Способ подготовки пыльцевых зерен для сканирующей электронной микроскопии Российский патент 2025 года по МПК G01N1/28 A01H1/02 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано при селекции, цитологии, палинологии, аллергологии.

Известен способ подготовки живого материала пыльцы для сканирующей электронной микроскопия с использованием 2,2-диметоксипропан (ДМП) и сушка в критической точке (Halbritter, Н. (1998) Preparing living pollen material for scanning electron microscopy using 2,2-dimethoxypropane (DMP) and critical-point drying. Biotechnic & Histochemistry, 73, 137-143).

Для дегидратации пыльцевых зерен автор предлагает 2,2-Диметоксипропан (ДМП). который представляет собой органическое соединение формулы (СН3)2С(ОСН3)2, которое является продуктом конденсации ацетона и метанола. Дегидратация в ДМП от 20-30 минут до 24 часов. Затем пыльники переносят в 100% ацетон на несколько минут и затем проводят финальную сушку при критической точке в жидком СО₂.

Аппараты для сушки при критической точке являются относительно дорогими устройствами (стоимость их достигает порядка 20 тысяч долларов США на 2010 год)

- ацетон - летучее бесцветное вещество органического происхождения с характерным сильным запахом. Вдыхание паров ацетона способствует развитию хронического бронхита, астмы и других заболеваний дыхательной системы.

Наиболее близким, к изобретению по совокупности существенных признаков относится способ, представленный в работе «Гексаметилдисилазан как осушитель для сканирующей электронной микроскопии пыльцы» Chissoe, W.F., Vezey, E.L. and Skvarla, J.J. (1994) Hexamethyldisilazane as a drying agent for pollen scanning electron microscopy. Biotechnic & Histochemistry, 69, 192-198. (Чиссо, В.Ф., Вези, Э.Л. и Скварла, Дж.Дж. (1994).)

Собранную пыльцу помещают в коническую пробирку и подвергают ацетолизу: смесь, содержащая уксусный ангидрид, смешанный с концентрированной серной кислотой в соотношении 9:1 согласно описанному ранее методу (Erdtman, G. 1960. The acetolysis method. A revised description. Sven.Bot. Tidskr. 54: 561-564.). Затем удаляют непереваренные грубые фрагменты растений путем фильтрации через тонкую проволочную сетку и помещают приблизительно 1 миллилитр водной суспензии пыльцы в 30% сахарозу для финальной очистки от механических примесей на 10-30 минут согласно ранее описанному методу (Chissoe, W. F. and Skvarla, J. J. 1974. Sucrose density pads for concentration and purification of pollen grains. Stain Technol. 49: 123-124.). Обезвоживание осуществляют с помощью 5-минутных промываний в восходящих концентрациях этанола, последняя промывка в 100% этаноле. После этого два раза по 5 минут финальная сушка в 100% гексаметилдисилазане (ГМДС).

Основной недостаток - сложность исполнения подготовки пыльцевых зерен для сканирующей электронной микроскопии.

Из анализа известных аналогичных технических решений выявлено, что технической проблемой в данной области является необходимость создания простых в исполнении способов подготовки пыльцевых зерен для сканирующей электронной микроскопии с высоким уровнем успеха.

Технический результат предлагаемого изобретения - получение высококачественного изображения ультраструктуры пыльцевых зерен с хорошо выраженной структурой экзины и апертуры.

Для решения технической проблемы и достижения заявленного результата в способе подготовки пыльцевых зерен для сканирующей электронной микроскопии, свежие пыльцевые зерна предварительно фиксируют в 2,5% формальдегиде в течение 10 минут, удаляя полленкит с поверхности экзины, обеспечивая сохранение формы пыльцевых зерен, приближенную к оригинальной, после чего пыльцевые зерна в 2,5% формальдегиде фильтруют, а в качестве обезвоживающего раствора для финальной дегидратации образцов используют гексаметилдисилазан.

Предлагаемый способ подготовки пыльцевых зерен для сканирующей электронной микроскопии позволяет получить высококачественные изображения ультраструктуры пыльцевых зерен с хорошо выраженной структурой экзины и апертуры, что является ключевым моментом для использования пыльцы как супервектора в геномном редактировании и эффективном создании новых сортов с заданными свойствами, которые не являются ГМО, так как не содержат чужеродный генетический материал.

Благодаря использованию формальдегида для фиксации повышается качество подготовки образцов пыльцевых зерен для изучения их ультраструктуры. Формальдегид осуществляет сшивки протеинов, что обеспечивает сохранение формы пыльцевого зерна максимально приближенной к оригинальной. Кроме того, формальдегид удаляет с поверхности пыльцевого зерна полленкит - богатый липидами слой, покрывающий поверхность экзины пыльцевого зерна, что позволяет получить высококачественное изображения архитектуры экзины.

Использование ГМДС для финальной дегидратации образцов приводит к получению высокой доли пыльцевых зерен практически без искажений. ГМДС имеет пониженное поверхностное натяжение, а также сшивает белки, что повышает прочность образца во время сушки на воздухе. Кроме того, обработка ГМДС увеличивает зарядный потенциал, что важно при обязательном использовании металлического покрытия образцов для СЭМ.

В предлагаемом способе используют деликатную фиксацию свежих пыльцевых зерен в 2.5% формальдегиде в течение 10 минут, что позволяет сохранить форму пыльцевых зерен, приближенную к оригинальной.

Для очистки образцов от механических примесей используют простую и быструю фильтрацию через фильтр, снабженный нейлоновой сеткой с соответствующим размером.

Существенными признаками, характеризующими изобретение, являются

- использование 2.5% формальдегида в течение 10 минут для сохранения формы пыльцевых зерен приближенной к оригинальной и для удаления полленкита с поверхности экзины, что позволяет получить четкие изображения ее ультраструктуры;

- применение гексаметилдисилазана (ГМДС) для финальной сушки образцов вместо сушки при критической точке в жидком СО₂, значительно снижает затраты, так как не требуют дорогостоящего оборудования;

- применение этанола для дегидратации образцов вместо ацетона, который часто используют в подготовке образцов для СЭМ, что делает предлагаемый способ более привлекательным для пользователей. Вдыхание паров ацетона способствует развитию хронического бронхита, астмы и других заболеваний дыхательной системы.

- применение фильтров делает метод простым и удобным для пользователей и не требует специальной подготовки.

- время от сбора пыльцы до просмотра препаратов пыльцевых зерен в сканирующем электронном микроскопе занимает около одного часа (50-55 минут) благодаря хорошо отработанному протоколу, удобному для пользователя с применением минимального числа реактивов.

Примеры конкретного выполнения способа.

Для подготовки пыльцевых зерен для СЭМ используют реактивы:

2,5% формальдегид готовят свежеприготовленным из параформальдегида: 2,5 г параформальдегида растворить в 100 мл 0,1 М PBS при нагревании (60°С) и магнитной мешалке (150 об/мин). Для облегчения растворения периодически добавляют несколько капель NaOH (1М). После растворения рН доводят до 7,4.

0.1 М PBS (Фосфатно-солевой буфер): 8 г NaCl, 0.2 г KCl, 2.2 г Na2HPO4⋅7H2O и

0.26 г KH2PO4 растворить в 100 мл дистиллированной воды

70%, 90% и 96% этанол

Гексаметилдисилазан (СН₃)₃SiNHSi(СН₃)₃

1. Пыльцевые зерна собрать в чашки Петри диаметром 5 см.

2. Добавить 2,5% формальдегид в чашку Петри с пыльцой и оставить на 10 минут.

3. Пыльцевые зерна в 2,5% формальдегиде профильтровать через фильтр с соответствующим размером сетки, так чтобы пыльцевые зерна остались на фильтрующей сетке.

4. Пыльцевые зерна на сетке фильтра тщательно промыть, медленно капая 2 мл PBS из пипетки на сетку фильтра в течение 3 мин.

5. Пыльцевые зерна на сетке фильтра обезводить (дегидратировать) путем последовательной промывки 70%, 90% и 96% этанолом по 3 минуты путем капания этанола аналогично описанному выше

6. После обезвоживания пыльцевые зерна на сетке пропитывают ГМДС путем медленного добавления 500 мл ГМДС в течение 3 минут и сушат на воздухе до полного испарения в течение как минимум 10 минут или оставляют на ночь

7 Пыльцевые зерна высыпают, слегка постукивая по фильтру, на клейкую двустороннюю углеродную ленту, помещенную в чашку Петри или непосредственно на столик для микроскопии с предварительно наклеенной двусторонней углеродной лентой.

8. Перед сканирующей электронной микроскопией пыльцевые зерна покрывают золотом в атмосфере аргона.

SEM анализ пыльцевых зерен провести с использованием сканирующего электронного микроскопа JEOL JCM-7000 или JEOL JSM-6380LA при ускоряющем напряжении 15 кВ и высоком вакууме, что обеспечивает хорошее разрешение, но требует обезвоживания образцов во избежание испарения и образования тумана.

Выводы. Способ получения высококачественных препаратов пыльцевых зерен для сканирующей электронной микроскопии обеспечит получение высококачественного изображения ультраструктуры пыльцевых зерен с хорошо выраженной структурой экзины и апертуры, отличается низкой стоимостью, минимальными затратами времени, простотой исполнения и высоким уровнем успеха, так как испытан на представителях основных групп культурных растений.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ подготовки пыльцевых зерен для сканирующей электронной микроскопии, предусматривающий фиксирование свежих пыльцевых зерен в 2,5% формальдегиде, фильтрацию и отмывку пыльцевых зерен; затем проводят стадию дегидрирования последовательной промывкой 70%, 90% и 96% этанолом и осуществляют финальную дегидратацию образцов гексаметилдисилазаном. Изобретение обеспечивает изображение ультраструктуры пыльцевых зерен с выраженной структурой экзины и апертуры. 1 табл., 1 пр.

Способ подготовки пыльцевых зерен для сканирующей электронной микроскопии, предусматривающий фиксирование свежих пыльцевых зерен в 2,5% формальдегиде, фильтрацию и отмывку пыльцевых зерен; затем проводят стадию дегидрирования последовательной промывкой 70%, 90% и 96% этанолом и осуществляют финальную дегидратацию образцов гексаметилдисилазаном.