Способ использования интегрирующей сферы для фотометрической регистрации формирования de novo биогенных наночастиц металлов Российский патент 2023 года по МПК G01J1/02 B82B3/00 

Изобретение относится к оптическому приборостроению и предназначено для быстрой сравнительной оценки метаболической активности клеток на основании регистрации параметров формирования ими наночастиц металлов. Задачей изобретения является повышение чувствительности фотометрической регистрации и оценки параметров биогенных наночастиц металлов, формируемых in situ живыми клетками при их контакте с вносимым непосредственно в их суспензию раствором соли как источником катионов. Для повышения чувствительности при регистрации параметров формирующихся биогенных наночастиц металлов источник «белого» светового потока интегрирующей сферы дополнен системой волоконно-оптического подведения световых потоков и модулем регуляции светового потока, имеющего нескольких фиксированных длин волн, соответствующих возбуждающему воздействию для флюоресценции наночастиц металла определённого состава. Назначением и техническим результатом использования интегрирующей сферы является повышение точности оценки метаболической активности исследуемых биологических объектов на основании регистрации параметров динамики формирования наночастиц металлов непосредственно в пробах, содержащих исследуемые клетки. Техническим результатом является также возможность проведения измерений биогенных наночастиц в капле реакционной смеси или в луночном планшете.

В современной экспериментальной науке и многих областях биотехнологии постоянно расширяется спектр направлений применения наночастиц металлов. Известна природная способность метаболически активных клеток восстанавливать катионы и формировать in situ сначала нанокластеры нуль-валентных атомов, а затем и более крупные наночастицы соответствующих металлов. Метод, основанный на этом свойстве метаболически активных клеток, даёт возможность контролировать присутствие жизнеспособных микроорганизмов и даже спор или вирусных частиц в различных растворах и жидких средах, то есть контролировать их контаминацию. Показано, что скорость формирования de novo и укрупнения биогенных наночастиц металлов повышается с повышением уровня физиологической активности культур микроорганизмов, а также отражает состояние микробных сообществ и клеток высших организмов. Данный аналитический подход основан на точном знании того, что линейные размеры биогенных наночастиц металлов, формирующихся de novo в присутствии клеток из восстановленных катионов путём самосборки нуль-валентных атомов, пропорциональны метаболической восстановительной активности живых клеток [Zhou et al., 2013, Сорокин с соавт., 2013, Skladnev et al., 2020]. В стерильных средах восстановление внесённых катионов к формированию наночастиц не приводит.

Предлагаемое изобретение повышает эффективность фотометрической регистрации и оценки параметров формирующихся de novo биогенных наночастиц металлов, что позволяет оценивать уровень метаболической активности клеток в практически значимых областях биотехнологии, экологии и медицины.

В настоящее время в качестве общепринятой системы контроля контаминации для стерильных растворов фармацевтических, медицинских и биологических препаратов, субстанций и других стерильных материалов, в соответствии с правилами национальных стандартов применяют метод прямого высева на индикаторные среды (ГФ РФ XII ОФС 42-0066-07, USP37 - NF 32, R 2014, E P, 8th ed., JP 15th ed.). О стерильности исследуемой жидкости, согласно этим документам, судят по отсутствию роста микроорганизмов при контрольных посевах на специальных индикаторных средах после инкубации в оптимальных условиях. Наиболее существенным недостатком этого метода прямого высева на твёрдые среды является длительность его проведения - не менее 14-18 дней, а также его трудоёмкость и необходимость использования многих дорогих реактивов. В последние годы для обнаружения микробной и вирусной контаминации растворов и биологических жидкостях применяют методы молекулярной диагностики, основанные на специфических реакциях отдельных маркеров биологических объектов - нуклеиновые кислоты, белки, липополисахариды мембран бактерий: RT2-PCR Array Handbook 06/2013, Способ определения бактериальной контаминации крови - Патент РФ 2208645, Способ выявления патогенных штаммов и изолятов бактерии Рasteurella multocida - Патент РФ 2477321. Такие методы существенно сокращают время проведения анализов, однако требуют использования дорогостоящих реактивов, ещё более дорогого аналитического оборудования и высокой квалификации персонала.

Ранее нами был заявлен способ обнаружения контаминации жидкостей микроорганизмами и вирусными частицами, основанный на регистрации процесса формирования биогенных наночастиц металлов, формирующихся непосредственно в исследуемых образцах из продуктов восстановления катионов, искусственно внесённых в исследуемые пробы в виде стерильных растворов солей металлов (Патент РФ 2641960, 2016). В ходе реакции восстановления катионов в присутствии метаболически активных клеток доля невосстановленных катионов на поверхности биогенных нанокластеров постоянно и быстро уменьшается. Снижение поверхностного заряда минимизирует силы отталкивания формирующихся de novo нанокластеров, что способствует их самосборке и формированию всё более крупных наночастиц. Суспензии живых клеток способны за 20 минут формировать in situ наночастицы серебра диаметром 20 - 150 нм. В аналогичных условиях реакции восстановления катионов суспензии покоящихся микробных клеток, суспензии спор или вирусных частиц за то же время формируют биогенные наночастицы серебра диаметром лишь до 2 - 10 нм. В стерильных образцах ростовых сред и иных жидкостей формируются только предшественники наночастиц (нанокластеры восстановленных атомов) размером порядка 1-1,5 нм.

Поскольку наночастицы металлов имеют кристаллическую структуру, их параметры, свойства и динамика формирования могут быть зарегистрированы бóльшим числом аналитических методов, чем подходят для регистрации присутствия клеток микроорганизмов или иных биологических объектов. Для детекции наночастиц металлов широко используют их специфические оптические свойства, обусловленные явлением поверхностного плазмонного резонанса, высокоразвитой поверхностью, высокой емкостью двойного электрического слоя, а также на способность наночастиц к усилению сигнала в рамановской, световой и флуоресцентной спектрометрии. Одной из уникальных особенностей нанокластеров многих металлов размером от 2-5 нм являются их выраженные флуоресцентные свойства. При размерах нанокластеров восстановленных атомов металлов, соизмеримых с длиной волны Ферми для электронов, из-за дискретных электронных состояний, вызванных сильным квантовым удержанием свободных электронов, проявляют супра-молекулярные свойства наночастиц. По мере увеличения размера нанокристаллических структур металлов (в процессе самосборки нанокластеров в наночастицы) соотношение поверхностных и глубинных атомов изменяется, что приводит к смещению излучения флуоресценции и даже её полному гашению [Szerencsés et al., 2020]. Нами предлагается использовать эти природные свойства флуоресценции биогенных нанокластеров и наночастиц различного размера для удобной и точной фотометрической регистрации и оценки динамики процесса их формирования de novo непосредственно в суспензиях живых клеток.

При измерении параметров препаратов наночастиц металлов наиболее широко применяют световую и флуоресцентную спектрометрию. Однако при исследовании биогенных наночастиц металлов, получаемых in situ с участием тех или иных биообъектов, возникают существенные искажения результатов из-за присутствия многочисленных клеток или спор в реакционной смеси. Наибольшие искажения наблюдаются в тех случаях, когда наночастицы формируются непосредственно на поверхности клеток (так называемое инкрустирование биообъекта наночастицами). Эти причины делают метод просвечивающей спектрометрии недостаточно эффективным и не позволяющим точно решать поставленные задачи.

Ранее нами было предложено использование интегрирующей сферы в качестве измерительного элемента спектрофотометра в vis-диапазоне для исследования препаратов биогенных наночастиц серебра, формирующихся in situ, по параметрам отражённого спектра [Сорокин с соавт., 2013]. В данном изобретении мы предлагаем использовать специальную интегрирующую сферу в качестве конструктивного элемента спектрофотометра для регистрации биогенных наночастиц в vis-диапазоне, а также в режиме флюоресценции непосредственно в суспензиях на фоне присутствия в реакционной смеси клеток, спор или фрагментов тканей.

Наиболее близкая к совокупности существенных признаков предлагаемому изобретению является специальная интегрирующая сфера, представляющая собой полый шар, внутренняя поверхность которого покрыта диффузно рассеивающими материалами, что позволяет получать по отражательной и пропускательной способностям наиболее точные спектральные характеристики образцов в области λ_200-2600 нм [Патент РФ 2251667, 2005]. Прототип относится к оптическому приборостроению и предназначен для оценки свойств светорассеивающих материалов. Недостатком прототипа является крупный шаг углублений на внутренней поверхности сферы (7 мм), несоизмеримый с длиной волны 1-5 мкм ближнего ИК-диапазона, который и обусловливает низкую степень диффузности индикатрисы отражения поверхности сферы Морриса. Кроме того, отклонения индикатрисы отражения от идеально диффузной в коротковолновой ИК-области достигают 20-60% при больших углах наблюдения.

Существенные преимущества предложенного изобретения в сравнении с прототипом следующие:

- предложенная конструкция интегрирующей сферы позволяет проводить измерение формирующихся in situ биогенных наночастиц металлов на фоне присутствующих в реакционной смеси клеток или спор как в режиме vis-спектрометрии, так и в флуоресцентном режиме. В прототипе возможны измерения только в ИК-диапазоне;

- предложенная конструкция интегрирующей сферы позволяет удобнее проводить измерение исследуемой клеточной суспензии, находящейся непосредственно на покровном стекле отверстия интегрирующей сферы, или в луночном планшете, располагающемся напротив этого отверстия. В прототипе исследуемый образец необходимо помещать внутрь сферы;

- предложенная конструкция интегрирующей сферы позволяет внесение дополнительных реагентов в исследуемый образец для проведения формирования биогенных наночастиц in situ непосредственно в процессе измерения. В прототипе такая возможность не предусмотрена.

Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности фотометрического определения параметров биогенных наночастиц металлов, формирующихся in situ непосредственно в суспензии живых клеток. Предложенная конструкция интегрирующей сферы разработана для повышения чувствительности фотометрического определения уровня метаболической активности живых клеток на основании регистрации параметров биогенных наночастиц металлов, формирующихся de novo из вносимых непосредственно в суспензии исследуемых клеток стерильных растворов солей как источников катионов. Поскольку в присутствии метаболически активных клеток формирование из катионов нанокластеров нуль-валентных атомов, а затем и более крупных наночастиц происходит с большой скоростью, предлагаемая конструкция интегрирующей сферы предусматривает возможность оценивать динамику их формирования c момента внесения источника катионов.

Для многих металлов установлены параметры освещения, возбуждающего выраженные флуоресцентные свойства нанокластеров размером от 2-5 нм. Применение смеси растворов нескольких солей способно усилить флуоресцентные свойства нанокластеров за счёт присутствия в них восстановленных атомов разных металлов. Периодические фотометрические измерения после внесения в исследуемую суспензию клеток источника катионов позволяет определить момент, когда диаметр формирующихся de novo биогенных нанокластеров восстановленных атомов достигает размеру, соответствующему появлению флуоресценции. В случае высокой восстановительной активности исследуемой суспензии клеток процесс укрупнения нанокластеров путём их самосборки приводит к формированию всё более крупных биогенных наночастиц (от 20-50 нм до 200 нм за 20 минут реакции восстановления катионов). Детально показано, что для нанокластеров серебра частотой возбуждения флуоресценции служит поток с длиной волны λ₃₃₇ нм, для возбуждения флуоресценции нанокластеров золота поток с длиной волны λ₅₁₆ нм. Усиления флюоресценции нанокластеров можно добиться благодаря присутствию в реакционной смеси солей лантаноидов. Для крупных наночастиц некоторых металлов характерно гашение флуоресценции при достижении некоторых размеров. В случае формирования биогенных наночастиц de novo, гашение флуоресценции препарата означает, что все сформировавшиеся наночастицы превышают этот размер.

В предложенной конструкции интегрирующей сферы предусмотрена возможность продолжения регистрации изменения размеров наночастиц в исследуемой суспензии клеток с использованием спектрометрии как в диапазоне vis-спектрометрии, так и в режиме флуоресцентной спектрометрии. Для этого интегрирующая сфера спектрометра оснащена дополнительным модулем переключения режимов светового потока (Фиг. 1. 5) от «белого» с широким спектром частот на отдельно настраиваемые специфические значения длины волны, необходимые для возбуждения флуоресценции нанокластеров восстановленных атомов тех металлов, катионы которых используются в качестве источника при формировании биогенных наночастиц. Модуль режимов светового потока позволяет регулировать общий уровень освещения исследуемого образца. Использование дополнительных светофильтров обеспечивает достижение наибольшей чувствительности измерения спектральных характеристик биогенных наночастиц металлов, формирующихся непосредственно в суспензии живых клеток.

Предложенная конструкция предусматривает удобное размещение исследуемого образца напротив специального отверстия интегрирующей сферы. В заявляемой конструкции интегрирующая сфера располагается таким образом, чтобы отверстие для исследуемого образца (Фиг.1, 1) находится сверху в горизонтальном положении. Такая ориентация отверстия для размещения исследуемого образца позволяет наносить исследуемую суспензию клеток на прозрачное покровное стекло, закрывающее это отверстие (Фиг. 1. А). Второй вариант предусматривает проведение реакции восстановления катионов живыми клетками в лунках планшетов того или иного стандартного типа (Фиг. 1. Б). В обоих случаях предложенная конструкция позволяет внесение стерильных растворов источников катионов (для начала реакции восстановления) непосредственно в исследуемую клеточную суспензию с последующим периодическим повторением измерений.

На Фиг. 1. представлено устройство интегрирующей сферы для регистрации спектров биогенных нанокластеров и наночастиц в vis-диапазоне и в режимах флуоресцентной спектрометрии. Показана схема для измерения непосредственно в капле клеточной суспензии (А), или в лунке планшета (Б). Отверстие в интегрирующей сфере для помещения исследуемого образца 1, датчик измерения характеристик отражённого светового потока 2, источник светового потока 3, образец исследуемой суспензии 4, модуль переключения режимов светового потока 5, светофильтр 6.

Пример 1

Исследуемую суспензию клеток помещают на прозрачное покровное стекло, закрывающее отверстие интегрирующей сферы (Фиг. 1 А). Проводят регистрацию спектральных характеристик в диапазоне vis-спектрометрии для контрольного определения параметров исследуемой суспензии клеток в исходный момент эксперимента (для подтверждения отсутствия в ней наночастиц металлов). В исследуемую суспензию клеток вносят источник катионов в виде аликвоты стерильного раствора соли как источника катионов. Проводят повторную регистрацию спектральных характеристик суспензии клеток в диапазоне vis-спектрометрии для контрольного подтверждения отсутствия наночастиц металлов во внесённой аликвоте источника катионов. Продолжают через необходимые интервалы времени проведение повторных измерений спектральных характеристик образца в диапазоне около специфической длины волны наночастиц используемого металла для регистрации параметров биогенных наночастиц, формирующихся in situ в исследуемой суспензии клеток (Фиг. 2).

На Фиг. 2. представлено изменение специфического спектра наночастиц серебра, формирующихся за 40 минут в образце клеточной суспензии бактерий.

Пример 2

В отдельные лунки многолуночного планшета помещают суспензии клеток, для которых необходимо определить уровень восстановительной активности в отношении катионов. Многолуночный планшет располагают напротив отверстия интегрирующей сферы для исследуемого образца. Проводят регистрацию спектральных характеристик образцов (в диапазоне vis-спектрометрии и в режиме флуоресцентной спектрометрии) для контрольного определения параметров, подтверждающего отсутствие наночастиц металлов в исходный момент эксперимента. Источники катионов вносят в каждый из исследуемых образцов в виде стерильного раствора солей. Возможность перемещения планшетов обеспечивает последовательные циклические повторные измерения спектральных характеристик каждого из исследуемых вариантов образцов через фиксированные промежутки времени. Определяют продолжительности реакции восстановления использованных катионов, необходимого для формирования флуоресцирующих биогенных нанокластеров восстановленных атомов, а также время, соответствующее полному гашению флюоресценции наночастиц.

Пример 3

Исследуемые суспензии природных водных проб помещают в отдельные лунки многолуночного планшета. Располагают планшет напротив отверстия интегрирующей сферы для исследуемого образца. Проводят регистрацию спектральных характеристик исследуемых суспензий клеток микробных сообществ (в диапазоне vis-спектрометрии и в режиме флуоресцентной спектрометрии) для контрольного определения параметров, подтверждающего отсутствие наночастиц металлов в исходный момент эксперимента. Источники катионов вносят в каждый из исследуемых образцов в виде стерильного раствора солей. Проводят повторную регистрацию спектральных характеристик исследуемых суспензий клеток для контрольного подтверждения отсутствия наночастиц во внесённой аликвоте источника катионов. Продолжают через каждые 3 минуты проведение повторных измерений спектральных характеристик образца (в диапазоне vis-спектрометрии и в режиме флуоресцентной спектрометрии). Определяют продолжительности реакции восстановления использованных катионов, необходимого для формирования флуоресцирующих биогенных нанокластеров восстановленных атомов, что соответствует их размеру от 5 нм. На основании полученных результатов спектральных характеристик при специфических значениях длин волн λ наночастиц металлов оценивают уровень активности сравниваемых препаратов клеток в отношении использованных катионов.

Пример 4

В лунки многолуночного планшета вносят по 100-150 мкл стерильных растворов солей в качестве источников катионов - субстратов для формирования наночастиц. Многолуночный планшет располагают напротив отверстия интегрирующей сферы для исследуемого образца с возможностью его перемещения для последовательной регистрации спектральных характеристик в каждой из лунок. Проводят регистрацию спектральных характеристик каждого из образцов (в диапазоне vis-спектрометрии и в режимах флуоресцентной спектрометрии соответствующих использованным источникам катионов) для контрольного определения параметров, подтверждающего отсутствие наночастиц металлов в исходный момент эксперимента. В отдельные лунки помещают препараты опухолевых или нормальных (контрольных) тканей, для которых необходимо определить уровень восстановительной активности в отношении катионов, используемых в эксперименте (Фиг. 3). Продолжают проведение повторных измерений спектральных характеристик каждого из исследуемых вариантов образцов. На основании полученных результатов спектральных характеристик сформировавшихся наночастиц оценивают уровень восстановительной активности сравниваемых препаратов клеток в отношении использованных катионов.

На Фиг. 3. Представлено измерение с использованием интегрирующей сферы поглощения наночастиц серебра (при λ₄₀₀ нм), формирующихся в реакционных смесях, содержащих опухолевые или нормальные клетки.

Источники информации

1. Ильясов С.Г. Интегрирующая сфера для инфракрасной области спектра. Патент РФ 2251667, 2005.

2. Складнев Д.А., Сорокин В.В., Кураков В.В. Способ обнаружения микробной и вирусной контаминации растворов. Патент РФ № 2641960, 2016.

3. Morris J.C., Integrating Sphere to the Infrared. Applied Optics, 1966, 5(6), 1035-1037.

4. Zhou, Y., Wang, H., Lin, W., Lin, L., Gao, Y., Yang, F., Du, M., Fang, W., Huang, J., Sun, D., Li, Q. (2013). Quantitative nucleation and growth kinetics of gold nanoparticles via model-assisted dynamic spectroscopic approach. J. Colloid Interface Sci., 407, 8-16.

5. Sorokin, V.V., Skladnev, D.A., Volkov, V.V., Tereshchenko, E.Y., Mulyukin, A.L., Gal'chenko, V.F. The pathways of silver nanoparticles formation by Mycobacterium smegmatis. Dokl. Biol. Sci., 2013, 452, 325-328.

6. Skladnev D.A., Vasilyeva L.V., Berestovskaya Yu.Yu., Kotsyurbenko O.R., Kalenov S.V., Sorokin V.V. Detection of microorganisms in low-temperature water environments by in situ generation of biogenic nanoparticles. Front. Astron. Space Sci., 2020, 7:59.

7. Szerencsés B., Igaz N., Tóbiás Á., Prucsi Z., Rónavári A., Bélteky P., Dániel, Papp C., Makra I., Vágvölgyi C., Kónya Z., Pfeiffer I., Kiricsi M. Size-dependent activity of silver nanoparticles on the morphological switch and biofilm formation of opportunistic pathogenic yeasts. BMC Microbiol., 2020, 20, 176. Published online 2020 Jun 22. doi: 10.1186/s12866-020-01858-9.

Изобретение относится к области оптического приборостроения и касается способа фотометрической регистрации формирования биогенных наночастиц металлов с использованием интегрирующей сферы. Способ включает расположение интегрирующей сферы таким образом, чтобы ее отверстие находилось сверху в горизонтальном положении, размещение над отверстием покровного стекла или луночного планшета, нанесение исследуемой суспензии живых клеток или фрагментов тканей на покровное стекло или в луночный планшет. Исследуемый образец освещают посредством модуля обеспечения режимов светового потока как в режиме спектрометрии в видимом диапазоне длин волн, так и в режиме флуоресцентной спектрометрии и измеряют спектральные характеристики образца. Далее в исследуемый образец вносят источник катионов металлов и проводят повторные измерений спектральных характеристик образца через заданные промежутки времени при проведении реакции восстановления катионов. Технический результат заключается в повышении точности оценки метаболической активности исследуемых биологических объектов, а также обеспечении возможности проведения измерений биогенных наночастиц в капле реакционной смеси или в луночном планшете. 4 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ фотометрической регистрации формирования биогенных наночастиц металлов с использованием интегрирующей сферы, включающий расположение интегрирующей сферы таким образом, чтобы отверстие интегрирующей сферы находилось сверху интегрирующей сферы в горизонтальном положении, размещение покровного стекла, закрывающего это отверстие, или размещение напротив отверстия луночного планшета, нанесение исследуемой суспензии живых клеток или фрагментов тканей на покровное стекло или в луночный планшет, освещение исследуемого образца посредством модуля обеспечения режимов светового потока как в режиме спектрометрии в видимом диапазоне длин волн, так и в режиме флуоресцентной спектрометрии, измерение спектральных характеристик образца, внесение в исследуемый образец источников катионов металлов и проведение повторных измерений спектральных характеристик образца через заданные промежутки времени при проведении реакции восстановления катионов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что исследуемые суспензии живых клеток или фрагменты тканей помещают в лунки многолуночного планшета, который для проведения измерений располагают напротив отверстия интегрирующей сферы для образца с возможностью перемещения.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию восстановления катионов проводят непосредственно в исследуемых образцах клеточной суспензии.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что динамику формирования биогенных нанокластеров и наночастиц металлов регистрируют путём последовательных измерений спектральных характеристик реакционной смеси в режиме спектрометрии в видимом диапазоне длин волн и в режиме флуоресцентной спектрометрии.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника катионов в исследуемые суспензии клеток вносят стерильный раствор солей, обеспечивающих максимальную флюоресценцию формирующихся нанокластеров и наночастиц металлов.