ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ПИКРОЗИД Российский патент 2025 года по МПК A61K31/7048 A61K9/20 A61K9/08 A61K36/80 A61K47/10 A61K33/06 A61P7/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей очищенное соединение, выделенное из Picrorrhiza kurroa. Конкретнее, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей очищенный пикрозид, выделенный из Picrorrhiza kurroa. Более конкретно, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей очищенный пикрозид I, для предотвращения или лечения иммунопатологического состояния, такого как нейтропения, и ее применению.

Уровень техники

Индуцированная лекарственными средствами нейтропения - иммунопатологическое состояние - является серьезным и опасным для жизни неблагоприятным явлением, которое может возникать в связи с лечением различными лекарственными средствами. Чаще всего обусловленная цитотоксической терапией нейтропения характеризуется предсказуемым и зависящим от дозы снижением количества нейтрофилов. Нейтропения ассоциируется с рядом химиотерапевтических и нехимиотерапевтических лекарственных препаратов, включая, но не ограничиваясь указанными, циклофосфамид, тионамид, клозапин, дапсон, метимазол, пенициллин, ритуксимаб, прокаинамид, сульфасалазин, тиамазол, карбимазол, амоксициллин, котримоксазол, тиклопидин и валганцикловир. Нейтропения в результате нехимиотерапевтических лекарственных средств является менее распространенной, чем нейтропения, обусловленная химиотерапией. Хотя данное состояние может возникнуть в любое время в течение курса лечения в зависимости от первичной терапии, чаще всего оно случается в пределах первых недель после введения лекарственного средства. Затронутые болезнью пациенты в большинстве случаев испытывают тяжелую нейтропению в течение от нескольких недель до нескольких месяцев после первого воздействия лекарственного средства. Индуцированная лекарственными средствами нейтропения характеризуется уменьшенной выработкой или увеличенным разрушением нейтрофилов. Клиническим последствием нейтропении является восприимчивость к инфекции, пропорциональная степени нейтропении, что может привести даже к смерти.

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) одобрены Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) для использования при лечении тяжелой нейтропении с лихорадкой. G-CSFs и GM-CSFs продемонстрировали доказанную эффективность по их способности уменьшать число случаев, величину и длительность нейтропении после применения химиотерапии и поэтому являются широко распространенными вариантами лечения индуцированной лекарственными средствами нейтропении. Однако нет ни одного лекарственного средства без отрицательного воздействия. Некоторыми из распространенных симптомов, наблюдаемыми после введения G-CSF, являются одышка, боль в груди, тошнота, гипоксемия, потоотделение, анафилаксия, обморок и гиперемия. Для сравнения неблагоприятные эффекты GM-CSFs являются умеренными, такими как жар, боль в мышцах, плохое самочувствие, сыпь и реакция в месте инъекции, но также известно, что при высоких дозировках случаются серьезные последствия, такие как, перикардит и тромбоз. Это обстоятельство повышает необходимость в улучшенных методах лечения, предпочтительно происходящих из природных источников с повышенной безопасностью и эффективностью.

В последние десятилетия спектр заболевания сместился к комплексным хроническим заболеваниям, требующим агрессивной терапии, такой как химиотерапия. Как правило, синтетические лекарственные средства в большей степени связаны с неблагоприятными воздействиями и токсичностью, которые добавляются к нагрузке на пациента. Стратегия Всемирной организации здравоохранения 2002–2005, связанная с лекарственными средствами, настоятельно советует прием лекарственных средств растительного происхождения в качестве комплементарной или альтернативной медицины во всем мире. Согласно данным ВОЗ приблизительно 70% мировой популяции использует лекарственные препараты растительного происхождения в качестве комплементарной терапии в течение последних двух десятилетий. Лекарственные препараты растительного происхождения часто вводятся одновременно с терапевтическими лекарственными средствами для лечения основных заболеваний благодаря общему мнению, что они не имеют нежелательных побочных эффектов.

Picrorhiza kurroa является хорошо известным лекарственным растением, традиционно популярным в Индийской аюрведической системе, применяемым для лечения расстройств органов дыхания и печени. Пикрозид I и пикрозид II являются двумя из наиболее важных компонентов, найденных в корнях и корневищах растения. Пикрозид I и пикрозид II используются в фитопрепаратах по отдельности и в комбинации. Фармакологические преимущества пикрозида I и пикрозида II широко обсуждаются в литературе и связаны с проявлением антиоксидантной, противовоспалительной, противоаллергической, гепатопротекторной, желчегонной, антиастматической и противоопухолевой активности. Однако не сообщалось о композиции, содержащей пикрозид I или пикрозид II или их комбинации для лечения нейтропении.

Исходя из этого, авторы изобретения представляют новое фармакологическое преимущество пикрозида при лечении нейтропении. Раскрытое здесь изобретение сфокусировано на разработке композиции, содержащей активный ингредиент, полученный из природных источников для лечения нейтропении. Следовательно, согласно настоящему изобретению, обеспечена композиция, содержащая пикрозид, для лечения нейтропении. Конкретнее, обеспечена композиция, содержащая пикрозид I, для лечения нейтропении. Кроме того, описывается новый индустриализированный способ выделения пикрозида I и пикрозида II. Настоящее изобретение также относится к способу приготовления указанной новой фармацевтической композиции, содержащей пикрозид. Настоящее изобретение также относится к способу лечения или предотвращения нейтропении у субъекта, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества новой композиции, содержащей активный ингредиент, такой как пикрозид I.

Раскрытие сущности изобретения

На основании вышеизложенного, для преодоления недостатков известного уровня техники задачей настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пикрозида I, для лечения или предотвращения нейтропении.

Для решения указанной задачи настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую очищенный пикрозид I и фармацевтически приемлемые эксципиенты, для лечения или предотвращения нейтропении у субъекта, нуждающегося в этом. Кроме того, указанная композиция может находиться в пероральной или инъецируемой форме.

Согласно одному варианту осуществления обеспечивается фармацевтическая композиция для лечения нейтропении, содержащая терапевтически эффективное количество очищенного пикрозида I и приемлемые фармацевтические носители или эксципиенты.

Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит от 100 до 400 мг очищенного пикрозида I и приемлемые фармацевтические носители или эксципиенты.

Согласно предпочтительному варианту осуществления количество очищенного пикрозида I в указанной фармацевтической композиции составляет от 150 до 400 мг.

Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция является пероральной или инъецируемой композицией.

Согласно предпочтительному варианту осуществления пероральная фармацевтическая композиция имеет форму таблетки.

Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит наполнитель, растворитель и смазывающее вещество. Согласно другому варианту осуществления наполнителем является F melt типа C, растворитель является этанолом, смазывающее вещество является стеаратом магния. Согласно предпочтительному варианту осуществления количество наполнителя составляет около 98 процентов по массе, количество смазывающего вещества составляет около 1 процента по массе.

Согласно одному важному варианту осуществления обеспечивается фармацевтическая композиция для лечения нейтропении, содержащая 390 мг очищенного пикрозида I, наполнитель, растворитель, смазывающее вещество, при этом указанная композиция является готовой для перорального введения.

Согласно альтернативному варианту осуществления инъецируемая фармацевтическая композиция находится в форме препарата для инъекции.

Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит растворитель. Согласно предпочтительному варианту осуществления растворителем является 2,5% ПЭГ400.

Согласно одному важному варианту осуществления обеспечивается фармацевтическая композиция для лечения нейтропении, содержащая 195 мг очищенного пикрозида I и растворитель, при этом указанная композиция является стерильной, имеет значение pH в пределах от 4,0 до 7,0 и является готовой для подкожного введения.

Согласно одному варианту осуществления инъецируемая фармацевтическая композиция содержится в предварительно заполненном стерильном шприце или флаконе или картридже.

Согласно одному важному варианту осуществления обеспечивается способ лечения нейтропении у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества пикрозида I, содержащегося в указанной композиции.

Согласно одному варианту осуществления композицию вводят субъекту один раз в день. Согласно другому варианту осуществления композицию вводят субъекту в течение периода времени до 5 последовательных дней.

Подробное описание изобретения

Чтобы разъяснить рассмотренные выше и другие задачи, признаки и преимущества настоящего изобретения, конкретный вариант осуществления этого изобретения подробно описывается с примерами, изложенными ниже. Принцип и способ действия этого изобретения описан и проиллюстрирован в этом варианте осуществления. Прежде всего, специалисту в данной области техники будет понятно, что это изобретение на практике может быть осуществлено иначе, чем конкретно описано и проиллюстрировано. Изобретение не следует ограничивать описанным вариантом осуществления, способом и примерами, так как оно включает все варианты осуществления и способы в пределах сущности и объема данного изобретения. Кроме того, в нижеследующем описании изобретения определенная терминология может использоваться только с целью ссылки и не предназначена для ограничения.

В случае если приводится диапазон значений, должно быть понятно, что также раскрывается каждое промежуточное значение, до одной десятой единицы нижнего предела, между верхним и нижним пределами этого диапазона, если контекст явно не указывает иное. Каждый меньший диапазон между любым установленным значением и/или промежуточным значением в установленном диапазоне и любым другим установленным или промежуточным значением в этом установленном диапазоне охватывается изобретением. Верхний и нижний пределы этих более узких диапазонов независимо могут включаться или исключаться из диапазона, и каждый диапазон, в котором один из двух, ни один из двух или оба предела включаются в более узкий диапазон, также охватывается изобретением, за исключением специально исключенного предела в установленном диапазоне. В случае если установленный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один из двух или оба из включенных пределов, также охватываются изобретением.

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую соединение пикрозид, полученное из P. Kurroa, предназначенную для лечения или предотвращения иммунопатологических состояний, таких как нейтропения. Конкретнее, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую пикрозид I для лечения или предотвращения нейтропении. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает новый индустриализированный способ выделения пикрозида I и пикрозида II из P. kurroa. Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения или предотвращения нейтропении у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества новой композиции, содержащей активный ингредиент пикрозид I вместе с фармацевтически приемлемым носителем или дополнительными компонентами.

Соответственно, задача настоящего изобретения состоит в обеспечении фармацевтической композиции, содержащей пикрозид I, для лечения или предотвращения нейтропении у субъекта, страдающего от нейтропении, путем введения указанному субъекту терапевтически эффективного количества указанной композиции, содержащей активный ингредиент пикрозид I вместе с фармацевтически приемлемым носителем или дополнительными компонентами.

Термин «пикрозид I», раскрытый в описании, включает пикрозид I, выделенный из P. kurroa. Термин «Picrorhiza kurroa (Пикрориза курроа)» или «P. kurroa», раскрытый в описании, включает культивированное или выросшее естественным путем и коммерчески доступное растение, но не ограничивается этим. Picrorhiza kurroa Royle ex Benth., более известное под названием «Кутки» или Кутаки», является многолетним травянистым растением из семейства Scrophulariacae, растет в дикой форме в северо-западных областях Гималаев и в области Гархвал в Индии. С 1970 года P. kurroa включено в список Фармакопеи Индии (1970) как официальное лекарственное средство. Таким образом, было заготовлено коммерчески доступное в Индии растение P. kurroa. Соответственно, в настоящем изобретении растительное сырье и экстракт были заготовлены в больших количествах. Корни Picrorhiza kurroai добывали в Ноорнихале, Анекале, Бангалоре; номер партии RM/PK/SEP-19-03. Водный экстракт Picrorhiza kurroai был получен из Ноорнихала, Анекала, Бангалора; номер партии RDP/PK/011.

Следует отметить, что травы и растения могут быть обработаны и могут иметь различные формы для приема разными путями, и в этом случае речь может идти о препаратах для инъекций, капсулах и таблетках, которые содержат сырое растение или его высушенный экстракт в молотой или порошкообразной форме. Соответственно, часть растения может использоваться в виде сырого материала, или его жидкого и/или твердого экстракта. Подходящие методики включают несколько стадий, например, вымачивание, фильтрование и экстракцию с использованием сверхкритических жидкостей, для приготовления материала используются сжиженные газы или подходящие растворители. Пикрозид I и пикрозид II получают из корней и корневищ P. kurroa. Компоненты, которые должны быть экстрагированы из растительного материала, дополнительно очищаются и выделяются для того, чтобы сделать их пригодными для целевого использования в композиции для лечения или предотвращения нейтропении. Объектом настоящего изобретения является способ экстрагирования, дополнительной очистки и выделения пикрозида I и пикрозида II из P. kurroa для получения очищенного пикрозида I и пикрозида II.

Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит очищенный пикрозид I. Соответственно, обеспечивается способ экстракции, дополнительной очистки и выделения пикрозида I и пикрозида II из P. kurroa с целью получения очищенного пикрозида I и пикрозида II. В описании раскрывается способ экстракции пикрозида I и пикрозида II из P. kurroa, включающий стадии: приготовление крупного порошка из корней и корневищ P. kurroa и затем использование экстрагирующего агента, выбранного из воды, деминерализованной воды, метанола, этанола в разных соотношениях и т.д. или их смеси при заранее определенном значении pH; проведение, по меньшей мере, еще одного цикла экстракции с использованием указанного растворителя при предварительно определенной температуре; сбор и фильтрование жидкого экстракта; выпаривание жидкого экстракта под вакуумом при заранее определенной температуре для получения сухого порошкообразного экстракта. Также в описании раскрывается способ дополнительной очистки пикрозида I и пикрозида II из сухого порошкообразного экстракта P. kurroa, включающий стадии: растворение сухого порошкообразного экстракта в воде, загрузку на колонку с ионообменной смолой для хроматографии, сбор первой фракции в воду; сбор, по меньшей мере, еще двух последующих фракций в метанол, промывку колонки метанолом и высушивание концентрата, содержащего пикрозид I и пикрозид II. Способ выделения пикрозида I и пикрозида II из P. kurroa включает стадии: использование колоночной хроматографии с силикагелем; растворение указанного экстрагированного и очищенного экстракта в метаноле; сбор, по меньшей мере, одной фракции, содержащей пикрозид I или пикрозид II в метанол и хлороформ; использование тонкослойной хроматографии для элюирования пикрозида I и пикрозида II.

Конкретно, в описании раскрывается метод экстракции пикрозида I и пикрозида II из P. Kurroa, включающий стадии: экстракции крупного порошка из корней и корневищ P. kurroa с использованием деминерализованной воды в качестве экстрагирующего агента, выбранного из воды, при этом значение pH находится в пределах 6,5 - 7,5; проведение, по меньшей мере, еще одного цикла экстракции с использованием указанного растворителя при температуре в пределах между 50-90°C; сбор и фильтрование жидкого экстракта; выпаривание жидкого экстракта под вакуумом при температуре в пределах между 40 - 55°C до получения сухого порошкообразного экстракта, и характеризующийся выходом экстракта около 28,75%. Способ для дополнительной очистки пикрозида I и пикрозида II из P. kurroa включает стадии: использование методов обращенно-фазовой хроматографии, включая применение смол, выбранных из Diaion-HP-20, Amberlite-XAD-4,8,7,16 и т.д. Предпочтительно выбираются смолы, подходящие для предварительной очистки полярных соединений, таких как фенолы. Загруженную колонку повторно промывают водой до тех пор, пока не будет получен бесцветный элюат. Кроме того, колонку промывают 30% метанолом в воде и собирают фракции. Эту стадию повторяют до получения бесцветных элюатов. Затем колонку промывают 100% метанолом и собирают фракции примерно около 100 мл. Фракции проверяют с помощью тонкослойной хроматографии (TLC) на предмет интересующих маркеров под УФ и выбранные фракции высушивают до получения концентрата, содержащего примерно от 4 до 6% пикрозида I и примерно от 5 до 8% пикрозида II.

Высушенную фракцию ресуспендируют в метаноле, адсорбируют на силикагеле, при этом два объема силикагеля добавляют к метанол-пикрозидной смеси и высушивают с помощью роторного испарителя. Затем высушенный материал загружают на колонку с силикагелем, которая заполнена хлороформом. Колонку промывают хлороформом, 2% метанолом в хлороформе, затем 3% метанолом в хлороформе и, наконец, 4% метанолом в хлороформе. Данный метод обеспечивает очищенный пикрозид I и пикрозид II в 4% метаноле в хлороформной фракции. Выбирают фракции, содержащие минимальное количество загрязняющих веществ и максимальное количество пикрозида, высушивают их и взвешивают. Затем вычисляют окончательный вес для установления общего выхода. Далее чистоту проверяют с помощью ВЭЖХ. При этом способе первым элюируется пикрозид I, а затем пикрозид II, характеризующиеся чистотой содержания около 96,42% и около 89,02%, соответственно.

Авторы настоящего изобретения отмечают, что вышеописанный способ по настоящему изобретению занимает более короткое время: 3 часа для очистки пикрозида I, по сравнению со способом, известным из предшествующего уровня техники (Hussain et al., 2013), требующим 6 часов, что все равно приводит к незначительно более высокому выходу. Соответственно, в способе по настоящему изобретению используется простой растворитель, т.е. вода, безопасная среда, по сравнению с использованием двух недружественных по отношению к окружающей среде растворителей, таких как петролейный эфир, этанол и т.д., как сообщается в предшествующем уровне техники (Hussain et al., 2013)

Авторы настоящего изобретения также отмечают, что указанные очищенные пикрозид I и пикрозид II демонстрируют способность к лечению и предотвращению иммунопатологических состояний, а именно нейтропении, в различных in vivo тестах на мышах. Исходя из имеющейся информации, эта антинейтропеническая активность пикрозида I или пикрозида II не была известна ранее. Кроме того, отмечается, что пикрозид I проявляет несколько более желательную активность в отношении лечения или предотвращения нейтропении по сравнению с пикрозидом II. Кроме того, мыши, которых лечили пикрозидом I, показали более высокое количество белых клеток крови (WBC) по сравнению с мышами, которых лечили пикрозидом II. Соответственно, пикрозид I был выбран в качестве кандидата для композиции для лечения нейтропении вследствие его суммарного эффекта на количества нейтрофилов и WBC. Основной задачей настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции пикрозида I для лечения или предотвращения нейтропении. Таким образом, в соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую очищенный пикрозид I, полученный вышеописанными способами и предназначенный для лечения или предотвращения нейтропении. Фармацевтическая композиция пикрозида II также раскрывается в описании.

Термин «лечить», раскрытый в описании, означает любое действие с целью облегчения или благоприятного изменения симптома, связанного с определенным заболеванием или нарушением, раскрытым в описании, путем введения указанной композиции, а термин «предотвратить», раскрытый в описании, означает любое действие с целью ингибирования или отсрочки возникновения определенного заболевания или нарушения, раскрытого в описании, путем введения указанной композиции.

Один вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую очищенный пикрозид I, полученный вышеописанными способами, и фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты, для лечения или предотвращения нейтропении. Термин «фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты», определенный в данном описании, включает фармацевтические добавки, неактивные ингредиенты, красящие вещества, вкусовые вещества, связывающие вещества, смягчающие вещества, наполнители, смазывающие вещества, консервирующие вещества и вещества других классов, используемые для приготовления медикаментов, которые хорошо известны в данной области техники или из предшествующих литературных источников.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая очищенный пикрозид I, может быть приготовлена в виде лекарственной формы для перорального применения, например, порошка, таблетки, капсулы, мягкой капсулы, водосодержащих лекарственных препаратов, сиропа, эликсира, пилюль, порошков, саше, гранул. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению в пероральной дозированной форме должна быть таблеткой. В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция должна дополнительно содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как наполнители, растворители и смазывающие вещества. В предпочтительном варианте осуществления наполнитель должен быть F melt типа C, растворитель должен быть этанолом, и смазывающее вещество должно быть стеаратом магния. Следует отметить, что количества эксципиентов должны быть пропорциональны количеству активного ингредиента, т.е. пикрозида I. Соответственно, количество наполнителя должно быть около 98% по массе, количество смазывающего вещества должно быть около 1% по массе.

Таким образом, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения обеспечивается фармацевтическая композиция для лечения нейтропении, содержащая 390 мг очищенного пикрозида I, наполнитель, растворитель, смазывающее вещество, при этом указанная композиция должна быть готовой для перорального введения.

Композиция согласно настоящему изобретению также может быть приготовлена в виде фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемые носители, адьюванты или разбавители, например, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбитол, маннитол, ксилитол, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Композиция может дополнительно включать средства, препятствующие агглютинации, увлажняющие вещества, ароматизирующие вещества, эмульгаторы, консервирующие вещества и т.д. Композиции по изобретению могут быть приготовлены таким образом, чтобы обеспечить быстрое, непрерывное или замедленное высвобождение активного ингредиента после их введения пациенту с помощью любого способа, хорошо известного в данной области техники.

В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция, содержащая очищенный пикрозид I, может быть приготовлена в виде инъекционного препарата, например, раствора, суспензии или эмульсии. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению должна быть инъекционным раствором. В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция должна дополнительно содержать фармацевтически приемлемый растворитель, выбранный из метанола, 2,5% ПЭГ400, 5% ПЭГ400, 5% DMSO, 5% этил лактата и 1,4% пропиленгликоля. В предпочтительном варианте осуществления указанная композиция должна содержать 2,5% ПЭГ400, при этом значение pH композиции должно находиться в пределах от 4,0 до 7.0. Следует отметить, что инъецируемые композиции по настоящему изобретению также могут растворяться в маслах или других растворителях, которые обычно используются для получения инъекционных препаратов. Подходящие примеры носителей включают физиологический раствор, этанол, растительные масла, изопропил миристат и т.д., но не ограничиваются указанными. В другом варианте осуществления настоящего изобретения инъецируемая композиция должна быть стерильной и готовой к использованию, при этом композиция может содержаться в предварительно заполненном шприце или флаконе или картридже или в любом другом подходящем виде или среде.

Таким образом, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения обеспечивается фармацевтическая композиция для лечения нейтропении, содержащая 195 мг очищенного пикрозида I и растворитель, при этом указанная композиция является стерильной и готовой для подкожного введения, имея значение pH в пределах от 4,0 до 7,0.

Способы получения составов и эксципиентов будут описаны в дальнейшем, однако настоящее изобретение не ограничивается этим. Характерные примеры приготовления изложены ниже.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения также обеспечивается способ лечения или предотвращения нейтропении у субъекта, причем данный способ включает введение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество очищенного пикрозида I, полученного с помощью вышеописанных способов, субъекту, страдающему от нейтропении.

Следовательно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечивается способ лечения или предотвращения нейтропении у субъекта, при этом способ включает введение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество очищенного пикрозида I, полученного с помощью вышеописанных способов, субъекту, страдающему от нейтропении.

В предпочтительном варианте осуществления обеспечивается способ лечения нейтропении у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества пикрозида I в виде пероральной композиции или в виде инъецируемой композиции. В предпочтительном варианте осуществления указанная композиция вводится субъекту один раз в день.

В другом предпочтительном варианте осуществления указанная композиция вводится субъекту в течение периода времени до 5 последовательных дней.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения также обеспечивается применение композиции, содержащей очищенный пикрозид I, полученный с помощью вышеописанных способов, и фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты, для производства лекарственных препаратов, используемых для лечения или предотвращения нейтропении.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться субъекту разными путями. В соответствии с одним воплощением настоящего изобретения термин «субъект», определенный в описании, включает животных, таких как крыса, мышь, домашние животные, или человека. Предусматривается несколько способов введения, например, введение может быть осуществлено перорально, или с помощью внутривенной, внутримышечной, подкожной инъекции. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что различные модификации и варианты могут быть сделаны в композициях, применении и препаратах настоящего изобретения без отклонения от сущности и объема изобретения.

В соответствии с одним аспектом изобретения желательная дозировка пикрозида I может варьироваться в зависимости от состояния и веса субъекта, тяжести, лекарственной формы, пути и периода введения, и может быть выбрана специалистами в данной области техники. Следует отметить, что для оценки начальной дозы у людей сделана экстраполяция дозы с животных на людей с использованием аллометрического масштабирования и с учетом различия в фармакокинетике и фармакодинамике между видами. Например, доза 1 мг и 2 мг для введения мышам экстраполируется как доза 195 мг и 390 мг для введения людям, соответственно.

Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения предусматривается, что для получения желательных эффектов, обычно рекомендуется вводить людям количество соединения по настоящему изобретению, а именно очищенного пикрозида I, в пределах от 100 до 200 мг/день, предпочтительно от 150 до 200 мг/день, более предпочтительно от 190 до 200 мг/день. Доза может быть введена за один раз или может быть введена за несколько раз в день. Такое введение может быть сделано в течение 5 последовательных дней.

Поскольку нейтропения непосредственно связана с количеством нейтрофилов, эффект композиции на состояние специфически отражается на количестве нейтрофилов, а также на количестве WBC. Соответственно, для того, чтобы определить эффект пикрозида I на нейтропению, были проведены in vivo тесты на мышах. Нейтропения была индуцирована у мышей путем введения циклофосфамида для создания животной экспериментальной модели. Мышам с индуцированной нейтропенией вводили композицию, содержащую пикрозид I, и наблюдали за изменениями веса тела, контролировали количество нейтрофилов по анализу крови и клинические симптомы, такие как токсичность и смертность. Исследовательская модель была воспроизведена у мышей с индуцированной нейтропенией при введении композиции, содержащей пикрозид II. Авторы изобретения отмечают, что оба и пикрозид I и пикрозид II в значительной степени вызывают регрессию индуцированной циклофосфамидом нейтропении у мышей. Кроме того, эффективность и активность пикрозида I для лечения нейтропении сравнивали с G-CSF, который является лекарственным средством, одобренным FDA для лечения данного состояния. Авторы изобретения также отмечают, что результаты лечения пикрозидом I мышей были сравнимы с результатами лечения мышей G-CSF.

Как описано в настоящем изобретении, заявленная композиция очищенного пикрозида I, полученного из P. Kurroa, показала сильную антинейтропеническую активность по результатам in vivo тестов с использованием швейцарских мышей альбиносов с нейтропенией, индуцированной лекарственным средством, например, теста на пролиферацию и активность нейтрофилов под воздействием возникновения нейтропении. Следовательно, композиция может использоваться в качестве терапевтического средства для лечения и предотвращения нейтропении.

Включение в описание изобретения сведений в качестве ссылки

Публикации, упомянутые в данном подробном описании, включаются в описание в качестве ссылки в равной мере, как если бы каждая отдельная публикация была конкретно и по отдельности включена посредством ссылки.

Примеры

Следующие примеры предоставляются только с иллюстративной целью и рассматриваются как типичные примеры раскрытия изобретения и не предназначаются для ограничения объема пунктов формулы изобретения, предоставленных в этом описании.

Пример 1. Приготовление сырого экстракта P. kurroa

400 г крупного порошка корневищ Picrorhiza kurroa экстрагировали деминерализованной водой при pH 6,5-7,5. Около 2000 мл воды добавили для каждого цикла. Всего было проведено три цикла при 80°C. Жидкий экстракт собрали и профильтровали через PP-фильтр для удаления дебриса. Затем профильтрованный жидкий экстракт выпаривали под вакуумом при 50-55°C с помощью роторного испарителя с получением сухого порошка из экстракта. Компонентный анализ был выполнен с помощью ВЭЖХ. Результат ВЭЖХ подтвердил, что сырой экстракт Picrorhiza kurroa содержал примерно от 4 до 6 % пикрозида I и примерно от 5 до 8% пикрозида II.

Пример 2. Приготовление очищенного экстракта пикрозида I и пикрозида II из P. kurroa

Сырой экстракт P. kurroa был приготовлен с помощью метода экстракции согласно Примеру 1. 100 мл HP20 смолы загрузили на колонку и уравновесили водой. 13 г водного экстракта P. kurroa полностью растворили в 100 мл воды и адсорбировали на смоле. Первая фракция была собрана с помощью 300 мл воды. Вторую фракцию собрали с помощью 30% метанола в 300 мл воды. Третью фракцию собрали с помощью 60% метанола в 400 мл воды. Колонку промыли метанолом. Было отмечено, что третья фракция и использованный для промывки метанол содержали как пикрозид I, так и пикрозид II. Обе фракции были смешаны вместе и высушены до получения концентрата.

Компонентный анализ был проведен с помощью ВЭЖХ. Результат ВЭЖХ подтвердил, что очищенный экстракт P. kurroa содержал около 14,41% пикрозида I и около 16,60% пикрозида II.

Пример 3. Выделение пикрозида I и пикрозида II из P. kurroa

Очищенный экстракт P. Kurroa получили с помощью метода экстракции согласно Примеру 2. Выделение проводили с помощью обычной колоночной хроматографии с силикагелем. 90г силикагеля (100-200#) загрузили вместе с хлороформом в стеклянную колонку. 6 г очищенного экстракта растворили в достаточном количестве метанола. Далее, 12 г силикагеля (60-120#) добавили для абсорбции. Эту смесь высушили и загрузили на слой силикагеля. Сбор нескольких фракций начинали 5% метанолом в хлороформе. Фракции были объединены вместе согласно шаблону TLC.

Компонентный анализ проводили с помощью ВЭЖХ. Результат ВЭЖХ подтвердил, что были получены пикрозид I с чистотой около 96,2% и пикрозид II с чистотой около 89,02%.

Пример 4. Получение таблетки пикрозида I

Приготовление таблетки

Очищенный пикрозид I, полученный с помощью методов согласно Примерам 1, 2 и 3, использовали для указанной пероральной композиции. Таблетки получали путем растворения пикрозида I в достаточном количестве этанола (5 мл на партию из 50 таблеток). F-melt типа C предварительно профильтровали через сито #40 и гранулировали, используя предыдущую стадию. Гранулированную влажную массу, полученную таким образом, высушили при 60°C. Затем высушенные гранулы просеяли, используя ASTM #40, и смазали ASTM #60. Стеарат магния «пропускали» вручную. Таблетки прессовали, используя указанные ниже параметры:

Размеры пуансона: 5,5 мм стандартное углубление; Целевой вес: 70 мг; Прочность: 30-50 N; D.T: 1-2 мин; Толщина: 2,6±0,2 мм; Истираемость: NMT 1%

Таблица 1. Состав таблетки пикрозида I (1 мг)

Ингредиенты мг/таблетку масс./масс.% Пикрозид I 1,0 1,43 F melt типа C 68,50 97,86 Этанол qs Стеарат магния 0,5 0,71

qs – сколько потребуется

Вышеописанный способ, включая параметры процесса и соотношение ингредиентов, был повторен для приготовления таблетированной лекарственной формы пикрозида II. 1 мг пикрозида II добавили в композицию вместо 1 мг пикрозида I.

Пример 5. Приготовление инъекционной композиции с пикрозидом I и тест на стабильность

Приготовление инъекционного препарата

Для указанной инъекционной композиции использовали очищенный пикрозид I, полученный с помощью методов согласно Примерам 1, 2 и 3. Инъекционный препарат был приготовлен путем растворения 1 мг пикрозида I в растворителе под контролем значения pH примерно в диапазоне от 4 до 7, затем им наполняли ампулы и далее стерилизовали с помощью обычного способа, используемого при получении инъекционных препаратов. Для сравнительных композиций для растворения пикрозида I использовали различные растворители, такие как метанол, 2,5% ПЭГ400, 5% ПЭГ400, 5% ДМСО, 5% этил лактат и 1,4% пропиленгликоль.

Растворы обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Для количественного анализа использовали ВЭЖХ. Было установлено, что композиции, приготовленные с 2,5% ПЭГ400, являются наиболее подходящими, и их дополнительно анализировали на стабильность.

Вышеописанный способ, включая параметры процесса и соотношение ингредиентов, был повторен для приготовления инъекционной композиции пикрозида II. 1 мг пикрозида II добавили в композицию вместо 1 мг пикрозида I.

Данные о стабильности

Три композиции, содержащие 1 мг пикрозида I и 2,5% ПЭГ400, обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин и оставляли стоять при комнатной температуре (RT), 2-8°C и 40°C, 75%RH (относительная влажность) в течение 1 месяца. Для количественного анализа с помощью ВЭЖХ брали образец (20 мкл) при 220 нм. Все композиции демонстрировали отличную стабильность в течение периода 1 месяц.

Таблица 2. Анализ стабильности инъекционной композиции пикрозида I и 2,5% ПЭГ400; количественный анализ был проведен с помощью ВЭЖХ.

Температурные условия Результат % (1 месяц) 2-8°C 96,59 RT 102,33 40°C, 75% RH 86,89

Пример 6. Тест на экспериментальной модели на животных (мыши)

Для установления анти-нейропенического действия пикрозида I был проведен тест с использованием мышей с индуцированной нейтропенией.

Подготовка экспериментального животного

Швейцарских мышей-альбиносов собственного разведения содержали в стандартных лабораторных условиях, таких как, кондиционированный воздух с адекватной подачей свежего воздуха (воздухообмен 12-15 в час), комнатная температура 21,1 - 23,2°C и относительная влажность 55-69%, со строгим 12-часовым циклом день-ночь в экспериментальной комнате. Мышей акклиматизировали к лабораторным условиям в течение минимального периода времени 7 дней.

Введение циклофосфамида с целью индуцирования нейтропении

Отобранных швейцарских мышей-альбиносов случайным образом разбили на четыре группы, исходя из веса тела, в каждой группе было 6 мышей. Животным в Группах 2 и 3, 4 внутрибрюшинно вводили 150 мг/кг циклофосфамида в День 0 для того, чтобы индуцировать нейтропению. В День 3 животные из Групп 2, 3 и 4 показали циклофосфамид-индуцированную нейтропенизацию при сравнении с Группой 1 (Контроль). В День 4, мышам из Групп 2, 3 и 4 вновь ввели однократную дозу 100 мг/кг циклофосфамида. Общий подсчет и определение лейкоцитарной формулы (нейтрофилы, лимфоциты и моноциты) был выполнен в День 3. Количество нейтрофилов на День 3 сравнили между группами с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим критерием Дуннетта или t-критерием Стьюдента. Значение P<0.05 считали статистически значимым.

Таблица 3. Среднее количество WBC% и нейтрофилов% в День 3 после введения циклофосфамида

Группы % WBC % нейтрофилов Группа 1 6,52 25,83 Группа 2 1,78 19,33 Группа 3 1,53 20,83 Группа 4 2,00 21,83

Пример 7. Введение пикрозида I (в инъекционной форме) мышам с вызванной циклофосфамидом нейтропенией

Нейтропению, связанную с циклофосфамидом, индуцировали у мышей с помощью метода из Примера 6. Инъекционную композицию приготовили с помощью метода согласно Примеру 5. Композицию с пикрозидом I вводили подкожно в дозе 1 мг/мышь/день животным в Группе 3 в течение 5 дней, начиная с Дня 5 и заканчивая в День 10. Композицию с пикрозидом II вводили подкожно в дозе 1 мг/мышь/день животным в Группе 4 в течение 5 дней, начиная с Дня 5 и заканчивая в День 10. В День 10 вновь отбирали кровь для подсчета общего количества лейкоцитов и определения лейкоцитарной формулы (нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов) вручную. Количество нейтрофилов в День 10 сравнили между группами с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим критерием Дуннетта или t-критерием Стьюдента. Значение P<0.05 считали статистически значимым. Кроме того, наблюдали за изменением веса тела мышей и проявлением любых клинических симптомов.

Не было отмечено связанных с лечением изменений веса тела у мышей, получавших пикрозид I или пикрозид II. Также не было отмечено клинических признаков токсичности и случаев смертности у мышей, получавших пикрозид I или пикрозид II.

Результаты Дня 10 показали, что циклофосфамид вызвал нейтропению и снижение общего количества лейкоцитов в Группе 2 (обозначенной как «Контроль с носителем») по сравнению с Группой 1 (обозначенной как «Нормальный контроль»). Лечение Группы 3 и Группы 4 Пикрозидом I и Пикрозидом II, соответственно, показало значительное увеличение, как общего количества лейкоцитов, так и количества нейтрофилов в День 10 по сравнению с Группой 2, указывая на полное устранение нейтропении. Кроме того, пикрозид I и пикрозид II повышали количество нейтрофилов (P<0,01) более, чем у мышей в Группе 1 (нормальный контроль).

На основании вышеизложенного, очевидно, что инъекция пикрозида I и пикрозида II в значительной степени способствует регрессии индуцированной циклофосфамидом нейтропении у мышей.

Таблица 4. Среднее количество нейтрофилов % и WBC% в День 10 после введения пикрозида I и пикрозида II

Группы % Нейтрофилов (день 3) % Нейтрофилов (день 10) % WBC
(день 3) % WBC
(день 10) Группа 1 25,83 26,17 6,52 6,37 Группа 2 19,33 20,17 1,78 3,08 Группа 3 (Пикрозид I) 20,83 32,67 1,53 9,23 Группа 4 (Пикрозид II) 21,83 32,83 2,00 6,98

Пример 8. Введение пикрозида I (перорально) мышам с индуцированной циклофосфамидом нейтропенией

Нейтропения, связанная с циклофосфамидом, была индуцирована у мышей с помощью метода согласно Примеру 6. Композиция для пероральной таблетки была приготовлена с использованием способа из Примера 4. Композицию пикрозида I вводили перорально в дозе 2 мг/мышь/день (2 таблетки) животным в Группе 1 и Группе 2 в течение 5 дней, соответственно начиная в День 5 и заканчивая в День 10. Для сравнительного исследования пероральную композицию вводили, используя дистиллированную воду и ПЭГ. Конкретнее, пероральные таблетки вводили в дистиллированной воде мышам в Группе 1 и в 5% ПЭГ мышам в Группе 2. В День 10 вновь собирали кровь для подсчета общего количества лейкоцитов и определения лейкоцитарной формулы (нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов) вручную. Количество нейтрофилов в День 10 сравнили между группами с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим критерием Дуннетта или t-критерием Стьюдента. Значение P<0,05 считали статистически значимым. Кроме того, наблюдали за изменением веса тела мышей и проявлением любых клинических симптомов.

Не было отмечено связанных с лечением изменений веса тела у мышей, обработанных пикрозидом I. Также не было отмечено клинических признаков токсичности и случаев смертности у мышей, обработанных пикрозидом I.

Результаты Дня 10 продемонстрировали, что лечение мышей в Группе 1 пикрозидом I в дистиллированной воде и в Группе 2 пикрозидом I в 5% ПЭГ показало значительное повышение как общего количества лейкоцитов, так и количества нейтрофилов в День 10 по сравнению с Днем 3.

Исходя из вышеизложенного, совершенно ясно, что таблетки пикрозида I для перорального приема в значительной степени устраняют индуцированную циклофосфамидом нейтропению у мышей.

Таблица 5. Среднее количество нейтрофилов и WBC в День 10 после введения пикрозида I

Группы Нейтрофилы (10⁹/л)
(день 3) Нейтрофилы (10⁹/л)
(день 10) WBC (10⁹/L)
(день 3) WBC (10⁹/L)
(день 10) Группа 1 0, 38 1, 58 1, 75 9, 5 Группа 2 0, 31 1, 03 2, 01 8, 9

Пример 9. Сравнительное введение пикрозида I и G-CSF мышам с нейтропенией, индуцированной циклофосфамидом

Нейтропения, связанная с циклофосфамидом, была индуцирована у мышей с помощью метода из Примера 6. Группа 1 была обозначена как контрольная группа с носителем, Группа 2 была обозначена как контрольная группа с циклофосфамидом, Группа 3 – как получавшая пикрозид I и Группа 4 - как получавшая G-CSF. Композицию пикрозида I вводили подкожно в дозе 1 мг/мышь/день животным в Группе 3 в течение 5 дней, соответственно начиная с Дня 5 и заканчивая в День 10. G-CSF композицию вводили подкожно в дозе 2 мкг/мышь/день животным в Группе 4 в течение 5 дней, соответственно начиная в День 5, а заканчивая в День 10. В День 10 вновь собирали кровь для общего подсчета лейкоцитов и дифференцированного подсчета (нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов) вручную. Количество нейтрофилов в День 10 сравнивали между группами с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с последующим критерием Дуннетта или t-критерием Стьюдента. Значение P<0,05 считалось статистически значимым. Кроме того, гепатотоксичность определяли по уровням ALT и AST.

Результаты показали, что лечение пикрозидом I вызывало уменьшение индуцированного циклофосфамидом снижения % нейтрофилов. Наблюдаемые изменения в группе с введением пикрозида I были сравнимы с изменениями при лечении G-CSF. Введение пикрозида I мышам вызывало существенную коррекцию (p<0,001) уровней AST и ALT по сравнению с Группой 2. Это наблюдаемое снижение AST и ALT было сравнимо с уровнями AST и ALT, достигнутыми после лечения G-CSF.

Таблица 6. Среднее количество нейтрофилов % в Дни 0, 3 и 10 после введения пикрозида I и G-CSF

Группы % Нейтрофилы (день 0) % Нейтрофилы (день 3) % Нейтрофилы (день 10) Группа 1
(контроль) 47, 30 48, 20 47, 10 Группа 2
(CPH контроль) 46, 20 6, 800 8, 500 Группа 3 (Пикрозид I) 46, 00 6, 600 23, 90 Группа 4
(G-CSF) 46, 10 6, 700 28, 20

Таблица 7. Эффект пикрозида I при гепатотоксичности, вызванной циклофосфамидом

Группы AST (IU/L) ALT (IU/L) Группа 1
(контроль) 25, 82 22, 32 Группа 2
(CPH контроль) 136, 70 119, 30 Группа 3 (Пикрозид I) 50, 32 37, 16 Группа 4
(G-CSF) 50, 54 36, 17

Ссылки

Hussain A, Shadma W, Maksood A, Ansari SH. Protective effects of Picrorhiza kurroa on cyclophosphamide-induced immunosuppression in mice. Pharmacognosy Research, 2013; 5: 30-36.

Группа изобретений относится к применению фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пикрозида I, для лечения или предотвращения нейтропении, также относится к лечащей нейтропению фармацевтической композиции, содержащей 390 мг пикрозида I, наполнитель, растворитель или смазывающее вещество, также относится к лечащей нейтропению фармацевтической композиции, содержащей 195 мг пикрозида I и растворитель, причем указанная композиция является стерильной, также относится к способу лечения нейтропении у субъекта, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пикрозида I. Группа изобретений обеспечивает применение пикрозида I для лечения или предотвращения нейтропении. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 7 табл., 9 пр.

1. Применение фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пикрозида I, для лечения или предотвращения нейтропении.

2. Применение по п. 1, где композиция содержит от 100 до 400 мг пикрозида I и фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты.

3. Применение по п. 2, причем количество пикрозида I в композиции составляет от 150 до 400 мг.

4. Применение по п. 1, где указанная композиция является пероральной или инъецируемой композицией.

5. Применение по п. 4, где указанная пероральная композиция имеет форму таблетки.

6. Применение по п. 5, где композиция дополнительно содержит наполнитель, растворитель и смазывающее вещество.

7. Лечащая нейтропению фармацевтическая композиция, содержащая 390 мг пикрозида I, наполнитель, растворитель или смазывающее вещество.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, которая является готовой для перорального введения.

9. Фармацевтическая композиция по п. 7, в которой наполнитель представляет собой F melt типа C, растворителем является этанол, а смазывающим веществом является стеарат магния.

10. Фармацевтическая композиция по п. 7, в которой количество наполнителя составляет около 98% по массе и количество смазывающего вещества составляет около 1% по массе.

11. Применение по п. 4, где указанная инъецируемая композиция имеет форму препарата для инъекции.

12. Применение по п. 11, где композиция дополнительно содержит растворитель.

13. Лечащая нейтропению фармацевтическая композиция, содержащая 195 мг пикрозида I и растворитель, причем указанная композиция является стерильной.

14. Фармацевтическая композиция по п. 13, которая имеет значение pH в пределах от 4,0 до 7,0.

15. Фармацевтическая композиция по п. 13 или 14, которая является готовой для подкожного введения.

16. Фармацевтическая композиция по п. 13, в которой растворитель представляет собой 2,5% ПЭГ400.

17. Фармацевтическая композиция по п. 13, где композиция содержится в предварительно заполненном стерильном шприце, или флаконе, или картридже.

18. Способ лечения нейтропении у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пикрозида I, применяемой в п. 1.

19. Способ по п. 18, согласно которому композицию вводят субъекту один раз в день.

20. Способ по п. 18, согласно которому композицию вводят субъекту в течение периода времени до 5 последовательных дней.