СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ МИКРОБНОЙ И ВИРУСНОЙ КОНТАМИНАЦИИ РАСТВОРОВ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ Российский патент 2018 года по МПК G01N33/48 G01N33/15 B82B3/00 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в фармацевтике, медицине, биотехнологии, ветеринарии и аналитике в качестве высокочувствительного, быстрого, технически простого и экономичного способа определения контаминации растворов и биологических жидкостей.

Контаминация - это присутствие в растворе или каком-либо материале жизнеспособных клеток микроорганизмов, спор, вирусных частиц или иных биологических объектов. В настоящее время в качестве общепринятой системы определения отсутствия контаминации в стерильных растворах фармацевтических, медицинских и биологических препаратах, субстанциях и других материалах, в соответствии с правилами национальных стандартов применяют метод прямого высева на индикаторные среды (ГФ РФ XII ОФС 42-0066-07, USP37 - NF 32, R 2014, ЕР, 8th ed, JP 15th ed). О стерильности исследуемого раствора, согласно этим документам, судят по отсутствию роста микроорганизмов и других биологических объектов на специфичных индикаторных средах после инкубации в оптимальных условиях. Наиболее существенным недостатком применения метода прямого высева на среды является длительность его проведения - не менее 14-18 дней. Помимо этого, недостатком данного метода является его трудоемкость и необходимость использования многих дорогих реактивов. В ряде случаев при проведении анализа препарата на контаминацию необходима дополнительная обработка испытуемого образца для исключения его собственного антимикробного действия.

Для обнаружения определенных видов микроорганизмов и вирусов, кроме прямого посева на индикаторные среды для определения микробной и вирусной контаминации в растворах и биологических жидкостях, применяют методы современной молекулярной диагностики, основанные на специфических реакциях отдельных маркеров биологических объектов - нуклеиновые кислоты, белки, липополисахариды мембран бактерий: RT²-PCR Array Handbook 06/2013;

Способ определения бактериальной контаминации крови - патент РФ 2208645; Способ выявления патогенных штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida - патент РФ 2477321. Однако такие методы, несмотря на меньшие затраты времени на анализ, требуют использования дорогостоящих реактивов, специальной подготовки исследуемых растворов, сложного аналитического оборудования и высокой квалификации персонала.

Предлагаемый способ обнаружения контаминации растворов и жидкостей микроорганизмами и вирусными частицами основан на регистрации различными физическими методами процессов формирования наночастиц металлов, формирующихся in situ непосредственно в образцах исследуемых растворов из внесенных в исследуемую жидкость стерильных растворов солей металлов.

Наночастицы металлов обладают уникальными оптическими свойствами, обусловленными явлением поверхностного плазмонного резонанса, способностью усиления сигнала в рамановской и флуоресцентной спектроскопии, высокоразвитой поверхностью, высокой емкостью двойного электрического слоя и т.п. Взвеси наночастиц металлов получают при восстановлении в реакционном растворе соответствующих катионов. Восстановителями катионов в процессах формирования наночастиц металлов могут выступать любые соединения, способные быть донорами электронов. Если в качестве восстановителя используют конкретные химические соединения, в том числе соединения биологической природы, говорят о «химическом способе» формирования наночастиц. При этом способе восстановление катионов начинается мгновенно при смешивании растворов обоих компонентов реакции. Происходит очень быстрое образование центров первичных кластеров восстановленных атомов металлов. Если в реакционной смеси концентрация кластеров окажется достаточной для их объединения, процессы восстановления и кристаллизации продолжаются, что приводит к формированию зародышей наночастиц размером до 1,5-2 нм.

Если в качестве восстановителя выступают биомолекулы поверхностных структур живых клеток того или иного микроорганизма - говорят о «биотехнологическом способе». Поскольку в живых клетках микроорганизмов осуществляются реакции энергетического и конструктивного метаболизма, поверхностные структуры клеток обладают ярко выраженным восстановительным потенциалом благодаря восстановительным группировкам своих поверхностных биополимеров. Наличие этого потенциала приводит к гораздо более быстрому формированию кластеров восстановленных атомов, более частому возникновению зародышей наночастиц и ускоренному росту формирующихся полноценных выполненных наночастиц размером от 15-20 нм уже через 15-30 минут. Контаминация растворов вирусными частицами также приводит к формированию за такое же время «выполненных» наночастиц. Однако, поскольку восстановительный потенциал поверхностных белков вирусных частиц (в отличие от потенциала живых клеток) не пополняется за счет внутреннего энергетического метаболизма, формирующиеся наночастицы достигают размеров от 6 нм. Кроме того, во многих случаях вирусных контаминаций формирующиеся наночастицы металлов остаются ассоциированными с белками капсид, что приводит к своеобразному контрастированию вирусных частиц.

Таким образом, об обнаружении микробной или вирусной контаминации растворов или биологических жидкостей можно судить по параметрам, свойствам и динамике формирования «выполненных» наночастиц, формирующихся in situ непосредственно в исследуемых образцах растворов за несколько минут. Напротив, в стерильных растворах за такое же время формируются (химическим способом) только кластеры восстановленных атомов или мелкие зародыши наночастиц.

Необходимо подчеркнуть, что поскольку наночастицы металлов имеют кристаллическую структуру, их параметры, свойства и динамика формирования могут быть зарегистрированы гораздо большим числом аналитических методов, чем для регистрации присутствия клеток микроорганизмов или иных биологических объектов. Это значит, что новый подход позволяет достоверно, объективно, технологически просто и экономично выявлять случаи микробной или вирусной контаминации растворов, биологических жидкостей и других стерильных материалов.

В качестве аналога нами выбран патент US 8,546,097 В2, 2013 (Martis L., Patel М., Giertych J.A., Mongoven J.W., Kunzler J.A., Owen W.F. Methods and compositions for detection of microbial contaminants in peritoneal dialysis solutions). В аналоге заявлен метод, реализующий использование высокочувствительной реакции на присутствие пептидогликана, а также для выявления контаминации грамположительными бактериями биологической жидкости.

Существенные преимущества заявляемого нами способа в сравнении с аналогом следующие.

1. В заявляемом способе для выявления контаминации исследуемых образцов применяют низкоконцентрированные растворы обычных солей металлов, тогда как в аналоге используют набор высокоспецифичных, дорогостоящих реактивов.

2. Реализация заявляемого способа позволяет выявлять контаминации не только грамположительными, но и грамотрицательными микроорганизмами и вирусными частицами, в то время как применение метода, представленного в аналоге, рассчитано на обнаружение контаминации только грамположительными патогенными бактериями.

3. Реализация заявляемого способа позволяет напрямую выявлять присутствие контаминирующих биологических объектов в исследуемом растворе. В аналоге авторами указано, что обнаружение пептидогликана не отменяет необходимости детектирования присутствия клеток бактерий Alicylobacillus acidocalarius, для чего применяли дополнительный метод.

4. Реализация заявляемого способа позволяет выявлять контаминации растворов биологическими объектами за 20-40 минут. В аналоге длительность анализа только пептидогликана занимает 4 часа.

Дополнительный поиск известных решений показал, что заявленное изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, следовательно, данное изобретение соответствует условию «изобретательский уровень».

Осуществление изобретения

В заявляемом методе обнаружения контаминации растворов микроорганизмами или вирусными частицами по формированию наночастиц in situ использовали стерильные водные растворы солей металлов в конечных концентрациях, не влияющих на жизнеспособность микроорганизмов. Стерильный водный раствор соли металла вносили в асептических условиях непосредственно в аликвоты исследуемого раствора, после чего реакционную смесь инкубировали при слабом перемешивании при температурах, не влияющих на жизнеспособность микроорганизмов.

В качестве контроля использовали заведомо стерильные растворы с идентичным составом компонентов. Присутствие биологических контаминантов в исследуемых растворах приводило к запуску реакции восстановления внесенных катионов и формированию выполненных наночастиц размером от 15 нм (по биотехнологическому способу за счет контакта с восстановителями поверхностных структур клеток или вирусных частиц). В контрольных стерильных вариантах растворов реализовался химический способ формирования зародышей наночастиц размером не более 2 нм - исключительно за счет восстановителей среды - растворенных молекул различной природы (рис. 1).

Заявляемый способ обнаружения контаминации растворов микроорганизмами или вирусными частицами тестировали на модельных суспензиях биологических микрообъектов низкой плотности, приготовленных на основе полноценной ростовой среды LB (содержащей пептон 0,5%, дрожжевой экстракт 0,7%, NaCl 0,5%), а также на основе физиологического раствора (NaCl 0,9%). Во всех экспериментах контаминация приводила к формированию выполненных наночастиц металлов размером более 15 нм, тогда как в стерильных вариантах растворов и сред таких наночастиц металлов не обнаруживали.

Возможность реализации заявляемого нанобиотехнологического способа обнаружения контаминации растворов микроорганизмами или вирусными частицами по формированию наночастиц in situ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

В модельных экспериментах для обнаружения контаминации стандартной 10%-ной ростовой среды LB микроорганизмами грамотрицательной культуры использовали суспензию клеток микобактерий Mycobacterium smegmatis. В качестве контрольного раствора использовали аликвоту стерильной 10%-ной среды LB. Источник катионов серебра вносили с соблюдением правил асептики в виде стерильного водного раствора Ag(NH₃)₂NO₃ в аликвоты: а) контаминированную микобактериями и б) контрольную стерильную. Реакцию восстановления катионов серебра для формирования наночастиц Ag⁰ проводили от 5 до 40 минут. Сорбцию клеток и наночастиц проводили на предварительно стерилизованные сеточки для электронной микроскопии в течение 3 минут при комнатной температуре, в темноте, с соблюдением правил асептики, после чего сеточки промывали стерильной бидистиллированной водой для удаления с поверхности несорбированного материала и остатков реакционной смеси. С применением просвечивающего электронного микроскопа было показано, что в обоих вариантах присутствует значительное число зародышей наночастиц (до 2 нм), тогда как более крупные выполненные наноразмерные объекты (более 15 нм) наблюдали только в контаминированном растворе. Подтверждение того, что наблюдаемые в поле зрения электронного микроскопа оптически плотные наночастицы состоят из восстановленного серебра Ag⁰, получали методом рентгеновского микроанализа. Спектроскопия двух сравниваемых растворов показала увеличение поглощения в специфической для наночастиц Ag⁰ области λ₄₀₅ нм только в контаминированном растворе, что также свидетельствует о формировании в нем наночастиц серебра (рис. 2).

Пример 2

В модельных экспериментах для обнаружения контаминации стандартной 10%-ной ростовой среды LB микроорганизмами грамположительной культуры использовали разбавленную такой же стерильной средой суспензию клеток Bacillus cereus. В качестве контрольного раствора использовали аликвоту стерильной 10%-ной среды LB. Источник катионов золота вносили с соблюдением правил асептики в виде стерильного водного раствора HAuCl₄. Реакцию восстановления катионов для формирования наночастиц проводили 20 минут при комнатной температуре в темноте в условиях, исключающих попадание посторонней микрофлоры. Приготовление препаратов для электронного микроскопирования проводили, как описано в примере 1. С применением просвечивающего электронного микроскопа было показано, что в обоих вариантах присутствует значительное число зародышей наночастиц (до 2 нм), тогда как более крупные выполненные наночастицы различной геометрической формы размером более 15 нм наблюдали только в контаминированном растворе. Подтверждение того, что наблюдаемые в поле зрения электронного микроскопа оптически плотные наночастиц состоят из восстановленного золота Au⁰, получали методом рентгеновского микроанализа (рис. 3).

Пример 3

В модельных экспериментах для обнаружения вирусной контаминации в стандартной 10%-ной ростовой среде LB использовали суспензию частиц фага G7C. В качестве контрольного раствора использовали аликвоту стерильной 10%-ной среды LB. Источник катионов серебра вносили с соблюдением правил асептики в виде стерильного водного раствора Ag(NH₃)₂NO₃. Реакцию восстановления катионов серебра для формирования наночастиц проводили 25 минут при температуре 45°C в темноте с соблюдением правил асептики. Приготовление препаратов для электронного микроскопирования проводили, как описано в примере 1. Формирование зрелых выполненных наночастиц Ag⁰ размером до 6 нм наблюдали только в растворах, контаминированных вирусными частицами (рис. 4).

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способу определения контаминации растворов и биологических жидкостей. Сущность способа состоит в том, что детектируют биологические объекты, включающие микроорганизмы или вирусы, с помощью наночастиц металлов, формирующихся in situ из внесенных в исследуемый объект солей соответствующих металлов, при последующем анализе динамики спектральных характеристик формирующихся наночастиц. В присутствии клеток микроорганизмов в течение 20-40 минут размер формирующихся наночастиц металлов достигает величины более 15 нм, в присутствии вирусов размер формирующихся наночастиц достигает 6 нм, тогда как в отсутствие контаминации исследуемых объектов за то же время размер образующихся зародышей наночастиц не превышает 2 нм. Использование заявленного способа позволяет с высокой чувствительностью, достоверностью, технической простотой и быстротой выявлять случаи микробной контаминации растворов и биологических жидкостей. 4 ил., 3 пр.

Способ определения контаминации растворов и биологических жидкостей, основанный на детекции биологических объектов, включающих микроорганизмы или вирусы, с помощью наночастиц металлов, формирующихся in situ из внесенных в исследуемый объект солей соответствующих металлов, при последующем анализе динамики спектральных характеристик формирующихся наночастиц, отличающийся тем, что в присутствии клеток микроорганизмов в течение 20-40 минут размер формирующихся наночастиц металлов достигает величины более 15 нм, в присутствии вирусов размер формирующихся наночастиц достигает 6 нм, тогда как в отсутствие контаминации исследуемых объектов за то же время размер образующихся зародышей наночастиц не превышает 2 нм.