - внеклеточных секретируемых везикул (экзосом EV)

Для выделения экзосом EV культивировали клетки HEK-293T в среде DMEM с добавлением с 10% FBS, не содержащей везикул. Удаление везикул из FBS проводили ультрафильтрацией с использованием колонок для ультрафильтрации Amicon Ultra-15 100 кДа (Merck Millipore, Дармштадт, Германия), как описано ранее [22].

Выделение везикул из культуральных сред проводили согласно протоколу, описанному Heath с соавт. с модификациями [23]. Культуральные среды последовательно центрифугировали при 300×g (10 мин), 2000×g (10 мин) и 10000×g (10 мин). Надосадочную жидкость наносили на хроматографические колонки, заполненные смолой Macro-Prep DEAE Resin (Bio-Rad, Hercules, CA, США), промывали буфером, содержащим 50 мМ HEPES и 100 мМ NaCl (20 объемов колонки), далее буфером, содержащим 50 мМ HEPES и 335 мМ NaCl (10 объемов колонки) и элюировали буфером, содержащим 50 мМ HEPES/890 мМ NaCl. Элюат концентрировали с использованием колонок для ультрафильтрации Amicon Ultra-15 (100 кДа) (Merck Millipore), промывали трижды фосфатно-солевым буфером и переконцентрировали. Аликвоты выделенных везикул лизировали буфером RIPA и разводили в PBS; концентрацию белка в образцах измеряли с помощью набора Pierce Coomassie (Bradford) Protein assay Kit (Thermo-Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).

2.3. Выделение экзосом-подобных частиц emNV

Клетки HEK-293T (~5 × 10⁶) дважды промывали PBS и снимали с помощью раствора Версена (ПанЭко). Клеточную суспензию последовательно пропускали через поликарбонатные мембранные фильтры с диаметром пор 10-, 5-, 1 мкм (Nuclepore, Whatman, Inc., Клифтон, Нью-Джерси, США) (7 раз через каждый фильтр) с использованием мини-экструдера (Avanti Polar Lipids, Бирмингем, Великобритания). Полученный раствор центрифугировали в течение 10 минут при 2000×g, затем в течение 10 минут при 10000×g для удаления клеточного дебриса; затем надосадочную жидкость фильтровали через концентратор Centrisart 1 (300 кДа) (Sartorius, Goettingen, Германия). Полученный ретентат промывали 3 раза раствором PBS и ре-концентрировали. Аликвоты выделенных везикул лизировали буфером RIPA и разводили PBS, концентрацию белка в образцах измеряли с помощью набора Pierce Coomassie (Bradford) Protein assay Kit (Thermo-Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).

2.4. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

Анализ образцов EV и EMNV с помощью просвечивающей электронной микроскопии проводили, как описано ранее [24]. Перед измерением, 5 мкл образцов EV/EMNV пипеткой помещали на медную сетку (400 mesh) с углерод-формваровой пленкой и инкубировали в течение 1 мин. Избыток раствора удаляли промоканием фильтровальной бумагой, сетку промывали в дистиллированной воде в течение 10 с. Сетку помещали в 10 мкл 2% ацетата уранила, затем промоканием удаляли лишнюю жидкость; данная стадия проводилась дважды. Образцы EV/emNV визуализировали на просвечивающем электронном микроскопе LIBRA 200 FE HR (Zeiss).

2.5. Динамическое рассеивание света (DLS)

Анализ образцов EV/emNV методом динамического рассеивания света проводили на Malvern Zetasizer NanoZS (Malvern, Вустершир, Великобритания). Каждый образец EV/EMNV, разбавленный 1/1000 в PBS, фильтровали через фильтр 20 мкм (Corning) и анализировали 5 раз; В кюветы из полистирола (DTS0012, Malvern) помещали 1,5 мл разведенных образцов. Анализ проводился при 25°C (100 измерений на каждый анализ) с использованием 20 мВт гелий/неонового лазера (633 нм). Данные анализировали в программе Zetasizer 8.01.4906 (Malvern); ζ-потенциалы анализировали в кюветах U-типа (DTS1070; Malvern) с золотыми электродами. Измерения ζ -потенциалов проводили при 25°C не менее 5 раз. Фоновый сигнал измеряли в PBS, отфильтрованном через фильтр 0.2 мкм.

2.6. Внесение (упаковка) доксорубицина

Частицы EV и emNV (1 мг белка) загружали инкубацией с 400 мкг/мл доксорубицина при 37 ◦C в течение 2 ч при встряхивании со скоростью 500 об/мин. Свободный доксорубицин удаляли ультрафильтрацией с использованием концентратора Centrisart 1 (300 кДа) (Sartorius) и промывали 3 раза раствором PBS. Для оценки эффективности упаковки доксорубицина в образцах измеряли оптическую плотность с помощью спектрофотометра (λ = 480 нм), а количество загруженного доксорубицина определяли с помощью калибровочной кривой. Эффективность загрузки (%) рассчитывали по следующей формуле: (доксорубицин, инкапсулированный в везикулы)/(исходное количество доксорубицина, использованное для упаковки) × 100%.

2.7. Вестерн-блоттинг

Образцы частиц EV/emNV или клетки HEK-293T лизировали с использованием 50 мкл буфера RIPA (50 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 150 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% додецилсульфата натрия [SDS], 1 мМ NaF) и инкубировали при перемешивании в течение 30 мин при 4°C с последующей обработкой ультразвуком в течение 30 секунд. Образцы загружали на 10% SDS-полиакриламидный гель после смешивания с 6-кратным буфером Лэммли (5:1, 60 мкг/лунку), а затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали 5% молоком в TBS-T (20 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% Твин-20) и окрашивали первичными антителами к маркерам экзосом (EXOAB-KIT-1 для CD63, CD9, CD81 и Hsp70, SBI) в разведении 1:1000 или к β-актину (A1978, Sigma) в разведении 1:5000 в 5% молоке в TBS-T на ночь при 4°C. Мембраны промывали 3 раза TBS-T и инкубировали в течение 1 часа с анти-кроличьими антителами козы, конъюгированными с HRP (Ab6721, Abcam, Кембридж, Массачусетс, США) или с козьими анти-мышиными HRP-конъюгированными антителами (Ab6787; Abcam), разбавленными 1:5000 5% молоком в TBS-T. Мембраны промывали 3 раза TBS-T, проявляли хемилюминесцентный сигнал с помощью реактива SuperSignal West Femto Maximum (Thermo-Fisher) и детектировали с помощью Рентгеновской пленки с экспозицией 2 часа.

2.8. Анализ методом проточной цитометрии

Анализ методом проточной цитометрии проводили на цитометре BD FACSCanto II (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Вкратце, среду для культивирования клеток удаляли, а клетки дважды промывали в PBS, снимали с планшетов в растворе трипсина-ЭДТА, ресуспендировали в полной среде, дважды промывали в PBS. EGFP-положительные клетки детектировали на канале FITC; доксорубицин-положительные клетки анализировали на канале PerCP-Cy5-5. Данные были получены с помощью программы BD FACSDiva и проанализировали с помощью программного обеспечения NovoExpress версии 1.6.1 (ACEA Biosciences, San Диего, Калифорния, США).

2.9. Анализ цитотоксичности

Клетки HEK-293T, HepG2 и SKBR3 высевали на 96-луночные планшеты с конфлуентностью ~30%. Клетки HEK-293T обрабатывали доксорубицином (500 нМ), HCQ (50 мкМ) или доксорубицином, загруженным в EV или emNV (500 нМ) (отдельно или в комбинации с 50 мкМ HCQ) в течение 12 часов. Клетки HepG2/SKBR3 обрабатывали доксорубицином, загруженным в EV, в концентрации 100 нМ. После этого к клеткам добавляли реагент для анализа цитотоксичности (ab112118; Abcam) в соответствии с инструкцией производителя. Оптическую плотность измеряли с помощью планшетного спектрофотометра CLARIOstar Plus для расчета относительной жизнеспособности клеток.

2.10. Анализ активированной каспазы-3

Клетки HEK-293T трансфицировали плазмидой, кодирующей ZipGFP-Casp3 (подарок от Xiaokun Shu, Addgene #81241) [21], который кодирует репортерный конструкт на основе ZipGFP и TEV-протеазы для визуализации апоптоза. Флуоресценцию репортера измеряли с помощью проточной цитофлуориметрии.

2.11. Анализ LysoTracker

Клетки HEK-293T инкубировали с 50 мкМ HCQ в полной среде FluoroBrite DMEM в течение 24 часов. Затем добавляли краситель LysoTracker Deep Red на 1 ч и визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии.

2.12. Окрашивание частиц красителем ExoGlow Protein

Наночастицы EV/emNV окрашивали с помощью реактива для мечения ExoGlow™-Protein EV (зеленый) (EXOGP300A1, SBI), по протоколу производителя с модификациями. Вкратце, к наночастицам (500 мкг белка по массе) добавляли краситель ExoGlow и инкубировали при 37 ◦C в инкубаторе-шейкере при 350 об/мин в течение 20 мин; затем свободный краситель ExoGlow удаляли ультрафильтрацией с использованием концентраторов Centrisart 1 (300 кДа) (Sartorius) с последующими 3 промывками PBS.

2.13. Высокопропускная визуализация флуоресценции в живых клетках

Клетки HEK-293T высевали в 96-луночные чёрные планшеты Cellvis со стеклянным дном (ThermoFisher Scientific) с плотностью клеток ~ 30% и обрабатывали частицами (наночастицами) EV/emNV, нагруженными доксорубицином или мечеными ExoGlow. Клетки анализировали с помощью высокопропускной системы визуализации CELENA® X через 2–22 часа после добавления наночастиц. Интернализация наночастиц измерялась как средняя флуоресценция наночастиц, меченных ExoGlow, в целевых клетках. Высвобождение доксорубицина определяли количественно, по уровням средней флуоресценции внутриклеточного доксорубицина. Анализ был выполнен в программном обеспечении Leica LAS X Life Science версии 3.7.6 (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия).

2.14. Анализ траектории наночастиц

Количество бислойных липидных частиц в образцах и их распределение по размеру определяли методом анализа траектории наночастиц (NTA) с использованием прибора NanoSight LM10 HS (NanoSight Ltd., Amesbury, UK). Образцы разводились фосфатно-солевым буфером до конечной концентрации около 1.5 × 10⁸ частиц/мл. Видеосъемка Броуновского движения частиц в растворе записывалась при комнатной температуре с температурной регистрацией. При записи использовались параметры камеры: Camera shutter 850, camera gain 450, lower threshold 715, higher threshold 10,725. Обработка видео осуществлялась с использованием программного обеспечения Nanoparticle Tracking Analysis analytical software version 2.3 build 0033 (NanoSight Ltd., Amesbury, UK), порог детекции 9. При анализе одного образца записывали минимум 12 индивидуальных видео, каждое по 60 сек, и анализировали минимум 5000 индивидуальных траекторий частиц. Данные нескольких видео объединяли для получения гистограмм распределения частиц по размерам и концентрации частиц с учётом фактора разведения образца.

2.15. Статистический анализ

Значения представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD), анализ проводился в программе GraphPad Prism 7.0. Для сравнения значений и расчета статистической достоверности использовались Критерий Стьюдента или однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным тестом HSD Tukey (где применимо).

Результаты

На первом этапе выделили секретируемые экзосомы EV и экзосом-подобные частицы emNV (нановезикулы) из клеток HEK293T и охарактеризовали их физические и биологические свойства, как описано в разделе Материалы и методы (Фиг.1). Анализ с помощью просвечивающей электронной микроскопии показал, что частицы EV и emNV представляют собой наночастицы с четко выраженной протеолипидной мембраной (Фиг. 1а, б). Экзосом-подобные частицы emNV имели правильную сферическую форму, в то время как для экзосом EV была характерна некоторая агрегация и отклонение от сферической формы (Фиг. 1а). Данное явление уже было показано для секретируемых везикул [24], в то время как в процессе экструзии, вероятно, образуются преимущественно наночастицы правильной сферической формы. Анализ распределения по размерам с использованием метода динамического рассеивания света (DLS) подтвердил данные ПЭМ и показал одинаковый индекс полидисперсности как для секретируемых везикул EV, так и для emNV (Фиг. 2). DLS (Фиг. 1в) продемонстрировал, что секретируемые везикулы имели размер от 120 до 140 нм (Фиг. 1в). Кроме того, частицы были отрицательно заряжены (Фиг. 1г), при этом emNV имели более сильный отрицательный заряд поверхности по сравнению с секретируемыми частицами EV (-22 мВ против -15 мВ). Отрицательный заряд является характерным для обоих типов частиц (протеолипидных везикул); более отрицательный заряд поверхности emNV может объясняться более высокой концентрацией белков на поверхности этих везикул, различной плотностью белков или перераспределением заряда [25,26]. Биологические свойства полученных везикул были определены согласно существующим стандартам исследования биологических наночастиц путем анализа четырех биомаркеров [27], включая CD81, CD9, Hsp70 и CD63 (Фиг. 1д). Оба типа биологических наночастиц были положительными по данным маркёрам, интенсивность окрашивания полос для данных маркёров была сходной в обоих типа везикул. β-актин экспрессировался в лизатах клеток HEK-293T и, как и ожидалось, не обнаруживался в NP. Эти данные показали, что использованный протокол производства emNV обеспечивает получение чистого продукта частиц, по свойствам схожего с секретируемыми везикулами.

По данным измерения общего белка частиц, выход экзосом-подобных наночастиц emEV был в 60 раз выше, чем выход секретируемых везикул EV, полученных с такого же количества клеток HEK293T. (Фиг.3а). Эффективность загрузки доксорубицина в секретируемые и экзосом-подобные наночастицы методом инкубации с доксорубицином была сопоставимой для обоих типов частиц (Фиг.3б). На данном этапе проверили влияние HCQ на эндосомальный компартмент клеток HEK293T с помощью анализа накопления флуоресцентного красителя LysoTracker, чувствительного к закислению среды. Как показано на Фиг. 4, обработка клеток HCQ снижает интенсивность флуоресценции красителя, что доказывает способность HCQ дестабилизировать эндосомальный компартмент клеток и усиливать высвобождение препаратов из эндосом в цитоплазму. Эти данные соотносятся с другими работами [28]. Чтобы сравнить эффективность доставки доксорубицина с использованием секретируемых EV или экзосом-подобных наночастиц emNV, клетки HEK293T обрабатывали свободным доксорубицином или доксорубицином, загруженным в оба типа наночастиц. Также, проводилась обработка загруженными наночастицами в сочетании с обработкой HCQ, чтобы определить эффект данного вещества на накопление доксорубицина в клетках. Интернализацию доксорубицина оценивали с помощью проточной цитометрии (по проценту флуоресцирующих клеток и средней интенсивности флуоресценции, Фиг. 5 и 10). В качестве отрицательного контроля использовали клетки без обработки или с обработкой только HCQ. По сравнению с необработанными клетками и отрицательным контролем, при обработке внеклеточными и эндосом-подобными наночастицами, загруженными доксорубицином, процент флуоресцирующих клеток был сопоставимым (более 90%) (Фиг. 5). Однако, анализ средней интенсивности флуоресценции показал различия в профиле интернализации. В частности, обработка доксорубицин-загруженными частицами с HCQ значительно увеличивала интенсивность средней флуоресценции клеток (Фиг. 10), по сравнению с обработкой частицами без обработки HCQ. Данный эффект может объясняться гашением флуоресценции, которая происходит при интернализации загруженных доксорубицином частиц в эндосомальный компартмент по сравнению с высвобождением доксорубицина в цитоплазму, как показано ранее [29]. Однако, эти данные также не исключают, что HCQ напрямую может увеличивать скорость интернализации частиц. Для точного анализа этого явления мы провели замедленный (от 2 до 22 часов после обработки) анализ высвобождения доксорубицина из EV и EMNV с и без обработки HCQ методом высокопропускной визуализации флуоресценции (Фиг. 6а). В этом анализе выявлено, что при обработке внеклеточными везикулами флуоресценция доксорубицина в клетках более эффективно (но статистически не значимо) увеличивается по сравнению с обработкой экзосом-подобными наночастицами на всём временном интервале (Фиг. 6а). Обработка HCQ вместе с частицами значительно увеличивает флуоресценцию доксорубицина для обоих типов везикул уже в наиболее ранней временной точке, что может свидетельствовать об увеличении скорости интернализации частиц. Кроме того, увеличение высвобождения доксорубицина может быть связано с усилением эндосомального выхода под действием HCQ, что ранее показано для HCQ на других системах нано-носителей [19,20].

Чтобы детальнее исследовать кинетику интернализации наночастиц с помощью флуоресцентной микроскопии, были помечены внеклеточные EV и экзосом-подобные наночастицы emNV флуоресцентным красителем ExoGlow, который одинаково эффективен для мечения обоих типов наночастиц. По сравнению с внеклеточными наночастицами, мы наблюдали более высокую интернализацию экзосом-подобных наночастиц emNV (Фиг. 6б, Фиг. 7). Кроме того, впервые показано последовательное увеличение интернализации EV (p < 0,05) и emNV (ns, p > 0,05) при совместной обработке с доксорубицином (Фиг. 6б, Фиг. 7). Следует отметить, при обработке частицами в отсутствии HCQ, флуоресценция клеток со временем незначительно снижалась. Это явление можно объяснить делением клеток (особенно выраженным для линии НЕК-293Т), которое приводит к снижению вдвое содержания интернализованных частиц в каждом цикле деления [30]. Данные по интернализации были подтверждены анализом жизнеспособности клеток, проведенным через 57 ч. после добавления наночастиц. Полученные результаты демонстрируют, что, хотя сам по себе HCQ не оказывает выраженного химиотерапевтического действия и не повышает цитотоксичность свободного доксорубицина, данный химикат повышает эффективность доксорубицина, инкапсулированного в оба типа везикул (Фиг. 8), аналогично увеличению эффективности интернализации. Способность HCQ повышать токсичность доксорубицина, загруженного в бислойные липидные частицы была подтверждена также на клетках гепатомы человека (HepG2) и клетках рака молочной железы (SKBR3), как показано на Фиг.11.

Чтобы оценить, имеют ли две системы доставки схожие механизмы цитотоксичности, авторы исследовали активацию каспазы-3 [21] как маркер апоптоза, индуцированного доксорубицином. Этот анализ также важен для исключения потенциального нарушения жизнеспособности клеток при действии HCQ, так как в клетках, которые обрабатывали цитотоксичными дозами HCQ, ранее была показана активация каспазы-3 [31]. Свободный доксорубицин, а также доксорубицин, упакованный во внеклеточные или экзосом-подобные везикулы, активировал каспазу-3, что позволяет предположить, что механизмы доставки доксорубицина в составе EV и emNV не отличаются. В то же время, HCQ не вызывал активации каспазы-3 (Фиг. 9).

В совокупности, авторы напрямую сравнили эффективность секретируемых EV и экзосом-подобных нановезикул emNV для доставки низкомолекулярного химиотерапевтического препарата доксорубицина. Биологические и физические свойства EV и emNV были сходными, однако, интернализация emNV была немного более эффективной по сравнению с секретируемыми везикулами EV. При этом, цитотоксичность двух видов везикул была одинаковой (Фиг. 6, 7). Кроме того, полученные авторами данные показали влияние препарата гидроксихлорохина, одобренного для медицинского применения, на увеличение интернализации EV и emNV в клетки и усиление их цитотоксической активности для опухолевых клеток (Фиг. 8). Данное вещество дестабилизирует эндолизосомальный компартмент, стимулирует высвобождение упакованного везикулярного содержимого в цитоплазму и улучшает эффективность биологических наночастиц. Потенциально гидроксихлорохин способен увеличивать эффективность других низкомолекулярных веществ (в частности, химиопрепаратов, цитостатиков и препаратов таргетной противоопухолевой терапии) при их доставке с помощью биологических везикул, представляющих собой экзосомы EV и экзосомподобные частицы emNV.

Сущность и промышленная применимость заявленной группы изобретений поясняются следующими примерами, ни в коей мере не уменьшая притязания по формуле изобретения во всех частных формах воплощения признаков.

Пример 1

В первом варианте применения изобретения, бислойные липидные частицы (EV либо emNV) размером 30-150 нм, загруженные химиотерапевтическим препаратом в количестве от 1 до 1×10¹² молекул препарата, системно вводятся пациенту (перорально либо парентерально) в дозе 0,1 – 100 мг/кг веса совместно с введением производного гидроксихлорохина в до концентрации гидроксихлорохина в тканях от 5 мкМ до 100 мкМ в ткани опухоли.

Пример 2

При введении бислойных липидных частиц EV и/или emNV, загруженных химиотерапевтическим препаратом в количестве 1 молекулы препарата из Примера 1 происходит снижение жизнеспособности клеток опухолевой ткани на 10-15%, в то время как при совместном введении производного гидроксихлорохина из Примера 1 происходит увеличение цитотоксического действия до 30%.

Пример 3

При введении бислойных липидных частиц, загруженных химиотерапевтическим препаратом в количестве 1×10¹² молекул препарата из Примера 1 происходит снижение жизнеспособности клеток опухолевой ткани на >90%, в то время как при совместном введении производного гидроксихлорохина из Примера 1 происходит дополнительное увеличение цитотоксического действия до 95%, а также ускоренная гибель клеток опухолевой ткани, наблюдаемая в ходе динамического анализа жизнеспособности (гибель до 50% клеток на 24-36 час при использовании только препарата в составе бислойных липидных частиц, против гибели до 50% клеток на 12-20 час при использовании препарата совместно с гидроксихлорохином из Примера 1).

Пример 4

Во втором варианте применения изобретения, бислойные липидные частицы (EV либо emNV) размером 30-150 нм, загруженные химиотерапевтическим препаратом в количестве от 1 до 1×10¹² молекул препарата, и производным гидроксихлорохина в концентрации 5 мкМ до 100 мкМ, системно вводятся пациенту (перорально либо парентерально) до накопления оптимального количества частиц в опухоли. Загрузка производного гидроксихлорохина непосредственно в частицы обеспечивает более быстрый эффект усиления цитотоксичности упакованного цитотоксического вещества, при этом уменьшается накопление производного гидроксихлорохина в здоровых тканях. В результате, происходит разрушение опухоли с минимальными побочными эффектами либо без них.

Пример 5

Использование бислойных липидных частиц, загруженных химиотерапевтическим препаратом в количестве 1 молекулы препарата из Примера 4 при одновременной загрузке производных гидроксихлорохина из Примера 4 вызывает детектируемую цитотоксическую активность (снижение жизнеспособности на 30-60%) на клетках опухолей уже на 12 час после введения против 20-го часа при использовании частиц без одновременной загрузки гидроксихлорохина.

Пример 6

Использование бислойных липидных частиц, загруженных химиотерапевтическим препаратом в количестве 1×10¹² молекул препарата из Примера 4 при одновременной загрузке производных гидроксихлорохина из Примера 4 вызывает детектируемую цитотоксическую активность (снижение жизнеспособности на 50-80%) на клетках опухолей уже на 8 час после введения против 16-го часа при использовании частиц без одновременной загрузки гидроксихлорохина.

Пример 7

В третьем варианте применения, бислойные липидные частицы (EV либо emNV) размером 30-150 нм, загруженные химиотерапевтическим препаратом в количестве от 1 до 1×10¹² молекул препарата, вводятся локально в опухолевый очаг совместно с производным хлорохина (либо вводятся частицы, загруженные химиотерапевтическим препаратом и производным гидроксихлорохина до концентрации от 5 мкМ до 100 мкМ в ткани опухоли). Введение может осуществляться путём нанесения на кожу, слизистые оболочки либо использованием эндоскопических процедур. В результате, в опухолевом очаге создаётся оптимальная концентрация загруженных бислойных липидных частиц с противоопухолевым препаратом, и происходит разрушение опухолевых клеток, усиливаемое производным гидроксихлорохина. При этом всасывание препаратов в системный кровоток не происходит, и разрушение опухоли происходит с минимальными или отсутствующими побочными эффектами.

Пример 8

Введение бислойных липидных частиц, загруженных химиотерапевтическим препаратом в количестве 1 молекулы препарата локально в опухолевый очаг совместно с производным хлорохина из Примера 7 обеспечивает максимальное накопление частиц в опухолевой ткани со снижением размеров опухоли на 10-15% и с минимальным выходом частиц из зоны первичной опухоли, в отличие от характерного для системного введения распределения в органы выведения, включая печень, селезенку, легкие и почки, что обеспечивает минимальные токсические эффекты, связанные с образование двуцепочечных разрывов генома в здоровых тканях и гибель здоровых клеток с нарушением функционирования органов.

Пример 9

Введение бислойных липидных частиц, загруженных химиотерапевтическим препаратом в количестве 1×10¹² молекулы препарата локально в опухолевый очаг совместно с производным хлорохина из Примера 7 обеспечивает максимальное накопление частиц в опухолевой ткани со снижением размеров опухоли на 60-90% и с минимальным выходом частиц из зоны первичной опухоли, в отличие от характерного для системного введения распределения в органы выведения, включая печень, селезенку, легкие и почки, что обеспечивает минимальные токсические эффекты, связанные с образование двуцепочечных разрывов генома в здоровых тканях и гибель здоровых клеток с нарушением функционирования органов, не вызывает значительной потери веса у испытуемых животных.

Таким образом, при реализации заявленных способов представленными выше примерами обеспечивается увеличение цитотоксической активности химиопрепаратов, доставляемых в составе бислойных липидных частиц, за счет применения по новому назначению гидроксихлорохина и его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания, увеличение эффективности доставки лекарственного препарата в очаг ракового заболевания, увеличение эффективности действия химиотерапевтического лекарственного препарата, усиление цитотоксичности используемого химиотерапевтического препарата в отношении целевых клеток, что потенциально позволяет использовать более низкие дозы цитотоксичных веществ (химиотерапевтических препаратов), усиление интернализации и увеличение эндосомального выхода цитотоксических препаратов, упакованных в бислойные липидные частицы, повышение эффективности разрушения опухолевых клеток и расширение арсенала способов направленной доставки химиотерапевтических препаратов, включая цитостатиков и препаратов таргетной терапии, в опухолевые клетки с более высокой эффективностью.

Источники информации

1. Y. Shi, R. Van der Meel, X. Chen, T. Lammers, The EPR effect and beyond: Strategies to improve tumor targeting and cancer nanomedicine treatment efficacy, Theranostics. 10 (2020) 7921.

2. M.E.R. O’Brien, N. Wigler, M. Inbar, R. Rosso, E. Grischke, A. Santoro, R. Catane, D.G. Kieback, P. Tomczak, S.P. Ackland, Reduced cardiotoxicity and comparable efficacy in a phase IIItrial of pegylated liposomal doxorubicin HCl (CAELYXTM/Doxil®) versus conventional doxorubicin forfirst-line treatment of metastatic breast cancer, Ann. Oncol. 15 (2004) 440–449.

3. L. Sercombe, T. Veerati, F. Moheimani, S.Y. Wu, A.K. Sood, S. Hua, Advances and challenges of liposome assisted drug delivery, Front. Pharmacol. 6 (2015) 286.

4. T. Wang, S. Yang, V.A. Petrenko, V.P. Torchilin, Cytoplasmic delivery of liposomes into MCF-7 breast cancer cells mediated by cell-specific phage fusion coat protein, Mol. Pharm. 7 (2010) 1149–1158.

5. X. Luan, K. Sansanaphongpricha, I. Myers, H. Chen, H. Yuan, D. Sun, Engineering exosomes as refined biological nanoplatforms for drug delivery., Acta Pharmacol. Sin. 38 (2017) 754–763. https://doi.org/10.1038/aps.2017.12.

6. D. Kostyushev, A. Kostyusheva, S. Brezgin, V. Smirnov, E. Volchkova, A. Lukashev, V. Chulanov, Gene editing by extracellular vesicles, Int. J. Mol. Sci. 21 (2020) 7362.

7. D. Ha, N. Yang, V. Nadithe, Exosomes as therapeutic drug carriers and delivery vehicles across biological membranes: current perspectives and future challenges, Acta Pharm. Sin. B. 6 (2016) 287–296.

8. S. Kamerkar, V.S. LeBleu, H. Sugimoto, S. Yang, C.F. Ruivo, S.A. Melo, J.J. Lee, R. Kalluri, Exosomes facilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pancreatic cancer., Nature. 546 (2017) 498–503. https://doi.org/10.1038/nature22341.

9. Y. Liang, L. Duan, J. Lu, J. Xia, Engineering exosomes for targeted drug delivery, Theranostics. 11 (2021) 3183.

10. P. Saha, S. Sharma, L. Korutla, S.R. Datla, F. Shoja-Taheri, R. Mishra, G.E. Bigham, M. Sarkar, D. Morales, G. Bittle, Circulating exosomes derived from transplanted progenitor cells aid the functional recovery of ischemic myocardium, Sci. Transl. Med. 11 (2019) eaau1168.

11. L. Mao, Y.-D. Li, R.-L. Chen, G. Li, X.-X. Zhou, F. Song, C. Wu, Y. Hu, Y.-X. Hong, X. Dang, Heart-targeting exosomes from human cardiosphere-derived cells improve the therapeutic effect on cardiac hypertrophy, J. Nanobiotechnology. 20 (2022) 1–14.

12. W. Zhou, Y. Zhou, X. Chen, T. Ning, H. Chen, Q. Guo, Y. Zhang, P. Liu, Y. Zhang, C. Li, Pancreatic cancer-targeting exosomes for enhancing immunotherapy and reprogramming tumor microenvironment, Biomaterials. 268 (2021) 120546.

13. S. Li, Z. Lin, X. Jiang, X. Yu, Exosomal cargo-loading and synthetic exosome-mimics as potential therapeutic tools, Acta Pharmacol. Sin. 39 (2018) 542–551.

14. I. Kimiz-Gebologlu, S.S. Oncel, Exosomes: Large-scale production, isolation, drug loading efficiency, and biodistribution and uptake, J. Control. Release. 347 (2022) 533–543.

15. L.I. Sun, R. Xu, X. Sun, Y. Duan, Y. Han, Y. Zhao, H. Qian, W. Zhu, W. Xu, Safety evaluation of exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stromal cell, Cytotherapy. 18 (2016) 413–422.

16. T.R. Lunavat, S.C. Jang, L. Nilsson, H.T. Park, G. Repiska, C. Lässer, J.A. Nilsson, Y.S. Gho, J. Lötvall, RNAi delivery by exosome-mimetic nanovesicles–Implications for targeting c-Myc in cancer, Biomaterials. 102 (2016) 231–238.

17. S.C. Jang, O.Y. Kim, C.M. Yoon, D.-S. Choi, T.-Y. Roh, J. Park, J. Nilsson, J. Lotvall, Y.-K. Kim, Y.S. Gho, Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors, ACS Nano. 7 (2013) 7698–7710.

18. A.-L. Tian, Q. Wu, P. Liu, L. Zhao, I. Martins, O. Kepp, M. Leduc, G. Kroemer, Lysosomotropic agents including azithromycin, chloroquine and hydroxychloroquine activate the integrated stress response, Cell Death Dis. 12 (2021) 1–13.

19. G. Gao, X. Sun, X. Liu, Y. Jiang, R. Tang, Y. Guo, F. Wu, G. Liang, Intracellular Nanoparticle Formation and Hydroxychloroquine Release for Autophagy‐Inhibited Mild‐Temperature Photothermal Therapy for Tumors, Adv. Funct. Mater. 31 (2021) 2102832.

20. Y. Li, M.H. Cho, S.S. Lee, D.-E. Lee, H. Cheong, Y. Choi, Hydroxychloroquine-loaded hollow mesoporous silica nanoparticles for enhanced autophagy inhibition and radiation therapy, J. Control. Release. 325 (2020) 100–110.

21. T.-L. To, A. Schepis, R. Ruiz-González, Q. Zhang, D. Yu, Z. Dong, S.R. Coughlin, X. Shu, Rational Design of a GFP-Based Fluorogenic Caspase Reporter for Imaging Apoptosis In Vivo., Cell Chem. Biol. 23 (2016) 875–882. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2016.06.007.

22. R. Kornilov, M. Puhka, B. Mannerström, H. Hiidenmaa, H. Peltoniemi, P. Siljander, R. Seppänen-Kaijansinkko, S. Kaur, Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum, J. Extracell. Vesicles. 7 (2018) 1422674.

23. N. Heath, L. Grant, T.M. De Oliveira, R. Rowlinson, X. Osteikoetxea, N. Dekker, R. Overman, Rapid isolation and enrichment of extracellular vesicle preparations using anion exchange chromatography, Sci. Rep. 8 (2018) 1–12.

24. V.S. Chernyshev, R. Rachamadugu, Y.H. Tseng, D.M. Belnap, Y. Jia, K.J. Branch, A.E. Butterfield, L.F. Pease, P.S. Bernard, M. Skliar, Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes, Anal. Bioanal. Chem. 407 (2015) 3285–3301.

25. H.-K. Woo, Y.K. Cho, C.Y. Lee, H. Lee, C.M. Castro, H. Lee, Characterization and modulation of surface charges to enhance extracellular vesicle isolation in plasma, Theranostics. 12 (2022) 1988.

26. M.C. Deregibus, F. Figliolini, S. D’antico, P.M. Manzini, C. Pasquino, M. De Lena, C. Tetta, M.F. Brizzi, G. Camussi, Charge-based precipitation of extracellular vesicles, Int. J. Mol. Med. 38 (2016) 1359–1366.

27. C. Théry, K.W. Witwer, E. Aikawa, M.J. Alcaraz, J.D. Anderson, R. Andriantsitohaina, A. Antoniou, T. Arab, F. Archer, G.K. Atkin‐Smith, Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines, J. Extracell. Vesicles. 7 (2018) 1535750.

28. F. Perche, Y. Yi, L. Hespel, P. Mi, A. Dirisala, H. Cabral, K. Miyata, K. Kataoka, Hydroxychloroquine-conjugated gold nanoparticles for improved siRNA activity, Biomaterials. 90 (2016) 62–71.

29. G. Marcelo, E. Kaplan, M.P. Tarazona, F. Mendicuti, Interaction of gold nanoparticles with Doxorubicin mediated by supramolecular chemistry, Colloids Surfaces B Biointerfaces. 128 (2015) 237–244.

30. A. Parodi, M. Evangelopoulos, N. Arrighetti, A. Cevenini, M. Livingston, S.Z. Khaled, B.S. Brown, I.K. Yazdi, F. Paradiso, J.N. Campa‐Carranza, Endosomal Escape of Polymer‐Coated Silica Nanoparticles in Endothelial Cells, Small. 16 (2020) 1907693.

31. L. Lagneaux, A. Delforge, M. Dejeneffe, M. Massy, M. Bernier, D. Bron, Hydroxychloroquine-induced apoptosis of chronic lymphocytic leukemia involves activation of caspase-3 and modulation of Bcl-2/bax/ratio, Leuk. Lymphoma. 43 (2002) 1087–1095.

32. Заявка на патент на изобретение US20160137716A1 (Samir El Andaloussi, Huddinge (SE)), 19.05.2016 "Therapeutic delivery vesicles" .

33. Патент на изобретение AU2018365299B2 (Evox Therapeutics Ltd), 16.05.2019 " Exosomes comprising RNA therapeutics".

34. Патент на изобретение KR 10-0390332 (Yoo Oh-Young (KR)) от 27.06.2015 "Anticancer composition consisting of anticancer and antimalarial drugs".

35. Патент на полезную модель RU 42953 U1 (Закрытое акционерное общество "Вектор-Медика" (RU)), 27.12.2004 "Липосомальная нанокапсула с доксорубицином".

36. Заявка на патент на изобретение US20200297631A1 (The University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC (US)), 24.09.2020 "Biological agent - exosome compositions and uses thereof" (прототип).

Группа изобретений относится к области фармацевтики, а именно к способам применения гидроксихлорохина или его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания. Способ применения гидроксихлорохина или его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания, в котором получают бислойные липидные частицы – экзосомы EV и/или экзосом-подобные частицы emNV, в них вносят химиотерапевтический лекарственный препарат – доксорубицин, фторурацил, паклитаксел, циклофосфамид или препараты таргетной терапии – от 1 до 1×10¹² молекул на частицу, частицы вносят в раствор гидроксихлорохина или его производных, выбираемых из хлорохина или мефлохина, в концентрации от 5 до 100 мкМ, пациенту вводят раствор в дозе 0,1-100 мг/кг веса, содержащий гидроксихлорохин или его производные и указанные частицы. Способ того же назначения, отличающийся от вышеуказанного тем, что гидроксихлорохин или его указанные производные вносят в бислойные липидные частицы до концентрации 5-100 мкМ, затем частицы вводят пациенту. Способ того же назначения, отличающийся от вышеуказанных тем, что химиотерапевтический препарат вносят в бислойные липидные частицы в количестве от 1 до 1×10¹² молекул препарата на частицу, затем пациенту вводят указанные частицы и гидроксихлорохин или его производные. Группа изобретений позволяет увеличить цитотоксическую активность химиопрепаратов, доставляемых в составе бислойных липидных частиц, увеличить эффективность доставки препаратов в очаг ракового заболевания и эффективность их действия, усилить их цитотоксичность в отношении целевых клеток, увеличить их интернализацию и эндосомальный выход, повысить разрушение опухолевых клеток. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 11 ил., 9 пр.

1. Способ применения гидроксихлорохина или его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания, включающий:

- получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосомы EV;

и/или получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосом-подобные частицы emNV;

- внесение химиотерапевтического лекарственного препарата, в качестве которого используют доксорубицин, фторурацил, паклитаксел, циклофосфамид или препараты таргетной терапии, в бислойные липидные частицы от 1 до 1×10¹² молекул химиотерапевтического лекарственного препарата на бислойную липидную частицу;

- внесение бислойных липидных частиц, содержащих химиотерапевтический лекарственный препарат, в раствор гидроксихлорохина или в раствор его производных, выбираемых из хлорохина или мефлохина, в концентрации от 5 до 100 мкМ;

- введение пациенту раствора в дозе 0,1-100 мг/кг веса, содержащего гидроксихлорохин или его производные и бислойные липидные частицы, содержащие химиотерапевтический лекарственный препарат.

2. Способ применения гидроксихлорохина или его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания, включающий:

- получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосомы EV;

и/или получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосом-подобные частицы emNV;

- внесение химиотерапевтического лекарственного препарата, в качестве которого используют доксорубицин, фторурацил, паклитаксел, циклофосфамид или препараты таргетной терапии, в бислойные липидные частицы в количестве от 1 до 1×10¹² молекул химиотерапевтического лекарственного препарата на бислойную липидную частицу;

- внесение гидроксихлорохина или его производных, выбираемых из хлорохина или мефлохина, в бислойные липидные частицы до содержания гидроксихлорохина или его производных в бислойных липидных частицах в концентрации 5-100 мкМ;

- введение пациенту полученных бислойных липидных частиц, содержащих химиотерапевтический лекарственный препарат и содержащих гидроксихлорохин или его производные.

3. Способ применения гидроксихлорохина или его производных для доставки химиотерапевтического лекарственного препарата в очаг ракового заболевания, включающий:

- получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосомы EV;

и/или получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосом-подобные частицы emNV;

- внесение химиотерапевтического лекарственного препарата, в качестве которого используют доксорубицин, фторурацил, паклитаксел, циклофосфамид или препараты таргетной терапии, в бислойные липидные частицы в количестве от 1 до 1×10¹² молекул химиотерапевтического лекарственного препарата на бислойную липидную частицу;

- введение пациенту бислойных липидных частиц, содержащих химиотерапевтический лекарственный препарат, и введение пациенту гидроксихлорохина или его производных, выбираемых из хлорохина или мефлохина.

4. Способ по любому из пп. 1-3, включающий получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосомы EV, методом их выделения из культуральной среды мезенхимальных стромальных клеток (МСК), выделенных из таких источников, как костный мозг, жировая ткань, пуповинная кровь, плацента, соединительные ткани, кожа или их производные, включая генно-модифицированные аналоги, производных индуцированных плюрипотентных клеток, включая генетически-модифицированные клетки с удаленными или внесенными генетическими последовательностями, обеспечивающими их неиммуногенные свойства или свойства продукции дополнительных белков и/или РНК.

5. Способ по любому из пп. 1-3, включающий получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосомы EV, методом их выделения из клеток HEK293 или их модификации T, F или генно-модифицированные аналоги, включая генетически-модифицированные клетки с удаленными или внесенными генетическими последовательностями, обеспечивающими их неиммуногенные свойства или свойства продукции дополнительных белков и/или РНК.

6. Способ по любому из пп. 1-3, включающий получение бислойных липидных частиц, представляющих собой экзосом-подобные частицы emNV, методом экструзии клеточной массы через фильтры или наслаиванием компонентов клеточной массы на терапевтический агент, при этом клетки выбирают из мезенхимальных стромальных клеток (МСК), выделенных из таких источников, как костный мозг, жировая ткань, пуповинная кровь, плацента, соединительные ткани, кожа или их производные, включая генно-модифицированные аналоги, производных индуцированных плюрипотентных клеток, включая генетически-модифицированные клетки с удаленными или внесенными генетическими последовательностями, обеспечивающими их неиммуногенные свойства или свойства продукции дополнительных белков и/или РНК или клеток HEK293 или их модификации T, F или генно-модифицированные аналоги.

7. Способ по любому из пп. 1-3, в котором внесение химиотерапевтического лекарственного препарата в бислойные липидные частицы осуществляют методом инкубации, или методом экструзии, или методом заморозки-разморозки, или методом пермеабилизации клеточной мембраны, или методом обработки поверхностно-активными соединениями, или методом электропорации (нуклеофекции), в том числе с помощью микропульсов.

8. Способ по любому из пп. 1-3, в котором в качестве химиотерапевтического лекарственного препарата используют препараты таргетной терапии, такие как мезилат иматиниба, гефитиниб, эрлотиниб, сорафениб, сунитиниб, дезатиниб, лапатиниб, нилотиниб, бортезомиб, тамоксифен, tofacitinib, кризотиниб, обатоклакс, навитоклакс, госсипол, ингибиторы PARP инипариб и олапариб, ингибитор PI3K перифозин, ингибитор VEGFR-2 алатиниб, ингибиторы BRAF вемурафениб и дабрафениб, ингибитор MEK траметиниб, ингибиторы Hsp90 салиномицин, винтафолид, ингибиторы серин-треонин киназы темсиролимус, эверолимус, или аналоги этих лекарственных препаратов.

9. Способ по любому из пп. 1-3, в котором дополнительно вводят в бислойные липидные частицы (а) анкилирующие агенты, такие как цисплатин, карбоплатин, дакарбазин, хлорамбуцил, оксалиплатин, темозоломид, (б) антиметаболиты, такие как 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, капецитабин, гемцитабин, метотрексат, (в) противоопухолевые антибиотики, такие как эпирубицин, даунорубицин, идарубицин, адриамицин, (г) противоопухолевые антибиотики, не являющиеся антрациклинами, такие как блеомицин, митоксантрон, митомицин-С, актиномицин D, (д) ингибиторы топоизомеразы, такие как топотекан, иринотекан, этопозид, тенипозид, митоксантрон, (е) ингибиторы митоза, такие как доцетаксел, паклитаксел, винбластин, винкристин, (ж) винкаалкалоиды, такие как винбластин, винкристин, (з) таксаны, такие как доцетаксел или (и) глюкокортикостероиды, такие как метилпреднизолон, преднизон, дексаметазон.

10. Способ по любому из пп. 1-3, в котором раковое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, опухоль головы, опухоль шеи, опухоль головного мозга, глиобластомы, глиомы, рак легких, рак органов пищеварения, рак желудка, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак кожи или рак глаз.

11. Способ по любому из пп. 1-3, в котором бислойные липидные частицы, представляющие собой экзосомы EV и экзосом-подобные частицы emNV, включают экспонированные на их поверхности таргетирующие лиганды.

12. Способ по п. 11, в котором таргетирующие лиганды представляют собой пептиды, аптамеры, лиганды, рецепторы, антитела, нанотела, высоко- и низкомолекулярные соединения.

13. Способ по п. 11, в котором экспонирование на поверхность бислойных липидных частиц emNV осуществляют с помощью генетических методов, в том числе с помощью экспрессии генетических конструктов, которые обеспечивают экспрессию белков и пептидов на поверхности бислойных липидных частиц с экспонированием на внешней мембране.

14. Способ по п. 11, в котором экспонирование на внешней поверхности бислойных липидных частиц осуществляют с помощью химического метода клик-химия или с помощью использования аптамеров, низко- и высокомолекулярных соединений.

15. Способ по п. 12, в котором рецепторы представляют собой рецепторы, специфичные к опухолевым клеткам и тканям, рецепторы жирных кислот, такие как FFA1, FFA4, рецепторы альбумина, такие как Fcnr, SPARC, Gp30, Gp18, рецепторы глюкозы, такие как GLUT-1, GLUT-4, GLUT-5, рецепторы scavenger receptor A, MSR1, CD204, FcIIIgamma в нативном виде, либо в виде слитого либо химерного конструкта для заякоривания рецептора в мембране бислойных липидных частиц, либо химически-модифицированные варианты рецепторов.

16. Способ по любому из пп. 1-3, в котором размер бислойных липидных частиц составляет от 30 нм до 150 нм.

17. Способ по любому из пп. 1-3, в котором гидроксихлорохин или его производные используют в виде инъекционного раствора.

18. Способ по п. 3, в котором гидроксихлорохин или его производные используют в виде таблеток.

19. Способ по любому из пп. 1 и 3, в котором осуществляют введение пациенту бислойных липидных частиц, содержащих химиотерапевтический лекарственный препарат, в дозе 1×10¹⁰ - 1×10³⁰ бислойных липидных частиц на 1 кг веса человека.

20. Способ по п. 2, в котором осуществляют введение пациенту бислойных липидных частиц, содержащих химиотерапевтический лекарственный препарат и гидроксихлорохин или его производные, в дозе 1×10¹⁰ - 1×10³⁰ бислойных липидных частиц на 1 кг веса человека.