СПОСОБ ОЦЕНКИ МОРФОЛОГИИ ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН РАСТЕНИЙ Российский патент 2015 года по МПК A01H1/04 

Использование: ботаника, цитология растений, селекция растений.

Сущность изобретения: В основе способа лежит морфоцитологический анализ эпилюминесценции пыльцевых зерен, окрашенных смесью растворов флуорохромов - пиронина Б и Hoechst 33258. В результате разработки предлагаемого приема окрашивания установлено, что пиронин Б избирательно окрашивает экзину пыльцевых зерен в оранжево-красный цвет, а несвязанный с ДНК Hoechst 33258 вызывает яркую желто-зеленую флуоресценцию апертур пыльцевых зерен, значительно превосходящую уровень их автофлуоресценции. Получаемые изображения окрашенных пыльцевых зерен отличаются четкостью и цветовой контрастностью структур оболочки.

Заявляемое изобретение относится к области ботаники, цитологии и селекции растений и может быть использовано для ускоренного выявления морфологических особенностей оболочки пыльцевых зерен, и в частности размеров, количества и расположения апертур, через которые осуществляется рост пыльцевых трубок.

Предлагаемый способ может иметь важное значение для селекции растений при определении морфологического качества пыльцевых зерен у выборки генотипов как одного из косвенных признаков нормального протекания процесса микроспорогенеза, а также уровня плоидности исследуемых растений. Количество апертур в оболочке пыльцевых зерен - один из детерминированных на генетическом уровне морфологических маркеров уровня плоидности у растений одного таксономического рода (Бреславец, 1963). При кратном увеличении базового числа хромосом генотипа (n=х) возрастает количество апертур в его пыльцевых зернах. Вследствие этого, данный признак часто используют для предварительного отбора экспериментально полученных полиплоидных форм из массы подвергаемого полиплоидизации растительного материала одного вида, сорта или генетической линии.

Изучение морфологии оболочки пыльцы и количества апертур возможно путем ее окрашивания с последующей световой микроскопией препаратов, однако в данном случае ограничен набор красителей и отмечается низкий цветовой контраст апертур на фоне оболочки. Для этих целей наиболее часто применяют 1%-ный раствор основного фуксина, избирательно окрашивающего экзину пыльцевых зерен в насыщенный красный цвет. При этом апертуры не окрашиваются и выделяются на фоне экзины только в экваториальной плоскости; в аксиальной плоскости они частично маскируются окрашенной экзиной с верхней или нижней стороны. Данную проблему можно успешно решить с помощью применению флуоресцентных красителей (флуорохромов), способных вызывать окрашивание различных клеточных структур.

Люминесцентная микроскопия пыльцы предполагает ее окрашивание флуоресцентными красителями с последующим анализом флуоресценции, индуцированной падающим светом определенного диапазона длин волн. Для окрашивания пыльцевых зерен растений наиболее часто применяют такие флуорохромы, как акридиновый оранжевый, анилиновый синий, примулин (Методические рекомендации…, 1988).

В результате использования примулина оболочка пыльцевых зерен флуоресцирует зеленым светом, а апертуры - желтым светом, однако из спектральной близости желтых и зеленых оттенков общая контрастность окрашенных препаратов пыльцы является недостаточной для быстрого анализа ее морфологических особенностей.

Наиболее близким по своей сущности к заявленному изобретению является метод изучения морфологического качества пыльцы путем ее окрашивания по Г.М. Козубову (1967) 0,000002-0,00001%-ным водным раствором акридинового оранжевого и цитологического анализа с помощью люминесцентного микроскопа. При сравнительной простоте данный метод позволяет проводить анализ морфологии пыльцы и по зеленовато-желтой окраске отличать стерильные пыльцевые зерна.

Однако указанный метод имеет и ряд недостатков: получаемые изображения окрашенных пыльцевых зерен характеризуются близкими цветовыми оттенками, что делает низкой контрастность апертур на общем фоне экзины пыльцевых зерен. Кроме того, у фертильной пыльцы акридиновый оранжевый окрашивает ядра вегетативной и генеративной клеток, которые из-за флуоресценции могут быть ошибочно приняты у отдельных видов растений за апертуры округлой формы - поры.

Целью изобретения является разработка способа ускоренной оценки морфологического качества пыльцы за счет получения контрастного люминесцентного окрашивания экзины и апертур пыльцевых зерен растений.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, - повышение контрастности люминесцентного окрашивания апертур пыльцевых зерен.

Вследствие единого принципа морфоанатомического строения пыльцы покрытосеменных растений предлагаемый способ позволяет оценить особенности морфологии пыльцевых зерен с разным типом апертур у растений различных систематических групп.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем.

Предварительно готовят красящий раствор и хранят его до применения. Выделенную из пыльников и слегка подсушенную пыльцу окрашивают на предметном стекле в капле красителя, накрывают покровным стеклом, выдерживают до контрастного окрашивания препарата (в среднем 5-30 минут) и просматривают с помощью люминесцентного микроскопа при заданной комбинации возбуждающего и запирающего светофильтров. При необходимости производят фотодокументирование полученных изображений окрашенных пыльцевых зерен, видимых в поле зрения микроскопа.

Hoechst 33258, или бисбензимид Н 33258 (Bisbenzimide H 33258; полное химическое название - {2-[2-(4-гидроксифенил)-6-бензимидазол]-6-(1-метил-4-пиперазинил)-бензимидазол}-тригидрохлорид; 2′-(4-гидроксифенил)-5-(4-метил-1-пиперазинил)-2,5′-ди-(1H-бензимидазол)) - флуоресцентный краситель состава C₂₅H₂₄N₆O·3HCl·5H₂O с молекулярной массой M_r=623,96. В цитологических и гистологических исследованиях применяется для окрашивания ядер и хромосом, что обусловлено его связыванием с ДНК. Максимумы длин волн поглощения и излучения света данным флуорохромом зависят от pH раствора при окрашивании ДНК. При связывании красителя с ДНК максимум его эмиссии составляет 465 нм при длине волны возбуждающего света 360 нм.

Несвязанный с ДНК (т.е. чистый) раствор красителя Hoechst 33258 имеет зеленую флуоресценцию с максимумом эмиссии в диапазоне 510-540 нм, такой же оттенок флуорохрома наблюдается при изучении препаратов, обработанных его растворами повышенных концентраций (при концентрации рабочего раствора флуорохрома 50 нг/мл). В таком свободном состоянии Hoechst 33258 способен контрастировать оболочку клеток растений, что было экспериментально показано при изучении первичных растительных клеточных стенок (Hernandez et al., 1988). Это свойство раствора Hoechst 33258 использовано в данном изобретении.

Ранее флуоресцентные красители пиронин Б и Hoechst 33258 не применяли для окрашивания оболочек пыльцевых зерен ни в одной из существующих цитологических методик. При окрашивании пыльцы каждым из данных флуорохромов в отдельности контрастной картины удовлетворительного качества не наблюдается. Hoechst 33258 при связывании с ДНК окрашивает ядра вегетативной и генеративной клеток пыльцы, а в несвязанном виде усиливает автофлуоресценцию апертур пыльцевых зерен. Пиронин Б избирательно окрашивает экзину пыльцы, однако без контрастирования апертур их автофлуоресценция у пыльцы некоторых видов растений является недостаточной. Только совместное применение пиронина Б и Hoechst 33258 при окрашивании пыльцы позволяет получить контрастные люминесцентные изображения, обладающие приемлемой для морфоцитологического анализа четкостью. При этом через окрашенную пиронином Б экзину становятся невидимыми вегетативное и генеративное ядра пыльцы, что снижает вероятность их ошибочной идентификации в качестве пор.

Для приготовления комплексного красителя смешивают 20 объемных частей 0,00001%-ного водного раствора Hoechst 33258 и 1 часть 2%-ного спиртового раствора пиронина Б, перемешивают и хранят в закрытой емкости из темного стекла в холодильнике.

Цитологический анализ пыльцы проводят с помощью инвертированного люминесцентного микроскопа в диапазоне длин волн возбуждающего света 340-380 нм и с использованием запирающего фильтра, пропускающего длинноволновую часть спектра более 510 нм. Пыльцевые зерна исследуемого растительного генотипа помещают на предметное стекло, окрашивают в капле заранее приготовленного комплексного флуоресцентного красителя, и, накрыв препарат покровным стеклом, изучают эпилюминесценцию поверхности пыльцы. Наблюдают контрастное избирательное окрашивание оболочки пыльцевых зерен - желто-зеленый оттенок апертур, обусловленный флуоресценцией несвязанного с ДНК раствора Hoechst 33258, на общем оранжево-красном фоне экзины, окрашенной пиронином Б.

Полученное контрастное изображение окрашенных пыльцевых зерен позволяет за небольшой промежуток времени изучить несколько их морфологических параметров - общие линейные размеры или диаметр пыльцы; количество апертур, их тип, размеры и взаимное расположение, возможные аномалии их морфологии. Пыльцевые зерна мелкой фракции, в большинстве являющиеся гипоанеуплоидными, окрашиваются в насыщенно-красный цвет без флуоресценции апертур и выделяются среди общего количества морфологически нормальной пыльцы.

Метод окрашивания пыльцевых зерен смесью растворов пиронина Б и Hoechst 33258 в объемном соотношении 20:1 позволяет быстро получить четкую картину расположения и размеров апертур у пыльцы разных генотипов сельскохозяйственных культур, в том числе плодовых и ягодных растений, а также выявить различные морфологические аномалии ростовых пор.

Пример 1. Определена возможность применения способа окрашивания пыльцы смесью растворов красителей пиронина Б и Hoechst 33258 в объемном соотношении 20:1 и последующего микроскопического эпилюминесцентного анализа препаратов пыльцевых зерен у генотипов рода Ribes L. разного уровня плоидности. Так, у растений смородины красной диплоидного сорта Голландская красная (2n=2x=16) морфологически нормальная фертильная пыльца содержит 4-8 округлых пор, имеющих зелено-желтую флуоресценцию при окрашивании экзины в насыщенно-красный цвет. При этом даже в случае использования монохромного фотодокументирования просматриваемых флуоресцентных изображений получаются контрастные фотографии пыльцевых зерен, на которых отчетливо различимы апертуры на общем фоне экзины (фиг.1, а). У тетраплоидного аналога (2n=4x=32) данного сорта пыльцевые зерна содержат в экзине 7-14 пор, окрашиваемых аналогично (фиг.1, б).

Пример 2. При окрашивании и последующей эпи-люминесцентной микроскопии отмечены сходные аномалии в количестве, взаимном расположении и размерах апертур у пыльцевых зерен триплоидных генотипов яблони домашней Malus domestica L. (на примере сорта Рождественское, 2n=3x=51) и вишни обыкновенной Cerasus vulgaris Mill. (на примере элитной формы Восторг, 2n=3x=24). Пыльца данных триплоидов из-за нарушений цитокинеза при ее образовании отличается наличием 3-6 апертур в форме борозд различной ширины, удаленных на разном расстоянии друг от друга, отделенных друг от друга или соединенных тонкими поперечными бороздами (фиг.2, а).

Пример 3. Экспериментально установлена возможность применения способа окрашивания пыльцы смесью растворов красителей пиронина Б и Hoechst 33258 в объемном соотношении 20:1 и последующего микроскопического эпи-люминесцентного анализа препаратов пыльцевых зерен у растений разных систематических групп - как дикорастущих, так и возделываемых человеком: зерновые (рожь озимая), плодовые (яблоня, лимон) и ягодные (смородина), цветочно-декоративные культуры (лилия, бегония) (фиг. 3). Универсальность предлагаемого способа связана с единым принципом морфоанатомического строения пыльцы покрытосеменных растений и общим принципом действия используемых красителей на окрашиваемые структуры пыльцевого зерна.

При использовании данного способа пыльцевые зерна с одной апертурой - однопоровые и однобороздные - приобретают наиболее четкую картину окрашивания (фиг. 3, пыльца ржи и лилии). Многоапертурная пыльца имеет более информативное изображение в полярной проекции вследствие отображения всех апертур; в экваториальной проекции возможно наблюдение лишь части апертур (фиг. 3, пыльца лимона). Тем не менее данный способ позволяет с минимальными затратами времени изучать размеры, количество и расположения апертур у пыльцевых зерен различных типов, принадлежащих растениям разных систематических групп.

Список используемой литературы

1. Бреславец Л.П. Полиплоидия в природе и опыте / Л.П. Бреславец. - М.: Изд-во АН СССР, 1963. - 364 с.

2. Козубов Г.М. Люминесцентный метод изучения пыльцы растений / Г.М. Козубов // Ботанический журнал. - 1967. - Т. 52. - №8. - С. 1156-1157.

3. Методические рекомендации по применению циологических методов в плодоводстве / Под общ. ред. Н.П. Романовой. - М., 1988. - 52 с.

4. Hernandez, L.F. et al. Fluorescent staining of primary plant cell walls using bis-benzimide (33258 Hoechst) fluorochrome // Stain Technol. - 1988. - Vol. 63 - P. 190.

Изобретение относится к селекции растений. Изобретение представляет собой способ оценки морфологии пыльцевых зерен растений, заключающийся в их окрашивании и индукции флуоресценции в падающем свете с помощью инвертированного люминесцентного микроскопа, отличающийся тем, что препарат пыльцы на предметном стекле обрабатывают комплексным красителем, состоящим из 20 объемных частей 0,00001%-ного водного раствора Hoechst 33258 и 1 части 2%-ного спиртового раствора пиронина Б, и изучают эпи-люминесценцию окрашенных пыльцевых зерен, возбуждаемую падающим светом в диапазоне длин волн 340-380 нм, с запирающим светофильтром, пропускающим длинноволновую часть спектра более 510 нм. Изобретение позволяет ускорить оценку морфологии пыльцевых зерен, размеров и характера расположения их апертур по получаемых контрастным изображениям. 3 ил., 3 пр.

Способ оценки морфологии пыльцевых зерен растений, заключающийся в их окрашивании и индукции флуоресценции в падающем свете с помощью инвертированного люминесцентного микроскопа, отличающийся тем, что препарат пыльцы на предметном стекле обрабатывают комплексным красителем, состоящим из 20 объемных частей 0,00001%-ного водного раствора Hoechst 33258 и 1 части 2%-ного спиртового раствора пиронина Б, и изучают эпи-люминесценцию окрашенных пыльцевых зерен, возбуждаемую падающим светом в диапазоне длин волн 340-380 нм, с запирающим светофильтром, пропускающим длинноволновую часть спектра более 510 нм.