ВЕЗИКУЛЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИНГИБИТОР PTEN, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2023 года по МПК A61K9/127 A61K31/7088 A61K35/28 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[1] Настоящее изобретение относится к мембранным везикулам, загруженным ингибитором PTEN, фармацевтическим композициям, содержащим указанные везикулы, и их применению для лечения неврологических расстройств и, более конкретно, к внеклеточным везикулам клеточного происхождения, загруженным экзогенным ингибитором PTEN, фармацевтическим композициям, содержащим их, и их применению для лечения травм спинного мозга.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[2] Повреждение спинного мозга может привести к вегетативной дисфункции, утрате чувствительности или утрате подвижности. Такое повреждение спинного мозга (ПСМ) вызывается травмой, опухолями, ишемией, расстройствами развития, нейродегенеративными заболеваниями, демиелинизирующими заболеваниями, поперечным миелитом, пороками развития сосудов или другими причинами. Последствия ПСМ зависят от характера травмы и ее расположения в спинном мозге. Кроме того, поскольку ПСМ является динамическим процессом, степень повреждения может первоначально не проявляться полностью при всех острых синдромах спинного мозга. Неполное поражение спинного мозга может перерасти в более полное поражение; чаще уровень повреждения поднимается на один или два уровня в течение нескольких часов или дней после первоначального события. Это клиническое ухудшение объясняется сложным каскадом патофизиологических событий.

[3] Психологические и социальные последствия ПСМ часто подавляют пациента. Некоторые из распространенных инвалидизирующих состояний, связанных с ПСМ, представляют собой постоянный паралич конечностей, хроническую боль, мышечную атрофию, утрату произвольного контроля над мочевым пузырем и кишечником, сексуальную дисфункцию и бесплодие.

[4] Недавние достижения в области нейробиологии привлекли значительное внимание к исследованиям ПСМ и сделали доступными значительно более совершенные варианты лечения и реабилитации. Например, продемонстрирован потенциал функциональной электрической стимуляции (ФЭС) в отношении усиления регенерации нервов, что позволяет значительно улучшить восстановление и улучшение функциональной способности после ПСМ. Вместе с тем, не все пациенты с ПСМ подходят для ФЭС (требуется полное поражение спинного мозга); пациент должен находиться в неврологически стабильном состоянии; периферические нервы должны быть интактными и реагировать на экзогенную электрическую стимуляцию.

[5] Регенерация аксонов после ПСМ ограничена из-за присущей зрелым нейронам чрезвычайно ограниченной способности к росту, а также из-за внешних факторов, например, глиального рубца, созревающего со временем, и ингибирующих веществ. Имели место попытки изменения внешних факторов, но с ограниченным успехом. Например, за счет удаления внеклеточной ингибирующей молекулы, доставки нейротрофического фактора или трансплантации пермиссивной подложки не удавалось вызвать устойчивую регенерацию поврежденного корково-спинномозгового пути.

[6] Гомолог фосфатазы и тензина (PTEN) представляет собой высококонсервативную протеинтирозинфосфатазу с двойной специфичностью. Этот белок дефосфорилирует липидные вторичные мессенджеры фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфат [PI(3,4,5)P3] и фосфатидилинозит-3,4-бисфосфат [PI(3,4)P2] с образованием фосфатидилинозит-4,5-бисфосфата [PI(4,5)P2] и фосфатидилинозит-4-фосфата [PI(4)P], соответственно. Эта уникальная активность делает PTEN основным гомеостатическим регулятором и белком-супрессором опухолей, функция которого отсутствует или нарушена в большом количестве опухолей в результате соматических изменений. Важная роль сигнального пути PI3K/AKT/mTOR при росте, регенерации и выживании клеток подтверждает обоснованность терапевтического воздействия на PTEN. Предлагаемые терапевтические мишени, основанные на ингибировании PTEN, включают рост и регенерацию нервов после травмы или повреждения, лечение ишемии/реперфузии сердца и ассоциированных с ними заболеваний, заживление ран и бесплодие (см. обзор Pulido, 2018, Molecules, 23, 285). Интересно, что основная парадигма вовлечения PTEN в канцерогенез состоит в том, что он является супрессором рака, и продемонстрировано, что ингибирование PTEN может происходить при метастазах в головной мозг (Zhang et al., Nature, 2015, 527, 100-104).

[7] PTEN преимущественно экспрессируется в нейронах головного мозга взрослых, играет важную роль в контроле регенерации кортикоспинальных нейронов посредством подавления мишени активности рапамицина (mTOR) у млекопитающих. Активность mTOR сильно подавляется в аксотомизированных нейронах взрослых, ограничивая синтез нового белка, необходимого для устойчивой регенерации аксонов. В нескольких публикациях упоминается участие PTEN в подавлении регенерации нервов, а в других показано положительное влияние истощения PTEN на состояния, связанные с повреждением или нарушением функции аксонов. Эффективное ингибирование PTEN могло бы потенциально увеличивать количество mTOR, тем самым способствуя регенерации нервов.

[8] В WO 2009/117389 описано терапевтическое применение ингибиторов PTEN для лечения нейродегенеративных расстройств. В WO 2015/066701 описан способ регенерации нервов или ослабления дегенерации нервов путем введения пептида, ингибирующего PTEN, в поврежденный нерв или рядом с ним. В WO 2011/044701 описаны конкретные пептиды, ингибирующие PTEN, и их применение для лечения заболеваний, связанных с цитотоксическим стрессом, включая заболевания и повреждения центральной нервной системы.

[9] Предложено огромное количество носителей, пригодных для доставки молекул миРНК, включая, в числе прочего, липосомы, белковые частицы, мицеллы и липидные частицы. Rungta et al. (Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2013, 2, e136) показали, что миРНК в липидных наночастицах (LNP) может вызывать эффективный сайленсинг экспрессии генов в нейронах.

[10] Внеклеточные мембранные везикулы (EV) - это мембранные везикулы, секретируемые различными типами клеток. EV присутствуют в кровотоке в нормальных физиологических условиях, и их уровни повышаются при различных заболеваниях, например, диабете и связанных с ним сосудистых осложнениях, сердечно-сосудистых заболеваниях, гематологических злокачественных новообразованиях, а также при солидных опухолях.

[11] EV можно разделить на три субпопуляции: (I) экзосомы диаметром 30-100 нм, происходящие из эндосомальных компартментов; (II) микровезикулы диаметром от 100 нм до 1 мкм, высвобождающиеся с поверхности клетки посредством «везикуляции»; и (III) апоптотические тельца диаметром 1-5 мкм, которые высвобождаются из апоптотических клеток. EV содержат некоторые элементы исходной клетки, включая белки, фрагменты ДНК, микроРНК и мРНК.

[12] ЕР 2254586 посвящен экзосомам, выделенным из мезенхимальных стволовых клеток, причем указанные экзосомы обладают по меньшей мере одним биологическим свойством мезенхимальных стволовых клеток. Кроме того, экзосомы предложены в качестве носителей для различных лекарств, включая низкомолекулярные соединения и некодирующие РНК (например, US 2017/0247708 и Ha et al., Acta Pharmaceutica Sinica B 2016;6(4):287-296). Обычно миРНК вводят в экзосомы путем электропорации.

[13] В WO 2018/033911, выданном некоторым авторам настоящей заявки, описаны экзосомы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток, для лечения неврологических расстройств.

[14] Повреждение нейронов в целом и повреждение спинного мозга (ПСМ) в частности включает длинный и сложный каскад вторичных событий, следующих за собственно повреждением. Сложность каскада может влиять на эффективность предлагаемых способов лечения, и существует неудовлетворенная потребность в разработке дополнительных безопасных, эффективных и удобных методов лечения ПСМ.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[15] Согласно одному аспекту, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN).

[16] Согласно еще одному аспекту, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), для применения при лечении неврологического заболевания, расстройства или состояния.

[17] В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения неврологического заболевания, расстройства или состояния у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества мембранных частиц, загруженных экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), что приводит к лечению неврологического заболевания или состояния. Согласно некоторым вариантам реализации, мембранные частицы представляют собой внеклеточные везикулы клеточного происхождения.

[18] Согласно еще одному аспекту, в настоящем изобретении предложены выделенные внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN).

[19] Согласно любому из вышеперечисленных аспектов, внеклеточные везикулы выбраны из группы, состоящей из экзосом, микровезикул, мембранных частиц, мембранных везикул, эктосом и экзовезикул. В соответствии с дополнительными признакамм в описанных вариантах реализации, частицы содержат экзосомы. Согласно некоторым вариантам реализации, внеклеточные везикулы представляют собой комбинацию экзосом и микровезикул. Согласно некоторым вариантам реализации, внеклеточные везикулы, например, экзосомы, происходят из адгезивных клеток, экспрессирующих мезенхимальные маркеры. Согласно некоторым вариантам реализации, адгезивные клетки, экспрессирующие мезенхимальные маркеры, выбраны из мезенхимальных стволовых клеток, стволовых клеток слизистой оболочки полости рта или обонятельных обкладочных клеток. Согласно другим вариантам реализации, внеклеточные везикулы, например, экзосомы, происходят из адгезивных клеток, экспрессирующих маркеры клеток нервного гребня. Согласно одному варианту реализации, клетки нервного гребня содержат клетки краниального нервного гребня. Согласно дополнительным признакам в описанных вариантах реализации, клетки краниального нервного гребня выбраны из группы, состоящей из стволовых клеток пульпы зуба (DPSC), стволовых клеток выпавших молочных зубов (SHED), стволовых клеток периодонтальной связки (PDLSC), стволовых клеток апикального сосочка (SCAP) и клеток-предшественников зубных фолликулов (DFPC). Согласно любому из вышеуказанных аспектов и вариантов реализации, внеклеточные везикулы представляют собой выделенные внеклеточные везикулы. Согласно некоторым аспектам и вариантам реализации, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению представляет собой бесклеточную композицию.

[20] Согласно любому из вышеуказанных аспектов и вариантов реализации, ингибитор PTEN включает полинуклеотидный или олигонуклеотидный ингибитор экспрессии PTEN. Согласно некоторым вариантам реализации, ингибитор PTEN представляет собой олигонуклеотид для РНК-интерференции. Согласно некоторым вариантам реализации, олигонуклеотид для РНК-интерференции представляет собой миРНК против PTEN. Согласно некоторым вариантам реализации, миРНК содержит последовательность, комплементарную нуклеиновой кислоте, кодирующей белок PTEN человека. Согласно некоторым вариантам реализации, олигонуклеотидный ингибитор содержит гидрофобный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации, гидрофобный фрагмент представляет собой стерин, ганглиозид, липид, витамин, жирную кислоту, пептид или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации, гидрофобный фрагмент представляет собой стерин. Согласно некоторым вариантам реализации, стерин включает холестерин.

[21] Согласно дополнительным признакам любого из описанных аспектов или вариантов реализации, ингибитор PTEN включает пептидный ингибитор.

[22] Согласно некоторым вышеупомянутым аспектам и вариантам реализации, неврологическое заболевание представляет собой нейродегенеративное заболевание. Согласно другим аспектам и вариантам реализации, неврологическое состояние представляет собой повреждение спинного мозга. Согласно некоторым вышеупомянутым аспектам и вариантам реализации, лечение повреждения спинного мозга включает введение фармацевтической композиции или выделенных внеклеточных везикул субъекту, нуждающемуся в этом. Согласно некоторым вариантам реализации, введение включает интраназальное введение. Согласно некоторым вариантам реализации, лечение дополнительно включает введение субъекту терапевтически эффективного количества хондроитиназы ABC или кодирующего ее полинуклеотида.

[23] Если не указано иное, все технические и/или научные термины, используемые в настоящем документе, имеют же значение, обычно подразумеваемое специалистом в области техники, к которой относится изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, можно использовать при реализации или тестировании вариантов реализации настоящего изобретения, ниже описаны типичные способы и/или материалы. В случае конфликта преимущественную силу имеет описание патента, включая определения. Кроме того, материалы, способы и примеры носят исключительно иллюстративный характер и не предназначены для ограничения.

Краткое описание чертежей

[24] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения описаны в настоящем документе исключительно в качестве примера со ссылкой на прилагаемые чертежи. Применительно к конкретным подробным чертежам следует подчеркнуть, что детали на них показаны в качестве примера и в целях иллюстративного обсуждения вариантов реализации настоящего изобретения. В этом отношении описание чертежей делает способы практической реализации вариантов реализации настоящего изобретения очевидными для специалистов в данной области техники.

[25] На фиг. 1 показана визуализация MSC-Exo с помощью Cryo-TEM.

[26] На фиг. 2 показано микро-КТ сканирование всех тканей ЦНС у травмированных (верхняя панель) и здоровых (нижняя панель) крыс. На фигуре видно, что экзосомы проникают через гематоэнцефалический барьер и достигают места поражения спинного мозга.

[27] На фиг. 3 показано количественное определение наночастиц золота (GNP) при интраназальном введении GNP-экзосом посредством оценки с использованием индуктивно связанной плазмы (ICP) в ЦНС (левая панель) и основных органах (правая панель) с использованием FAAS у здоровых и травмированных крыс. *p < 0,05, ***p < 0,001.

[28] На фиг.4 показано количественное определение средней интенсивности сигнала PKH26 в сегменте позвоночника T10 с использованием экзосом, меченных PKH26 (PKH26-Exo), у интактных и травмированных крыс. **р < 0,01.

[29] На фиг.5 показана количественная оценка сигналов PKH26-Exo, локализованных вместе с нейронами, астроцитами и активированной микроглией (p < 0,01).

[30] На фиг. 6 показан NanoSight-анализ самодоставляющейся МАРК-миРНК с меткой Cy3, инкубированной с экзосомами. На фигурах показано распределение нефлуоресцентных экзосом (серый) и Cy3-экзосом (черный) по размерам.

[31] На фиг. 7 показаны типичные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания нейронов ганглиев задних корешков (DRG), обработанных: контролем (средой) (фиг. 7A), неспецифичной контрольной миРНК (фиг. 7B), MSC-Exo (фиг. 7C), PTEN-миРНК (фиг. 7D) или ExoPTEN (фиг. 7E). Масштаб 100 мкм.

[32] На фиг. 8 показано количество точек ветвления по отношению к уровню ветвления для всех групп. Количество точек ветвления на средних уровнях ветвей, количественно определенное программным обеспечением IMARIS, сравнивали по группам. На среднем уровне ветвей PTEN-миРНК-экзосомы способствовали формированию значительно большего количества точек ветвления аксонов, чем все другие группы.

[33] На фиг.9 показана общая длина аксонов (фиг. 9A), количество аксонов (фиг. 9B), количество точек ветвления (фиг. 9C) и максимальный уровень ветвления (фиг. 9D), измеренные и сопоставленные во всех группах.

[34] На фиг.10 показана экспрессия белка и мРНК в области ПСМ и в печени при интраназальном введении ExoPTEN. На фиг. 10A и B показана экспрессия белка PTEN в спинном мозге и печени, соответственно, у обработанных экзосомами (IN) и обработанных ExoPTEN (IN) крыс по сравнению с необработанными крысами с ПСМ. На фиг. 10C и D показан ОТ-кПЦР-анализ экспрессии мРНК PTEN в спинном мозге и печени у необработанных, обработанных экзосомами (IN) и обработанных ExoPTEN (IN) крыс с ПСМ, причем GAPDH использовали в качестве внутреннего контроля. Данные представлены в формате "среднее ± стандартная ошибка среднего" с множественными сравнениями по Краскелу-Уоллису; IL: введение в очаг поражения; В: интраназально.

[35] На фиг. 11 показано, что лечение посредством интраназального введения ExoPTEN индуцирует восстановление двигательных, чувствительных функций и функций мочевого пузыря. На фиг. 11А показаны еженедельные двигательные балльные показатели по Бассо, Битти и Бреснахану (BBB) у крыс с ПСМ: необработанных (n = 15, черные) или обработанных PTEN-миРНК (IL) (n = 3), ExoPTEN (IL) (n = 4), экзосомами (IN) (n = 10) или ExoPTEN (IN) (n = 7); IL: введение в очаг поражения; В: интраназально. Выполняли двухфакторный дисперсионный анализ с последующим расчетом критерия множественных сравнений Тьюки (***p < 0,001, ****p < 0,0001 между группой контрольного рассечения и ExoPTEN (IN)). ^#p < 0,05, ^##p < 0,01, ^###p < 0,001 между экзосомами (IN) и ExoPTEN (IN). На фиг. 11B показано распределение двигательных балльных показателей по BBB в каждой группе в течение 8 недель. Представлена наивысшая балльная оценка, полученная каждой крысой в каждой группе. Показано отношение количества крыс с заданной оценкой к общему количеству крыс в каждой группе. На фиг. 11С показаны значения средней недельной массы тела (± SEM) у животных в группе контрольного рассечения или крыс, получавших PTEN-миРНК (IL), ExoPTEN (IL), экзосомы (IN) или ExoPTEN (IN). Выполняли двухфакторный дисперсионный анализ с последующим расчетом критерия множественных сравнений Тьюки. *p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001 между группой контрольного рассечения и ExoPTEN (IN). ^#p < 0,05, ^##p < 0,01, ^###p < 0,001 между экзосомой (IN) и ExoPTEN (IN). На фиг. 11D показана масса тела по отношению к балльному показателю BBB для каждой группы на 8 неделе. Рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона, обозначенный как R², который демонстрировал высокую корреляцию между балльными показателями BBB и значениями массы для всех групп. На фиг. 11E показан процент восстановления чувствительности на 0, 4, 8 неделях после лечения. На фиг. 11F показана функция мочевого пузыря, выраженная как время достижения спонтанного мочевого рефлекса (суток) от начала лечения. На фиг. 11G показаны изображения крыс после поперечного сечения: необработанных (верхняя панель), обработанных экзосомами (средняя панель) и обработанных PTEN-миРНК-экзосомами (нижняя панель), с 3 дня по 8 неделю после операции.

[36] На фиг. 12 показано измерение МРТ и электрофизиологических параметров в области поражения у обработанных и необработанных крыс: на фиг. 12A и фиг. 12B показана площадь поперечного сечения на 4 мм рострально и каудально от эпицентра повреждения, соответственно; на фис. 12C показаны средние значения фракционной анизотропии (FA) внутри очага поражения; на фиг. 12D и фиг. 12E показаны амплитуда (фиг. 12D) и латентность (фиг. 12E) потенциалов, вызванных двигательными стимулами у крыс, обработанных экзосомами (IN), ExoPTEN (IN) или здоровых крыс.

[37] На фиг.13 показано количественное определение и сравнение иммунофлуоресцентных маркеров в трех группах крыс: необработанных, обработанных экзосомами и обработанных ExoPTEN.Маркеры представляют собой β-III-тубулин (фиг. 13A), CD11b (фиг. 13B), GFAP (фиг. 13C) и CD31 (фиг. 13D). Данные представлены в формате "среднее значение ± стандартная ошибка среднего", выполнен однофакторный дисперсионный анализ с последующим расчетом критерия множественных сравнений Тьюки (*p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001).

[38] На фиг. 14 представлены типичные изображения аксонов кортикоспинального тракта, отслеживаемых посредством BDA, у необработанных (верхняя панель, n = 3), обработанных экзосомами (средняя панель, n = 3) и обработанных ExoPTEN (нижняя панель, n = 2) крыс с ПСМ. Масштаб 500 мкм. В прямоугольниках показаны увеличенные выбранные области. Белыми стрелками обозначены BDA-положительные волокна каудальнее эпицентра. Масштаб 100 мкм. После интраназального введения ExoPTEN (верхняя панель) наблюдали значительно более выраженный рост аксонов по сравнению с группами контрольного рассечения или обработки экзосомами.

Подробное описание изобретения

[39] Настоящее изобретение в некоторых вариантах его реализации относится к везикулам, загруженным экзогенным ингибитором PTEN, для лечения неврологических расстройств и, более конкретно, но не исключительно, к везикулам клеточного происхождения, загруженным ингибитором PTEN, для лечения повреждений спинного мозга. Перед подробным разъяснением по меньшей мере одного варианта реализации настоящего изобретения следует понимать, что настоящее изобретение не обязательно ограничивается в своем применении подробной информацией, изложенной в нижеследующем описании или проиллюстрированной примерами. Настоящее изобретение можно реализовать в других вариантах реализации или воплотить или осуществить различными способами.

[40] В частности, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что экзосомы можно эффективно загружать миРНК, конъюгированной с холестерином (фиг. 6). Как показано в примерах, более чем в трети экзосом наблюдали обнаружимое количество миРНК. Более того, экзосомы, загруженные PTEN-миРНК, способствовали устойчивой аксональной регенерации нейронов ганглиев дорсальных корешков in vitro (фиг. 7). При переходе к исследованиям in vivo гистологические и микроКТ-изображения всей центральной нервной системы подтвердили, что интраназально введенные экзосомы пересекали гематоэнцефалический барьер, направлялись к поражению спинного мозга и интернализировались нейронами в очаге поражения (фиг. 2). Еще более поразительно то, что интраназально введенные экзосомы, загруженные PTEN-миРНК, способствовали надежной регенерации аксонов и ангиогенезу, что сопровождалось снижением астроглиоза и микроглиоза (фиг. 13).Кроме того, интраназальное введение ExoPTEN позволяло частично восстановить электрофизиологическую и структурную целостность, а самое главное, обеспечило выраженное восстановление двигательных функций. (Фиг. 11).

[41] В соответствии с идеей настоящего изобретения экзосомы, загруженные агентами, способными подавлять экспрессию и/или активность PTEN, можно применять при лечении других неврологических заболеваний или состояний в целом и, конкретнее, дегенеративных неврологических заболеваний или состояний. В частности, из настоящего изобретения ясно, что ингибирование активности и, в частности, ингибирование экспрессии PTEN в очаге поражения позволяет эффективно лечить повреждение спинного мозга.

[42] Согласно одному аспекту настоящего изобретения, предложена фармацевтическая композиция, содержащая частицы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN).

[43] Термины «гомолог фосфатазы и тензина» «PTEN» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к ферменту - гомологу фосфатазы и тензина человека, являющемуся продуктом EntrezGene ID: 5728, который может характеризоваться аминокислотной последовательностью, соответствующей номеру доступа UniProt: P60484. Другие гомологи нечеловеческого происхождения можно легко выявить с использованием известных способов, например, поиска BLAST, и считается, что они включены в сущность изобретения. Белок PTEN действует как фосфатаза, дефосфорилируя фосфатидилинозит(3,4,5)-трисфосфат (PtdIns (3,4,5)P3 или PIP3). PTEN специфически катализирует дефосфорилирование 3'-фосфата инозитного кольца в PIP3, в результате чего образуется бифосфат PIP2 (PtdIns(4,5)P2). Это дефосфорилирование имеет важное значение, поскольку оно приводит к ингибированию сигнального пути AKT. Типичная аминокислотная последовательность PTEN показана в SEQ ID NO: 1.

[44] Термины «частица» и «везикула» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к дискретному объекту, используемому для доставки активного агента. Термины «активный агент» и «активный фрагмент» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к агенту, обладающему биологической активностью, фармакологическим действием и/или терапевтической полезностью. Неограничивающим примером активных агентов являются низкомолекулярные соединения, РНК, ДНК, пептиды и белки. Согласно некоторым вариантам реализации, активный агент является неэндогенным активным агентом, т.е. не присутствует в живой клетке в природе. В одном варианте реализации "неэндогенный" означает, что активный агент не присутствует в организме человека и/или в клетках человека.

[45] Частица может содержать везикулу или уплощенную сферу, ограниченную липидным бислоем. Диаметр частиц может составлять 40-100 нм. Частицы могут быть образованы за счет почкования эндосомальной мембраны внутрь. Плотность частиц может составлять приблизительно 1,13-1,19 г/мл, они могут плавать на градиентах сахарозы. Частицы могут быть обогащены холестерином и сфингомиелином, а также маркерами липидного рафта, например, GM1, GM3, флотилином и src-протеинкиназой Lyn. Частицы могут содержать один или более белков, присутствующих в мезенхимальных стволовых клетках или среде, кондиционированной мезенхимальными стволовыми клетками (MSC-CM), например, белок, характерный или специфический для MSC или MSC-CM. Они могут содержать РНК, например, микроРНК.

[46] Согласно некоторым вариантам реализации, частицы представляют собой мембранные везикулы. В настоящем документе термин «мембранные везикулы» относится к любой структуре везикул, содержащей жидкость, заключенную в липидный бислой. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации, частицы представляют собой липидные двуслойные фосфолипидные мембранные везикулы. Согласно некоторым вариантам реализации, мембранные везикулы выбраны из внеклеточных везикул, липосом, эктосом и трансферосом. Согласно некоторым вариантам реализации, мембранные везикулы представляют собой синтетические мембранные везикулы. Согласно другим вариантам реализации, мембранные везикулы представляют собой частицы клеточного происхождения. Согласно некоторым вариантам реализации, клетки представляют собой эукариотические клетки. Согласно одному варианту реализации, мембранные везикулы представляют собой липосомы.

[47] Согласно одному варианту реализации, мембранные везикулы представляют собой внеклеточные везикулы. Согласно некоторым вариантам реализации, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению включает внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), причем внеклеточные везикулы имеют клеточное происхождение.

[48] Термины «внеклеточные везикулы» и «EV» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к везикулам клеточного происхождения, содержащим мембрану, охватывающую внутреннее пространство. Обычно диаметр внеклеточных везикул составляет от 30 нм до 1000 нм, и они могут содержать различный макромолекулярный груз во внутреннем пространстве, на внешней поверхности внеклеточной везикулы либо на ее мембране. Указанный груз может содержать нуклеиновые кислоты, белки, углеводы, липиды, низкомолекулярные соединения и/или их комбинации. Термин «внеклеточные везикулы» включает термины «экзосома» и «микровезикулы». Термины «экзосомы» и «нановезикулы» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к EV диаметром от 30 до 100 нм. Как правило, безотносительно к конкретным теоретическим представлениям, экзосомы образуются внутри клеток и высвобождаются из клетки при слиянии мультивезикулярного тельца (MVB) с плазматической мембраной. В качестве альтернативы, экзосомы высвобождается непосредственно из плазматической мембраны. В настоящем документе термин «микровезикулы» относится к EV диаметром от 100 до 1000 нм. Термин «эктосомы» относится к везикулам различного размера (например, диаметром 0,1-1 мм), отпочковывающимся непосредственно от плазматической мембраны.

[49] Согласно некоторым вариантам реализации, внеклеточные везикулы выбраны из экзосом, микровезикул, эктосом, экзовезикул и их комбинации.

[50] Согласно одному варианту реализации, EV представляют собой экзосомы. Экзосомы могут обладать по меньшей мере одним из следующих свойств: (а) обладать размером от 50 до 100 нм, согласно электронной микроскопии; (b) содержать комплекс с молекулярной массой > 100 кДа, содержащий белки массой < 100 кДа; (c) содержать комплекс с молекулярной массой > 300 кДа, содержащий белки массой < 300 кДа; (d) содержать комплекс с молекулярной массой > 1000 кДа; или (e) обладать гидродинамическим радиусом менее 100 нм, согласно лазерной дифракции или динамическому светорассеянию. Согласно одному варианту реализации, диаметр экзосом составляет от 50 до 100 нм.

[51] Согласно еще одному варианту реализации, внеклеточные везикулы представляют собой микровезикулы. Согласно одному варианту реализации, EV представляют собой микровезикулы. Согласно одному варианту реализации, диаметр микровезикул составляет от 100 до 1000 нм, от 120 до 800 нм, от 150 до 600 нм или от 200 до 400 нм. Согласно еще одному варианту реализации, размер микровезикул составляет от 100 до 300 нм или от 150 до 250 нм. Согласно некоторым вариантам реализации, диаметр EV составляет от 30 до 250 нм или от 50 до 200 нм. Согласно некоторым вариантам реализации, диаметр EV составляет от 70 до 170 нм или от 80 до 150 нм.

[52] Размер EV может составлять более 2 нм. Размер EV может составлять более 5 нм, 10 нм, 20 нм, 30 нм, 40 нм или 50 нм. Размер EV может составлять более 100 нм, например, более 150 нм. Размер EV может составлять по существу 200 нм или более.

[53] Размер EV может находиться в определенном диапазоне, например, от 2 нм до 20 нм, от 2 нм до 50 нм, от 2 нм до 100 нм, от 2 нм до 150 нм или от 2 нм до 200 нм. Размер EV может составлять от 20 до 50 нм, от 20 до 100 нм, от 20 до 150 нм или от 20 до 200 нм. Размер EV может составлять от 50 до 100 нм, от 50 до 150 нм или от 50 до 200 нм. Размер EV может составлять от 100 нм до 150 нм или от 100 нм до 200 нм. Размер EV может составлять от 150 до 200 нм. Размер EV может составлять от 100 до 600 нм, от 150 до 500 нм или от 200 до 400 нм.

[54] Размер можно определить различными способами. В принципе, размер можно определить фракционированием по размеру и фильтрацией через мембрану с соответствующим ограничением размера. Затем размер частиц можно определить путем отслеживания сегрегации составляющих белков с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ или с помощью биологического анализа.

[55] Размер может составлять гидродинамический радиус. Гидродинамический радиус EV может быть менее 100 нм. Он может составлять от приблизительно 30 нм до приблизительно 70 нм. Гидродинамический радиус может составлять от приблизительно 40 нм до приблизительно 60 нм, например, от приблизительно 45 нм до приблизительно 55 нм. Гидродинамический радиус может составлять приблизительно 50 нм. Гидродинамический радиус EV можно определить любыми подходящими средствами, например, лазерной дифракцией или динамическим светорассеянием.

[56] Согласно еще одному варианту реализации, внеклеточные везикулы представляют собой комбинацию экзосом и микровезикул. Согласно некоторым вариантам реализации, внеклеточные везикулы представляют собой выделенные внеклеточные везикулы. Согласно еще одному варианту реализации, EV представляют собой экзовезикулы или эктосомы.

[57] Как описано выше, внеклеточные везикулы происходят из клеток. Термины «полученный из» и «происходящий из» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к везикулам, которые продуцируются внутри, посредством или из определенной клетки, типа клеток или популяции клеток. В настоящем документе термины «родительская клетка», «клетка-продуцент» и «исходная клетка» включают любую клетку, из которой происходит и выделяется внеклеточная везикула. Эти термины также включают клетку, которая использует белковый, липидный, углеводный или нуклеотидный компонент внеклеточной везикулы. Например, термины «родительская клетка» или «клетка-продуцент» включают клетку, являющуюся источником внеклеточной везикулы. Согласно некоторым вариантам реализации, клетки представляют собой эукариотические клетки.

[58] Внеклеточные везикулы (EV) можно получить из биологических клеток любым из нескольких способов, например, путем секреции, почкования или диспергирования из биологических клеток. EV могут представлять собой объекты, которые можно выделить из мезенхимальных стволовых клеток (MSC), клеток нервного гребня (NCC), среды, кондиционированной мезенхимальными стволовыми клетками (MSC-CM), или среды, кондиционированной клетками нервного гребня. EV могут нести ответственность за активность исходных клеток, например, MSC, NCC, NCC-CM или MSC-CM, или, по меньшей мере, обладать их активностью. EV могут нести ответственность за и выполнять по существу большую часть или все функции исходных клеток, например, MSC, NCC, NCC-CM или MSC-CM. Например, EV могут представлять собой замену (или биологическую замену) для MSC, NCC, NCC-CM или MSC-CM. Например, внеклеточные везикулы могут продуцироваться, выделяться, порождаться или распространяться биологическими клетками. Если биологическая клетка находится в культуре клеток, частица может секретироваться в среду для культивирования клеток.

[59] Примеры биологических клеток, из которых можно получать EV, включают адгезивные клетки, экспрессирующие мезенхимальные маркеры, например, мезенхимальные стволовые клетки, стволовые клетки слизистой оболочки полости рта или обонятельные обкладочные клетки, астроциты и клетки нервного гребня. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором PTEN, причем внеклеточные везикулы происходят из адгезивных клеток, экспрессирующих мезенхимальные маркеры. Согласно одному варианту реализации, адгезивные клетки, экспрессирующие мезенхимальные маркеры, выбраны из мезенхимальных стволовых клеток (MSC), стволовых клеток слизистой оболочки полости рта и обонятельных обкладочных клеток. Согласно одному варианту реализации, клетки представляют собой мезенхимальные стволовые клетки (MSC).

[60] Термин «мезенхимальные стволовые клетки» относится к мультипотентным стромальным клеткам, которые могут дифференцироваться в клетки различного типа, хорошо известные в данной области техники, в том числе в остеобласты (костные клетки), хондроциты (хрящевые клетки), миоциты (мышечные клетки) и адипоциты (жировые клетки).

[61] В своем плюрипотентном состоянии мезенхимальные стволовые клетки обычно экспрессируют следующие маркеры: CD105, CD166, CD29, CD90 и CD73, но не экспрессируют CD34, CD45 и CD133.

[62] Мезенхимальные стволовые клетки можно выделять из различных тканей, включая костный мозг, жировую ткань, пульпу зуба, слизистую оболочку полости рта, периферическую кровь и амниотическую жидкость, но не ограничиваясь ими. Согласно одному варианту реализации, мезенхимальные стволовые клетки выделяют из костного мозга. Согласно одному варианту реализации, мезенхимальные стволовые клетки происходят из области, выбранной из костного мозга, жировой ткани, пуповины, пульпы зуба, слизистой оболочки полости рта, периферической крови и амниотической жидкости. Согласно некоторым вариантам реализации, EV получают из MSC, происходящих из костного мозга. Согласно еще одному варианту реализации, EV получают из MSC, происходящих из жировой ткани. Согласно некоторым из таких вариантов реализации, EV выбраны из экзосом, микровезикул и их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации, клетки экспрессируют маркеры CD105, CD166, CD29, CD90 и CD73. Согласно дополнительному варианту реализации, клетки экспрессируют CD105, CD166, CD29, CD90 и CD73 и не экспрессируют CD34, CD45 и CD133. Согласно некоторым вариантам реализации, клетки выбраны из стволовых клеток пульпы зуба (DPSC), стволовых клеток выпавших молочных зубов (SHED), стволовых клеток периодонтальной связки (PDLSC), стволовых клеток апикального сосочка (SCAP) и клеток-предшественников зубных фолликулов (DFPC).

[63] EV могут содержать один или более белков, олигонуклеотидов или полинуклеотидов, секретируемых клетками конкретного типа, например, мезенхимальными стволовыми клетками или клетками нервного гребня. EV могут содержать один или более белков или полинуклеотидов, присутствующих в кондиционированной среде мезенхимальных стволовых клеток (MSC-CM). В конкретном варианте реализации EV могут содержать микроРНК, происходящие из MSC или клеток нервного гребня.

[64] Например, EV могут содержать 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более или 70% или более указанных белков и/или полинуклеотидов. EV могут содержать по существу приблизительно 75% указанных белков и/или полинуклеотидов. Белки можно задать посредством ссылки на список белков или продуктов списка генов.

[65] EV могут обладать по меньшей мере одним свойством мезенхимальных стволовых клеток. Частица может обладать биологическим свойством, например, биологической активностью. Частица может обладать любой из биологических активностей MSC. Частица может, например, обладать терапевтической или восстанавливающей активностью MSC.

[66] Способы выделения, очистки и размножения мезенхимальных стволовых клеток (MSC) известны в данной области техники и включают, например, способы, описанные Caplan и Haynesworth в патенте США № 5486359 и в статье Jones E.A. et al., 2002, Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells, Arthritis Rheum. 46(12): 3349-60.

[67] Культуры мезенхимальных стволовых клеток можно получить путем разбавления аспиратов BM (обычно 20 мл) равными объемами сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS; GIBCO Laboratories, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк, США) и наслоения разбавленных клеток на приблизительно 10 мл колонки с фиколлом (Ficoll-Paque; Pharmacia, Пискатауэй, штат Нью-Джерси, США). После 30 минут центрифугирования при 2500 x g слой мононуклеарных клеток удаляют с поверхности раздела и суспендируют в HBSS. Затем клетки центрифугируют при 1500 x g в течение 15 минут и ресуспендируют в полной среде (MEM,α среда без дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов; GIBCO); 20% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), полученной из партии, отобранной для быстрого роста MSC (Atlanta Biologicals, Норкросс, штат Джорджия, США); 100 единиц/мл пенициллина (GIBCO), 100μг/мл стрептомицина (GIBCO); и 2 мМ L-глутамина (GIBCO). Ресуспендированные клетки помещают в приблизительно 25 мл среды в 10-сантиметровую культуральную чашку (Corning Glass Works, Корнинг, штат Нью-Йорк, США) и инкубируют при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO₂. После 24 часов культивирования неадгезивные клетки выбрасывают, а адгезивные клетки дважды тщательно промывают физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS). Среду заменяют свежей полной средой каждые 3-4 дня в течение приблизительно 14 дней. Затем адгезивные клетки собирают с использованием 0,25% трипсина и 1 мМ ЭДТА (трипсин/ЭДТА, GIBCO) в течение 5 минут при 37°C, пересевают в 6-сантиметровую чашку и культивируют еще 14 дней. Затем клетки трипсинизируют и подсчитывают с использованием устройства для подсчета клеток, например, гемоцитометра (Hausser Scientific, Хоршэм, штат Пенсильвания, США). Культивируемые клетки восстанавливают центрифугированием и ресуспендируют в 5% ДМСО и 30% FCS в концентрации от 1 до 2 × 10⁶ клеток на мл. Аликвоты по 1 мл медленно замораживают и хранят в жидком азоте.

[68] Для размножения фракции мезенхимальных стволовых клеток замороженные клетки размораживают при 37°C, разбавляют полной средой и восстанавливают центрифугированием для удаления ДМСО. Клетки ресуспендируют в полной среде и высевают при концентрации приблизительно 5000 клеток/см². После 24 часов культивирования неадгезивные клетки удаляют, а адгезивные клетки собирают с использованием трипсина/ЭДТА, диссоциируют путем пропускания через суженную пипетку Пастера и предпочтительно повторно высеивают при плотности от приблизительно 1,5 до приблизительно 3,0 клеток/см². В этих условиях культуры MSC могут расти приблизительно до 50 удвоений популяции и увеличить свою численность приблизительно в 2000 раз [Colter DC., et al. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. Proc Natl Acad Sci USA. 97: 3213-3218, 2000].

[69] Культуры MSC, используемые в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, включают три группы клеток, определяемые их морфологическими особенностями: мелкие и агранулярные клетки (далее называемые как RS-1), мелкие и гранулярные клетки (называемые далее в настоящем документе как RS-2) и крупные и умеренно гранулярные клетки (называемые далее в настоящем документе зрелыми MSC). Присутствие и концентрацию таких клеток в культуре можно анализировать, выявляя наличие или отсутствие различных маркеров клеточной поверхности с помощью, например, иммунофлуоресценции, гибридизации in situ и анализа активности.

[70] Согласно некоторому варианту реализации, EV не происходят из астроцитов. Таким образом, в настоящем изобретении рассмотрены композиции, содержащие частицы, загруженные ингибитором PTEN, при условии, что частицы не являются экзосомами, происходящими из астроцитов.

[71] Согласно конкретному варианту реализации, внеклеточные везикулы происходят из клеток, экспрессирующих маркеры клеток нервного гребня. Согласно конкретному варианту реализации, EV происходят из клеток нервного гребня. Согласно еще одному варианту реализации, клетки нервного гребня представляют собой клетки краниального нервного гребня. Согласно некоторым вариантам реализации, клетки краниального нервного гребня включают стволовые клетки пульпы зуба (DPSC), стволовые клетки выпавших молочных зубов (SHED), стволовые клетки периодонтальной связки (PDLSC), стволовые клетки апикального сосочка (SCAP) и клетки-предшественники зубных фолликулов (DFPC), но не ограничиваются ими. Согласно некоторым вариантам реализации, такие клетки экспрессируют мезенхимальные маркеры, заданные выше.

[72] EV можно получать или выделять несколькими способами. Такой способ может включать выделение EV из мезенхимальных стволовых клеток (MSC) или из клеток нервного гребня (NCC).

[73] Следовательно, EV согласно настоящему изобретению являются выделенными EV. Таким образом, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая выделенные внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), причем внеклеточные везикулы отделены от клеток. Согласно некоторым вариантам реализации, клетки представляют собой клетки человека.

[74] Согласно любому из вышеуказанных вариантов реализации, внеклеточные везикулы представляют собой выделенные внеклеточные везикулы. В настоящем документе термины «очищать», «очищенный», «очистка», «выделять», «выделенный» и «выделение» используются взаимозаменяемо и относятся к состоянию популяции (например, множеству с известным или неизвестным количеством и/или концентрацией) внеклеточных везикул, подвергшихся одному или более из процессов очистки, например, отбору желаемых внеклеточных везикул или, в качестве альтернативы, удалению или уменьшению количества остаточных биологических продуктов. Согласно одному варианту реализации, соотношение EV к остаточным родительским клеткам по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 8 или 10 раз выше, или, в некоторых предпочтительных вариантах реализации, по меньшей мере в 50, 100 или 1000 раз выше, чем в исходном материале. В некоторых предпочтительных вариантах реализации термин «выделенный» имеет значение "по существу бесклеточный" или "бесклеточный", и его можно заменить этим термином. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению включает выделенные внеклеточные везикулы, загруженные ингибитором PTEN. Согласно некоторым вариантам реализации, фармацевтическая композиция представляет собой бесклеточную композицию, т.е. не содержит обнаружимого количества клеток.

[75] Как упоминалось, липидные двухслойные фосфолипидные мембранные везикулы, например, внеклеточные везикулы загружены экзогенным ингибитором PTEN.

[76] В настоящем документе термин «экзогенный» относится к молекуле или веществу (например, соединению, нуклеиновой кислоте или белку), которые происходят извне данной мембранной везикулы, например, внеклеточных везикул, и которые не присутствуют в везикуле в естественных условиях. По отношению к внеклеточным везикулам этот термин относится к молекулам или веществам, которые в природе не присутствуют в везикулах, но не в клетках, из которых происходят внеклеточные везикулы. Согласно некоторым вариантам реализации, термин «экзогенный» относится к синтетическим неприродным молекулам. Согласно некоторым вариантам реализации, вещество искусственно загружают во внеклеточные везикулы или в клетки, из которых происходят внеклеточные везикулы. По отношению к пептидам, белкам и нуклеиновым кислотам этот термин означает, что соединение искусственно загружают во внеклеточные везикулы или в клетки, из которых происходят везикулы, или искусственно экспрессируют в клетках, из которых получены везикулы, однако указанное соединение не экспрессируется естественным образом в исходных клетках.

[77] Термин «загруженный» означает, что частицы, т.е. мембранные везикулы искусственно дополняют или заполняют ингибитором. По отношению к расположению ингибитора относительно мембранной везикулы этот термин имеет значение "заключенный внутри везикул, вынесенный на поверхность везикулы (внутренней и/или внешней поверхности) или присутствующий на ней, внедренный в мембрану везикул (внешнюю, внутреннюю или промежуточную)". Согласно одному варианту реализации, ингибитор заключен внутри внешней мембраны везикулы. Согласно другому варианту реализации, ингибитор заключен внутри внутренней мембраны везикулы. Согласно еще одному варианту реализации, ингибитор заключен в жидкой фазе везикулы.

[78] Согласно одному варианту реализации, ингибитор PTEN ингибирует или подавляет активность PTEN. Согласно еще одному варианту реализации, ингибитор PTEN ингибирует или подавляет экспрессию PTEN.

[79] Согласно одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой белок или пептид. Согласно еще одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой низкомолекулярное соединение. Примеры ингибиторов PTEN на основе белков включают ингибиторы, описанные в патентных заявках США № 20160074472 и 20160311857, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки, но не ограничиваются ими. Согласно некоторым вариантам реализации, ингибиторы PTEN на основе белков включают пептиды, последовательность которых выбрана из последовательности 1, 2, 5, 6, описанной в WO 2011/044701, и пептиды с последовательностями 1-5, описанными в WO 2015/105957.

[80] Ингибиторы на основе белка согласно настоящему изобретению можно синтезировать биохимически, например, с использованием стандартных твердофазных методик. Эти способы включают исключительно твердофазный синтез, способы частичного твердофазного синтеза, конденсацию фрагментов, классический синтез из растворов. Процедуры твердофазного синтеза полипептидов хорошо известны в данной области техники. Синтетические пептиды можно очистить с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии, а их состав можно подтвердить с помощью аминокислотного секвенирования.

[81] Кроме того, для создания ингибиторов на основе белка согласно настоящему изобретению можно использовать рекомбинантные методики. Для получения полипептидного ингибитора согласно настоящему изобретению с использованием рекомбинантной технологии полинуклеотид, кодирующий пептид согласно настоящему изобретению, лигируют в экспрессирующий нуклеотидный вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность под транскрипционным контролем цис-регуляторной последовательности (например, промоторной последовательности), подходящей для контроля конститутивной, тканеспецифической или индуцибельной транскрипции полипептидов согласно настоящему изобретению в клетках-хозяевах. Экспрессирующие векторы дополнительно описаны ниже в настоящем документе.

[82] Помимо того, что пептиды согласно настоящему изобретению можно синтезировать в клетках-хозяевах, их также можно синтезировать с использованием систем экспрессии in vitro. Эти способы хорошо известны в данной области техники, а компоненты этой системы доступны для приобретения.

[83] Согласно конкретному варианту реализации, ингибиторы на основе белка экспрессируются в клетках, из которых происходят EV. Таким образом, например, в настоящем изобретении рассмотрена экспрессия белкового ингибитора в популяции MSC с последующим получением EV из генетически модифицированных MSC.

[84] Согласно некоторым вариантам реализации, экзогенный ингибитор PTEN является ингибитором экспрессии PTEN. Согласно одному варианту реализации, ингибитор экспрессии PTEN представляет собой полинуклеотид или олигонуклеотид. Согласно еще одному варианту реализации, ингибитор представляет собой олигонуклеотид для РНК-интерференции (РНКи). Согласно одному варианту реализации, олигонуклеотид для РНК-интерференции представляет собой миРНК. Согласно еще одному варианту реализации, олигонуклеотид для РНК-интерференции представляет собой кшРНК.

[85] Термин «полинуклеотид» в настоящем документе относится к длинной нуклеиновой кислоте, содержащей более 150 нуклеотидов. Термин «олигонуклеотид» в настоящем документе относится к короткой одноцепочечной или двуцепочечной нуклеотидной последовательности, например, рибонуклеиновой кислоте (РНК), дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) или их миметикам, причем указанная нуклеиновая кислота обычно содержит не более 150 нуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации, олигонуклеотид содержит от 2 до 150, от 10 до 100 или от 15 до 50 нуклеотидов. Согласно другим вариантам реализации, олигонуклеотид содержит от 15 до 40, от 17 до 35 или от 18 до 30 нуклеиновых кислот.

[86] В одном варианте реализации полинуклеотидный или олигонуклеотидный агент представляет собой агент, вызывающий РНК-сайленсинг. В настоящем документе термин «РНК-сайленсинг» относится к группе регуляторных механизмов (например, РНК-интерференция (РНКи), транскрипционному сайленсингу гена (TGS), посттранскрипционному сайленсингу гена (PTGS), подавлению, совместной суппрессии и репрессии трансляции), опосредованных молекулами РНК, что приводит к ингибированию или «сайленсингу» экспрессии соответствующего гена, кодирующего белок. РНК-сайленсинг наблюдается у многих организмов, включая растения, животных и грибы.

[87] В настоящем документе термины «агент, вызывающий РНК-сайленсинг», «молекула, вызывающая РНК-сайленсинг» и «олигонуклеотид, вызывающий РНК-сайленсинг» используются взаимозаменяемо и относятся к РНК, которая способна ингибировать или вызывать «сайленсинг» экспрессии гена-мишени. В некоторых вариантах реализации агент, вызывающий РНК-сайленсинг, способен предотвращать полный процессинг (например, полную трансляцию и/или экспрессию) молекулы мРНК посредством механизма посттранскрипционного сайленсинга. Агенты, вызывающие РНК-сайленсинг, включают молекулы некодирующих РНК, например, двуцепочечные РНК, содержащие спаренные цепи, а также РНК-предшественники, из которых можно получить такие малые некодирующие РНК. Типичные агенты, вызывающие РНК-сайленсинг, включают дцРНК, например, миРНК, микроРНК и кшРНК. В одном варианте реализации агент, вызывающий РНК-сайленсинг, способен вызывать РНК-интерференцию. В еще одном варианте реализации агент, вызывающий РНК-сайленсинг, способен опосредовать репрессию трансляции.

[88] РНК-интерференция относится к процессу специфичного по отношению к последовательности посттранскрипционного сайленсинга генов у животных, опосредованного малыми интерферирующими РНК (миРНК). Соответствующий процесс у растений обычно называют посттранскрипционным сайленсингом генов или РНК-сайленсингом, а у грибов - "подавлением". Считается, что процесс посттранскрипционного сайленсинга генов является эволюционно-консервативным механизмом клеточной защиты, используемым для предотвращения экспрессии чужеродных генов и обычно присутствующим у различных растений и таксонов организмов. Такая защита от экспрессии чужеродных генов могла развиться в ответ на продукцию двуцепочечных РНК (дцРНК), полученных в результате вирусной инфекции, или в результате случайной интеграции транспозонных элементов в геном хозяина, посредством клеточного ответа, который специфически разрушает гомологичную одноцепочечную РНК. или вирусную геномную РНК.

[89] Присутствие в клетках длинных дцРНК стимулирует активность фермента рибонуклеазы III, называемого дайсером. Дайсер участвует в процессинге дцРНК с образованием коротких фрагментов дцРНК, известных как малые интерферирующие РНК (миРНК). Длина малых интерферирующих РНК, полученных в результате активности дайсера, обычно составляет от приблизительно 21 до приблизительно 23 нуклеотидов, и они содержат двуцепочечные структуры из приблизительно 19 пар оснований. Реакция РНКи также включает эндонуклеазный комплекс, обычно называемый РНК-индуцируемым комплексом сайленсинга (RISC), который опосредует расщепление одноцепочечной РНК с последовательностью, комплементарной антисмысловой цепи двуцепочечной миРНК. Расщепление РНК-мишени происходит в середине области, комплементарной антисмысловой цепи двуцепочечной миРНК.

[90] Соответственно, в настоящем изобретении рассматривается применение дцРНК для подавления экспрессии белка с мРНК. Согласно одному варианту реализации, размер дцРНК составляет более 30 п. н. Применение длинных дцРНК (т.е. дцРНК более 30 п. н.) является очень ограниченным из-за представлений о том, что эти более длинные области двуцепочечной РНК приводят к индукции интерферона и PKR-ответа. Вместе с тем, использование длинных дцРНК может обеспечить многочисленные преимущества, поскольку клетка может выбирать оптимальную последовательность сайленсинга, устраняя необходимость в тестировании множества миРНК; длинные дцРНК позволяют уменьшить сложность библиотек сайленсинга по сравнению со сложностью, необходимой для миРНК; и, что, возможно, является наиболее важным, длинная дцРНК может предотвращать мутации, обеспечивающие ускользание вируса от защитных механизмов, при использовании в качестве терапевтических средств.

[91] Различные исследования демонстрируют, что длинные дцРНК можно использовать для сайленсинга экспрессии генов, не вызывая стрессовой реакции или значительных неспецифичных эффектов.

[92] В частности, в настоящем изобретении также рассмотрено введение длинной дцРНК (транскриптов длиной более 30 оснований) для сайленсинга гена в клетки, в которых не активирован путь интерферона (например, эмбриональные клетки и ооциты).

[93] В настоящем изобретении также рассмотрено введение длинной дцРНК, специально разработанной с учетом необходимости отсутствия индукции путей интерферона и PKR, для подавления экспрессии генов. Например, Shinagwa и Ishii [Genes & Dev. 17 (11): 1340-1345, 2003] разработали вектор под названием pDECAP для экспрессии длинной двуцепочечной РНК с промотора РНК-полимеразы II (Pol II). Поскольку в транскриптах pDECAP отсутствуют как 5'-кэп, так и 3'-поли(A)-хвост, облегчающие экспорт дцРНК в цитоплазму, длинная дцРНК из pDECAP не индуцирует ответ интерферона.

[94] Еще один способ обхода путей интерферона и PKR в системах млекопитающих представляет собой введение малых ингибирующих РНК (миРНК) посредством трансфекции либо путем эндогенной экспрессии.

[95] Термин «миРНК» относится к двуцепочечным малым ингибирующим РНК (обычно длиной 18-30 пар оснований), индуцирующим путь РНК-интерференции (РНКи). Обычно миРНК химически синтезируют в виде 21-мерных молекул с центральной двуцепочечной областью длиной 19 п. н. и симметричными 3'-липкими концами из 2 оснований, хотя недавно описано, что химически синтезированные двуцепочечные РНК длиной 25-30 оснований могут обеспечивать вплоть до 100-кратного увеличения эффективности по сравнению с 21-мерной молекулой в том же положении. Наблюдаемая повышенная эффективность в отношении запуска РНКи, полученная при использовании более длинных РНК, теоретически является результатом предоставления дайсеру субстрата (27-мерного) вместо продукта (21-мерного), что увеличивает скорость или эффективность входа двуцепочечной миРНК в RISC.

[96] Обнаружено, что положение 3'-липкого конца влияет на эффективность миРНК, и асимметричные двуцепочечные структуры с 3'-липким концом на антисмысловой цепи обычно более эффективны, чем двуцепочечные структуры с 3'-липким концом на смысловой цепи. Это может быть связано с асимметричной загрузкой цепи в RISC, поскольку при адресном действии на антисмысловой транскрипт наблюдается противоположная картина эффективности.

[97] Типичные последовательности миРНК, рассматриваемые для ингибирования PTEN, включают 5'-GUUAGCAGAAACAAAAGGAGAUAUCAA-3' (SEQ ID NO: 2; смысловая цепь); 5'-UUGAUAUCUCCUUUUGUUUCUGCUAAC-3' (SEQ ID NO: 3; антисмысловая цепь); или 5'-CAGCCGUUCGGAGGAUUAUUCGUCUTT-3' (SEQ ID NO: 4; смысловая цепь), 5'-AGACGAAUAAUCC UCCGAACGGCUGTT-3' (SEQ ID NO: 5 антисмысловая цепь). Согласно одному варианту реализации, миРНК, ингибирующая экспрессию PTEN, содержит нуклеотидную последовательность 5'-GAGUUCUUCCACAAACAGAA-3' (SEQ ID NO: 10; смысловая). Согласно одному варианту реализации, миРНК, ингибирующая экспрессию PTEN, содержит нуклеотидную последовательность 5'-UUCUGUUUGUGGAAGAACUC-3' (SEQ ID NO: 11; антисмысловая цепь). Согласно одному варианту реализации, миРНК представляет собой двуцепочечную миРНК, содержащую SEQ ID NO: 10 и 11.

[98] Одна типичная последовательность, которая может являться мишенью миРНК PTEN, приведена в SEQ ID NO: 6 (5'-GAGTTCTTCCACAAACAGAA-3'). Еще одна типичная последовательность, которая может являться мишенью миРНК PTEN, приведена в SEQ ID NO: 7 (5′-GTATAGAGCGTGCAGATAA-3′).

[99] Таким образом, согласно одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой миРНК. Согласно некоторым вариантам реализации, миРНК может иметь несколько модификаций, улучшающих проникновение в мембрану везикул или клеток.

[100] Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 11, 2, 3, 4 и 5. Согласно одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой миРНК с последовательностью SEQ ID NO: 2 и/или 3. Согласно еще одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой миРНК с последовательностью SEQ ID NO: 4 и/или 5. Согласно некоторым вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, мишенью которой является SEQ ID NO: 6. Согласно другим вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, мишенью которой является SEQ ID NO: 7. Согласно одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой миРНК с последовательностью SEQ ID NO: 10. Согласно еще одному варианту реализации ингибитор PTEN представляет собой миРНК с последовательностью SEQ ID NO: 11. Согласно дополнительному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой двуцепочечную миРНК, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 и 11.

[101] Согласно еще одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой миРНК, являющуюся вариантом нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10, 11, 2, 3, 4 и 5. Согласно одному варианту реализации, указанный вариант характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с исходной последовательностью. Согласно еще одному варианту реализации, вариант характеризуется по меньшей мере 80%, 85% или 90% идентичностью последовательности с исходной последовательностью. Согласно одному варианту реализации, вариант обладает активностью исходной последовательности.

[102] Термины «гомолог», «вариант», «вариант ДНК», «вариант последовательности» и «вариант полинуклеотида» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к ДНК-полинуклеотиду или олигонуклеотиду, характеризующемуся по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с исходной последовательностью. Вариант может включать мутации, например, делецию, добавление или замену, причем указанные мутации не изменяют открытую рамку считывания, и указанный полинуклеотид кодирует пептид или белок, по существу обладающий структурой и функцией, аналогичной структуре или функции пептида или белка, кодируемого исходным полинуклеотидом. Согласно некоторым вариантам реализации, варианты являются консервативными вариантами. В настоящем документе термин «консервативные варианты» относится к вариантам, в которых изменение одного или более нуклеотидов в данном положении кодона не приводит к изменению аминокислоты, кодируемой в этом положении. Таким образом, пептид или белок, кодируемый консервативными вариантами, характеризуется 100% идентичностью последовательности с пептидом или белком, кодируемым исходным полинуклеотидом. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант представляет собой неконсервативный вариант, кодирующий пептид или белок, являющийся консервативным аналогом пептида белка, кодируемого исходным полинуклеотидом. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант характеризуется по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с исходной последовательностью.

[103] Согласно еще одному варианту реализации, миРНК представляет собой миРНК, комплементарную последовательности, кодирующей PTEN, и ингибирующую ее экспрессию и/или трансляцию. Согласно одному варианту реализации, миРНК комплементарна последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 6 и 7. Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит последовательность, комплементарную фрагменту нуклеиновой кислоты, кодирующей белок PTEN, и ингибирует его экспрессию. Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит последовательность, комплементарную фрагменту нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 1. Согласно одному варианту реализации, такая миРНК характеризуется 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% или 100% комплементарностью указанной последовательности.

[104] Следует принимать во внимание, что для подавления гена-мишени можно использовать более одного миРНК-агента. Таким образом, например, в настоящем изобретении рассмотрено применение по меньшей мере двух миРНК, мишенью которых является PTEN.

[105] Термины «иметь», «имеет», «имеющий» и «содержащий» могут также включать значения «состоящий из» и «состоящий по существу из» и могут быть заменены этими терминами.

[106] Цепи двуцепочечной интерферирующей РНК (например, миРНК) можно соединять с образованием структуры "шпилька" или "стержень-петля" (например, кшРНК). Таким образом, как упоминалось, агент, вызывающий РНК-сайленсинг согласно настоящему изобретению, также может представлять собой короткую шпилечную РНК (кшРНК).

[107] Термин «кшРНК» в настоящем документе относится к РНК-агенту, содержащему структуру "стержень-петля", включающую первую и вторую области комплементарной последовательности, причем степень комплементарности и ориентация областей достаточны для спаривания оснований между указанными областями, причем первая и вторая области соединены областью петли, причем указанная петля возникает из-за отсутствия спаривания оснований между нуклеотидами (или аналогами нуклеотидов) внутри области петли. Количество нуклеотидов в петле составляет от 3 до 23 включительно, или от 5 до 15, или от 7 до 13, или от 4 до 9, или от 9 до 11. Некоторые нуклеотиды в области петли могут участвовать во взаимодействиях пар оснований с другими нуклеотидами в области петли. Примеры олигонуклеотидных последовательностей, которые можно использовать для образования петли, включают 5'-UUCAAGAGA-3' (SEQ ID NO: 8;) и 5'-UUUGUGUAG-3' (SEQ ID NO: 9). Специалист в данной области техники должен понимать, что полученный одноцепочечный олигонуклеотид образует структуру "стержень-петля" или шпильку, содержащую двуцепочечную область, способную взаимодействовать с механизмом РНКи. Согласно некоторым вариантам реализации, кшРНК содержит нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 2. Согласно другим вариантам реализации, кшРНК содержит нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 4. Согласно одному варианту реализации, кшРНК содержит нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 2 и 3. Согласно еще одному варианту реализации, кшРНК содержит нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 4 и 5. Согласно некоторым вариантам реализации, кшРНК содержит нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 10 или 11. Согласно другим вариантам реализации, кшРНК содержит нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 10 и 11.

[108] Согласно еще одному варианту реализации, агент, вызывающий РНК-сайленсинг, может представлять собой микроРНК. МикроРНК - это малые РНК, состоящие из генов, кодирующих первичные транскрипты различного размера. Они обнаружены как у животных, так и у растений. Первичный транскрипт (называемый «при-микроРНК») подвергается процессингу посредством различных нуклеолитических стадий до более короткого предшественника микроРНК, или «пре-микроРНК». Пре-микроРНК присутствует в форме третичной структуры, так что готовая (зрелая) микроРНК присутствует в двуцепочечной структуре, причем две цепи называются микроРНК (цепь, которая в конечном итоге спаривается с мишенью). Пре-микроРНК представляет собой субстрат для формы дайсера, которая удаляет двуцепочечную микроРНК из предшественника, после чего, как и в случае с миРНК, двуцепочечная структура может быть включена в комплекс RISC. Продемонстрировано, что микроРНК могут экспрессироваться трансгенно и быть эффективными за счет экспрессии формы-предшественника, а не всей первичной формы.

[109] В отличие от миРНК, микроРНК связываются с последовательностями транскриптов, обладающими только частичной комплементарностью, и репрессируют трансляцию, не влияя на равновесные уровни РНК. Как микроРНК, так и миРНК подвергаются процессингу с участием дайсера и связываются с компонентами РНК-индуцируемого комплекса сайленсинга. Была выдвинута гипотеза, что регуляция генов посредством пути микроРНК по сравнению с путем миРНК определяется исключительно степенью комплементарности транскрипту-мишени. Предполагается, что миРНК, характеризующиеся лишь частичной идентичностью с мРНК-мишенью, функционируют, вызывая репрессию трансляции аналогично микроРНК, а не запускают разрушение РНК.

[110] Следует принимать во внимание, что агент, вызывающий РНК-сайленсинг, согласно настоящему изобретению необязательно ограничивается молекулами, содержащими только РНК, но и включает химически модифицированные нуклеотиды и соединения, не являющиеся нуклеотидами.

[111] Дополнительные агенты, способные подавлять PTEN, включают рибозимы, ДНК-ферменты и агенты системы CRISPR (например, CRISPR/Cas).

[112] Рибозимы все чаще используются для ингибирования экспрессии генов, специфичного по отношению к последовательности, путем расщепления мРНК, кодирующих рассматриваемые белки. Возможность конструирования рибозимов для расщепления любой конкретной РНК-мишени сделала их ценными инструментами как в фундаментальных исследованиях, так и в терапевтических приложениях. В области терапии рибозимы используют для адресного воздействия на вирусные РНК при инфекционных заболеваниях, на доминантные онкогены при раке и на специфические соматические мутации при генетических расстройствах. В частности, несколько протоколов генной терапии с применением рибозимов для пациентов с ВИЧ уже проходят исследования 1 фазы. Совсем недавно рибозимы стали использовать для исследований трансгенных животных, валидации генов-мишеней и исследования метаболических путей. Некоторые рибозимы находятся на различных стадиях клинических исследований. ANGIOZYME® является первым химически синтезированным рибозимом, изученным в клинических исследованиях на людях. ANGIOZYME® специфически ингибирует образование VEGF-r (рецептора фактора роста эндотелия сосудов), ключевого компонента пути ангиогенеза. Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., а также другие компании продемонстрировали важность антиангиогенных терапевтических средств на животных моделях. HEPTAZYME®, рибозим, разработанный для селективного разрушения РНК вируса гепатита C (ВГС), оказался эффективным в отношении снижения уровня РНК вируса гепатита C в анализах клеточных культур (Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated - домашняя веб-страница).

[113] Другим агентом, способным подавлять PTEN, является технология РНК-зависимых эндонуклеаз, например, система CRISPR.

[114] Дополнительным способом регуляции экспрессии гена PTEN в клетках являются олигонуклеотиды, образующие трехцепочечные структуры (TFO). Исследования показали, что можно сконструировать TFO, которые могут распознавать полипуриновые/полипиримидиновые области в двуцепочечной спиральной ДНК специфичным для последовательности образом и связываться с ними. Модификация олигонуклеотидов, например, введение интеркаляторов и замены в основной цепи, а также оптимизация условий связывания (pH и концентрации катионов) помогли преодолеть естественные препятствия для активности TFO, например, отталкивание зарядов и нестабильность, и недавно показано, что определенные последовательности могут являться мишенями синтетических олигонуклеотидов.

[115] Таким образом, для любой заданной последовательности в гене PTEN можно разработать последовательность, образующую трехцепочечную структуру. Длина олигонуклеотидов, образующих трехцепочечную структуру, предпочтительно составляет по меньшей мере 15, более предпочтительно 25, еще более предпочтительно 30 или более нуклеотидов, вплоть до 50 или 100 п. н.

[116] Как уже упоминалось, внеклеточные везикулы согласно настоящему изобретению могут быть загружены полинуклеотидным или олигонуклеотидным агентом, непосредственно ингибирующим экспрессию PTEN.

[117] Для облегчения загрузки мембранных везикул (например, экзосом) полинуклеотидный или олигонуклеотидный груз может содержать одну или более из гидрофобных модификаций. Гидрофобные модификации увеличивают гидрофобность полинуклеотидного или олигонуклеотидного груза по сравнению с нативной (немодифицированной) РНК или ДНК. В некоторых вариантах реализации гидрофобные модификации увеличивают гидрофобность полинуклеотида или олигонуклеотида по меньшей мере на два порядка (например, по меньшей мере на 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более порядков) по сравнению с нативной (немодифицированной) РНК или ДНК. В других вариантах реализации гидрофобные модификации увеличивают гидрофобность полинуклеотида или олигонуклеотида по меньшей мере на 10 порядков по сравнению с нативной (немодифицированной) РНК или ДНК. В других вариантах реализации гидрофобные модификации увеличивают гидрофобность полинуклеотида или олигонуклеотида по меньшей мере на два порядка (например, по меньшей мере на 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более порядков) по сравнению с немодифицированным полинуклеотидом или олигонуклеотидом. В других вариантах реализации гидрофобные модификации увеличивают гидрофобность полинуклеотида или олигонуклеотида по меньшей мере на десять порядков по сравнению с немодифицированным полинуклеотидом или олигонуклеотидом. Повышение гидрофобности можно оценить с помощью любого подходящего метода. Например, гидрофобность можно определять путем измерения процентной растворимости в органическом растворителе, например, октаноле, по сравнению с растворимостью в водном растворителе, например, воде.

[118] В некоторых вариантах реализации гидрофобный характер полинуклеотидного или олигонуклеотидного груза можно увеличить путем увеличения доли нуклеотидов, подвергнутых гидрофобной модификации, в молекуле полинуклеотида или олигонуклеотида. Например, в одном варианте реализации 20% или более нуклеотидов в олигонуклеотидной или полинуклеотидной молекуле гидрофобно модифицированы, например, 25% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 99% или более и т.д. нуклеотидов в олигонуклеотидной или полинуклеотидной молекуле гидрофобно модифицированы. В одном варианте реализации 100% нуклеотидов в молекуле олигонуклеотида или полинуклеотида гидрофобно модифицированы. В типичном варианте реализации 30% или более нуклеотидов в молекуле олигонуклеотида или полинуклеотида содержат гидрофобные модификации. Увеличение доли гидрофобно модифицированных нуклеотидов в молекуле олигонуклеотида или полинуклеотида может быть полезным, когда, например, гидрофобная модификация является слабо гидрофобной (например, 2'O-метильная модификация). В вариантах реализации с использованием сильно гидрофобной модификации, например, посредством стерина, липида и т.д., одной гидрофобной модификации может быть достаточно для облегчения загрузки в экзосомы.

[119] В некоторых вариантах реализации гидрофобная модификация представляет собой ковалентную модификацию. Гидрофобные модификации молекул нуклеиновых кислот могут включать, например, модификации каркаса, модификации углеводов, модификации оснований и/или модификации конъюгатов и их комбинации.

[120] Модификации каркаса включают изменения в сложноэфирных фосфатных связях в молекуле нуклеиновой кислоты. Примеры подходящих модификаций каркаса включают фосфортиоатные модификации, фосфородитиоатные модификации, п-этокси-модификации, метилфосфонатные модификации, метилфосфортиоатные модификации, алкил- и арилфосфаты (в которых заряженный фосфонатный кислород заменен алкильной или арильной группой), алкилфосфотриэфиры (в которых заряженный кислородный фрагмент алкилирован), модификации каркаса пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК), модификации каркаса заблокированной нуклеиновой кислоты (LNA) и т.п., но не ограничиваются ими. Эти модификации можно использовать в комбинации друг с другом и/или в комбинации со связями фосфодиэфирного каркаса.

[121] В одном варианте реализации гидрофобная модификация представляет собой фосфортиоатную (PS) модификацию, в которой один из немостиковых атомов кислорода фосфатной группы заменен на серу с образованием PS-группы. Эта модификация обеспечивает значительную устойчивость к расщеплению нуклеазами и обладает благоприятными фармакокинетическими свойствами. PS-связи можно включать в молекулы олигонуклеотидов с использованием стандартных методик, например, твердофазного синтеза олигонуклеотидов.

[122] В еще одном варианте реализации гидрофобная модификация представляет собой фосфонатную модификацию, в которой один немостиковый атом кислорода заменен алкильной группой. В других вариантах реализации гидрофобная модификация представляет собой модификацию пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК). ПНК являются имитаторами олигонуклеотидов с нейтрально заряженным пептидным каркасом по сравнению с сильно заряженным углеводно-фосфатным каркасом нативных РНК и ДНК (см., например. В других вариантах реализации молекула гидрофобно модифицированной нуклеиновой кислоты представляет собой фосфордиамидатморфолиноолигонуклеотид (PMO).

[123] В других вариантах реализации молекулы олигонуклеотидного груза могут быть гидрофобно модифицированы по углеводному фрагменту (например, рибозе, дезоксирибозе и т.д.). Модификации углевода часто происходят в 2'-положении сахарного кольца, где, например, 2'-фрагмент может быть модифицирован или замещен гидрофобным фрагментом, например, атомом галогена, алкокси-, аминоалкокси-, алкильной, азидной или аминогруппой. В неограничивающих примерах модификации углевода могут включать О-метил-, F-, метоксиэтил- и 2'-фтор-β-D-арабинонуклеотид (FANA). Другие 2'-модификации включают, например, 2'O-аллильные, 2'O-этиламинные и 2'O-цианоэтильные модификации. Кроме того, можно вносить модификации в других сайтах, включая 4'-положение в углеводном фрагменте.

[124] В других вариантах реализации молекулы олигонуклеотидного груза могут содержать гидрофобные модификации оснований. В типичных вариантах реализации эти модификации включают фенильную, нафтильную и изобутильную модификации. Другие варианты реализации включают C-5 пропинил-модифицированные основания, 5-метилцитозин, 2-аминопурин, 2-амино-6-хлорпурин, 2,6-диаминопурин и гипоксантин.

[125] Помимо увеличения гидрофобного характера олигонуклеотидного груза, вышеупомянутые модификации каркаса, углевода и основания повышают стабильность олигонуклеотидов в присутствии частиц (например, экзосом) и сводят к минимуму разрушение, которое может происходить во время загрузки.

[126] Согласно некоторым вариантам реализации, олигонуклеотид для РНК-интерференции, например, миРНК или кшРНК, содержит гидрофобный фрагмент. Гидрофобные фрагменты также можно химически конъюгировать с олигонуклеотидом для усиления его гидрофобности. Таким образом, в одном варианте реализации олигонуклеотид для РНК-интерференции конъюгирован с гидрофобным фрагментом. Согласно одному варианту реализации, указанный гидрофобный фрагмент выбран из группы, состоящей из стерина, ганглиозида, липида, витамина, жирной кислоты, пептида и их комбинации. Согласно одному варианту реализации, олигонуклеотид для РНК-интерференции конъюгирован со стерином. В типичных вариантах реализации фрагмент представляет собой молекулу холестерина, поэтому в соответствии с такими вариантами реализации олигонуклеотид для РНК-интерференции конъюгирован с холестерином. Согласно некоторым вариантам реализации, одна из цепей двуцепочечной молекулы для РНКи конъюгирована с гидрофобной молекулой, например, холестерином. Согласно другим вариантам реализации, две цепи двуцепочечной молекулы для РНКи конъюгированы с гидрофобной молекулой, например, холестерином. Согласно другим вариантам реализации, олигонуклеотид для РНК-интерференции конъюгирован с молекулой, выбранной из моносиалотетрагексозилганглиозида (GM1), липида, витамина, низкомолекулярного соединения, пептида или их комбинации. В некоторых вариантах реализации указанный фрагмент представляет собой липид. Например, в некоторых вариантах реализации указанный фрагмент представляет собой пальмитоильную группу. В некоторых вариантах реализации указанный фрагмент представляет собой стерин, например, холестерин. Дополнительные гидрофобные фрагменты включают, например, фосфолипиды, витамин D, витамин E, сквален и жирные кислоты. В другом типичном варианте реализации олигонуклеотидный груз конъюгирован с миристиновой кислотой или ее производным (например, миристоилированный олигонуклеотидный груз). В некоторых вариантах реализации гидрофобный фрагмент конъюгирован с концами олигонуклеотидного груза (т.е. «концевая модификация»). В других вариантах реализации гидрофобный фрагмент конъюгирован с другими областями молекулы олигонуклеотида.

[127] Согласно некоторым конкретным вариантам реализации, ингибитор PTEN представляет собой молекулу миРНК, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 11, 2, 3, 4 и 5, и конъюгированную с гидрофобной молекулой, например, холестерином. Согласно некоторым вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, мишенью которой является нуклеотидная последовательность, выбраная из SEQ ID NO: 6 и 7, конъюгированную с гидрофобной молекулой, например, холестерином. Согласно некоторым вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, мишенью которой является нуклеотидная последовательность, выбраная из SEQ ID NO: 6 и 7, конъюгированную с гидрофобной молекулой, например, холестерином. Согласно одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой миРНК с последовательностью SEQ ID NO: 10, конъюгированную с холестерином. Согласно другому варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой двуцепочечную миРНК, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10, конъюгированную с холестерином вместе с SEQ ID NO: 11. Согласно конкретным вариантам реализации, миРНК содержит последовательность, комплементарную фрагменту нуклеиновой кислоты, кодирующей белок PTEN, и ингибирует его экспрессию, причем по меньшей мере одна из последовательностей миРНК конъюгирована с гидрофобной молекулой, например, холестерином. Согласно одному варианту реализации, белок PTEN содержит SEQ ID NO: 1.

[128] В конкретных вариантах реализации олигонуклеотид стабилизирован посредством включения одной или более модификаций каркаса, модификаций углевода и/или модификаций основания, описанных в настоящем документе, и дополнительно конъюгирован с гидрофобным фрагментом. Например, олигонуклеотид в определенных вариантах реализации может содержать одну или более из модификаций каркаса, модификаций углевода и/или модификации оснований в по меньшей мере до 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65% или более нуклеотидах, и, кроме того, конъюгирован с гидрофобным фрагментом, описанным в настоящем документе, например, конъюгирован со стерином, GM1, липидом, витамином, низкомолекулярным соединением или пептидом, или их комбинацией. В типичном варианте реализации олигонуклеотидный груз конъюгирован со стерином, например, холестерином. В еще одном типичном варианте реализации олигонуклеотидный груз конъюгирован с GM1. В еще одном типичном варианте реализации олигонуклеотидный груз конъюгирован с миристиновой кислотой или ее производным.

[129] В некоторых вариантах реализации гидрофобно модифицированный олигонуклеотид может включать обнаружимую метку. Типичные метки включают флуоресцентные метки и/или радиоактивные метки. В вариантах реализации, где гидрофобно модифицированные олигонуклеотиды содержат флуоресцентную метку, обнаружимая метка может представлять собой, например, Cy3. Добавление обнаружимой метки к гидрофобно модифицированным олигонуклеотидам можно использовать в качестве способа мечения экзосом и отслеживания их биораспределения. В других вариантах реализации обнаружимую метку можно присоединить непосредственно к экзосомам, например, посредством мечения экзосомального липида и/или экзосомального пептида.

[130] Нуклеиновые кислоты можно синтезировать с использованием любого количества процедур, известных в данной области техники. Для этой цели коммерчески доступен ряд автоматических синтезаторов нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах реализации груз нуклеиновой кислоты представляет собой синтетический олигонуклеотид. В других вариантах реализации нуклеиновые кислоты можно получать с использованием, например, ферментов рестрикции, экзонуклеаз или эндонуклеаз.

[131] Согласно любому из вышеуказанных вариантов реализации, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению дополнительно содержит лиазу-хондроитиназу ABC.

[132] Хондроитин-ABC-лиаза (EC 4.2.2.4, хондроитиназа, хондроитин-ABC-элиминаза, хондроитиназа ABC) представляет собой фермент с систематическим названием хондроитин-ABC-лиаза. Этот фермент катализирует следующую химическую реакцию:

Элиминирующее разрушение полисахаридов, содержащих 1,4-бета-D-гексозаминильные и 1,3-бета-D-глюкуронозильные или 1,3-альфа-L-идуронозильные связи, до дисахаридов, содержащих 4-дезокси-бета-D-глюк-4-энуронозильные группы. В одном варианте реализации лиаза-хондроитиназа ABC происходит из Proteus vulgaris.

[133] Хондроитиназа ABC может быть представлена в виде собственно белка или в составе носителя, например, в виде частиц (как описано выше в настоящем документе). Согласно одному варианту реализации, фармацевтическая композиция содержит внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором PTEN и хондроитиназой ABC в виде белка. Согласно еще одному варианту реализации, фармацевтическая композиция содержит внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором PTEN и хондроитиназой ABC во внеклеточных везикулах того же типа (например, экзосомах, полученных из мезенхимальных стволовых клеток). Согласно дополнительному варианту реализации, фармацевтическая композиция содержит внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором PTEN, и другие, отличающиеся внеклеточные везикулы, загруженные хондроитиназой ABC. Согласно некоторым вариантам реализации, указанные отличающиеся внеклеточные везикулы могут быть одного и того же типа (например, экзосомы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток) или разных типов (внеклеточные везикулы, полученные из различных клеток, например, ингибитор PTEN содержится в экзосомах, полученных из мезенхимальных стволовых клеток, а хондроитиназа ABC содержится в экзосомах, полученных из пульпы зуба, или наоборот).

[134] В соответствии с некоторыми вариантами реализации, фармацевтическая композиция дополнительно содержит дополнительные терапевтические агенты, которые можно применять при лечении неврологических расстройств. Неограничивающими примерами таких активных агентов являются ганглиозиды; антибиотики, нейромедиаторы, нейрогормоны, токсины, молекулы, способствующие развитию аксонов; и антиметаболиты, низкомолекулярные агенты и предшественники молекул нейромедиаторов, например, L-ДОФА. В качестве дополнения или альтернативы, дополнительным терапевтическим агентом являются клетки, способные облегчить по меньшей мере один симптом неврологического заболевания.

[135] В настоящем документе термин «фармацевтическая композиция» относится к композиции, содержащей мембранные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором PTEN, в частности, внеклеточные везикулы, например, экзосомы, включенные в состав с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями.

[136] Состав фармацевтической композиции можно корректировать в соответствии с областями применения. В частности, фармацевтическую композицию можно составить с использованием способа, известного в данной области техники, обеспечивающего быстрое, непрерывное или замедленное высвобождение активного ингредиента после введения млекопитающим. Например, композиция может представлять собой любую композицию, выбранную из пластырей, гранул, лосьонов, мазей для растирания, лимонадов, ароматических вод, порошков, сиропов, офтальмологических мазей, жидкостей и растворов, аэрозолей, спреев, экстрактов, эликсиров, мазей, жидких экстрактов, эмульсий, суспензий, отваров, вливаний, офтальмологических растворов, таблеток, суппозиториев, инъекций, спиртовых растворов, капсул, кремов, пастилок, настоек, паст, пилюль, а также мягких или твердых желатиновых капсул.

[137] Термин «фармацевтически приемлемый носитель» или «фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество» в настоящем документе относится к всевозможным растворителям, дисперсионным средам, консервантам, антиоксидантам, покрытиям, изотоническим агентам и агентам, замедляющим абсорбцию, поверхностно-активным веществам, наполнителям, разрыхлителям, связующим веществам, разбавителям, смазывающим веществам, скользящим веществам, агентам, регулирующим pH, буферным агентам, усилителям действия, увлажнителям, солюбилизирующим агентам, поверхностно-активным веществам, антиоксидантам и т.п., совместимым с фармацевтическим введением. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. Композиции могут содержать другие активные соединения, обеспечивающие добавочные, дополнительные или усиленные терапевтические функции, твердые носители или вспомогательные вещества, например, лактозу, крахмал или тальк, или жидкие носители, например, воду, жирные масла или жидкие парафины. Другие примеры носителей включают культуральную среду, например, DMEM или RPMI; гипотермическую среду для хранения, содержащую компоненты, удаляющие свободные радикалы, обеспечивающие буферизацию pH, онкотическую/осмотическую поддержку, энергетические субстраты и концентрации ионов, уравновешивающие внутриклеточное состояние при низких температурах; а также смеси органических растворителей с водой.

[138] Примеры вспомогательных веществ, без ограничения, включают альбумин, плазму, сыворотку и цереброспинальную жидкость (ЦСЖ), антиоксиданты, например, N-ацетилцистеин (NAC) или ресвератрол. Обычно фармацевтический носитель сохраняет количество частиц и активность ингибитора PTEN (например, количество не снижается более чем на 90%) в композиции в течение по меньшей мере 24 часов, по меньшей мере 48 часов или даже по меньшей мере 96 часов.

[139] Согласно любому из вышеуказанных вариантов реализации, фармацевтическая композиция составлена для введения путем, выбранным из интраназального, внутриочагового, интратекального, внутривенного, внутримышечного, подкожного, сублингвального, перорального и интрацеребрального пути введения. Согласно одному варианту реализации, фармацевтическая композиция составлена для интраназального введения. Согласно некоторым вариантам реализации, такая фармацевтическая композиция находится в форме жидкого раствора, капель для носа, спрея, дозированного спрея. Согласно другому варианту реализации, фармацевтическая композиция составлена для инъекции, например, внутриочаговой, интратекальной или внутривенной инъекции. Согласно таким вариантам реализации, фармацевтическая композиция находится в форме стерильного раствора для инъекций.

[140] Согласно некоторым вариантам реализации, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), причем указанные внеклеточные везикулы имеют клеточное происхождение. Согласно одному варианту реализации, EV выбраны из экзосом, микровезикул и их комбинации. Согласно еще одному варианту реализации, внеклеточные везикулы представляют собой экзосомы. Согласно некоторым вариантам реализации, внеклеточные везикулы происходят из MSC. Согласно одному варианту реализации, ингибитор PTEN является ингибитором экспрессии PTEN. Согласно еще одному варианту реализации, ингибитор экспрессии PTEN представляет собой миРНК. Согласно еще одному варианту реализации, ингибитор экспрессии PTEN представляет собой кшРНК. Согласно некоторым вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 11, 2, 3, 4 и 5. Согласно одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой миРНК, содержащую нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 10. Согласно еще одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой двуцепочечную миРНК, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11. Согласно некоторым вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, мишенью которой является SEQ ID NO: 6. Согласно другим вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, мишенью которой является SEQ ID NO: 7. Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит последовательность, комплементарную фрагменту нуклеиновой кислоты, кодирующей белок PTEN, и ингибирует его экспрессию. Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит последовательность, комплементарную фрагменту нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации, миРНК конъюгирована с холестерином. Согласно некоторым вариантам реализации, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая внеклеточные везикулы, выбранные из экзосом, микровезикул или их комбинации, загруженные молекулой миРНК, способной ингибировать экспрессию PTEN и конъюгированной с холестерином. Согласно таким вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 и 3. Согласно другим таким вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 и 5. Согласно еще одному такому варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой двуцепочечную миРНК, содержащую последовательности SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11. Согласно некоторым вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, мишенью которой является SEQ ID NO: 6. Согласно другим вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, мишенью которой является SEQ ID NO: 7. Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит последовательность, комплементарную фрагменту нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации, фармацевтическая композиция составлена для интраназального введения. Согласно другому варианту реализации, фармацевтическая композиция составлена для внутриочагового введения. Согласно еще одному варианту реализации, фармацевтическое средство составлено для перорального введения. Согласно некоторым вариантам реализации, фармацевтическую композицию вводят совместно с хондроитиназой ABC.

[141] Согласно одному варианту реализации, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая внеклеточные везикулы, выбранные из экзосом, микровезикул и их комбинации, причем указанные внеклеточные везикулы загружены миРНК или кшРНК, способными ингибировать экспрессию PTEN, а фармацевтическая композиция составлена для интраназального или интратекального введения. Согласно одному варианту реализации, миРНК или кшРНК конъюгированы с холестерином. Согласно одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой двуцепочечную миРНК, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10, необязательно конъюгированную с холестерином, и SEQ ID NO: 11 или ее вариант(ы). Согласно еще одному варианту реализации, миРНК или кшРНК содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 и/или 3 или ее вариант. Согласно дополнительному варианту реализации, миРНК или кшРНК содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 и/или 3 или ее вариант.

[142] Согласно любому из вышеуказанных вариантов реализации, фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно применять для лечения неврологического заболевания, расстройства, повреждения или состояния. Согласно одному из вариантов реализации, неврологическое состояние представляет собой повреждение спинного мозга.

[143] Согласно одному варианту реализации, мембранные везикулы представляют собой липосомы. Таким образом, согласно одному варианту реализации, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая липосомы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN). Термин «липосома» относится к микроскопической закрытой везикуле, содержащей внутреннюю фазу, заключенную в липидный бислой. Липосома может представлять собой небольшую одномембранную липосому, например, небольшую однослойную везикулу (SUV), большую однослойную липосому, например, большую моноламеллярную везикулу (LUV), еще более крупную однослойную липосомоу, например, гигантскую моноламеллярную везикулу (GUV), многослойную липосому, содержащую несколько концентрических мембран, например, мультиламеллярную везикулу (MLV), или липосому, содержащую несколько нерегулярных и неконцентрических мембран, например, мультивезикулярную везикулу (MVV). Согласно одному варианту реализации, липосомы представляют собой SUV. Согласно еще одному варианту реализации, липосомы представляют собой MLV.

[144] Согласно одному варианту реализации, липосомы представляют собой SUV. Согласно еще одному варианту реализации, липосомы представляют собой MLV. Согласно одному варианту реализации, липосомы содержат липосомообразующий липид, выбранный из группы, состоящей из фосфатидилхолина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина, фосфатидилэтаноламина, 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилхолина (POPC), сфингофосфолипидов, дистеароильных соединений и любой их комбинации. Согласно еще одному варианту реализации липосомообразующий липид представляет собой фосфатидилхолин. Согласно одному варианту реализации, фосфатидилхолин представляет собой гидрогенизированный фосфатидилхолин сои (HSPC). Согласно другим вариантам реализации, фосфатидилэтаноламин представляет собой 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DSPE), и указанное дистеароильное соединение представляет собой дистеароилгликоль (DSG) или дистеароиловый эфир оксикарбонил-3-амино-1,2-пропандиола (DS). В соответствии с еще одним вариантом реализации, липосомы содержат молекулу стабилизирующего полимера, например, полиалкиловый эфир, полисиаловую кислоту, полимолочную кислоту и полигликолевую кислоту. Согласно одному варианту реализации, липосомы содержат ПЭГ. Согласно некоторым вариантам реализации, липосомы дополнительно содержат холестерин.

[145] Согласно одному варианту реализации, липосомы содержат ингибитор PTEN. В настоящем документе используют все термины и варианты реализации, относящиеся к ингибитору PTEN. Согласно одному варианту реализации, ингибитор PTEN является ингибитором экспрессии PTEN. Согласно некоторым вариантам реализации, ингибитор экспрессии PTEN представляет собой олигонуклеотид для РНК-интерференции (РНКи). Согласно одному варианту реализации, олигонуклеотид для РНКи выбран из миРНК и кшРНК. Согласно другому варианту реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 11, 2, 3, 4 и 5. Согласно некоторым вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, мишенью которой является SEQ ID NO: 6. Согласно другим вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, мишенью которой является SEQ ID NO: 7. Согласно дополнительному варианту реализации, указанный олигонуклеотид для РНКи, например, миРНК или кшРНК, конъюгирован с гидрофобным фрагментом. Согласно еще одному варианту реализации, гидрофобный фрагмент выбран из группы, состоящей из стерина, ганглиозида, липида, витамина, жирной кислоты, гидрофобного пептида и их комбинации. Согласно одному варианту реализации, миРНК или миРНК конъюгированы с холестерином.

[146] В соответствии с идеей настоящего изобретения, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению предназначена для применения при лечении неврологического заболевания, расстройства или состояния у субъекта. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации, фармацевтическая композиция, содержащая частицы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), предназначена для применения при лечении неврологического заболевания, расстройства или состояния у субъекта, нуждающегося в этом. Согласно некоторым вариантам реализации, частицы представляют собой мембранные везикулы. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации, мембранные везикулы представляют собой внеклеточные везикулы.

[147] Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), для применения при лечении неврологического заболевания, расстройства или состояния у субъекта, нуждающегося в этом.

[148] Термин «неврологическое заболевание, расстройство или состояние» относится к заболеванию, расстройству или состоянию головного мозга, спинного мозга и/или нервов, которые их соединяют.

[149] Согласно конкретному варианту реализации, указанное состояние вызвано повреждением. Согласно одному варианту реализации, повреждение относится к спинному мозгу, т.е. представляет собой повреждение спинного мозга (ПСМ). Согласно другому варианту реализации, неврологическое заболевание, расстройство или состояние представляет собой повреждение нейронов.

[150] Термины «повреждение спинного мозга» и «ПСМ» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к повреждению спинного мозга. Согласно одному варианту реализации, указанное повреждение является результатом травмы. Согласно другому варианту реализации, поражение или повреждение является результатом дегенерации или заболевания. В зависимости от области повреждения спинного мозга и нервных корешков симптомы могут варьироваться в широких пределах, например, от боли до паралича и недержания мочи. Повреждения спинного мозга описываются как различные уровни «неполного повреждения», которые могут варьироваться от отсутствия воздействия на пациента до «полного» повреждения, что означает полную потерю функции. Повреждения спинного мозга обусловлены множеством причин, но обычно ассоциированы с обширными травмами в результате дорожно-транспортных происшествий, падениями, спортивными повреждениями и насилием. Таким образом, согласно одному варианту реализации, ПСМ выбрано из полного и неполного ПСМ. Согласно некоторым вариантам реализации, повреждение спинного мозга выбрано из острого или хронического ПСМ. Повреждение спинного мозга может быть чувствительным к вторичному повреждению тканей, включая глиальное рубцевание, ингибирование образования миелина, демиелинизацию, гибель клеток, отсутствие нейротрофической поддержки, ишемию, образование свободных радикалов и эксайтотоксичность, но не ограничиваясь ими.

[151] Заболевания спинного мозга включают аутоиммунные заболевания (например, рассеянный склероз), воспалительные заболевания (например, арахноидит), нейродегенеративные заболевания, полиомиелит, расщепление позвоночных дуг и опухоли спинного мозга, но не ограничиваются ими.

[152] Субъекты, которых можно лечить в соответствии с принципами настоящего изобретения, включают субъектов-млекопитающих, например, людей, мышей, крыс, обезьян, собак и кошек. В одном из вариантов реализации субъектом является человек.

[153] Термин «лечение» состояния или пациента относится к принятию мер для получения благоприятных или желательных результатов, в том числе клинических результатов. Благоприятные или желательные клинические результаты включают улучшение, прекращение, значительное ингибирование, замедление или купирование прогрессирования заболевания, состояния или расстройства, значительное улучшение или облегчение клинических или эстетических симптомов состояния, существенную профилактику появления клинических или эстетических симптомов заболевания, состояния или расстройства и защиту от опасных или раздражающих симптомов, но не ограничиваются ими. Лечение также относится к выполнению одного или более из следующих действий: (а) уменьшению тяжести расстройства; (b) ограничению развития симптомов, характерных для расстройств(а), подвергаемых(ого) лечению; (c) ограничению ухудшения симптомов, характерных для расстройств(а), подвергаемых(ого) лечению; (d) ограничение рецидивов расстройств(а) у пациентов, ранее страдавших указанным(м) расстройством(ами); и/или (e) ограничение рецидивов симптомов у пациентов, ранее не испытывавших симптомов расстройств(а). Согласно некоторым вариантам реализации, термин «лечение» включает регенерацию нервов, распространение аксонов, уменьшение астроглиоза и микроглиоза в очаге повреждения. Согласно другим вариантам реализации, этот термин охватывает улучшение симптомов, ассоциированных с заболеванием или состоянием. Согласно одному варианту реализации, термин «лечение» включает улучшение двигательных параметров. Согласно одному варианту реализации, улучшение двигательных параметров включает 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% улучшение двигательных параметров по сравнению с субъектом, не получавшим лечения. Согласно некоторым вариантам реализации, лечение включает уменьшение астроглиоза и/или микроглиоза в очаге повреждения. Согласно одному варианту реализации, уменьшение астроглиоза и/или микроглиоза включает 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% уменьшение астроглиоза и/или микроглиоза по сравнению с субъектом, не получавшим лечения.

[154] Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно вводить любым известным способом. «Введение» вещества, соединения или агента субъекту можно осуществлять с использованием одного из множества способов, известных специалистам в данной области техники. Например, соединение или агент можно вводить интраназально (например, путем ингаляции), интратекально (в позвоночный канал или в субарахноидальное пространство), артериально, внутрикожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, окулярно, сублингвально, перорально (внутрь), интрацеребрально и трансдермально (путем всасывания, например, через кожные протоки). Соединение или агент также можно соответствующим образом вводить с помощью перезаряжаемых или биоразлагаемых полимерных изделий или других изделий, например, пластырей и насосов, или составов, обеспечивающих пролонгированное, медленное или контролируемое высвобождение соединения или агента. Введение также можно выполнять, например, однократно, многократно и/или в течение одного или более продолжительных периодов. Согласно некоторым вариантам реализации, композицию вводят 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз в день. Согласно другим вариантам реализации, композицию вводят 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз в месяц. В некоторых вариантах реализации введение включает как прямое введение, включая самостоятельное введение, так и непрямое введение, включая действия по назначению лекарственного средства. Например, в настоящем документе врач, который инструктирует пациента самостоятельно вводить лекарственное средство или вводить лекарственное средство другому лицу, и/или который дает пациенту рецепт на лекарственное средство, вводит лекарственное средство пациенту. Согласно одному варианту реализации, фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят интраназально. Согласно другому варианту реализации, фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят внутриочаговым путем. Согласно одному варианту реализации, фармацевтическую композицию вводят перорально.

[155] Согласно конкретному варианту реализации, неврологическое заболевание представляет собой дегенеративное заболевание нервной системы. Согласно одному варианту реализации, дегенеративное заболевание нервной системы выбрано из болезни Паркинсона, эссенциального тремора, болезни Хантингтона, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза, БАС и органического психоза. Согласно одному варианту реализации, заболевание представляет собой расстройство памяти. В одном варианте реализации заболевание представляет собой расстройство психического развития, например, аутизм или шизофрению. Согласно еще одному варианту реализации, заболевание представляет собой поведенческое заболевание, например, шизофрению, синдром дефицита внимания и гиперактивности, аутизм, синдром Туретта, обсессивно-компульсивное расстройство, а также симптомы, ассоциированные с нейроповеденческими аспектами. Согласно конкретному варианту реализации, неврологическое заболевание представляет собой расстройство аутистического спектра (РАС).

[156] Согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая мембранные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), для применения при лечении поражения или повреждения нейронов у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации, повреждение нейронов представляет собой повреждение спинного мозга. Согласно еще одному варианту реализации, повреждение представляет собой повреждение нервных клеток головного мозга. Согласно одному варианту реализации, повреждение представляет собой повреждение головного мозга. Согласно еще одному варианту реализации, повреждение вызвано нейродегенеративным заболеванием. Согласно еще одному варианту реализации, нейродегенеративное заболевание выбрано из болезни Паркинсона, эссенциального тремора, болезни Хантингтона, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза, БАС и органического психоза.

[157] Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами реализации, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), для применения при лечении поражения или повреждения нейронов у субъекта, причем внеклеточные везикулы имеют внеклеточное происхождение.

[158] Согласно одному из вариантов реализации, внеклеточные везикулы представляют собой экзосомы. Согласно еще одному варианту реализации, EV представляют собой микровезикулы. Согласно одному варианту реализации, EV выбраны из экзосом, микровезикул и их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации, внеклеточные везикулы происходят из MSC. Согласно одному варианту реализации, экзогенный ингибитор PTEN является ингибитором экспрессии PTEN. Согласно еще одному варианту реализации, ингибитор экспрессии PTEN представляет собой миРНК или кшРНК. Согласно некоторым вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 11, 2, 3, 4 и 5. Согласно одному варианту реализации, миРНК является комплементарной или специфичной по отношению к последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 6 и 7. Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит последовательность, комплементарную фрагменту нуклеиновой кислоты, кодирующей белок PTEN, и ингибирует его экспрессию. Согласно одному варианту реализации, PTEN содержит SEQ ID NO: 1. Согласно одному из вариантов реализации, ингибитор PTEN представляет собой миРНК, содержащую нуклеотидную последовательность 10. Согласно еще одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой двуцепочечную миРНК, содержащую последовательности SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11. Согласно дополнительному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой кшРНК, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 11, 2, 3, 4 и 5. Согласно одному варианту реализации, кшРНК является специфичной или комплементарной по отношению к последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 6 и 7. Согласно некоторым конкретным вариантам реализации, кшРНК конъюгирована с холестерином.

[159] В соответствии с некоторыми вариантами реализации, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая EV, выбранные из экзосом, микровезикул или их комбинации, загруженные миРНК-олигонуклеотидом, способным ингибировать экспрессию PTEN и конъюгированным с холестерином, для применения при лечении повреждения спинного мозга. Согласно таким вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 11, 2, 3, 4 и 5. Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит последовательности SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11. Согласно некоторым вариантам реализации, фармацевтическую композицию вводят интраназально. Согласно еще одному варианту реализации, фармацевтическую композицию вводят внутриочаговым путем. Согласно еще одному варианту реализации, фармацевтическую композицию вводят перорально.

[160] Согласно любому из вышеприведенных вариантов реализации, лечение включает совместное введение фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению с лиазой-хондроитиназой ABC.

[161] В одном варианте реализации пациенту вводят полинуклеотид, кодирующий лиазу-хондроитиназу ABC (посредством генной терапии). Конструкты для экспрессии лиазы-хондроитиназы ABC дополнительно описаны ниже в настоящем документе. Полинуклеотид, кодирующий лиазу-хондроитиназу ABC, можно выгрузить в частицы. В еще одном варианте реализации пациенту вводят фермент сам по себе.

[162] В конкретном варианте реализации как ингибитор PTEN, так и хондроитиназу ABC совместно включают в одни и те же частицы. В другом варианте реализации ингибитор PTEN и хондроитиназу ABC загружают в частицы одного и того же типа (например, экзосомы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток), но не в одну и ту же частицу. В еще одном варианте реализации ингибитор PTEN и хондроитиназу ABC загружают в частицы разных типов (например, ингибитор PTEN содержится в экзосомах, полученных из мезенхимальных стволовых клеток, а хондроитиназа ABC содержится в экзосомах, полученных из пульпы зуба, или наоборот).

[163] Согласно некоторым вариантам реализации, применение дополнительно включает совместное введение с терапевтическими агентами, которые можно применять для лечения неврологических расстройств, например, ганглиозидами; антибиотиками, нейромедиаторами, нейрогормонами, токсинами, молекулами, способствующие развитию аксонов; и низкомолекулярными агентами-антиметаболитами и предшественниками молекул нейромедиаторов, например, L-ДОФА, или с клетками, способными облегчить по меньшей мере один симптом неврологического заболевания.

[164] Согласно некоторым вариантам реализации, частицы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), являются липосомами, согласно определению, приведенному выше. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая экзосомы, загруженные ингибитором (PTEN), для применения при лечении неврологического заболевания, расстройства или состояния у субъекта, нуждающегося в этом. Согласно некоторым вариантам реализации, состояние представляет собой травму спинного мозга.

[165] В соответствии с еще одним аспектом, в настоящем изобретении предложен способ лечения поражения, повреждения, заболевания или расстройства нейронов у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества мембранных везикул, загруженных экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), что приводит к лечению поражения, повреждения, заболевания или расстройства. В настоящем документе также действуют все положения вышеприведенных вариантов реализации и аспектов. Согласно некоторым вариантам реализации, мембранные везикулы представляют собой внеклеточные везикулы, описанные выше.

[166] Мембранные везикулы согласно настоящему изобретению можно вводить индивиду, получающему лечение, с использованием различных путей введения, определенных выше, включая подходы на основе трансплантации, характер которых зависит от места имплантации.

[167] Термины или фразы «трансплантация», «замена клеток» или «пересадка» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к введению частиц согласно настоящему изобретению в ткань-мишень, например, головной мозг, серое вещество и т.д. Мезенхимальные стволовые клетки, из которых получены частицы, могут быть получены из организма реципиента (аллогенные клетки) или неаллогенного или ксеногенного донора.

[168] Мембранные везикулы можно трансплантировать непосредственно в спинной мозг (интратекально), внутривенно, непосредственно в головной мозг или использовать комбинации вышеуказанного, позволяющие везикулам достичь головного мозга. В одном варианте реализации частицы доставляют неинвазивно, например, интраназально. Кроме того, рассмотрены другие способы введения, например, системное введение.

[169] Типичная доза мембранных везикул (например, экзосом), которую можно вводить (например, интраназально) на сеанс лечения, может составлять от 1 × 10⁶ - 1 × 10²⁰ до или между 1 × 10⁹ - 1 × 10¹⁵ для человека весом 70 кг.

[170] Термин «терапевтически эффективное количество» мембранных везикул соответствует количеству, которое при введении субъекту будет оказывать предполагаемый терапевтический эффект, например, при лечении повреждения нейронов, например, ПСМ. Полноценный терапевтический эффект не обязательно достигается при введении одной дозы, а может наступить только после введения серии доз. Таким образом, терапевтически эффективное количество можно вводить за одно или несколько введений. Точное эффективное количество, необходимое для субъекта, зависит, например, от размера, состояния здоровья и возраста субъекта, характера и степени когнитивного расстройства, а также от терапевтических средств или комбинации терапевтических средств, выбранных для введения, и от способа введения. Специалист может определить эффективное количество для данной ситуации с помощью обычных экспериментов.

[171] Согласно некоторым вариантам реализации, мембранные везикулы, например, EV, вводят интраназально, внутриочаговым путем, парентерально, местно, системно или перорально.

[172] Токсичность и терапевтическую эффективность активных ингредиентов, описанных в настоящем документе, можно определить посредством стандартных фармацевтических процедура in vitro, на культурах клеток или экспериментальных животных.

[173] Данные, полученные в результате этих анализов in vitro и в клеточных культурах, а также исследований на животных, можно использовать для определения диапазона доз для применения на людях. Дополнительную информацию можно получить из клинических исследований - см., например, Salem HK et al., Stem Cells 2010; 28:585-96; и Uccelli et al. Lancet Neurol. 2011; 10:649-56).

[174] Дозировка может варьироваться в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого пути введения. Точный состав, способ введения и дозировку может на индивидуальной основе выбрать врач с учетом состояния пациента.

[175] Для инъекций можно использовать составы активных ингредиентов фармацевтической композиции в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, например, растворе Хэнка, растворе Рингера или забуференном физиологическом растворе, а также с дополнительными агентами, описанными выше в настоящем документе.

[176] Количество и интервал введения можно корректировать на индивидуальной основе до достижения уровней активного ингредиента, достаточных для эффективного лечения неврологического расстройства. Дозировки, необходимые для достижения желательного эффекта, зависят от индивидуальных характеристик и пути введения.

[177] В зависимости от тяжести и чувствительности состояния, подлежащего лечению, введение частиц может быть одно- или многократным, причем курс лечения может продолжаться от нескольких дней до нескольких недель или месяцев, в зависимости от времени достижения улучшений болезненного состояния.

[178] Количество вводимых частиц, разумеется, зависит от индивида, подвергаемого лечению, тяжести заболевания, способа введения, заключения лечащего врача и т.д. Дозировка и время введения зависят от тщательного и постоянного мониторинга изменений состояния индивида.

[179] После введения частицы можно отслеживать, чтобы убедиться, что они достигли области-мишени. Это можно сделать, например, с использованием наночастиц золота - см. WO 2013/186735 A3.

[180] Согласно некоторым вариантам реализации, в настоящем изобретении предложены внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), для использования при получении лекарственного средства для лечения неврологического заболевания, расстройства или состояния у субъекта, нуждающегося в этом. Согласно некоторым вариантам реализации, внеклеточные везикулы представляют собой выделенные внеклеточные везикулы. Согласно одному варианту реализации, неврологическое состояние представляет собой повреждение спинного мозга.

[181] Согласно еще одному аспекту, в настоящем изобретении предложены липидные везикулы с двухслойной фосфолипидной мембраной, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN). Согласно некоторым вариантам реализации, мембранные везикулы представляют собой выделенные внеклеточные везикулы.

[182] Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами реализации, в настоящем изобретении предложены внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), причем внеклеточные везикулы имеют клеточное происхождение. Согласно одному варианту реализации, внеклеточные везикулы выбраны из внеклеточных везикул, липосом, эктосом и трансферосом. Согласно одному варианту реализации, внеклеточные везикулы выбраны из экзосом, микровезикул и их комбинации. Согласно одному варианту реализации, EV представляют собой экзосомы. Согласно одному варианту реализации, EV представляют собой микровезикулы. Согласно одному варианту реализации, диаметр микровезикул составляет от 100 до 1000 нм, от 120 до 800 нм, от 150 до 600 нм, от 200 до 400 нм. Согласно еще одному варианту реализации, размер микровезикул составляет от 100 до 300 нм или от 150 до 250 нм. Согласно некоторым вариантам реализации, диаметр EV составляет от 30 до 250 нм или от 50 до 200 нм. Согласно некоторым вариантам реализации, диаметр EV составляет от 70 до 170 нм или от 80 до 150 нм.

[183] Согласно любому из вышеперечисленных вариантов реализации, EV имеют клеточное происхождение. Согласно одному варианту реализации, EV, например, экзосомы, происходят из клеток, экспрессирующих мезенхимальные маркеры. Согласно одному варианту реализации, клетки представляют собой адгезивные клетки. Согласно некоторым вариантам реализации, клетки выбраны из мезенхимальных стволовых клеток, стволовых клеток слизистой оболочки полости рта и обонятельных обкладочных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации, клетки представляют собой мезенхимальные стволовые клетки (MSC). Согласно одному варианту реализации, мезенхимальные стволовые клетки происходят из области, выбранной из костного мозга, жировой ткани, пуповины, пульпы зуба, слизистой оболочки полости рта, периферической крови и амниотической жидкости. Согласно некоторым вариантам реализации, EV получают из MSC, происходящих из костного мозга. Согласно еще одному варианту реализации, EV получают из MSC, происходящих из жировой ткани. Согласно некоторым из таких вариантов реализации, EV выбраны из экзосом, микровезикул и их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации, клетки экспрессируют маркеры CD105, CD166, CD29, CD90 и CD73. Согласно дополнительному варианту реализации, клетки экспрессируют CD105, CD166, CD29, CD90 и CD73 и не экспрессируют CD34, CD45 и CD133. Согласно некоторым вариантам реализации, клетки выбраны из стволовых клеток пульпы зуба (DPSC), стволовых клеток выпавших молочных зубов (SHED), стволовых клеток периодонтальной связки (PDLSC), стволовых клеток апикального сосочка (SCAP) и клеток-предшественников зубных фолликулов (DFPC).

[184] EV могут обладать по меньшей мере одним свойством мезенхимальных стволовых клеток. Частица может обладать биологическим свойством, например, биологической активностью. Частица может обладать любой из биологических активностей MSC. Частица может, например, обладать терапевтической или восстанавливающей активностью MSC.

[185] Согласно некоторым вариантам реализации, EV получают из клеток, экспрессирующих маркеры клеток нервного гребня (NCC). Согласно одному варианту реализации, клетки представляют собой клетки нервного гребня. Согласно некоторым вариантам реализации, клетки нервного гребня представляют собой клетки краниального нервного гребня. Согласно одному варианту реализации, клетки краниального нервного гребня выбраны из стволовых клеток пульпы зуба (DPSC), стволовых клеток выпавших молочных зубов (SHED), стволовых клеток периодонтальной связки (PDLSC), стволовых клеток апикального сосочка (SCAP) и клеток-предшественников зубных фолликулов (DFPC). Согласно еще одному варианту реализации, клетки экспрессируют мезенхимальные маркеры, заданные выше.

[186] Согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации, EV отделены от клеток. Следовательно, согласно некоторым вариантам реализации, EV представляют собой выделенные EV, например, выделенные экзосомы и/или выделенные микровезикулы. Согласно одному варианту реализации, отношение EV к остаточным исходным клеткам по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 8 или 10 раз выше, или, в некоторых предпочтительных вариантах реализации, по меньшей мере в 50, 100 или 1000 раз выше, чем в исходном материале. Согласно некоторым вариантам реализации, EV представляют собой бесклеточные EV.

[187] EV можно получать или выделять несколькими способами. Такой способ может включать выделение EV из мезенхимальных стволовых клеток (MSC) или из клеток нервного гребня (NCC). Согласно некоторым вариантам реализации, выделенные внеклеточные везикулы не содержат клеток.

[188] Согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации, внеклеточные везикулы содержат ингибитор PTEN согласно определению в любом из вышеуказанных аспектов и вариантов реализации. Согласно одному варианту реализации, внеклеточные везикулы загружены ингибитором PTEN. Согласно одному из вариантов реализации, выделенные внеклеточные везикулы загружены указанным ингибитором PTEN. Согласно одному варианту реализации, ингибитор PTEN ингибирует или подавляет активность PTEN. Согласно еще одному варианту реализации, ингибитор PTEN ингибирует или подавляет экспрессию PTEN.

[189] Согласно одному варианту реализации, экзогенный ингибитор PTEN представляет собой белок или пептид. Согласно еще одному варианту реализации, экзогенный ингибитор PTEN представляет собой низкомолекулярное соединение. Согласно некоторым вариантам реализации, экзогенный ингибитор PTEN является ингибитором экспрессии PTEN. Согласно одному варианту реализации, экзогенный ингибитор экспрессии PTEN представляет собой полинуклеотидный агент или олигонуклеотидный агент. Согласно еще одному варианту реализации, экзогенный ингибитор PTEN представляет собой олигонуклеотид для РНК-интерференции. Согласно одному варианту реализации, олигонуклеотид для РНК-интерференции представляет собой миРНК. Согласно еще одному варианту реализации, олигонуклеотид для РНК-интерференции представляет собой кшРНК. Согласно одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой миРНК. Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 11, 2, 3, 4 и 5. Согласно одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой миРНК с последовательностью SEQ ID NO: 10. Согласно еще одному варианту реализации, ингибитор PTEN представляет собой двуцепочечную миРНК, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11. Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит последовательность, комплементарную фрагменту нуклеиновой кислоты, кодирующей белок PTEN, и ингибирует его экспрессию. Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит последовательность, комплементарную фрагменту нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 1. Таким образом, согласно одному варианту реализации, внеклеточные везикулы загружены миРНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 и 3 или SEQ ID NO: 4 и 5. Согласно некоторым вариантам реализации, выделенные внеклеточные везикулы загружены миРНК, содержащей нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 10 и 11. Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит последовательность, являющуюся вариантом нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10, 11, 2, 3, 4 и 5, и характеризующуюся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с исходной последовательностью. Согласно еще одному варианту реализации, выделенные внеклеточные везикулы загружены кшРНК, содержащей нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 10 и 11. Согласно одному варианту реализации, кшРНК содержит нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 2 и 3. Согласно еще одному варианту реализации, кшРНК содержит нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 4 и 5. Согласно дополнительному варианту реализации, миРНК содержит нуклеиновую кислоту, комплементарную последовательностям SEQ ID NO: 6 или 7. Согласно еще одному варианту реализации, кшРНК содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 8 и 9. Согласно некоторым вариантам реализации, ингибитор-олигонуклеотид, например, миРНК или кшРНК, содержит гидрофобный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации, гидрофобный фрагмент представляет собой стерин, ганглиозид, липид, витамин, жирную кислоту, пептид или их комбинацию. Согласно одному варианту реализации, стерин представляет собой холестерин.

[190] Согласно одному конкретному варианту реализации, в настоящем изобретении предложены выделенные экзосомы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток и загруженные молекулами миРНК, ингибирующими экспрессию PTEN. Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит холестериновый фрагмент, например, конъюгирована с ним. Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 11, 2, 3, 4 и 5, и конъюгирована с холестерином. Согласно еще одному варианту реализации, миРНК содержит нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 10 и 11. Согласно некоторым вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, мишенью которой является SEQ ID NO: 6, конъюгированную с холестерином. Согласно другим вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность, мишенью которой является SEQ ID NO: 7, конъюгированную с холестерином.

[191] Согласно некоторым вариантам реализации, выделенные внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), можно применять для лечения неврологического заболевания, расстройства, повреждения или состояния. Согласно одному из вариантов реализации, неврологическое состояние представляет собой повреждение спинного мозга. Таким образом, согласно одному варианту реализации, в настоящем изобретении предложены внеклеточные везикулы для использования при лечении повреждения спинного мозга, причем указанные мембранные везикулы загружены экзогенным ингибитором фосфатазы и гомолога тензина (PTEN). Согласно конкретному варианту реализации, неврологическое заболевание представляет собой дегенеративное заболевание нервной системы. Согласно одному варианту реализации, дегенеративное заболевание нервной системы выбрано из болезни Паркинсона, эссенциального тремора, болезни Хантингтона, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза, БАС и органического психоза. Согласно одному варианту реализации, заболевание представляет собой расстройство памяти. В одном варианте реализации заболевание представляет собой расстройство психического развития, например, аутизм или шизофрению. Согласно еще одному варианту реализации, заболевание представляет собой поведенческое заболевание, например, шизофрению, синдром дефицита внимания и гиперактивности, аутизм, синдром Туретта, обсессивно-компульсивное расстройство, а также симптомы, ассоциированные с нейроповеденческими аспектами.

[192] Согласно некоторым вариантам реализации, внеклеточные везикулы дополнительно содержат хондроитиназу ABC или кодирующий ее полинуклеотид. Согласно еще одному варианту реализации, EV, загруженные ингибитором PTEN, дополнительно содержат хондроитиназу ABC или кодирующий ее полинуклеотид.

[193] Согласно некоторым вариантам реализации, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая изолированные внеклеточные везикулы согласно любому из вышеуказанных вариантов реализации. Согласно некоторым вариантам реализации, фармацевтическая композиция предназначена для применения при лечении неврологического заболевания, расстройства, повреждения или состояния. Согласно одному варианту реализации, фармацевтическая композиция предназначена для применения при лечении повреждения спинного мозга.

[194] Согласно некоторым вариантам реализации, мембранные везикулы представляют собой липосомы. Согласно одному варианту реализации, липосомы представляют собой SUV. Согласно еще одному варианту реализации, липосомы представляют собой MLV. Согласно одному варианту реализации, липосомы содержат липосомообразующий липид, выбранный из группы, состоящей из фосфатидилхолина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина, фосфатидилэтаноламина, 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилхолина (POPC), сфингофосфолипидов, дистеароильных соединений и любой их комбинации. Согласно еще одному варианту реализации липосомообразующий липид представляет собой фосфатидилхолин. Согласно одному варианту реализации, фосфатидилхолин представляет собой гидрогенизированный фосфатидилхолин сои (HSPC). Согласно другим вариантам реализации, фосфатидилэтаноламин представляет собой 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DSPE), и указанное дистеароильное соединение представляет собой дистеароилгликоль (DSG) или дистеароиловый эфир оксикарбонил-3-амино-1,2-пропандиола (DS). В соответствии с еще одним вариантом реализации, липосомы содержат молекулу стабилизирующего полимера, например, полиалкиловый эфир, полисиаловую кислоту, полимолочную кислоту и полигликолевую кислоту. Согласно одному варианту реализации, липосомы содержат ПЭГ. Согласно некоторым вариантам реализации, липосомы дополнительно содержат холестерин.

[195] Согласно еще одному аспекту, в настоящем изобретении предложен способ получения внеклеточных везикул, загруженных экзогенным ингибитором PTEN, согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации, внеклеточные везикулы представляют собой экзосомы. Согласно еще одному варианту реализации, EV представляют собой микровезикулы. Согласно дополнительному варианту реализации, EV представляют собой комбинацию микровезикул и экзосом. Экзосомы и микровезикулы соответствуют определениям, приведенным в любом из вышеприведенных вариантов реализации и аспектов. Согласно некоторым вариантам реализации, EV получают из клеток, экспрессирующих мезенхимальные маркеры. Согласно одному варианту реализации, клетки, экспрессирующие мезенхимальные маркеры, выбраны из мезенхимальных стволовых клеток, стволовых клеток слизистой оболочки полости рта и обонятельных обкладочных клеток. Согласно еще одному варианту реализации, EV получают из клеток нервного гребня, например, из клеток краниального нервного гребня. Согласно одному варианту реализации, EV, например, экзосомы, происходят из мезенхимальных стволовых клеток. Согласно некоторым вариантам реализации, MSC выделяют из ткани, выбранной из костного мозга, жировой ткани, пульпы зуба, слизистой оболочки полости рта, периферической крови и амниотической жидкости. Согласно некоторым вариантам реализации, мезенхимальные стволовые клетки обычно экспрессируют следующие маркеры: CD105, CD166, CD29, CD90 и CD73, и не экспрессируют CD34, CD45 и CD133.

[196] Способ может включать выделение EV из кондиционированной среды мезенхимальных стволовых клеток (MSC-CM) или из кондиционированной среды клеток нервного гребня (NCC-CM). EV можно выделять, например, путем отделения от несвязанных компонентов на основе любого свойства EV. Например, EV можно выделять на основании их молекулярной массы, размера, формы, состава или биологической активности.

[197] Кондиционированную среду можно отфильтровать и/или концентрировать во время, до или после отделения. Например, ее можно отфильтровать через мембрану, например, с ограничением по размеру или молекулярной массе. Ее можно подвергать фильтрации с использованием тангенциального напряжения или ультрафильтрации.

[198] Например, можно использовать фильтрацию с использованием мембраны с подходящим ограничением по молекулярной массе или размеру, как описано в разделе «Анализ молекулярной массы» в другом месте настоящего документе.

[199] Кондиционированную среду, необязательно фильтрованную и/или концентрированную, можно подвергать действию дополнительных средств разделения, например, колоночной хроматографии. Например, можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с различными колонками. Колонки могут представлять собой эксклюзионные колонки или связывающие колонки.

[200] Для отслеживания активности частицы во время фракционирования среды, кондиционированной клетками, можно использовать одно или более из свойств или биологических активностей частицы. Например, для отслеживания частиц можно использовать светорассеяние, показатель преломления, динамическое светорассеяние или детекторы УФ и видимого излучения. Например, для отслеживания активности во время фракционирования можно использовать терапевтическую активность, например, кардиозащитную активность.

[201] В следующих абзацах представлен конкретный неограничивающий пример способа получения EV, например, экзосом, из мезенхимальных стволовых клеток.

[202] EV можно получить из мезенхимальных стволовых клеток путем культивирования мезенхимальных стволовых клеток в среде для их кондиционирования. Среда может содержать DMEM. DMEM может не содержать фенолового красного. В среду можно добавлять инсулин, трансферрин или селенопротеин (ITS) или любую их комбинацию. Она может содержать FGF2. Она может содержать PDGF AB. Концентрация FGF2 может составлять приблизительно 5 нг/мл. Концентрация PDGF AB может составлять приблизительно 5 нг/мл. Среда может содержать глутамин-пенициллин-стрептомицин или -меркаптоэтанол, или любую их комбинацию.

[203] Клетки можно культивировать в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 дней или более, например, в течение 3 дней. Кондиционированную среду можно получать путем отделения клеток от среды. Кондиционированную среду можно центрифугировать, например, при 500 g; ее можно концентрировать посредством фильтрации через мембрану. Мембрана может включать мембрану с ограничением массы > 1000 кДа. Кондиционированную среду можно концентрировать приблизительно в 50 раз или более.

[204] Кондиционированную среду можно подвергать жидкостной хроматографии, например, ВЭЖХ. Кондиционированную среду можно отделить с ограничением по размеру. Можно использовать любую эксклюзионную матрицу, например, сефарозу. В качестве примера, можно использовать колонку TSK Guard SWXL, 6 x 40 мм, или гель TSK G4000 SWXL, 7,8 x 300 мм. Элюирующий буфер может содержать любую физиологическую среду, например, физиологический раствор. Он может содержать 20 мМ фосфатный буфер с 150 мМ NaCl при pH 7,2. Хроматографическую систему можно уравновешивать при скорости потока 0,5 мл/мин. Режим элюирования может быть изократическим. Для отслеживания хода элюирования можно использовать УФ-поглощение при 220 нм. Фракции можно исследовать на предмет динамического светорассеяния (DLS) с использованием детектора квазиупругого свторассеяния (QELS).

[205] Фракции, в которых обнаружено динамическое светорассеяние, можно сохранить. Например, обнаружено, что фракция, полученная вышеописанным общим способом и элюирующаяся с временем удерживания 11-13 минут, например, 12 минут, демонстрирует динамическое светорассеяние. R_h частиц в этом пике составляет приблизительно 45-55 нм. Такие фракции включают EV из мезенхимальных стволовых клеток, например, экзосомы.

[206] Согласно одному варианту реализации, экзогенный ингибитор PTEN является ингибитором экспрессии PTEN. Согласно одному варианту реализации, экзогенный PTEN представляет собой олигонуклеотид для РНК-интерференции. Согласно одному варианту реализации, олигонуклеотид для РНК-интерференции представляет собой миРНК. Согласно еще одному варианту реализации, олигонуклеотид для РНК-интерференции представляет собой кшРНК. Согласно некоторым вариантам реализации, олигонуклеотид для РНКи конъюгирован с гидрофобным фрагментом. Согласно одному варианту реализации, указанный гидрофобный фрагмент выбран из стерина, ганглиозида, липида, витамина, жирной кислоты, пептида и их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации, олигонуклеотид для РНК-интерференции конъюгирован с холестерином. Таким образом, в одном варианте реализации агент для РНКи, например, миРНК, конъюгирован с холестерином.

[207] Следует принимать во внимание, что полинуклеотиды или олигонуклеотиды, например, миРНК или кшРНК, также можно загружать непосредственно в EV. В одном варианте реализации прямую загрузку олигонуклеотида для РНКи в EV выполняют путем электропорации и/или с использованием агентов для трансфекции. В альтернативных вариантах реализации загрузку выполняют в отсутствие электропорации и/или в отсутствие агентов для трансфекции.

[208] Согласно одному варианту реализации, EV инкубируют с ингибитором олигонуклеотидов для РНКи в течение периода времени, достаточного для обеспечения загрузки частиц ингибитором на основе нуклеиновой кислоты. Продолжительность времени, достаточная для загрузки EV грузом ингибитора на основе нуклеиновой кислоты, можно оптимизировать для конкретного типа груза, и, если модификация включает гидрофобную модификацию, типа модификации. Обычно время инкубирования продолжительностью приблизительно 1 час или менее является достаточным для обеспечения эффективной загрузки частиц нуклеиновой кислотой. Во многих случаях гидрофобно модифицированный груз эффективно загружается в экзосомы за очень короткий период времени, например, в течение 5 минут. Соответственно, в некоторых вариантах реализации эффективная загрузка имеет место в течение времени инкубирования продолжительностью 5 минут или менее, например, от 1 до 5 минут. В типичных вариантах реализации эффективная загрузка происходит в течение периода инкубирования продолжительностью 5 минут, 10 минут, 15 минут, 20 минут, 30 минут и т.д. В других вариантах реализации эффективная загрузка может происходить в течение 1 часа, в течение 2 часов, в течение 3 часов, в течение 4 часов, в течение 5 часов, в течение 6 часов, в течение 7 часов, в течение 8 часов, в течение 9 часов, в течение 10 часов, в течение 12 часов, в течение 24 часов и т.д.

[209] Нагрузка EV олигонуклеотидами не сильно зависит от температуры. В типичных вариантах реализации загрузка экзосом происходит при температуре, равной или приблизительно равной 37°C. В других вариантах реализации EV (например, экзосомы) можно загружать при комнатной температуре или температуре, приблизительно равной комнатной. В других вариантах реализации экзосомы можно загружать при температуре, равной или приблизительно равной 4°C.

[210] Согласно некоторым вариантам реализации, EV можно загружать без использования ультрацентрифугирования. Согласно другому варианту реализации, загрузка дополнительно включает ультрацентрифугирование. Согласно некоторым вариантам реализации, способ получения дополнительно включает стадию очистки или выделения загруженных EV. Согласно одному варианту реализации, выделение осуществляют посредством центрифугирования, например, ультрацентрифугирования. Согласно другому варианту реализации, выделение осуществляют путем фильтрации. Согласно одному варианту реализации, соотношение EV к остаточным родительским клеткам после очистки по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 8 или 10 раз выше, или, в некоторых предпочтительных вариантах реализации, по меньшей мере в 50, 100 или 1000 раз выше, чем в исходном материале. Согласно некоторым вариантам реализации, EV представляют собой бесклеточные EV.

[211] Согласно некоторым вариантам реализации, в настоящем изобретении предложен способ получения EV, например, экзосом, причем указанный способ включает инкубирование EV с олигонуклеотидами для РНКи, например, миРНК или кшРНК, конъюгированными с холестерином, в течение 0,5-5 часов при температуре от 25 до 42°C.

[212] Согласно одному варианту реализации, способ дополнительно включает этап выделения загруженных EV с помощью центрифугирования, например, ультрацентрифугирования. Согласно некоторым вариантам реализации, вместо холестерина можно использовать другой гидрофобный фрагмент. Согласно одному варианту реализации, олигонуклеотид для РНКи представляет собой миРНК. Согласно одному варианту реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2. Согласно еще одному варианту реализации миРНК содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3. Согласно определенному варианту реализации миРНК содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4. Согласно еще одному варианту реализации миРНК содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5. Согласно некоторым вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10. Согласно другим вариантам реализации, миРНК содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11. Согласно дополнительному варианту реализации, миРНК комплементарна нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6. Согласно одному варианту реализации, мишенью миРНК является нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 6. Согласно некоторым вариантам реализации, олигонуклеотид для РНКи представляет собой кшРНК. Согласно одному варианту реализации, миРНК или кшРНК содержат нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 2 и 3. Согласно еще одному варианту реализации, миРНК или кшРНК содержат нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 4 и 5. Согласно дополнительному варианту реализации, миРНК или кшРНК содержат нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 10 и 11. Согласно дополнительному варианту реализации, кшРНК содержит нуклеотидные последовательности, комплементарные SEQ ID NO: 6 или 7. Согласно еще одному варианту реализации, кшРНК содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 8 и 9. Согласно некоторым вариантам реализации, кшРНК или миРНК содержат последовательность, комплементарную фрагменту нуклеиновой кислоты, кодирующей белок PTEN, и ингибируют его экспрессию. Согласно одному варианту реализации, PTEN содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

[213] В некоторых вариантах реализации более 50% гидрофобно модифицированного олигонуклеотидного груза загружают в экзосомы с использованием способов, описанных в настоящем документе. Соответственно, в некоторых вариантах реализации гидрофобно модифицированный олигонуклеотидный груз загружают в экзосомы с эффективностью от 5 до 40%. Соответственно, в одном варианте реализации гидрофобно модифицированный олигонуклеотидный груз загружают в экзосомы с эффективностью от 10 до 35%, от 15 до 30% или от 20 до 25%. Например, гидрофобно модифицированный олигонуклеотидный груз загружают в экзосомы с эффективностью 5% или более, 10% или более, 15% или более, 20% или более, 25% или более, 30% или более, 35% или более, 40% или более, или 50% или более. Способы, описанные в настоящем документе, приводят к включению гидрофобно модифицированного олигонуклеотида во все или почти все экзосомы, подвергаемые обработке. Например, по меньшей мере 80% экзосом, инкубированных с гидрофобно модифицированным олигонуклеотидом, загружены олигонуклеотидом. В некоторых вариантах реализации гидрофобно модифицированный олигонуклеотидный груз включен по меньшей мере в 90% экзосом, инкубированных с олигонуклеотидом. Таким образом, можно получить популяции экзосом, в которых по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97 %, по меньшей мере 98% или более экзосом загружены олигонуклеотидным грузом. В одном варианте реализации по меньшей мере 99% экзосом загружены гидрофобно модифицированным олигонуклеотидом.

[214] EV (например, экзосомы) можно загрузить более чем 500 молекулами олигонуклеотидов на частицу (например, экзосому), например, по меньшей мере 500, по меньшей мере 600, по меньшей мере 700, по меньшей мере 800, по меньшей мере 900, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 1200, по меньшей мере 1500, по меньшей мере 2000, по меньшей мере 2500, по меньшей мере 3000 или более олигонуклеотидами на экзосому. В одном варианте реализации экзосомы содержат в среднем приблизительно 500-3000 олигонуклеотидов на экзосому. В еще одном варианте реализации экзосомы содержат в среднем приблизительно 500-1000 олигонуклеотидов на экзосому. В еще одном варианте реализации экзосомы содержат в среднем приблизительно 1000-1500 олигонуклеотидов на экзосому. В еще одном варианте реализации экзосомы содержат в среднем приблизительно 1000-2000 олигонуклеотидов на экзосому. В еще одном варианте реализации экзосомы содержат в среднем приблизительно 1000-3000 олигонуклеотидов на экзосому. В еще одном варианте реализации экзосомы содержат в среднем приблизительно 3000 олигонуклеотидов на экзосому. Количество гидрофобно модифицированного олигонуклеотидного груза, которое можно загрузить в экзосомы, позволяет получать экзосомы, в которых гидрофобно модифицированный олигонуклеотидный груз занимает значительную часть мембраны экзосомы. Например, можно получить EV (например, экзосомы), в которых олигонуклеотидный груз занимает приблизительно 1-10% площади поверхности частицы, например, приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или 10% площади поверхности частицы. Согласно некоторым вариантам реализации, олигонуклеотидный груз представляет собой олигонуклеотид для РНКи, например, миРНК или кшРНК. Согласно другим вариантам реализации, гидрофобно модифицированный олигонуклеотид представляет собой олигонуклеотид для РНКи, конъюгированный с гидрофобным фрагментом, например, с холестериновым фрагментом.

[215] Согласно некоторым вариантам реализации, липидные двухслойные фосфолипидные мембранные везикулы представляют собой липосомы. Согласно таким вариантам реализации липосомы загружают тем же способом, который описан для EV.

[216] Согласно другому варианту реализации, EV, загруженные РНКи-ингибитором PTEN, можно получить из клеток, искусственно загруженных олигонуклеотидом для РНКи или полинуклеотидом, кодирующим и способным экспрессировать или генерировать указанный РНКи-ингибитор в клетке. В этом случае полинуклеотидный/олигонуклеотидный агент лигируют в нуклеотидный конструкт под контролем цис-действующего регуляторного элемента (например, промотора), способного управлять экспрессией агента конститутивным или индуцибельным образом.

[217] Доставку нуклеотидного агента можно выполнять с использованием подходящего носителя/способа доставки гена (трансфекция, трансдукция и т.д.). Необязательно используют соответствующую систему экспрессии. Примеры подходящих конструктов включают pcDNA3, pcDNA3.1 (+/-), pGL3, PzeoSV2 (+/-), pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, каждый из которых доступен для приобретения в Invitrogen Co, но не ограничиваются ими.

[218] Экспрессирующий конструкт также может представлять собой вирус. Примеры вирусных конструктов включают аденовирусные векторы, ретровирусные векторы, вирусные векторы на основе вируса коровьей оспы, аденоассоциированные вирусные векторы, вирусные векторы на основе вируса полиомы, альфавирусные векторы, рабдовирусные векторы, лентивирусные векторы и герпесвирусные векторы, но не ограничиваются ими.

[219] Вирусный конструкт, например, ретровирусный конструкт, содержит по меньшей мере один транскрипционный промотор/энхансер или локус-определяющий элемент(ы), или другие элементы для контроля экспрессии гена другими способами, например, посредством альтернативного сплайсинга, экспорта ядерной РНК или посттранскрипционной модификации матричной РНК. Такие векторные конструкты также содержат сигнал упаковки, длинные концевые повторы (LTR) или их фрагменты, а также сайты связывания праймеров с положительной и отрицательной цепью, подходящие для используемого вируса, если они уже не присутствуют в вирусном конструкте. Кроме того, такой конструкт обычно содержит сигнальную последовательность для секреции пептида из клетки-хозяина, в которую он помещен. Сигнальная последовательность для этой цели предпочтительно представляет собой сигнальную последовательность млекопитающего или сигнальную последовательность вариантов пептида согласно настоящему изобретению. Конструкт также может необязательно включать сигнал, контролирующий полиаденилирование, а также один или более из сайтов рестрикции и последовательность терминации трансляции. В качестве примера, такие конструкты обычно содержат 5'-LTR, сайт связывания тРНК, сигнал упаковки, сайт начала синтеза второй цепи ДНК и 3'-LTR или их фрагменты.

[220] Доза вируса для инфекции предпочтительно составляет не менее 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵ или более БОЕ или вирусных частиц.

[221] Двуцепочечную РНК можно синтезировать путем добавления двух противоположных промоторов к концам генных сегментов, причем один промотор помещают непосредственно в 5'-положении по отношению к гену, а противоположный промотор помещают непосредственно в 3'-положении по отношению к сегменту гена. Затем дцРНК можно транскрибировать с помощью соответствующей полимеразы.

[222] В другом варианте реализации полинуклеотидные или олигонуклеотидные агенты можно инкубировать с клетками в культуре, что приводит к эффективному захвату нуклеиновой кислоты клетками. Для такого варианта реализации предпочтительно, чтобы агенты нуклеиновой кислоты были гидрофобно модифицированы, как дополнительно описано ниже в настоящем документе.

[223] Независимо от способа, используемого для загрузки частиц нуклеотидными агентами, описанными в настоящем документе, клетки затем инкубируют в течение времени, достаточного для продукции EV, например, экзосом. Экзосомы, выделенные из культуральной среды, содержат экзосомы, загруженные молекулой нуклеиновой кислоты, поглощенной, продуцируемой или экспрессируемой клетками. Соответственно, в одном варианте реализации предложен способ загрузки EV олигонуклеотидным грузом, включающий инкубирование клеток, способных продуцировать EV (например, экзосомы), с олигонуклеотидом в течение времени, достаточного для интернализации олигонуклеотида клетками, культивирование клетки в течение времени, достаточного для секреции экзосом, и выделения экзосом, загруженных олигонуклеотидом, из культуральной среды.

[224] Согласно некоторым вариантам реализации, в настоящем изобретении предложены выделенные внеклеточные везикулы, полученные согласно любому из вышеуказанных вариантов реализации. Согласно еще одному варианту реализации, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая внеклеточные везикулы, полученные в соответствии с любым из вышеуказанных вариантов реализации. Согласно некоторым вариантам реализации, такие выделенные внеклеточные везикулы и фармацевтические композиции можно применять при лечении неврологических заболеваний или состояний, например, повреждения спинного мозга.

[225] Частицы или фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению по меньшей мере в некоторых вариантах реализации можно заранее упаковать в лекарственные формы в виде шприца, готового к применению. В составе маркировки шприца можно указать название частиц и их источник. Маркировка может также содержать информацию, относящуюся к функции частиц. Шприц можно упаковать в упаковку, в составе маркировки которой также указана информация о частицах.

[226] Термины «содержащий», «включает(ют)», «имеющий», «имеет» и «содержит(ат)» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и имеют значение «по меньшей мере частично состоящий из». При интерпретации каждого утверждения в настоящем документе, которое включает термин «содержащий», могут также присутствовать другие признаки, кроме тех, которым предшествует этот термин. Родственные термины, например, «содержать» и «содержит», следует интерпретировать таким же образом. Термины «иметь», «имеет», «имеющий» и «содержащий» могут также включать значения «состоящий из» и «состоящий по существу из» и могут быть заменены этими терминами. Термин «состоящий из» исключает любой специально не обозначенный или не перечисленный компонент, этап или процедуру. Термин «состоящий по существу из» означает, что композиция или компонент могут содержать дополнительные ингредиенты, но только если эти дополнительные ингредиенты не приводят к существенному изменению основных и новых характеристик заявленных композиций или способов.

[227] В настоящем документе термин «приблизительно», употребляемый по отношению к измеряемой величине, например, количеству, времени и т.п., означает, что он включает изменчивость в диапазоне +/- 10% или +/- 5%, +/- 1% или даже +/- 0,1% от указанного значения.

[228] В настоящем документе формы единственного числа включают формы множественного числа, если иное явным образом не следует из контекста. Например, термин «соединение» или «по меньшей мере одно соединение» может включать множество соединений, включая их смеси.

[229] В настоящей заявке различные варианты реализации настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона приведено исключительно для удобства и краткости и не должно рассматриваться как жесткое ограничение сущности изобретения. Соответственно, следует считать, что описание диапазона включает все возможные конкретные поддиапазоны, а также отдельные численные значения в этом диапазоне. Например, описание диапазона, например, от 1 до 6, следует рассматривать как описание конкретных поддиапазонов, например, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3. до 6 и т.д., а также отдельных чисел в этом диапазоне, например, 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Это не зависит от широты диапазона.

[230] При любом указании численного диапазона в настоящем документе подразумевается, что он включает любое упомянутое число (дробное или целое) в пределах указанного диапазона. Фразы «варьирует между» первым указанным числом и вторым указанным числом и «находится в диапазоне от» первого указанного числа «до» второго указанного числа используются в настоящем документе взаимозаменяемо и предназначены для включения первого и второго указанных чисел, а также всех дробных и целых чисел между ними.

[231] В настоящем документе термин «способ» относится к способам, средствам, методикам и процедурам для выполнения заданной задачи, включая способы, средства, методики и процедуры, известные либо поддающиеся разработке на основе известных способов, средств, методик и процедур практикующими химиками, фармакологами, биологами, биохимиками и медицинскими специалистами, но не ограничиваясь ими.

[232] Следует понимать, что определенные особенности изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов реализации, также могут быть представлены в комбинации в одном варианте реализации. И наоборот, различные особенности изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта реализации, также могут быть представлены отдельно или в любой подходящей субкомбинации или в любом другом подходящем описанном варианте реализации изобретения. Определенные особенности, описанные в контексте различных вариантов реализации, не следует рассматривать как важные особенности этих вариантов реализации, если только вариант реализации не действует без этих элементов.

[233] Различные варианты реализации и аспекты настоящего изобретения, описанные выше и в приведенном ниже разделе формулы изобретения, находят экспериментальную поддержку в следующих примерах.

[234] Согласно еще одному аспекту, в настоящем изобретении предложены экзосомы, полученные из клетки нервного гребня, для применения при лечении повреждения спинного мозга.

ПРИМЕРЫ

[235] В данном разделе приведены ссылки на следующие примеры, которые вместе с вышеприведенным описанием иллюстрируют некоторые варианты реализации изобретения неограничивающим образом.

[236] Как правило, используемая в настоящем документе номенклатура и лабораторные процедуры включают молекулярные, биохимические, микробиологические методики и методики технологии рекомбинантных ДНК. Такие методики подробно описаны в литературе.

[237] Материалы и способы

[238] Получение мезенхимальных стволовых клеток

[239] MSC костного мозга человек приобрели в Lonza (Базель, Швейцария). Клетки культивировали и размножали, как описано ранее. Перед сбором экзосом клетки культивировали в тромбоцитах, не содержащих экзосом, и через 3 дня собирали среду. MSC-exo метили PKH26 (Sigma) в течение 5 минут и промывали с помощью ультрацентрифугирования (100000 g, 2 часа, 4°С). Осадок ресуспендировали в 200 мкл PBS.

[240] Протокол очистки экзосом

[241] MSC человека приобрели в Lonza (Базель, Швейцария). Клетки культивировали и размножали. Клетки культивировали с лизатом тромбоцитов, не содержащим экзосом (Rabin Medical Center, Израиль), и через 3 дня собирали среду. Экзосомы очищали с использованием стандартного протокола дифференциального центрифугирования, который включал выделение культуральной жидкости и центрифугирование в течение 10 мин при 300 g. Супернатант собирали и центрифугировали в течение 10 минут при 2000 g, а затем повторно центрифугировали в течение 30 минут при 10000 g. Затем супернатант пропускали через фильтр с размером пор 0,22 мкм и центрифугировали в течение 70 мин при 100000 g. Осадок, содержащий экзосомы и белки, промывали PBS, а затем центрифугировали в течение 70 мин при 100000 g. Осадок ресуспендировали в 200 мкл стерильного PBS. Все этапы центрифугирования выполняли при 4°C. Характеристики экзосом исследовали с помощью технологии NanoSight, электронной микроскопии и вестерн-блоттинга, используя калнексин в качестве отрицательного маркера и CD9 и CD81 в качестве положительного маркера.

[242] Флуоресцентное мечение экзосом из мезенхимальных стволовых клеток (MSC-Exo)

[243] MSC-Exo метили PKH26/PKH67 (Sigma) в течение 5 минут, а затем промывали PBS с использованием ультрацентрифугирования (100000 g, 2 часа, 4°C). Осадок ресуспендировали в 200 мкл PBS. Для экспериментов с PTX MSC-Exo суспендировали с 5 мкл PTX в течение 10 минут при 37°C, затем метили PKH26 и центрифугировали при 100000 g в течение 2 ч. MSC-Exo + PKH67 и MSC-Exo + PTX + PKH26 совместно вводили одной и той же крысе (n = 3).

[244] Синтез и конъюгирование наночастиц золота (GNP)

[245] К 30 мл DDW добавляли смесь 3,75 мл линолевой кислоты (18%), олеиновой кислоты (65%), пальмитиновой кислоты (16%) и этанола (1%), 200 мг NaOH и 15 мл этанола. Раствор перемешивали в течение 5 мин. Затем при перемешивании добавляли пятьдесят миллиграммов HAuCl₄, затем 5 мл аскорбиновой кислоты (0,05 М) и перемешивали в течение еще одной минуты. Затем к раствору GNP добавляли раствор ПЭГ7 (2,26 × 10^-3 г) и перемешивали смесь в течение 1 часа. Затем pH доводили до 9 с использованием NaOH и перемешивали раствор в течение еще одного часа. После добавления 80 мл н-гексана раствор перемешивали в течение 1 часа. Затем pH полученной смеси доводили до 7, используя раствор HCl (37%). Смесь помещали в воронку для разделения фаз (органической и водной). Водную фазу выпаривали в вакууме. Затем к раствору добавляли избыток карбодиимида (1,87 × 10^-3 г) и N-гидроксисукцинимид (Thermo Fisher Scientific, Inc., Рокфорд, штат Иллинойс, США) (2,12 × 10^-3 г) с последующим добавлением 2GF (Sigma-Aldrich, Israel Ltd.) (1,75 × 10^-3 г). В общей сложности 2,8 × 10¹⁰ экзосом (200 мкл экзосом в 1 мл физиологического раствора) инкубировали при 37°C в течение 3 ч с GNP, покрытыми глюкозой (35 мг/мл, 100 мкл). Затем экзосомы центрифугировали в течение 2 ч (100000 g, 4°C).

[246] Исследование характеристик GNP

[247] Для измерения размера и формы GNP использовали трансмиссионную электронную микроскопию (JEM-1400, JEOL), а дальнейшее исследование их характеристик выполняли с помощью спектроскопии в УФ и видимом спектре (UV-1650 PC; Shimadzu Corporation, Киото, Япония), ζ-потенциала (ZetaSizer 3000HS; Malvern Instruments, Малверн, Великобритания) и динамического светорассеяния.

[248] Количественные оценки GNP

[249] Для определения количества золота в нескольких основных органах (сердце, легких, почках и селезенке) использовали пламенную атомно-абсорбционную спектроскопию (SpectrAA 140; Agilent Technologies, Санта-Клара, штат Калифорния, США). Иссеченные ткани растворяли в 1 мл царской водки (смеси азотной и соляной кислот в соотношении 1:3), давали возможность испариться, а затем разбавляли до общего объема 4 мл. После фильтрации образцов через шприцевые фильтры с размером пор 0,45 нм определяли концентрацию золота по калибровочным кривым, построенным с использованием раствора с известными концентрациями золота. Для определения количества золота в головном мозге и очагах поражений в спинном мозге использовали спектрометрию с индуктивно связанной плазмой (ICP). Свежие ткани экстрагировали и сжигали при 550°C в течение 5 ч. Затем к расплавленным тканям добавляли 5 мл 1% HNO₃ и фильтровали через фильтры с размером пор 0,45 мкм. Концентрации золота в образцах определяли по корреляции со стандартной кривой для золота.

[250] Загрузка экзосом

[251] Экзосомы (40 мкл, приблизительно 10¹⁰ экзосом) загружали 0,1 нмоль cy3-MAPK-миРНК (Advirna Company) в пробирке EPPENDORF® и инкубировали в течение 1-3 часов при 37°C. Затем суспензию подвергали анализу Nanosight. Соотношение концентраций флуоресцирующих и нефлуоресцирующих экзосом определяли как эффективность загрузки.

[252] Для экспериментов in vivo 40 мкл экзосом загружали 0,1 нмоль PTEN-миРНК (Advirna Company) в течение 2-3 часов при 37°C перед интраназальным введением крысам с ПСМ. Экзосомы, загруженные PTEN-миРНК, назывались ExoPTEN.

[253] Разрастание аксонов в нейронах ганглиев задних корешков (DRG)

[254] Ганглии задних корешков на уровне грудного и поясничного отдела позвоночника взрослых крыс Sprague-Dawley (200-250 г) препарировали и погружали в ледяной сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS). DRG промывали HBSS, переносили в небольшую чашку, содержащую 4 мл 2,5 мг/мл коллагеназы II типа (Worthington), разрезали на мелкие кусочки с помощью скальпеля и инкубировали при 37°C в течение 40 мин. Раствор центрифугировали при 200 g в течение 3 мин для удаления коллагеназы, ресуспендировали в 2 мл культуральной среды, содержащей культуральную среду F12 (Gibco, 11765), 10% фетальную бычью сыворотку (Gibco), 100 Ед/мл пенициллина (Biological Industries, Бейт-ха-Эмек, Израиль), 100 мкг/мл стрептомицина, измельчая ~20 раз путем пропускания через наконечники для пипеток на 1 мл. Клетки высевали на 15 мм покровное стекло, предварительно покрытое ламинином (Sigma, L2020), внутри 12-луночного планшета при плотности 5 × 10⁴ на лунку на 5 часов. Затем среду DRG заменяли на среду, содержащую обычную среду DRG, 40 мкл экзосом, 0,1 нмоль неспецифичной контрольной (NTC) миРНК, 0,1 нмоль миРНК PTEN или 0,1 нмоль миРНК PTEN, загруженной в 40 мкл экзосом.

[255] Последовательность PTEN, являвшаяся мишенью миРНК, представлена в SEQ ID NO: 6 (5'-GAGTTCTTCCACAAACAGAA-3'). Для ингибирования экспрессии PTEN использовали двуцепочечную миРНК, содержащую одну цепь, содержащую нуклеотидную последовательность 5'-GAGUUCUUCCACAAACAGAA-3' (SEQ ID NO: 10), конъюгированную с холестерином, и нуклеотидную последовательность 5'-UUCUGUUUGUGGAAGAACUC-3' (SEQ ID NO: 11).

[256] Через 24 часа после посева клетки фиксировали в течение 10 минут 4% параформальдегидом (PFA), трижды промывали по 5 минут PBS, пермеабилизировали в течение 10 минут 0,3% Triton X-100, промывали три раза по 5 минут PBS, блокировали в течение 2 часов в 5% сыворотке КРС и инкубировали в течение ночи с антителом мыши против тубулина (Promega, 1:500) в 5% сыворотке КРС при 4°C. Затем образцы инкубировали с антителом осла против антител мыши, меченым Alexa488 (Invitrogen, 1:800) и DAPI (1:1000) в течение 3 ч. После трех промывок PBS образцы устанавливали и исследовали с помощью конфокальной микроскопии (LSM700). Изображения обрабатывали с использованием программного обеспечения IMARIS (версия 8.20) с целью количественной оценки уровня ветвей аксонов, максимального уровня ветвей, количества аксонов, общей длины аксонов. Параметры задавали следующим образом и применяли к каждому изображению: максимальный диаметр 60 мкм, минимальный диаметр 0,6 мкм, порог начальной точки от 10 мкм до 60 мкм, порог исходной точки 10 мкм, удаление исходных точек вокруг исходных точек с диаметром сферической области 24 мкм, максимальная допустимая длина зазора 60 мкм.

[257] КТ головного и спинного мозга ex vivo:

[258] Образцы головного и спинного мозга собирали и помещали в 4% параформальдегид на 3 дня для фиксации, затем пропитывали неионогенным иодсодержащим контрастным веществом (йопамидолом, Bayer Schering Pharma, Япония) в концентрации 150 мг/мл, разбавленным 7,5% параформальдегидом, при 4°C в течение 7 дней, с целью различения серого и белого вещества. Перед КТ-визуализацией образцы вынимали из раствора, промокали насухо и помещали в держатель образцов для визуализации. Держатель образцов заклеивали пластмассовой пленкой для предотвращения обезвоживания. Микро-КТ-сканирование образцов ex vivo выполняли с использованием микро-КТ-сканера (Skyscan High Resolution Model 1176) с номинальным разрешением 35 мкм, алюминиевым фильтром 0,2 мм и напряжением трубки 45 кВ. Реконструкцию выполняли с помощью модифицированного алгоритма Фельдкампа с использованием программного обеспечения SkyScanNRecon и ускорения за счет GPU. Использовали устранение кольцевых артефактов, сглаживание по Гауссу (3%) и поправку на усиление луча (25%). Трехмерные (3D) изображения с объемной визуализацией генерировали с использованием функции передачи RGBA в программном обеспечении SkyScan CT-Volume («CTVol») и SkyScan CT-Voxel («CTVox»).

[259] Иммунофлуоресцентный анализ

[260] Спинной мозг рассекали, фиксировали в 4% PFA в течение ночи, обрабатывали криопротектором (30% раствором сахарозы) в течение ночи, помещали в композит с оптимальной температурой резки (OCT) и делали продольные срезы (20 мкм) с использованием криостата (Leica CM1850, Германия). Срезы пермеаблизировали в 0,5% растворе Tween, блокировали 5% сывороткой КРС, а затем инкубировали с антителом кролика против тубулина (Abcam, 1:500), антителом кролика против GFAP (1:1000, Millipore), антителом мыши против CD11b (1:500, BioRad) или антителом мыши против CD31 (1:50, BD) в течение ночи при 4°C. Затем срезы инкубировали с антителом козы против антител кролика, меченым Alexa647 (Invitrogen, 1:800) и DAPI (1:1000) в течение 3 часов, накрывали покровными стеклами и визуализировали с помощью конфокального микроскопа (LSM700).

[261] Модель повреждения спинного мозга

[262] Все эксперименты на животных выполняли в строгом соответствии с протоколами, утвержденными технологическим институтом Technion-Israel. Рандомизацию животных выполнял экспериментатор, не знающий о лечении. Взрослых самок крыс Sprague-Dawley анестезировали смесью ксилазина (10-15 мг/кг) и кетамина (60-90 мг/кг) и поддерживающей дозой 1-2% изофлурана (Harvard Apparatus, США) во время операции. После ламинэктомии на уровне 9-11 грудных позвонков спинной мозг полностью рассекали на уровне Т10 с помощью микроножниц (Kent Scientific, США). Ростральную и каудальную культи приподнимали, чтобы обеспечить полное рассечение, и в образовавшуюся щель круговым движением вводили крючок (Kent Scientific, США) с целью подтверждения отсутствия оставшихся волокон в нижней части позвоночного канала. Группы, оцениваемые в данном исследовании, обозначали как "контрольное рассечение" (n = 15), "интраназальное введение контрольных экзосомы" (n = 10), "интраназальное введение ExoPTEN" (n = 7), "внутриочаговое введение PTEN-миРНК" (n = 3) и "внутриочаговое введение ExoPTEN" (n = 4). Затем мышечные слои и кожу зашивали, и крыс помещали в инкубационные камеры с регулируемой температурой. Для интраназальной обработки крысам интраназально вводили 40 мкл физиологического раствора, 40 мкл экзосом или 40 мкл ExoPTEN через 2-3 часа после операции и каждые 24 часа в течение 5 дней. Для внутриочаговой обработки крысам вводили 40 мкл PTEN-миРНК (0,1 нмоль) или 40 мкл ExoPTEN однократно при нанесении повреждения спинного мозга. Массаж мочевого пузыря выполняли два раза в день до восстановления функции мочевого пузыря. Антибиотики (цефазолин, 25 мг/кг, два раза в день) вводили ежедневно в течение 1 недели. Бупренорфин (Bayer) вводили в дозе 0,01-0,05 мг/кг до операции и через 3 дня после нее. Циклоспорин (10 мг/кг/сут) (Novartis) вводили всем крысам в течение 1 недели.

[263] Анализ поведения

[264] Восстановление двигательных функций оценивал экспериментатор, не знавший о лечении, с использованием способа на основе шкалы двигательных функций Бассо, Битти и Бреснахана (BBB). Измерения выполняли через 2-3 дня после имплантации, а затем один раз в 7 дней. Все измерения выполняли в одно и то же время дня во избежание циркадной изменчивости. Исходный уровень BBB задавали как значение, зарегистрированное при первом анализе после операции. Еженедельная оценка представляла собой минимальную оценку, полученной в течение каждой календарной недели. Восстановление чувствительности оценивали с помощью теста нитей фон Фрея. Нити (Bioseb) с градиентом изгибающих сил прикладывали к лапам для стимуляции ноцицептивных реакций (быстрое отдергивание лапы от раздражителя). Пороговое значение отмены задавали как минимальное усилие, вызывающее положительную реакцию по меньшей мере в 2 из 3 тестов с интервалом не менее 30 с между тестами.

[265] МРТ

[266] МРТ выполняли с помощью сканера с индукцией 9,4 Тл (Bruker Biospec, Эттлинген, Германия) с использованием цилиндрической объемной катушки (внутренний диаметр 86 мм) для возбуждения сигнала и одноканальной поверхностной катушки (диаметром 20 мм) для приема сигнала. Животные находились под наркозом (0,5-1,5% изофлурана) и получали кислород (0,5 л/мин). Во время визуализации контролировали дыхание (Small Animal Instruments, Stony Brook, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США) и поддерживали температуру тела с помощью термостатируемой циркулирующей горячей воды. Перед визуализацией DTI получали сагиттальные и аксиальные Т2-взвешенные анатомические сканы с использованием последовательности RARE для определения геометрии среза скана DTI. Использовали следующие параметры регистрации RARE: толщина 0,8 мм, поле зрения = 3x3 см, размер матрицы = 192x192, (пространственное разрешение = 156x156 мкм²), время повторения/эхо (TR/TE) = 1200/16,22 мс, 4 средних значения. Визуализацию DTI выполняли с использованием последовательности EPI-DTI со следующими параметрами: 30 неколлинеарных направлений градиента, 3 изображения A₀, b = 1000 с/мм², дифф. продолжительность (δ) = 2,6, дифф. разделение (Δ) = 11, 2 средних значения, толщина 0,8 мм, поле зрения = 3x3 см, размер матрицы = 192x192, (пространственное разрешение = 156x156 мкм²). Расчеты DTI и отслеживание волокон выполняли с использованием программного обеспечения ExploreDTI (Leemans et al., 2009). Полученные тензоры спектрально раскладывали по их собственным компонентам. Собственные значения использовали для расчета карт фракционной анизотропии (ФА). Исследуемые области (ИО) спинного мозга (белое и серое вещество) вручную сегментировали в каждом срезе. Трактографию применяли с использованием детерминированного (плавного) отслеживания волокна, заканчивающегося в вокселях с ФА ниже 0,2 или после изменения ориентации тракта на угол более 30° (Basser et al. 2000), с шагом 0,078 мм и длиной волокна 0,2-100 мм. Волокна, прошедшие через вручную выбранные исследуемые области, наносили на график в виде направлений.

[267] Электрофизиология

[268] На 8 неделе выполняли электрофизиологическое исследование для регистрации распространения нейронного сигнала через очаг поражения. После анестезии кетамином/ксилазином крыс помещали в стереотаксический аппарат и делали разрез по средней линии на коже головы. Обнажали череп и имплантировали два винтовых электрода для электростимуляции на 2 мм справа от средней линии, на уровне -1,0 мм и +4,0 мм кпереди и сзади от брегмы, соответственно. Винтовые электроды подключали к выходным клеммам стимулятора. Обнажали седалищный нерв в задней части ноги и вставляли два крючковых электрода из серебряной проволоки. Другой провод вставляли в подушечку ноги и использовали в качестве заземляющего электрода. Усиленные сигналы подвергали полосовой фильтрации от 0,1 до 3 кГц (широкополосный предусилитель 7P511 AC с предусилителем мощности 7DA, Grass Technologies, Уорик, штат Род-Айленд, США), оцифровывали (аналого-цифровой преобразователь NI USB-6341, National Instruments), регистрировали при 10 кГц и хранили на персональном компьютере с программным пакетом WinWCP (любезно предоставленным д-ром John Dempster, Стратклайдский университет, Великобритания). Интенсивность стимуляции выбирали в соответствии с сокращением задних конечностей и появлением надежного суммарного потенциала действия седалищного нерва (CAP) у первого животного и поддерживали на протяжении всего эксперимента.

[269] Вестерн-блоттинг

[270] Пораженные сегменты спинного мозга и печень помещали в раствор RIPA ((1% дезоксихолат натрия (DOC) (Sigma), 1% 100x-Triton (Biolab), 50 мМ трис-HCl (Sigma), 150 мМ NaCl (Sigma), 5 мМ ЭДТА (Sigma)), содержащий смесь ингибиторов протеаз (100 мМ PMSF, 2 мг/мл лейпептина, 50 мМ ортаванадата Na, 50 мМ апротинина, Sigma). Ткани гомогенизировали, 20 мкг общего белка разделяли с помощью электрофореза в 4-12% ДСН-ПААГ, а затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану на 90 мин. После блокирования 2% БСА в физиологическом растворе с трис-буфером и 0,1% Tween20 (TBST) в течение 3 часов мембраны инкубировали в течение ночи с антителом против PTEN, 1:1000 (моноклональное антитело мыши; № по каталогу 9556, Cell Signaling) или антителом против β-актина, 1:1000 (моноклональное антитело кролика; № по каталогу 8457, Cell Signaling) в качестве контроля загрузки в 2% БСА в TBST. На следующий день, после трех промывок TBST, мембраны инкубировали с антителом против IgG кролика, меченым ПХ (1:5000, NA934V, GE Healthcare), или антителом против IgG мыши, меченым ПХ (1:5000, NA931V, GE Healthcare), в течение 2 часов при комнатной температуре. Сигналы проявляли путем воздействия на блот усиленных хемилюминесцентных реагентов (№ по каталогу 1705061, BioRad) и последующего экспонирования в системе визуализации LAS-3000 (FujiFilm).

[271] РВ-кПЦР

[272] Общую РНК из поврежденных тканей спинного мозга и печени выделяли с использованием мини-набора Qiagen RNeasy, ДНК первой цепи синтезировали с использованием набора для обратной транскрипции High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями производителя. Количественную ПЦР в реальном времени выполняли на системе QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System. Праймеры включали PTEN (Thermo Fisher, идентификатор анализа: Rn00477208) или GAPDH (Thermo Fisher, идентификатор анализа: Rn01775763-g1). Использовали следующие условия реакции амплификации: 95°C в течение 20 с, затем 40 циклов при 95°C в течение 3 с, 60°C в течение 30 с в 10 мкл реакционной смеси в трех повторностях. Относительные уровни экспрессии определяли с использованием метода ΔΔCt, при котором исследуемый ген стандартизировали по экспрессии GAPDH.

[273] Нейроанатомическое отслеживание

[274] Для отслеживания кортикоспинальных аксонов крыс подвергали антероградному отслеживанию с использованием биотинилированного декстранамина (BDA) на 6 неделе. Под анестезией кетамином и ксилазином, описанной выше, крыс помещали в стереотаксическую рамку. Волосы на коже головы выбривали, выбритую область обрабатывали этанолом и просверливали небольшие отверстия в черепе над сенсомоторной корой. Микрошприц Hamilton с вытянутой стеклянной микропипеткой использовали для инъекций 1 мкл 10% BDA (мол. масса 10000, D1956, Molecular Probes) в 8 областей на полушарие в течение 2 минут на область с 2-минутными интервалами между инъекциями с использованием следующих координат: AP +1,0, ML ± 2,0; AP 0, ML ± 1,5; AP -1,0, ML ± 1,5; AP -2,0, ML ± 1,5; DV 1,5 мм. После завершения всех инъекций кожу головы зашивали, и крыс оставляли в камере для восстановления. На 8 неделе крыс подвергали глубокой анестезии кетамином и ксилазином и проводили транскардиальную перфузию 4% PFA. Поврежденные сегменты спинного мозга собирали, подвергали воздействию криопротектора (30% сахарозы), включали в ОКТ и получали продольные срезы толщиной 20 мкм. Срезы трижды промывали PBS и 0,1% Triton X-100, инкубировали в течение ночи при 4°C со стрептавидином, конъюгированным с Alexa Fluor594 (1:500, Invitrogen, S32356), трижды промывали PBS, устанавливали и накрывали покровным стеклом.

[275] Статистический анализ

[276] Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения MATLAB/Prism 5 (США). Для сравнения между двумя группами использовали двусторонний непарный t-критерий Стьюдента. Если не указано иное, остальные данные анализировали с использованием однофакторного или двухфакторного дисперсионного анализа с апостериорным множественным сравнением Тьюки. Все сгруппированные данные представляли в виде "среднее значение ± стандартная ошибка среднего". Уровни значимости: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

[277] Пример 1 - MSC-Exo при интраназальном введении проходит через ГЭБ и мигрирует в спинной мозг

[278] Средний размер экзосом, выделенных из экзосом мезенхимальных стволовых клеток (MSC-Exo), составлял 111 ± 64 нм, а концентрация - 40,43 × 10⁸ частиц/мл (фиг. S1D-E). MSC-Exo, визуализированные с помощью крио-ТЭМ, демонстрировали типичную сферическую форму. Для проверки способности MSC-Exo проходить через ГЭБ MSC-Exo метили наночастицами золота (GNP), как описано в (Betzer et al., 2017, ACS Nano 11, 10883-10893). Крио-ТЭМ-визуализация MSC-Exo, загруженных GNP, показала поглощение GNP экзосомами (фиг. 1). Для проверки способности MSC-Exo проходить через гематоэнцефалический барьер после интраназального (IN) введения загруженные GNP MSC-Exo интраназально вводили через три часа после полного рассечения спинного мозга. Микро-КТ сканирование через 24 часа после введения показало значительное накопление GNP в области повреждения спинного мозга, но не в головном мозге (фиг. 2, верхняя панель). В противоположность этому, у здоровых контрольных животных GNP локализовались в основном в головном мозге и обонятельных луковицах (фиг. 2, нижняя панель). Оценки посредством спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP) подтвердили, что количество GNP в области сегмента T10 позвоночника было значительно выше у травмированных крыс по сравнению со здоровыми контрольными животными (фиг. 3A, однофакторный дисперсионный анализ, F (3, 8) = 27,5, p < 0,001, критерий Тьюки). Аналогичным образом, у травмированных крыс в области сегмента T10 позвоночника накапливалось значительно большее количество экзосом, меченных PKH26 (красный липофильный краситель), после интраназавльного введения по сравнению со здоровыми крысами (фиг. 4, t (14) = 3,21, p < 0,01). Качественная микро-КТ и количественный ICP-анализ в ЦНС, наряду с иммунофлуоресцентным окрашиванием повреждений спинного мозга показали, что MSC-Exo проникает через гематоэнцефалический барьер и обладает хомингом по отношению к повреждению спинного мозга. Как ни странно, MSC-Exo значительно чаще встречались в области повреждения у крыс с повреждением спинного мозга, в то время как у здоровых крыс они преобладали в головном мозге.

[279] С целью исследования биораспределения MSC-Exo после интраназального введения использовали пламенную атомно-абсорбционную спектроскопия (FAAS) для количественного определения GNP в основных органах (печени, легких, сердце, почках и селезенке) через 24 часа после введения. Значимых различий между уровнями MSC-Exo у здоровых и травмированных крыс в легких, сердце и селезенке не обнаружено. Вместе с тем, в печени и почках здоровых крыс обнаружены более высокие уровни по сравнению с травмированными крысами, что указывает на более быстрое выведение MSC-Exo у интактных крыс (фиг. 4, правая панель, однофакторный дисперсионный анализ, F (9, 10) = 12,92, p < 0,001, критерий множественных сравнений Сидака).

[280] Кроме того, авторы продемонстрировали, что блокирование хемокиновых рецепторов экзосом, меченных PKH26 (красный краситель), токсином коклюша резко снижает способность MSC-Exo мигрировать к очагу повреждения. Для проверки существования преимущественного поглощения MSC-Exo конкретными типами клеток в области повреждения спинного мозга нейроны, астроциты и микроглию в поврежденных сегментах подвергали иммунохимическому окрашиванию через 24 часа после IN введения PKH26-Exo крысам через 2-3 ч после травмы. Обнаружили, что MSC-Exo совместно локализуется главным образом в нейронах и в значительно меньшей степени - в астроцитах и активированной микроглии (фиг. 5, однофакторный дисперсионный анализ, F (2, 13) = 11,59, p > 0,01, критерий Тьюки).

[281] Пример 2.PTEN-миРНК, загруженная в MSC-Exo, способствует устойчивому росту нейронов DRG in vitro

[282] MSC-Exo загружали конъюгированной с холестерином некодирующей cy3-MAPK-миРНК, как описано в разделе "Материалы и способы". Nanosight-анализ продемонстрировал эффективную загрузку cy3-MAPK-миРНК (33,64%) (фиг. 6).

[283] Для проверки возможности регулирования роста аксонов за счет ингибирования PTEN посредством MSC-Exo, содержащих миРНК, самодоставляющуюся PTEN-миРНК загрузили в MSC-Exo, далее называемые ExoPTEN, для доставки в нейроны ганглиев задних корешков (DRG) в культуре. Через день после обработки ExoPTEN нейроны DRG характеризовались более сложной, разветвленной и удлиненной морфологией по сравнению с нейронами, обработанными только средой, неспецифичной контрольной миРНК (NTC-миРНК), MSC-Exo или только PTEN-миРНК (фиг. 7). На средних уровнях ветвей нейроны, обработанные ExoPTEN, демонстрировали значительно большее количество точек ветвления (фиг. 8, однофакторный дисперсионный анализ, p < 0,001, критерий Тьюки). Общая длина аксонов, количество аксонов, точки ветвления и максимальный уровень ветвей были значительно выше в нейронах, обработанных ExoPTEN; конкретнее, они в 6,6, 6,6, 6,8 и 2,3 раза превосходили аналогичные показатели в необработанных нейронах, соответственно (фиг. 9, однофакторный дисперсионный анализ, все p < 0,001, критерий Тьюки). Как MSC-Exo, так и PTEN-миРНК сама по себе индуцировали разрастание нейронов DRG в одинаковой, но менее выраженной степени, чем при обработке ExoPTEN.

[284] Пример 3.Интраназальное введение ExoPTEN вызывает сайленсинг экспрессии PTEN в очагах повреждения спинного мозга

[285] Для проверки эффекта сайленсинга ExoPTEN in vivo ExoPTEN интраназально вводили в течение 5 дней подряд, начиная со дня полного рассечения спинного мозга. На 8 неделе вестерн-блоттинг белков, выделенных из области ПСМ, продемонстрировал 59% снижение уровней белка PTEN у крыс, обработанных ExoPTEN, по сравнению с необработанными крысами с ПСМ (фиг. 10A, критерий Краскела-Уоллиса, p = 0,0627). Значимых изменений уровня белка в тканях печени между группами не обнаружено (фиг. 10B, p = 0,8643). Параллельно анализ РВ-кПЦР продемонстрировал 32% снижение экспрессии гена PTEN после обработки ExoPTEN по сравнению с необработанными крысами с ПСМ (фиг. 10C, р = 0,1520), в то время как уровень экспрессии гена в печени был сопоставим (фиг. 10D, p> 0,9999).

[286] Пример 4. Интраназальное введение ExoPTEN обеспечивает значительное восстановление функций у крыс с полным ПСМ

[287] Для оценки нейропротекторного потенциала обработки ExoPTEN крыс с полным ПСМ разделили на пять групп: (1) без обработки, (2) внутриочаговое (IL) введение PTEN-миРНК, (3) внутриочаговое однократное введение ExoPTEN, (4) IN введение экзосом в течение 5 дней подряд и (5) IN введение ExoPTEN в течение 5 дней подряд (начиная со дня повреждения). Крыс подвергали оценке двигательных функций по BBB каждую неделю в течение 8 недель. IN введение ExoPTEN в течение 5 дней привело к значительному восстановлению двигательных функций (с получением F (4, 300) = 35,72, p < 0,0001, F (8, 300) = 2.931, р < 0,001, соответственно) по сравнению со всеми другими экспериментальными группами. Конкретнее, на 8 неделе средний балльный показатель двигательных функций по BBB в группе ExoPTEN (IN) (фиг. 11A) достиг 7,75 ± 2,14, что резко отличается от среднего балльного показателя 0,39 ± 0,14 у необработанных крыс с рассечением (p < 0,001). Между группами, интраназально получавшими ExoPTEN, и группами, интраназально получавшими пустые экзосомы, наблюдали статистически значимые различия (фиг. 11A). Незначительные, статистически незначимые (все p > 0,05) улучшения отмечены на 8 неделе в группах PTEN-миРНК (IL), ExoPTEN (IL) и экзосом (IN), причем балльный показатель двигательных функций по BBB составил 2,17 ± 1,48, 2,50 ± 1,21, 2,00 ± 1,23, соответственно (фиг. 11А). В течение 8 недель 28,6% крыс, получавших ExoPTEN (IN), демонстрировали балльный показатель двигательных функций по BBB ≥ 14, что отражает постоянное наступание на подошву, расхождение пальцев и устойчивую координацию между передними и задними конечностями, в то время как ни одна из других групп, получавших лечение, не смогла достичь этого уровня двигательных функций (фиг. 11Б). Крысы, получавшие ExoPTEN (IN), также быстрее набирали вес, чем в других группах, и достигали постоянных показателей на 5 неделе (фиг. 11C). Кроме того, на 8 неделе отмечена положительная корреляция между массой крысы и балльным показателем двигательных функций по BBB (фиг. 11D, коэффициент корреляции Пирсона = 0,6819, p < 0,0001). Тесты с нитями фон Фрея с градиентом изгибающих усилий (6, 8, 10, 15, 26, 60, 100, 180, 300 г) накладывали на задние конечности для определения порога отдергивания лапы в качестве индикатора восстановления чувствительности. Порог для стимуляции отдергивания лапы у здоровых крыс был задан на уровне 60 г, ниже которого реакцию отдергивания считали аллодинией. Ни одна из крыс не реагировала на нить с усилием 300 г после ПСМ, что указывает на полное исчезновение чувствительных функций. Нормальная сенсорная реакция была достигнута у 25% и 33,3% животных в группах ExoPTEN (IL) и ExoPTEN (IN), соответственно, на 4 неделе и осталась такой же на 8 неделе. Кроме того, 25% крыс в группе экзосом (IN) достигли восстановления чувствительности на 8 неделе. В противоположность этому, необработанные группы и группы PTEN-миРНК (IL) не демонстрировали восстановления чувствительных функций в течение 8 недель (фиг. 11E). Время до появления рефлекторных реакций мочеиспускания, отражающих функцию мочевого пузыря, быстрее всего восстанавливалось у животных, обработанных ExoPTEN (IN) (7,0 ± 0,7 дня), а затем - у крыс, не получавших лечения (8,9 ± 0,7 дня) (фиг. 11F, однофакторный дисперсионный анализ, p = 0,4079, критерий Тьюки). На фиг. 11G показаны различия в восстановлении крыс, получавших контрольный агент, экзосомы и ExoPTEN, в течение 8 недель после повреждения.

[288] Пример 5. Интраназальное введение ExoPTEN стимулирует структурную организацию и электрофизиологическую проводимость

[289] Для оценки структурной целостности спинного мозга у необработанных животных с ПСМ, животных с ПСМ, обработанных экзосомами (IN) или ExoPTEN (IN), и интактных крыс выполняли традиционную МРТ при индукции 9,4 Тл и диффузно-тензорную томографию (DTI). В контрольной группе с рассечением наблюдали тяжелую атрофию спинного мозга на 4 мм каудальнее эпицентра повреждения, в то время как в группах, получавших экзосомы и ExoPTEN, такая дегенерация была менее очевидна. Площади поперечного сечения, измеренные на 4 мм ростральнее эпицентра повреждения, существенно не различались между группами ПСМ (фиг. 12A, однофакторный дисперсионный анализ, F (3, 11) = 0,6120, p = 0,6212), но резко уменьшались на 4 мм каудальнее эпицентра в группе контрольного рассечения по сравнению с группой, получавшей ExoPTEN (фиг. 12B, 2,5 ± 0,5 мм² по сравнению с 4,2 ± 0,3 мм², p < 0,05). Трактография с диффузно-тензорной томографией (DTI) показала полное разъединение ростральной и каудальной культей в группе рассечения, частичное образование мостиков в группе экзосом и наиболее выраженное образование мостиков в группе ExoPTEN. Показатели фракционной анизотропии (ФА) рострально и каудально по отношению к месту повреждения были выше у крыс, получавших ExoPTEN, по сравнению с группой, получавшей экзосомы, или группой с ПСМ без лечения, но все же ниже, чем у интактных крыс (средние значения ФА в пределах очага повреждения в группах контрольного рассечения, экзосом, ExoPTEN и у интактных крыс составляли 0,2856, 0,2938, 0,3293, 0,5055, соответственно, фиг. 12C). Показатели среднего коэффициента диффузии (MD) не демонстрировали различий между группами с ПСМ, не получавшими лечения и получавшими экзосомы и ExoPTEN. Кроме того, у крыс, получавших ExoPTEN, наблюдались высокоамплитудные потенциалы, вызванные двигательными раздражителями (MEP), распространяющиеся от двигательной коры через очаг повреждения к седалищному нерву, в то время как в группе экзосом регистрировали сигналы с низкой амплитудой (фиг. 12D, 1.283 ± 0,085 мВ по сравнению с 0,662 ± 0,162 мВ, соответственно, p = 0,0273. Задержка MEP в группе, получавшей ExoPTEN, была короче, чем в группе, получавшей экзосомы (фиг. 12E, 31,03 ± 3,05 мс по сравнению с 38,49 ± 6,78 мс, p = 0,3726). Все сигналы исчезли после повторного пересечения ростральнее повреждения спинного мозга.

[290] Пример 6. Интраназальное введение ExoPTEN улучшает микросреду в области повреждения и восстанавливает кортикоспинальные аксоны

[291] Для выявления клеточных механизмов, лежащих в основе восстановления двигательной функции, очаги повреждения спинного мозга у необработанных животных и животных, получавщих экзосомы (IN) и ExoPTEN (IN) окрашивали по бета-III-тубулину, CD11b, CD31 и GFAP для обнаружения регенерации аксонов, микроглиоза, астроглиоз и ангиогенеза, соответственно. Уровень экспрессии β-III-тубулина был значительно выше у крыс, получавших ExoPTEN, чем у крыс, получавших экзосомы, в то время как у необработанных крыс с ПСМ он едва обнаруживался (фиг. 13A, p < 0,0001). CD11b-положительные клетки микроглии являлись наиболее распространенным типом клеток в группе с рассечением без лечения и присутствовали в значительно меньшем количестве в группах, получавших экзосомы и ExoPTEN (F (2, 24) = 25,18, p < 0,0001), причем значимые различия между ними отсутствовали (Фиг. 13B, панель 2, p = 0,9818). Аналогичный профиль экспрессии наблюдался для GFAP⁺-астроцитов (фиг. 13C). Обнаружено, что минимальный уровень ангиогенеза, согласно измерению количества CD31⁺-клеток, наблюдался у необработанных крыс с рассечением (фиг. 13D).

[292] Корково-спинномозговой путь (CST) отвечает за произвольный двигательный контроль над телом и задними конечностями. Для исследования возможности регенерации этого конкретного пути за счет интраназального введения ExoPTEN авторы изобретения отследили его ход, используя биотинилированный декстранамин (BDA), который вводили в соматомоторную кору головного мозга необработанныз, обработанных экзосомами (IN) или ExoPTEN (IN) крыс с ПСМ. Обнаружено, что в группе необработанных животных с ПСМ BDA-положительные волокна не смогли проникнуть в очаг повреждения (фиг. 14, верхняя панель), в то время как в группе, получавшей экзосомы, BDA-положительные волокна отмечались внутри очага повреждения, но не переходили в хвостовую культю (фиг. 14, средняя панель). В противоположность этому, в группе ExoPTEN четко наблюдались BDA-положительные волокна, проникающие в очаг повреждения и распространяющиеся за его пределы (фиг. 14, нижняя панель).

[293] Хотя настоящее изобретение описано в связи с конкретными вариантами его реализации, для специалистов в данной области техники будут очевидны его различные альтернативы, модификации и вариации. Соответственно, предполагается, что настоящее изобретение охватывает все подобные альтернативы, модификации и вариации, которые включены в сущность прилагаемой формулы изобретения. Хотя настоящее изобретение описано выше в настоящем документе посредством предпочтительных вариантов его реализации, его можно изменить без отступления от сущности настоящего изобретения, определенной в прилагаемой формуле изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Technion Research & Development Foundation Limited

RAMOT AT TEL-AVIV UNIVERSITY LTD.

<120> ВЕЗИКУЛЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИНГИБИТОР PTEN, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> TECH-075 PCT

<150> 62/649648

<151> 2018-03-29

<160> 11

<170> Версия PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 403

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Thr Ala Ile Ile Lys Glu Ile Val Ser Arg Asn Lys Arg Arg Tyr

1 5 10 15

Gln Glu Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr Tyr Ile Tyr Pro Asn Ile

20 25 30

Ile Ala Met Gly Phe Pro Ala Glu Arg Leu Glu Gly Val Tyr Arg Asn

35 40 45

Asn Ile Asp Asp Val Val Arg Phe Leu Asp Ser Lys His Lys Asn His

50 55 60

Tyr Lys Ile Tyr Asn Leu Cys Ala Glu Arg His Tyr Asp Thr Ala Lys

65 70 75 80

Phe Asn Cys Arg Val Ala Gln Tyr Pro Phe Glu Asp His Asn Pro Pro

85 90 95

Gln Leu Glu Leu Ile Lys Pro Phe Cys Glu Asp Leu Asp Gln Trp Leu

100 105 110

Ser Glu Asp Asp Asn His Val Ala Ala Ile His Cys Lys Ala Gly Lys

115 120 125

Gly Arg Thr Gly Val Met Ile Cys Ala Tyr Leu Leu His Arg Gly Lys

130 135 140

Phe Leu Lys Ala Gln Glu Ala Leu Asp Phe Tyr Gly Glu Val Arg Thr

145 150 155 160

Arg Asp Lys Lys Gly Val Thr Ile Pro Ser Gln Arg Arg Tyr Val Tyr

165 170 175

Tyr Tyr Ser Tyr Leu Leu Lys Asn His Leu Asp Tyr Arg Pro Val Ala

180 185 190

Leu Leu Phe His Lys Met Met Glu Glu Thr Ile Pro Met Phe Ser Gly

195 200 205

Gly Thr Cys Asn Pro Gln Phe Val Val Cys Gln Leu Lys Val Lys Ile

210 215 220

Tyr Ser Ser Asn Ser Gly Pro Thr Arg Arg Glu Asp Lys Phe Met Tyr

225 230 235 240

Phe Glu Phe Pro Gln Pro Leu Pro Val Cys Gly Asp Ile Lys Val Glu

245 250 255

Phe Phe His Lys Gln Asn Lys Met Leu Lys Lys Asp Lys Met Phe His

260 265 270

Phe Trp Val Asn Thr Phe Phe Ile Pro Gly Pro Glu Glu Thr Ser Glu

275 280 285

Lys Val Glu Asn Gly Ser Leu Cys Asp Gln Glu Ile Asp Ser Ile Cys

290 295 300

Ser Ile Glu Arg Ala Asp Asn Asp Lys Glu Tyr Leu Val Leu Thr Leu

305 310 315 320

Thr Lys Asn Asp Leu Asp Lys Ala Asn Lys Asp Lys Ala Asn Arg Tyr

325 330 335

Phe Ser Pro Asn Phe Lys Val Lys Leu Tyr Phe Thr Lys Thr Val Glu

340 345 350

Glu Pro Ser Asn Pro Glu Ala Ser Ser Ser Thr Ser Val Thr Pro Asp

355 360 365

Val Ser Asp Asn Glu Pro Asp His Tyr Arg Tyr Ser Asp Thr Thr Asp

370 375 380

Ser Asp Pro Glu Asn Glu Pro Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln Ile

385 390 395 400

Thr Lys Val

<210> 2

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Типичные последовательности миРНК, которые рассматривали

на предмет ингибирования PTEN

<400> 2

guuagcagaa acaaaaggag auaucaa 27

<210> 3

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Типичные последовательности миРНК, которые рассматривали

на предмет ингибирования PTEN

<400> 3

uugauaucuc cuuuuguuuc ugcuaac 27

<210> 4

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Типичные последовательности миРНК, которые рассматривали

на предмет ингибирования PTEN

<400> 4

cagccguucg gaggauuauu cgucutt 27

<210> 5

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Типичные последовательности миРНК, которые рассматривали

на предмет ингибирования PTEN

<400> 5

agacgaauaa uccuccgaac ggcugtt 27

<210> 6

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Типичная последовательность, которая может являться мишенью

миРНК PTEN

<400> 6

gagttcttcc acaaacagaa 20

<210> 7

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Типичная последовательность, которая может являться мишенью

миРНК PTEN

<400> 7

gtatagagcg tgcagataa 19

<210> 8

<211> 10

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Примеры олигонуклеотидных последовательностей, которые можно

использовать для формирования петли

<220>

<221> n

<222> (10)..(10)

<223> n=a, u, t, c, g или отсутствует

<220>

<221> прочее

<222> (10)..(10)

<223> n представляет собой a, c, g или u

<400> 8

uucaagagan 10

<210> 9

<211> 10

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Примеры олигонуклеотидных последовательностей, которые можно

использовать для формирования петли

<220>

<221> n

<222> (10)..(10)

<223> n=a, u, t, c, g или отсутствует

<220>

<221> прочее

<222> (10)..(10)

<223> n представляет собой a, c, g или u

<400> 9

uuuguguagn 10

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная последовательность

<400> 10

gaguucuucc acaaacagaa 20

<210> 11

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> искусственная последовательность

<400> 11

uucuguuugu ggaagaacuc 20

<---

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим мембранные везикулы, в том числе внеклеточные везикулы, в том числе так называемые экзосомы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN). Предложены способы лечения неврологических заболеваний, расстройств или состояний с применением внеклеточных везикул. Кроме того, предложены выделенные внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN). Изобретение обеспечивает дополнительный безопасный, эффективный и удобный метод лечения повреждения спинного мозга. 3 н. и 26 з.п. ф-лы, 14 ил., 6 пр.

1. Фармацевтическая композиция для лечения поражения или повреждения нейронов, содержащая внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), и фармацевтически приемлемый носитель, где указанные внеклеточные везикулы получены из мезенхимальных стволовых клеток (MSC) и указанный ингибитор PTEN представляет собой миРНК.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что внеклеточные везикулы выбраны из экзосом, микровезикул, эктосом, экзовезикул и их комбинации.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что внеклеточные везикулы представляют собой экзосомы.

4. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что адгезивные клетки выбраны из группы, состоящей из стволовых клеток пульпы зуба (DPSC), стволовых клеток выпавших молочных зубов (SHED), стволовых клеток периодонтальной связки (PDLSC), стволовых клеток апикального сосочка (SCAP) и клеток-предшественников зубных фолликулов (DFPC).

5. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что адгезивные клетки экспрессируют маркеры клеток нервного гребня.

6. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что клетки нервного гребня представляют собой клетки краниального нервного гребня.

7. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что ингибитор PTEN выбран из (i) миРНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 11, 2, 3, 4 и 5; (ii) миРНК, мишенью которой является нуклеотидная последовательность, выбранная из SEQ ID NO: 6 и 7; и (iii) миРНК, содержащей варианты нуклеиновой кислоты из (i) и (ii), характеризующиеся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с исходной последовательностью.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид РНКи дополнительно содержит гидрофобный фрагмент.

9. Фармацевтическая композиция по п. 8, отличающаяся тем, что указанный гидрофобный фрагмент выбран из группы, состоящей из стерина, ганглиозида, липида, витамина, жирной кислоты, гидрофобного пептида и их комбинации.

10. Фармацевтическая композиция по п. 9, отличающаяся тем, что указанный стерин представляет собой холестерин.

11. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-10, отличающаяся тем, что внеклеточные везикулы представляют собой выделенные внеклеточные везикулы.

12. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-11, дополнительно содержащая хондроитиназу ABC или внеклеточные везикулы, содержащие хондроитиназу ABC.

13. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-12, представленная в форме для введения путем, выбранным из интраназального, внутриочагового, интратекального, внутривенного, внутримышечного, подкожного, сублингвального, перорального и интрацеребрального путей введения.

14. Способ лечения поражения или повреждения нейронов у субъекта, включающий введение указанному субъекту фармацевтической композиции по любому из пп. 1-13.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что поражение или повреждение нейронов представляет собой повреждение спинного мозга (ПСМ).

16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что миРНК содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 11, 2, 3, 4 и 5.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что миРНК конъюгирована с холестериновым фрагментом.

18. Способ по любому из пп. 14-17, отличающийся тем, что композицию вводят интраназально.

19. Способ по любому из пп. 14-18, отличающийся тем, что способ дополнительно включает введение хондроитиназы ABC.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что внеклеточные везикулы, загруженные экзогенным ингибитором PTEN и хондроитиназой ABC, вводят в виде единой фармацевтической композиции или в виде различных фармацевтических композиций.

21. Выделенная внеклеточная везикула, загруженная экзогенным ингибитором гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), для доставки ингибитора PTEN, причем указанная внеклеточная везикула получена из мезенхимальных стволовых клеток (MSC) и указанный ингибитор PTEN представляет собой миРНК.

22. Выделенная внеклеточная везикула по п. 21, отличающаяся тем, что внеклеточная везикула выбрана из экзосом, микровезикул и их комбинации.

23. Выделенная внеклеточная везикула по п. 21 или 22, отличающаяся тем, что олигонуклеотид для РНКи выбран из (i) миРНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 11, 2, 3, 4 и 5; (ii) миРНК, мишенью которой является нуклеотидная последовательность, выбранная из SEQ ID NO 6 и 7; и (iii) миРНК, содержащей варианты нуклеиновой кислоты из (i) и (ii), характеризующиеся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с исходной последовательностью.

24. Выделенная внеклеточная везикула по любому из пп. 21-23, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид РНКи содержит гидрофобный фрагмент.

25. Выделенная внеклеточная везикула по п. 24, отличающаяся тем, что указанный гидрофобный фрагмент выбран из стерина, ганглиозида, липида, витамина, жирной кислоты, пептида и их комбинации.

26. Выделенная внеклеточная везикула по п. 25, отличающаяся тем, что указанный стерин представляет собой холестерин.

27. Выделенная внеклеточная везикула по п. 26, отличающаяся тем, что везикула представляет собой экзосому, загруженную молекулами миРНК, конъюгированными с холестерином и ингибирующими экспрессию PTEN, причем указанные экзосомы происходят из мезенхимальных стволовых клеток.

28. Выделенная везикула по п. 27, отличающаяся тем, что миРНК содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из SEQ ID NO: 10, 11, 2 и 4.

29. Выделенная везикула по любому из пп. 21-28, дополнительно содержащая хондроитиназу ABC или кодирующий ее полинуклеотид.