Способ изготовления функционально активной полимерной заплаты для артериальной реконструкции, устойчивой к аневризмообразованию Российский патент 2025 года по МПК A61L27/18 A61L27/26 A61L27/28 A61L27/54 A61L27/56 A61L33/04 A61L33/10 A61F2/06 

Изобретение относится к области медицины. Описан способ изготовления высокопористой полимерной заплаты, содержащей в своем составе проангиогенные факторы, предназначенной для применения в сердечно-сосудистой хирургии для реконструкции и восстановления стенки кровеносных сосудов, полученной методом электроспиннинга из биосовместимых полимеров и биологически активных компонент, стимулирующих полноценную эндотелизацию и ремоделирование заплаты после ее имплантации в сосудистую стенку, а также обладающей атромбогенной активностью за счет поверхностного гидрогелевого покрытия с включенными в него антиагрегантами и антикоагулянтами. В качестве полимеров используется смесь ε-поликапролактона и термопластичного полиуретана, что придает заплате устойчивость к аневризмообразованию в силу очень медленной скорости гидролиза полиуретана; в качестве биоактивных компонент выступают сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor, VEGF) и основной фактор роста фибробластов (basic fibroblast growth factor, bFGF) и хемоаттрактантная молекула - стромальный фактор 1 альфа (stromal cell-derived factor 1 alpha, SDF-1α); в качестве лекарственнонаполненного покрытия выступает гидрогель на основе поливинилпирролидон с присоединенными к нему иломедином и гепарином. При этом высокопористая структура заплаты и ее форма в виде лоскута достигается проведением электроспиннига 5% - 8% раствора смеси полимеров в трихлорметане и жидкой фазы раствора биологически активных компонент, введенной в полимерный раствор, на плоскую поверхность металлического коллектора или металлический барабан диаметром от 8 до 200 мм с последующим выкраиванием заплаты необходимого размера. Заплата после имплантации в стенку кровеносного сосуда подвергается ремоделированию с формированием нативной сосудистой ткани. На сегодняшний день существуют два основных подхода к закрытию артериотомии после удаления атеросклеротических бляшек и прочих образований, критично сужающих просвет артериальных сосудов - первичное ушивание и ангиопластика заплатой. При первичном ушивании на края разреза артерии накладываются швы. Заплата вшивается в область артериотомии, что позволяет расширить просвет кровеносного сосуда. При этом в клинической практике предпочтение отдается ангиопластике заплатой, что обеспечивает значимое снижение частоты осложнений в раннем и позднем послеоперационных периодах (Naylor A.R, Ricco J.B., de Borst G.J., Debus S., de Haro J., Halliday A., Hamilton G., Kakisis J., Kakkos S., Lepidi S., Markus H.S., McCabe D.J., Roy J., Sillesen H., van den Berg J.C., Vermassen F., Esvs Guidelines Committee, Kolh P., Chakfe N., Hinchliffe R.J., Koncar I., Lindholt J.S., Vega de Ceniga M., Verzini F., Esvs Guideline Reviewers, Archie J., Bellmunt S., Chaudhuri A., Koelemay M., Lindahl A.K., Padberg F., Venermo M. Editor's choice e management of atherosclerotic carotid and vertebral artery disease: 2017 clinical practice guidelines of the european society for vascular surgery (ESVS). Eur J Vase Endovasc Surg 2018; 55: 3-81).

Наиболее часто в качестве заплат используют аутологичные ткани, а именно собственную большую подкожную вену голени пациента, так как они обладают полной биосовметимостью, не вызывают иммунной реакции организма, удобны в имплантации, устойчивы к тромбозу и рестенозу, благодаря наличию эндотелиальной выстилки. Однако основной проблемой при использовании венозных заплат является формирование аневризм и возможные разрывы ткани в области шва. Помимо этого, для получения данного материала проводится дополнительное хирургическое вмешательство у пациента с изъятием здорового сосуда. У части пациентов и такая возможность отсутствует в силу предшествующего использования аутовен, либо венозной патологии (варикозная болезнь, тромбофлебит и прочее). В связи с этим, в клинической практике на сегодняшний день широкое применение имеют заплаты из ксеногенных (из тканей животного происхождения) и синтетических материалов.

Заплаты из ксеногенных материалов (ксеноперикард) подвержены массивной кальцификации и гиперплазии неоинтимы, а заплаты из синтетических материалов (политетрафторэтилен и полиэтилентерефталат) - формированию рестеноза за счет гиперплазии неоинтимы, а также псевдоаневризм в отдаленном периоде. Кроме того, закрытие артериотомии заплатами Dacron ассоциировано с высоким риском инфекционных осложнений и тромбообразования, тогда как при использовании заплат из PTFE необходимо больше времени для гемостаза.

Таким образом, использование существующих, в том числе коммерческих, сосудистых заплат все еще сопряжено с рядом осложнений, таких как тромбоз, аневризмы, рестеноз, инфекционное поражение.

Решением данной проблемы может стать создание полимерной сосудистой заплаты, обладающей проангиогенной активностью и устойчивостью к аневризмообразованию, а также сохраняющей возможность к полноценному ремоделированию после имплантации в сосудистое русло.

Известна заплата из полиамида (ПА), полиэтилентерефталата (ПЭТ) или политетрафторэтилена (ПТФЭ) с модификацией полиуретановыми (ПУ) микросферами (CN 102068323 A, China. Cardiac or vascular patch with anticoagulant effect, pub. date 26.03.2014). Заплата обладает антикоагулянтным действием. Основа заплаты состоит из синтетических полимеров полиамида, полиэтилентетрафталата, политетрафторэтилена), поверхность которых модифицирут с помощью полиуретана в виде микросфер, встраиваемых в поверхность заплаты посредством использования фосфорной кислоты. Нанометровую полиуретановую микросферу диаметр 100-300 нм с модифицированной фосфорной кислотой поверхностью (PU) пропитывают фосфатным буферным раствором, который и оказывает антикоагулянтный эффект. Такой подход позволяет сохранить физико-механические свойства заплат после поверхностной модификации, проведенной с целью улучшения атромбогенных свойств заплаты.

Основным недостатком данного подхода является отсутствие антианевризматической защиты и функциональной проангиогенной активности заплаты. Изготовление заплаты только из синтетических небиодеградируемых полимеров не решает проблему гиперплазии неоинтимы, инфицирования, рестеноза и формирования аневризм, что свойственно заплатам из синтетических полимеров.

Известны многослойная сосудистая заплата из полимолочной кислоты, поликапролактона и полиуретана для реконструкции стенки артерий и вен (CN 114642518 A, China. Biocompatible vascular patch, pub. date 21.06.2022). Композитный матрикс содержит внутренний, средний и наружный слои. Внутренний слой и наружный слой прикреплены к двум противоположным сторонам среднего слоя. Внутренний слой состоит из сополимера полимолочной кислоты/поликапролактона, содержит в своем составе гепарин, имеет пористую структуру, образованной путем укладки полимерных волокон диаметром от 100 нм до 800 нм, пористость составляет 60-80%. Внешний слой заплаты изготовлен из полиуретана и образован усеченными полимерными волокнами диаметр от 100 нм до 800 нм и длиной от 60 до 300 мкм. Пористость данного слоя от 80% до 90%. Внешний слой также в своем составе содержит гепарин. Промежуточный слой представляет собой непроницаемый для воды эластичный слой, сформированный из поликапролактона. Внутренний и внешний слои полимерной заплаты изготовлены методом электроспиннинга. Промежуточный слой сформирован способом литьевого формования, способом распыления жидкости, способом нанесения покрытия погружением, способом нанесения поверх покрытия или способом осаждения из паровой фазы. Соединения слоев заплаты осуществляется посредством термокомпрессионного склеивания при температуре от 80 до 85°С и давлении от 10 до 12 кПа.

Недостатком данных сосудистых заплат является использование методики литьевого формования для формирования среднего слоя. Присутствие такого материала будет препятствовать миграции сосудистых клеток в толщу заплаты, что делает невозможным формирование целостной новообразованной сосудистой ткани на основе данной заплаты. Кроме того, слоистость заплаты и разная архитектоника поверхности каждого из слоев могут привести к расслоению заплаты после имплантации в стенку сосуда в ответ как на пульсовую волну, так и в процессе различий в сроках биорезорбции слоев. Помимо этого, критичным является соединение слоев заплаты посредством термокомпрессионного склеивания при температуре от 80 до 85°С, что вряд ли позволяет сохранять средний слой в неизменном виде, так как температура плавления поликапролактона значимо ниже (59-64°С), чем температура, использованная для склеивания. Отсутствие в составе заплаты проангиогенных факторов будет дополнительно способствовать задержке или неполноценному формированию ремоделирования заплаты в сосудистом направлении.

Наиболее близким к заявленному технологическому решению является технология изготовления функционально активных биодеградируемых сосудистых протезов малого диаметра с лекарственным покрытием (RU 2702239 С1; МПК A61F 2/06 (2019.05); A61L 27/14 (2019.05); A61L 27/54 (2019.05); A61L 33/06 (2019.05). Технология изготовления функционально активных биодеградируемых сосудистых протезов малого диаметра с лекарственным покрытием. Антонова Л.В., Севостьянова В.В., Резвова М.А., Кривкина Е.О., Кудрявцева Ю.А., Барбараш О.Л., Барбараш Л.С.; №2702239, заявл. 25.06.2019; опубл. 07.10.2019). Технологии изготовления функционального биодеградируемого сосудистого протеза малого диаметра с лекарственным покрытием заключается в использовании смеси биодеградируемых полимеров ε-поликапролактона (ПКЛ) и полигидроксибутирата/валерата (ПГБВ) с послойным введенными в структуру протеза ростовых факторов VEGF, bFGF и хемоаттракантной молекулы SDF-1α. Тромборезистентность внутренней поверхности достигается формированием поверхностного лекарственного покрытия, содержащего лекарственные препараты антиагрегантного и антикоагулянтного действия, которые присоединены к поверхности протеза через гидрогелевое покрытие.

Одним из самых главных недостатков предложенной технологии является отсутствие антианевризматической защиты данного протеза, так как в состав трубчатого каркаса протеза входят только биодеградируемые полимеры. Помимо этого, послойное введение VEGF, bFGF SDF-1α в состав протеза может повлечь его расслоение в процессе и после имплантации в сосудистое русло, что в последующем может привести к формированию аневризм. Оба данных недостатка описаны авторами в собственных публикациях, содержащих результаты тестирования протезов in vitro и итоги преклинических испытаний на модели овцы (Антонова Л.В., Кривкина Е.О., Ханова М.Ю., Великанова Е.А., Матвеева В.Г., Миронов А.В., Шабаев А.Р., Сенокосова Е.А., Глушкова Т.В., Синицкий М.Ю., Мухамадияров Р.А., Барбараш Л.С. Результаты преклинических испытаний биодеградируемых сосудистых протезов малого диаметра на модели овцы / Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2022. -Т. XXIV. - №3. С. 80-93. DOI: 10.15825/1995-1191 -2022-3-80-93). Все протезы, имплантированные в сонную артерию овец на 18 месяцев и сохранившие свою проходимость, подверглись аневризматическому расширению уже через 6 месяцев после имплантации. Причиной тому послужила быстрая биорезорбция основного полимерного трубчатого каркаса, которая наблюдалась уже через 6 месяцев после имплантации. Поэтому вне зависимости, какую геометрическую форму придают биодеградируемым матриксам (форму трубчатого каркаса или форму пласта/заплаты), данные матриксы нуждаются в антианевризматической защите.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является способ создания биосовместимой полимерной заплаты для артериальной реконструкции, состоящей из биорезорбируемого и биостабильного полимеров, имеющей высокопористую структуру, обладающей проангионенной и атромбогенной активностью и сохраняющей способность к ремоделированию.

Технический результат достигается при совокупности следующих параметров:

1. В качестве основного материала для изготовления полимерной заплаты используют смесь биосовместимых полимеров: термопластичного полиуретана (ПУ) марок Chronoflex™, Tecoflex™, Pelletane™ и ε-поликапролактона (ε-polycaprolactone, ПКЛ). Полиуретан - это синтетический полимер-эластомер с высокой биосовместимостью; изделия из ПУ облададают механическими свойствами, схожими с аналогичными свойствами нативных сосудов. Полиуретан отличается повышенной стабильностью в биологических системах за счет крайне медленной скорости гидролитической деградации и используется в биомедицинской промышленности. Поэтому использование ПУ для изготовления полимерной заплаты будет препятствовать формированию аневризм после имплантации заплат в сосудистую стенку. Поликапролактон - биодеградируемый полимер с длительным сроком резорбции (до 3 лет). Постепенная биорезорбция ПКЛ будет способствовать ремоделированию заплаты после имплантации за счет возможности миграции сосудистых клеток в высокопористую стенку заплаты и формирования новообразованной сосудистой ткани, что делает возможным полноценное ремоделирование полимерной заплаты в долгосрочной перспективе. Использование комбинации данных полимеров придаст полимерной заплате высокую прочность, износостойкость и устойчивость к формированию аневризм наряду с сохранением эластичности.

2. Для стимуляции процесса привлечения и миграции сосудистых клеток в толщу полимерной заплаты после ее имплантации в сосудистое русло используют сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor, VEGF) и основной фактор роста фибробластов (basic fibroblast growth factor, bFGF) и хемоаттрактантную молекулу - стромальный фактор 1 альфа (stromal cell-derived factor 1 alpha, SDF-1α). VEGF обеспечивает полноценную эндотелизацию, bFGF стимулирует миграцию, пролиферацию и выживание эндотелиальных и гладкомышечных клеток. SDF-1α привлекает к зоне своей локации клетки-предшественники костно-мозгового происхождения из кровотока.

3. Полимерную заплату изготавливают методом эмульсионного электроспиннинга, что обеспечивает ввод смеси ростовых факторов и хемоаттрактантной молекулы в полимерное волокно в процессе изготовления заплаты. Для предупреждения расслаивания и осаждения получаемой эмульсии 5,0 мл полимерной эмульсии, содержащей VEGF, bFGF и SDF-1α, содержит 0.05 г плюроника (ПЛУ) - блок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена, позволяющего полимерному раствору с жидкой фазой длительно оставаться в состоянии эмульсии и не расслаиваться. В итоге стенка заплаты сформирована тонкими хаотично переплетенными полимерными волокнами диаметром от 300 нм до 4,0 мкм.

4. В процессе изготовления полимерной заплаты проангиогенные факторы и хемоаттрактантную молекулу вводят в полимерный раствор в жидкой фазе (0,9% растворе хлорида натрия, фосфатно-солевом буфере или стерильной воде) в концентрациях от 10 до 40 мкг на 1 мл полимерного раствора.

5. Для увеличения тромборезистентности поверхности полимерной заплаты ее модифицируют атромбогенными лекарственными средствами. В качестве атромбогенных лекарственных средств могут быть использованы антиагреганты (иломедин и его аналоги) и антикоагулянты (нефракционированный гепарин и его аналоги). Модификация поверхности протеза осуществляется смесью данных препаратов или их аналогов. При этом использование комбинации препаратов из разных групп усиливает атромбогенный эффект модифицирующего покрытия.

6. Модификация поверхности полимерной заплаты комбинацией атромбогенных лекарственных средств осуществляется посредством формирования на поверхности протеза гидрогелевого покрытия из поливинилпирролидона (polyvinylpyrrolidone, ПВП), который сшивается поверхностью заплаты посредством ионизирующего излучения. К свободным реакционным группам ПВП, оставшимся после полимеризации, присоединяются лекарственные средства методом комплексообразования. В силу растворимости полиуретана в спиртах для формирования гидрогелевого покрытия полимерной заплаты, содержащей ПУ, готовится водный раствор ПВП.

7. Антиагреганты и антикоагулянты вводят в готовое гидрогелевое покрытие путем погружения полимерной заплаты с привитым ПВП в раствор лекарственных препаратов, что позволяет комплексу лекарственных средств присоединиться к свободным реакционным группам ПВП, расположенным не только на внутренней и наружной поверхностях заплаты, но и в ее толще. Благодаря этому при контакте полимерной заплаты с кровью действие лекарственных средств осуществляется не только сразу при контакте с кровью, но и продолжается до полного высвобождения препаратов из толщи стенки полимерной заплаты. Такой способ присоединения лекарственных препаратов к поверхности заплаты не подвергает молекулы лекарственных веществ пространственным изменениям и не блокирует центры связывания молекул с факторами свертывания крови. Физико-механические характеристики полимерных заплат также не ухудшаются.

Изготовление функционально активной полимерной заплаты для артериальной реконструкции, устойчивой к аневризмообразованию, выполняют следующим образом:

Этап 1. Изготовление методом эмульсионного электроспиннинга полимерной заплаты, устойчивой к аневризмообразованию:

- Готовят эмульсию для изготовления полимерного трубчатого каркаса протеза из раствора смеси полимеров ПУ, ПКЛ, ПЛУ и композиции биологически активных веществ VEGF/bFGF/SDF-1α (РФ) в органическом растворителе трихлорметане с концентрацией 10-20%. Для этого 0,25 г ПУ, 0,4 г ПКЛ, 0,05 г ПЛУ, растворяют в 4,75 мл трихлорметана, смешивая с помощью магнитной мешалки или ультразвуковой ванны. Параллельно готовят 0,25 мл физиологического раствора, или фосфатно-солевого буфера, или стерильной воды с введенными в данный объем GF с концентрацией каждой молекулы 10-40 мкг/мл. Готовую жидкую фазу вносят в полимерный раствор ПУ/ПКЛ/ПЛУ и продолжают тщательно смешивать с помощью магнитной мешалки или ультразвуковой ванны до образования устойчивой эмульсии.

- Растворы VEGF, bFGF и SDF-1α могут быть как одной концентрации, так и в разных концентрациях в составе объединенного раствора РФ.

- Электроспиннинг эмульсии ПУ/ПКЛ/ПЛУ/РФ осуществляют на поверхность металлического вращающегося коллектора или барабана диаметром 8,0-200,0 мм при скорости подачи раствора 0,2-5 мл/ч, подаваемом напряжении 15-30 кВ, расстоянии от места выхода полимерной нити до коллектора 5-20 см. Процесс электроспиннинга продолжают до образования полимерного матрикса толщиной 250-1000 мкм. Снятие полимерного матрикса с коллектора или барабана выполняют посредством рассечения скальпелем полимерного полотна вдоль используемого коллектора/барабана и последующего осторожного отслаивания от металлической поверхности и распрямления. На выходе получают высокопористый полимерный пласт, из которого в дальнейшем выкраивается заплата нужного размера.

Этап 2. Формирование атромбогенного лекарственного покрытия на поверхности полимерной заплаты ПУ/ПКЛ/ПЛУ/РФ:

- Для модификации поверхности заплаты готовят раствор ПВП в воде с концентрацией 1-25%. Заплату погружают в раствор ПВП на 10-60 минут. Далее заплату вынимают из раствора и сушат горизонтально в течение 24 часов.

- Для проведения прививки ПВП к поверхности полимерной заплаты изделие помещают в стеклянную пробирку в скрученном состоянии, пробирку заполняют инертным газом, закупоривают парафилмом и облучают ионизирующим излучением с общей поглощенной дозой 10-15 кГр.

- В стерильных условиях готовят модифицирующий раствор, содержащий гепарин (Н) 50-1000 МЕ/мл и иломедин (I) 0,1-2,0 мкг/мл на основе стерильного глицинового буферного раствора (рН = 2,5-2,6).

- Для присоединения лекарственных препаратов к полимеризованному ПВП покрытию полимерные заплаты отмывают от остатков неполимеризовавшегося поливинилпирролидона посредством отмывания заплаты в стерильной воде четырехкратно по 15 минут. Затем заплаты погружают в модифицирующий раствор, содержащий гепарин и иломедин, и выдерживают в течение 30 минут. Далее изделие высушивают на воздухе в стерильных условиях.

Сущность изобретения поясняется иллюстрациями.

Фиг. 1. Сканирующая электронная микроскопия полимерной заплаты ПУ/ПКЛ/РФ/^I/H: а - внутренняя поверхность, ув. ×500; б - внешняя поверхность, ув. ×500.

Фиг. 2. Максимум агрегации тромбоцитов после контакта крови с полимерной заплатой ПУ/ПКЛ/РФ до и после модифицирования иломедином и нефракционированным гепарином; * - р < 0,05, в сравнении с заплатой ПУ/ПКЛ/РФ.

Фиг. 3. Имплантация полимерной заплаты ПУ/ПКЛ/РФ/^I/H в бедренную артерию примата: а - операция по имплантации полимерной заплаты в бедренную артерию павиана; б - вид имплантированного полимерной заплаты. Фиг. 4. Проходимость бедренной артерии с имплантированной полимерной заплатой спустя 180 дней после имплантации и вид эксплантированной полимерной заплаты ПУ/ПКЛ/РФ/^I/H спустя 180 дней после имплантации: а - УЗИ с функцией доплера бедренной артерии с имплантированной заплатой; б - макрофото эксплантированной бедренной артерии с имплантированной в стенку артерии заплатой; в - вид эксплантированной артерии с заплатой на поперечном срезе; г - стереомикроскопия поперечного среза эксплантированной бедренной артерии с заплатой, ув. ×10.

Пример 1. Изготовление функционально активной полимерной заплаты для артериальной реконструкции, устойчивой к аневризмообразованию

Полимерный матрикс изготавливают методом эмульсионного электроспиннинга из смеси ПУ, ПКЛ и ПЛУ в трихлорметане. Для этого в 4,75 мл трихлорметана вносили 0,25 г ПУ, 0,4 г ПКЛ, 0,05 г ПЛУ и подвергали перемешиванию раствора на магнитной мешалке при температуре 25°С. Комплекс биологически активных молекул VEGF, bFGF, SDF-1α (РФ) растворяют в 0,25 мл 0,9% раствора NaCl с итоговой концентрацией каждой молекулы 10 мкг/мл. Вносят полученную жидкую фазу в полимерный раствор ПУ/ПКЛ/ПЛУ и перемешивают с помощью магнитной мешалки до получения эмульсии. После смешивания полимерного раствора с жидкой фазой, содержащей РФ, итоговая концентрация полимеров в эмульсии составила 5% ПУ, 8% ПКЛ, 1% ПЛУ, а итоговая концентрация каждой биомолекулы - 500 нг на 1 мл полимерной эмульсии. Электроспиннинг осуществляют с использованием затупленной иглы 22G при напряжении 25 kV, скорости подачи раствора - 2,0 мл/ч, скорости вращения коллектора - 200 об/мин, расстоянии от иглы до намоточного коллектора - 150 мм, времени очистки иглы - 30 сек. В качестве коллектора используют барабан диаметром 200 мм. Время изготовления одного полимерного полотна - 8 часов. После окончания электроспиннинга острым скальпелем проводят разрез полимерного полотна вдоль барабана и осторожно отслаивающими движениями снимают лоскут с барабана и распрямляют его. Толщина стенки полимерного лоскута составила ~600 мкм.

Из полимерного полотна с помощью ножниц выкраивают заплату необходимого размера. Далее для формирования гидрогелевого слоя заплаты погружают в 10%-ный водный раствор ПВП на 30 мин и высушивают на воздухе при комнатной температуре в течение суток. Далее полимерные заплаты сворачивают и размещают в стеклянные пробирки, которые заполняют инертным газом аргоном и герметично запаковывают парафильмом. Прививку полимера на поверхность заплат проводят под действием ионизирующего излучения общей поглощенной дозой 15 кГр и времени облучения 2,5 ч. Под воздействием данной общей поглощенной дозы одновременно с модифицированием происходит стерилизация заплат, поэтому дальнейшие действия по обработке проводят в условиях стерильного бокса. Непривитый ПВП отмывают стерильной водой для инъекций с полным погружением заплаты в стерильную воду четырехкратно по 15 минут. Раствор лекарственных препаратов иломедина и нефракционарованного гепарина (I/H) готовят на стерильном глициновом буфере (рН = 2,61), внося 12500 ME гепарина и 40 мкг иломедина в 100 мл буфера. Полимерные заплаты выдерживают в приготовленном растворе в течение 30 минут, высушивают в течение суток на воздухе и размещают в стерильные емкости для хранения.

Оценка эффективности разработанной технологии

Оценка структуры поверхности полимерной заплаты ПУ/ПКЛ/РФ/^1/н методом сканирующей электронной микроскопии

Оценку структуры поверхности полимерных заплат проводили на сканирующем электронном микроскопе S-3400N (Hitachi, Япония) в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 10 кВ. Перед исследованием образцы протезов размером 0,5×0,5 см подвергали золото-палладиевому напылению с получением покрытия толщиной 15 нм при использовании системы для напыления ЕМ АСЕ200 (Leica Mikrosysteme GmbH, Австрия).

Полимерная заплата ПУ/ПКЛ/РФ/^I/H обладала высокопористой поверхностью без признаков расслоения (Фиг. 1).

Оценка гемосовместимости полимерной заплаты

Оценку агрегации тромбоцитов после контакта донорской плазмы с поверхностью полимерной заплаты проводили в соответствии со стандартом ISO 10993.4. К свежей донорской крови добавляли 3,8% раствор цитрата натрия (в соотношении 9:1) и затем центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут. Полученную обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) использовали в качестве положительного контроля реакции агрегации тромбоцитов. Для калибровки прибора применяли бедную тромбоцитами плазму, которую получали в результате повторного центрифугирования ОТП при 4000 об/мин в течение 20 мин. Исследуемые образцы матриксов помещали в кюветы с ОТП на 3 минуты, затем добавляли индуктор агрегации тромбоцитов АДФ (АГРЕНАМ, АГ-6) в концентрации 20 мкМ/л. Агрегацию тромбоцитов оценивали с помощью полуавтоматического 4-канального анализатора АР ACT 4004 (LABiTec, Германия). Спустя 5 минут регистрировали максимальный процент агрегации тромбоцитов (%).

Агрегация тромбоцитов при контакте с полимерной заплатой ПУ/ПКЛ/РФ до формирования лекарственного покрытия не превысила уровень контрольной обогащенной тромбоцитами плазмы (83,33 (82,24; 84,21) %). Модифицирование поверхности заплаты иломедином и нефракционированным гепарином способствовало статистически значимому снижению максимума агрегации тромбоцитов в 10 раз (Фиг. 2).

Имплантация полимерных заплат ПУ/ПКЛ/РФ/^I/H шириной 3,0-3,5 мм, длиной 30,0-40,0 мм в бедренную артерию приматов (взрослых самцов павианов) проводили по схеме 1 животное - 1 протез (Фиг. 3, а). Количество животных в группе - 5. Вид имплантированной полимерной заплаты представлен на Фиг. 3, б.

Оценка проходимости полимерных заплат ПУ/ПКЛ/РФ/^I/H после их имплантации в бедренную артерию приматов

Итоговый скрининг проходимости имплантированных полимерных заплат осуществляли методом ультразвукового исследования с функцией доплера 180 дней после имплантации. Через 180 дней после имплантации проходимость полимерных заплат ПУ/ПКЛ/РФ/^I/Н составила 80,0%. Признаков аневризмообразования не выявлено (Фиг. 4, а). После эксплантации бедренных артерий с имплантированной заплатой проходимость заплат подтверждена визуально с стереомикроскопически в 80,0% случаев (Фиг. 4, б-г).

Таким образом, предложенный способ изготовления функционально активной полимерной заплаты для артериальной реконструкции, устойчивой к аневризмообразованию, позволил на модели приматов (животной модели, максимально приближенной к человеку) достичь 80,0% проходимости заплат и их полноценного ремоделирования без сопутствующих признаков аневризмо- и тромбообразования.

Изобретение относится к области химии и медицины, а именно к способу изготовления функционально активной полимерной заплаты для артериальной реконструкции, устойчивой к аневризмообразованию. Способ включает следующие стадии: смесь полиуретана, ε-поликапролактона и блок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена растворяют в органическом растворителе с получением полимерного раствора; параллельно готовят жидкую фазу биологически активных молекул, содержащую сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и хемоаттрактантную молекулу SDF-1α в физиологическом растворе, или в фосфатно-солевом буфере, или в стерильной воде; жидкую фазу вносят в полимерный раствор с получением эмульсии; осуществляют электроспиннинг эмульсии с получением высокопористого полимерного полотна, из которого выкраивается полимерная заплата; проводят модификацию поверхности полимерной заплаты путем формирования гидрогелевого покрытия из поливинилпирролидона и его облучения ионизирующим излучением с последующей обработкой раствором лекарственных средств, содержащим иломедин и нефракционированный гепарин в буфере. Изобретение обеспечивает создание биосовместимой полимерной заплаты с высокопористой структурой, обладающей проангионенной и атромбогенной активностью и сохраняющей способность к ремоделированию. 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 пр.

1. Способ изготовления функционально активной полимерной заплаты для артериальной реконструкции, устойчивой к аневризмообразованию, характеризующийся тем, что смесь полиуретана, ε-поликапролактона и блок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена растворяют в органическом растворителе с получением полимерного раствора; параллельно готовят жидкую фазу биологически активных молекул, содержащую сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и хемоаттрактантную молекулу SDF-1α в физиологическом растворе, или в фосфатно-солевом буфере, или в стерильной воде; указанную жидкую фазу биологически активных молекул вносят в указанный полимерный раствор с получением эмульсии; затем осуществляют электроспиннинг полученной эмульсии с получением высокопористого полимерного полотна, из которого выкраивается полимерная заплата нужного размера; далее проводят модификацию поверхности полимерной заплаты путем формирования гидрогелевого покрытия из поливинилпирролидона и его облучения ионизирующим излучением с последующей обработкой раствором лекарственных средств, содержащим иломедин и нефракционированный гепарин в буфере.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в полученной эмульсии концентрация полиуретана составляет 5% мас./об., концентрация ε-поликапролактона составляет 8% мас./об., концентрация блок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена составляет 1% мас./об.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что объем указанной жидкой фазы биологически активных молекул составляет 250 мкл.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что электроспиннинг полученной эмульсии проводят на коллектор или барабан диаметром 8-200 мм с последующим снятием готового полимерного матрикса с коллектора или барабана посредством рассечения скальпелем полимерного полотна вдоль используемого коллектора или барабана и осторожного отслаивания полимерного полотна от металлической поверхности и его распрямления.

5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что электроспиннинг осуществляют при скорости подачи эмульсии 0,2-5 мл/ч и подаваемом напряжении 15-30 кВ.

6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что при облучении ионизирующим излучением общая поглощенная доза составляет 10-15 кГр.