Способ изготовления протезов кровеносных сосудов малого диаметра путем электроспиннинга и устройство для его осуществления Российский патент 2019 года по МПК A61F2/06 

Группа изобретений относится к области медицины, биотехнологии и тканевой инженерии, и может быть использована для изготовления протезов кровеносных сосудов малого диаметра (до 6 мм), предназначенных для хирургической реконструкции периферических кровеносных сосудов.

Большинство используемых тканных, плетеных или вязаных протезов сосудов (ПС), изготовленных из синтетических материалов, таких как дакрон или политетрафторэтилен, с успехом используются для протезирования сосудов с диаметром более 6 мм [1]. Однако, при протезировании сосудов диаметром менее 6 мм известные ПС, изготовленные из синтетических материалов, имеют ряд серьезных недостатков, совокупность которых приводит к уменьшению тока крови или полной закупорке сосудов [2]. Причиной стенозирования является формирование слоя неоинтимы и тромбообразование [3], в результате чего не более 50% синтетических ПС имеют двухгодичную первичную проходимость [4].

Одной из причин развития гиперплазии неоинтимы, наряду с биосовместимостью материала, обусловленной химическим строением полимера [5], является несоответствие податливости ПС, податливости нативной артерии [6]. Это несоответствие приводит к нарушению механической деформации артерии, накоплению напряжений в зоне анастамоза, нарушению равномерного потока крови, что стимулирует тромбообразование и формирование неоинтимы [7]. С другой стороны, поток крови и механическая деформация стенки необходимы для нормального функционирования эндотелиоцитов и эндотелия в целом [8].

Известно, что нарушение механических свойств стенки, ее эластичности и податливости, коррелирует с развитием утолщения стенки сосуда [9], а отличие напряжений, возникающих в стенке ПС по сравнению с нативной артерией, ассоциировано с гиперплазией неоинтимы в ПС [10]. Было показано, что механические характеристики ПС, такие как податливость и модуль Юнга, оказывают значительное влияние на отдаленную проходимость.

Широко применяемым методом изготовления ПС является электроспиннинг (Фиг. 1). Принцип метода электроспиннинга заключается в образовании волокон из раствора, подаваемого насосом (2), через электрод-фильеру (1) в сильном электрическом поле, сформированным между этим электродом и электродом-коллектором (3). Раствор или расплав полимерного материала подается из электрода-фильеры с заданной скоростью. Капля раствора полимера, выдавливаемая из фильеры, растягивается в электрическом поле и превращается в полимерные нити (растворитель испаряется в процессе движения нити ко второму электроду), которые собираются на токопроводящий электрод-коллектор, образуя пористый материал [11].

Для изготовления волокон могут быть использованы как природные, так и синтетические полимеры, а также их смеси и растворы, дополнительно содержащие низкомолекулярные лекарственные средства [12].

Для изготовления ПС использую вращающиеся электроды-коллекторы разного диаметра, различные полимеры и способы их укладки, однако только в некоторых исследованиях представлена полная механическая характеристика полученных сосудистых трансплантатов [13].

Известен способ изготовление ПС методом электроспиннинга на вращающемся электроде-коллекторе из смеси поли-капролактона (PCL) и коллагена [14], или PCL и желатина [15], обладающих длительной биостабильностью и неплохими механическими характеристиками. Однако такие ПС не обладают соответствующей нативным артериям податливостью и эластичностью.

Известен способ получения многослойных (два- и более слоя) ПС из смесей полимеров (например, PCL или полиуретаны) с различным содержанием природных белков (таких как коллаген, фиброин шелка, эластин, желатин) методом электроспиннинга на вращающемся электроде-коллекторе [16]. Основная идея такого подхода заключается в имитации различных слоев сосудистой стенки. Однако, такие ПС так же не обладают соответствующей нативным артериям податливостью и эластичностью.

Таким образом, все известные на сегодняшний день варианты изготовления ПС методом электроспиннинга ориентируются на использование полимеров с разными механическими свойствами, которые, однако, не позволяют получать ПС с требуемыми характеристиками податливости и механической совместимости.

Наиболее близким к заявляемой группе изобретений - прототипом, является способ получения ПС и устройство для его осуществления [17].

Известное устройство для электроспиннинга состоит из электрода-фильеры, соединенного с источником высокого напряжения (5-50 кВ), насоса и заземленного вращающегося электрода-коллектора с изменяемым диаметром, состоящего из множества кондуктивных пластин-спиц, расположенных вдоль основной оси коллектора. Расстояние между спицами можно увеличить или уменьшить механическим путем.

Формируемый из волокон материал можно растянуть (увеличить диаметр, получить растянутую трубку) или наоборот, собрать (уменьшить диаметр), так, как это обозначено на Фиг. 2.

Известный способ заключается в том, что на первой стадии, на такой электрод-коллектор минимального диаметра (Фиг. 2, позиция А), наносят первый слой микроволокон методом электроспиннинга из раствора эластичного полимера. Затем диаметр поперечного сечения электрода-коллектора увеличивают механическим путем за счет увеличения расстояния между спицами (Б) и наносят второй слой из раствора малоэластичного полимера (В). Далее диаметр электрода-коллектора уменьшают до первоначального значения, в результате, из-за упруго-эластичных сил первого слоя, диаметр полученного протеза уменьшается, а неэластичные элементы второго слоя сжимаются и приобретают волнистую, синусоидную структуру (Г).

В качестве эластичного полимера могут быть использованы органосиликоны, бутилкаучук, этиленпропилендиеновый терполимер, полисульфидный каучук, силиконовый каучук, неопрен, хлорсульфонированный полиэтилен, полиуретаны, акрилонитрил-бутадиеновый сополимер, сополимер стирол-бутадиена, акрилонитрил-бутадиен, полимеры сополимера поливинилхлорида, полиизобутилен, полиэпихлоргидрин, природный и синтетический полиизопрен, поливинилхлорид-полибутадиеновый каучук, фторуглеродные эластомеры, такие как сополимеры винилидена, фторида и хлорбифторэтилена, сополимеры винилиденфторида и гексафторэтилена и фторакрилатные эластомеры. В качестве неэластичных полимеров могут быть использованы - альгинаты, полилактиды, полиакрилаты (например, полиметилметакрилат, поликапролактон) и др.

Полученный ПС имеет диаграмму растяжения, близкую к таковой у нативной артерии: удлинение с малым усилием на начальном этапе (когда деформируется тонкий слой эластичного матрикса (из эластомера) и расправляются волокна из неэластичного полимера и удлинение с большим на втором этапе, когда на растяжение начинают работать волокна из не эластичного полимера.

Недостатками известного способа являются отсутствие возможности получать ПС с гладкой внутренней поверхностью и высокой податливостью. Формирование стенок протеза сосуда из разных полимеров с разными механическими свойствами приводит к быстрому расслоению стенки, формированию внутренних полостей, нарушению механической прочности ПС в условиях длительной циклической нагрузки.

Недостатками известного устройства является и сложная конструкция электрода-коллектора, что приводит к частому "закусыванию" стенок изготавливаемого ПС между спицами и нарушению их целостности. Кроме этого, конструкция известного устройства не обеспечивает возможности получения ПС с высокой податливостью. В связи с этим изобретение не нашло практического применения.

Задачей данного изобретения является разработка устройства для электроспиннинга и способа изготовления ПС путем электроспиннинга, который позволял бы изготавливать гемо- и биосовместимые ПС, пригодные для длительного функционирования in vivo, диаметр которых составляет 2-6 мм с высокой податливостью и гладкой внутренней поверхностью.

Технический результат: получение протезов кровеносных сосудов с высокой податливостью и гладкой внутренней поверхностью, высокой гемо- и биосовместимостью и с увеличенным сроком функционирования.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в том, что для электроспиннинга используют полимерную композицию, состоящую из смеси растворов полимера, белка и, при необходимости, биологически активных добавок (преимущественно антикоагулянтов), растворенных в подходящем растворителе, что позволяет получить поверхность, на которой не наблюдается адгезия тромбоцитов, но к которой прикрепляются и на которой охотно пролиферируют эндотелиоциты, а волокно укладывают на электрод-коллектор изменяемого диаметра, что позволяет получить ПС с высокой податливостью.

Поставленная задача также достигается устройством для проведения электроспиннинга, конструктивные элементы которого иллюстрируются следующими фигурами.

На фиг. 1 представлена общая блок-схема устройства для проведения электроспиннинга. На фиг. 3 представлена конструкция электрода-коллектора в начале процесса электроспиннинга, а на фиг. 4 - конструкция электрода-коллектора в конце процесса электроспиннинга.

Устройство для проведения электроспиннинга состоит из электрода-фильеры 1, соединенного с источником высокого напряжения (5-50 кВ), насоса 2 и заземленного вращающегося электрода-коллектора с изменяемым диаметром 3 (Фиг. 1).

Электрод-коллектор 3 выполнен в виде стальной трубки с отверстиями, на которой закреплена электропроводящая трубка из эластомера 4, выполненная с возможностью расширения в 1,1÷1,4 раза. Электрод-коллектор заполнен электролитом, снабжен на конце заглушкой 5 и соединен с устройством изменения объема электролита 6, снабженным поршнем 7, выполненным с возможностью продольного перемещения.

Диаметр трубки из эластомера может изменяться путем нагнетания/удаления электролита осуществляемого, например, при помощи поршня 7 или вынесенного насоса.

Устройство работает следующим образом. Открывают заглушку 5 электрода-коллектора и заполняют внутренний объем электрода-коллектора электролитом, передвигая поршень 7 влево. После заполнения системы электролитом, закручивают заглушку 5. Затем устанавливают электрод-коллектор с устройством изменения объема в блок вращения электрода-коллектора прибора для электроспиннинга, которое снабжено устройством перемещения поршня. При помощи движения поршня в обратном направлении (вправо), устанавливают диаметр электропроводящей трубки из эластомера 4 на электроде-коллекторе в 1,1÷1,4 раза больше, чем ее базовый диаметр 4. Включают программу плавного, преимущественно, линейного уменьшения диаметра трубки из эластомера на электроде-коллекторе (обеспечивающую движение поршня влево), и проводят электроспиннинг раствора полимера.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

ПС изготавливают методом электроспиннинга с использованием электрода-коллектора изменяемого диаметра со следующими параметрами: напряжение - 15-30 кВ, скорость подачи раствора полимеров - 1,0-2,0 мл/час, расстояние между фильерой и коллектором - 15-30 см, скорость вращения коллектора - 150-400 об/мин, скорость возвратно-поступательного движения фильеры - 20-40 мм/сек.

Предварительно готовят полимерную композицию для электроспиннинга, состоящую из смеси растворов полимера и белка. Для этого синтетический полимер смешивают с подходящим растворителем, преимущественно с гексафторизопропанолом (ГФИП) или трифторэтанолом (ТФЭ) до конечной концентрации 3,0%-10,0% (вес : объем), а выбранный белок - до конечной концентрации 0,1-30,0% от веса исходного полимера. В полимерную смесь могут быть добавлены другие биологически активные компоненты, в преимущественном варианте антикоагулянты, позволяющие улучшить тромборезистентность поверхности протезов. Затем полученные растворы смешивают в пропорциях, указанных выше, смесь перемешивают и получают раствор композиции, готовый для изготовления протезов сосудов при помощи электроспиннинга. В качестве синтетического полимера может быть использован полимер, выбранный из группы, но не ограничиваясь: полиуретаны с разными жесткими и мягкими сегнментами, поликапролактон (ПКЛ), полибутилентерефталат (ПБТФ), полилактид-ко-гликолид, нейлон или другие биосовместимые полимеры с близкими механическими свойствами. В качестве белка может быть использован коллаген, эластин или желатин в концентрации 0,1-30% от веса исходного полимера. В качестве антикоагулянта может быть использована третбутил-аммонийная соль гепарина в концентрации 1,5% или бивалирудин в концентрации 0,5-1,0% от веса исходного полимера.

Перед началом электроспиннинга устанавливают диаметр электрода-коллектора в 1,1÷1,4 раза больше, чем базовый диаметр электрода-коллектора (или требуемый диаметр протеза сосуда). В зависимости от времени электроспиннинга, выбирают программу плавного уменьшения диаметра электрода-коллектора. В преимущественном варианте выбирают программу линейного уменьшения диаметра электрода-коллектора, при этом время уменьшения диаметра равно времени процесса электроспиннинга, требуемого для получения стенки ПС требуемой толщины.

В процессе электроспиннинга на электрод-коллектор с изменяемым диаметром наносят требуемый объем раствора полимерной композиции.

После завершения электроспиннинга сосудистый протез снимают с электрода-коллектора, инкубируют в растворе 0,05 М NaHCO₃ рН 9,0 в течение 5 минут (в зависимости от температуры желирования белка температура этого раствора может варьировать от 10 до 100°С), затем протез сосуда переносят в свежеприготовленный раствор 2-5% глутаральдегида в этом же буфере (или ином без аминов, рН 8-10) и инкубируют в течение 2 часов. По окончанию инкубации в реакционную смесь вносят 1/10 объема 0,1 М раствора глицин/HCl рН=9,0, инкубируют в течение 10-15 минут для блокировки оставшихся альдегидных групп и, затем, вносят 1/10 объема раствора NaBH₄ (или NaCNBH₄) в концентрации 4 мг/мл и инкубируют 20 минут. После инкубации протезы отмывают 5-ю сменами апирогенной дистилированной воды (по 5 минут, 5-10 мл на один протез/одну смену), 1 раз апирогенной дистилированной водой с 2% глицерином (1-5%) и высушивают на воздухе в стерильном месте (ламинарном боксе) или в установке для вакуумной сушки, стерилизуют этиленоксидом, облучением электронным пучком (15-20 кГр) или иным способом. Перед использованием протезы вымачивают в физрастворе в течение 20-40 минут.

Предлагаемый способ позволяет получить «разгруженную» стенку ПС, эластичность которой соответствует эластичности стенки нативной артерии. В силу того, что напряжения в стенке протеза сосуда распределены так, что внешняя стенка старается уменьшиться в диаметре, а внутренняя, напротив увеличиться, полученный ПС не склонен к расслоению и обладает повышенной податливостью.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1. Для получения полимерной композиции для проведения электроспиннинга, выбранный полимер растворяют в растворителе до конечной концентрации 3,0-15,0%, а выбранный белок - до конечной концентрации 0,1-30,0% от веса исходного полимера, затем полученные растворы смешивают и получают полимерную композицию, позволяющую повысить эластичность микроволокнистого материала и упрочнить стенку протеза в 1,3÷1,5 раза по сравнению с чистым полимером (эластомером).

В преимущественном варианте, для получения полимерной композиции для проведения электроспиннинга, выбранный полимер растворяют в подходящем растворителе до конечной концентрации 3,0-15,0%, выбранный белок - до конечной концентрации 0,1-30,0% от веса исходного полимера, антикоагулянт - до конечной концентрации 0,1-3,0% от веса исходного полимера, затем полученные растворы смешивают и получают полимерную композицию, позволяющую повысить эластичность микроволокнистого материала и повысить его тромборезистентность.

2. В качестве растворителя для синтетических полимеров, белка и антикоагулянта используют гексафторизопропанол (ГФИП) или трифторэтанол (ТФЭ), что позволяет получать растворы синтетических полимеров с высоким содержанием белка и позволяет формировать волокна толщиной много менее 1 микрона, формирующие оптимальную структуру для адгезии клеток.

3. Для повышения эффективности прикрепления эндотелиальных клеток к внутренней поверхности ПС преимущественно используют такие белки как коллаген, эластин или желатин.

4. В качестве антикоагулянта используют трет-бутиламмонийную соль гепарина в концентрации 0,1-3,0% или бивалирудин в концентрации 0,5-3,0% от веса исходного полимера, что позволяет повысить тромборезистентность поверхности ПС.

5. Для проведения электроспиннинга используют электрод-коллектор уменьшающегося диаметра, представляющий собой стальную трубку с отверстиямими, на которую надета электропроводящая трубка из эластомера, при этом перед началом электроспиннинга устанавливают диаметр электрода-коллектора в 1,1÷1,4 раза больше, чем базовый диаметр электрода-коллектора (т.е. требуемый диаметр ПС), затем устанавливают программу плавного, преимущественно линейного, уменьшения диаметра электрода-коллектора, что позволяет получить более пластичные ПС, не склонные к разволокнению стенки и обладающие повышенной податливостью.

6. Фиксацию белкового слоя на поверхности волокон проводят обработкой бифункциональным сшивающим реагентом, преимущественно глутаровым альдегидом, с последующей дезактивацией реакционно-способных групп обработкой щелочным раствором глицина, в результате чего формируется структура, не изменяющая характеристик в процессе длительного функционирования.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого устройства, по сравнению с прототипом, являются:

1. электрод-коллектор выполнен в виде стальной трубки с отверстиями, на которой закреплена электропроводящая трубка из эластомера, заполненной электролитом и снабженной на конце заглушкой, при этом коллектор соединен с устройством изменения объема электролита, снабженным поршнем, выполненным с возможностью продольного перемещения, а трубка из эластомера выполнена с возможностью расширения в 1,1÷1,4 раза, что позволяет повысить податливость получаемых протезов;

2. трубка из токопроводящего эластомера изготовлена преимущественно из силиконовой термовулканизирующейся резины марки «Пентасил 6403», наполненной нанотрубками МУНТ-2, что обеспечивает технологичность процесса и гладкую внутреннюю поверхность ПС;

3. возможность увеличения диаметра трубки из токопроводящего эластомера обеспечена предварительным закачиванием раствора электролита в электрод-коллектор, при этом уменьшение объема раствора электролита под электродом приводит к уменьшению диаметра электрода-коллектора.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Для получения ПС приготовили 2 мл полимерной смеси, состоящей из 1,2 мл 5% раствора полиуретана Tecoflex EG 80А (Lubrizol inc, США) в ГФИП, 0,45 мл 2% раствора желатина в ГФИП и 0,35 мл ГФИП. Получили полимерную композицию, содержащую 3% полиуретана (вес : объем) и 15% желатина. Стерильный шприц (электрод-фильеру) заполняли полученной полимерной композицией и проводили электроспиннинг раствора в следующем режиме: скорость подачи полимерной композиции 1,5 мл/час, скорость вращения электрода-коллектора 300 об/мин, возвратно-поступательные движения фильеры со скоростью 20 мм/сек, расстояние между фильерой и электродом-коллектором 20 см и напряжение 20 кВ.

В качестве трубки из токопроводящего эластомера, надеваемой на стальную трубку с отверстиями (электрод-коллектор), использовали трубку из силиконовой термовулканизирующейся резины марки «Пентасил 6403», в состав которой были добавлены нанотрубки МУНТ для формирования токопроводящих свойств (Институт катализа СО РАН, г. Новосибирск) с изначальным внешним диаметром 5 мм. Диаметр трубки увеличивали до 6 мм путем нагнетания в нее электропроводящей жидкости и запускали процесс электроспиннинга с программой плавного линейного уменьшения диаметра электрода-коллектора до исходного диаметра (5 мм). По завершению электроспиннинга ПС, представляющий собой трубку из полиуретана с толщиной стенки 115 мкм (внутренний диаметр 6 мм) и длиной 80 мм, снимали с электрода-коллектора, инкубировали в растворе 0,05 М NaHCO₃ рН 9,0 в течение 5 минут, затем ПС переносили в свежеприготовленный раствор 2% глутаральдегида в этом же буфере и инкубировали в течение 2 часов. По окончанию инкубации в реакционную смесь вносили 1/10 объема 0,1 М раствора глицин/HCl рН=9,0, инкубировали в течение 10-15 минут для блокировки оставшихся альдегидных групп и, затем, вносили 1/10 объема раствора NaBH₄ в концентрации 4 мг/мл и инкубировали 20 минут. После инкубации ПС отмывали 5-ю сменами апирогенной дистилированной воды (по 5 минут, 5-10 мл на один протез/одну смену), 1 раз апирогенной дистилированной водой с 2% глицерином и высушивали на воздухе в стерильном месте (ламинарном боксе).

Пример 2.

Для получения ПС приготовили 2 мл полимерной смеси, состоящей из 1,4 мл 5% раствора полиуретана Pellethane 2363-80А (Lubrizol inc, США) (вес : объем) в ТФЭ, 0,35 мл 2% раствора желатина в ТФЭ (вес : объем), 0,07 мл 1% раствора бивалирудина в ТФЭ (вес : объем) и 0,18 мл ТФЭ. Получили полимерную композицию, содержащую 3,5% полиуретана (вес : объем), 10% желатина и 1% бивалирудина. Стерильный шприц заполняли полученной полимерной композицией и проводили электроспиннинг раствора в следующем режиме: скорость подачи полимерной композиции 2.0 мл/час, скорость вращения электрода-коллектора 400 об/мин, возвратно-поступательные движения фильеры со скоростью 40 мм/сек, расстояние между фильерой и электродом-коллектором 30 см и напряжение 30 кВ.

В качестве трубки из токопроводящего эластомера, надеваемой на стальную трубку с отверстиями (электрод-коллектор), использовали трубку из силиконовой термовулканизирующейся резины марки «Пентасил 6403» с изначальным внешним диаметром 5 мм. Диаметр трубки увеличивали до 6 мм путем нагнетания в нее электропроводящей жидкости и запускали процесс электроспиннинга с программой плавного линейного уменьшения диаметра электрода-коллектора до исходного диаметра (5 мм).

По завершению электроспиннинга ПС, представляющий собой трубку из полиуретана с толщиной стенки 110 мкм (внутренний диаметр 5 мм) и длиной 60 мм, снимали с электрода-коллектора, инкубировали в растворе 0,05 М NaHCO₃ рН 9,0 в течение 5 минут, затем ПС переносили в свежеприготовленный раствор 2% глутаральдегида в этом же буфере и инкубировали в течение 2 часов. По окончанию инкубации в реакционную смесь вносили 1/10 объема 0,1 М раствора глицин/HCl рН=9,0, инкубировали в течение 10-15 минут для блокировки оставшихся альдегидных групп и, затем, вносили 1/10 объема раствора NaBH₄ в концентрации 4 мг/мл и инкубировали 20 минут. После инкубации ПС отмывали 5-ю сменами апирогенной дистилированной воды (по 5 минут, 5-10 мл на один протез/одну смену), 1 раз апирогенной дистилированной водой с 2% глицерином и высушивали на воздухе в стерильном месте (ламинарном боксе).

Пример 3.

Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что для получения ПС приготовили 2 мл полимерной смеси, состоящей из 1,2 мл 5% раствора полиуретана Tecoflex EG 80А (Lubrizol inc, США) в ГФИП, 0,15 мл 2% раствора эластина в ГФИП, 0,09 мл 1% раствора трет-бутиламмонийной соли гепарина в ГФИП и 0,56 мл ГФИП. Получили полимерную композицию, содержащую 3% полиуретана (вес : объем), 5% эластина и 1,5% гепарина.

Стерильный шприц (электрод-фильеру) заполняли полученной полимерной композицией и проводили электроспиннинг раствора в следующем режиме: скорость подачи полимерной композиции 1,5 мл/час, скорость вращения электрода-коллектора 300 об/мин, возвратно-поступательные движения фильеры со скоростью 20 мм/сек, расстояние между фильерой и электродом-коллектором 20 см и напряжение 20 кВ.

На фиг. 5 представлена внутренняя поверхность протезов, изготовленных методом электроспиннинга на стальном электроде-коллекторе (А) и изготовленных заявляемым способом на электроде-коллекторе с изменяемым диаметром (Б). Было показано, что в протезе сформирована микроволоконная структура по типу тканеинженерной матрицы (по данным сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) (×1000 увеличение).

Для измерения пористости и стабильности показателя пористости в процессе изменяющейся гидравлической нагрузки, протезы вымачивали в дистиллированной воде в течение 20 минут и измеряли пористость в соответствие с ГОСТ Р 51556-2000. Пористость протезов из полиуретана (ПУ) с 15% желатином, изготовленных как классическим, так и предлагаемым способом, составляла 0,1÷0,3 мл. Для тестирования стабильности малопроницаемого слоя в условиях изменяющейся гидравлической нагрузки протез сосуда устанавливали в гидравлический стенд, состоящий из резервуаров для создания избыточного давления, систем установки и поддержания избыточного давления (0-300 мм рт.ст.), впускного и выпускного клапанов, контроллера, управляющего клапанами и компьютерной программы, управляющей контроллером. Цикл нагрузки включал подачу давления (500 мс) удержание (100 мс) стравливание давления (200 мс) и временной разрыв (50 мс). Обнаружено, что 100.000 циклов гидравлической нагрузки не приводят к изменению проницаемости протезов сосудов, их разволокнению, что демонстрирует высокую стабильность полученной структуры.

Усадку протезов сосудов и изменение их податливости исследовали на испытательном стенде для гидродинамических испытаний протезов сосудов, который был снабжен бесконтактным микрометром, записывающим 64 показания в секунду. Таким образом, мы измеряли диаметр протеза сосуда, а после приложения циклически изменяющегося давления и податливость протеза сосуда. В качестве контроля использовали участок свежей нативной брюшной аорты крысы. В таблице 1 представлены данные по исследованию нативной аорты крысы и протезов сосудов из Tecoflex и желатины, изготовленных классическим и заявляемым способом (пример 2).

На фиг. 6 представлены графики изменения наружного диаметра ПС, изготовленных стандартным и заявляемым способом после приложения циклически изменяющегося давления.

Из таблицы 1 и фиг. 6 следует, что протезы сосудов, изготовленные заявляемым способом из 3,0% Tecoflex и 15,0% желатины (пример 2), обладают лучшими физико-механическими свойствами, являются более эластичными по сравнению с такими же протезами, но изготовленными классическим способом. При этом модифицированные протезы наименее подвержены изменению размеров и податливости с течением времени.

Бисовместимость протезов, полученных по примерам 1-3, исследовали in vitro. Показано, что клетки охотно адгезируют и активно пролиферируют на поверхности материала, изготовленного предложенным методом. Клетки эндотелия из пупочной вены человека инкубировали с исследуемым материалом, в результате чего было показано, что, адгезия эндотелиоцитов к поверхности материала и скорость их пролиферации значимо не отличаются от адгезии/пролиферации на поверхности материала, изготовленного стандартным способом (фиг. 7, 8). При инкубации первичных фибробластов с наружным слоем материала, так же не было обнаружено разницы в адгезии и пролиферации этих клеток на поверхности матриксов (фиг. 9).

На фиг. 7. изображена поверхность протезов, по данным сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) после инкубации вместе с эндотелиоцитами пупочной вены человека, где А - протез, изготовленный стандартным методом, Б - протез, изготовленный заявляемым способом. На фиг. 7 видно, что, адгезия эндотелиоцитов к поверхности материала, изготовленного заявляемым способом, значимо не отличается от адгезии на поверхности материала, изготовленного стандартным методом.

На фиг. 8 представлены данные по оценке жизнеспособности клеток HUVEC, взятых от разных доноров на поверхности различных протезов, где А протез, изготовленный стандартным методом, Б - протез, изготовленный заявляемым способом.

На фиг. 9. представлены данные по оценке жизнеспособности первичных фибробластов, взятых от разных доноров на поверхности различных протезов, где А - протез, изготовленный стандартным методом, Б - протез, изготовленный заявляемым способом. На фиг. 8 и 9 видно, что, скорость пролиферации эндотелиоцитов и фибробластов на поверхности материала, изготовленного заявляемым способом, значимо не отличается от скорости пролиферации на поверхности материала, изготовленного стандартным методом.

Для сравнения прочностных характеристик протезов сосудов, изготовленных классическим и заявляемым способом, были проведены механические испытания образцов (таблица 2).

Механические свойства, изучали, как описано в ГОСТ 51556-2000, с использованием универсальной разрывной машины для испытания материалов Zwick/Roell Z100 (Германия) при постоянной скорости приложения силы 10 мм/мин. Прочность протеза сосуда на прорыв ниткой измеряли, как описано в (Schaner P.J., et al, Journal of vascular surgery, 2004).

Было показано, что модификация способа изготовления не влияет на прочность протезов сосудов: прочность на разрыв составляет 15÷16 МПа, прочность на прорыв ниткой составляла в 160÷180 грамм силы.

Для исследования in vivo, протезы, изготовленные заявляемым способом, были имплантированы в инфраренальный отдел брюшной аорты крыс линии Wistar (18 крыс).

Интраоперационная оценка качества изготовленных протезов показала их хорошую устойчивость к «разлохмачиванию» при отрезании части ножницами, высокую способность сохранять свою цилиндрическую форму на протяжении всех этапов имплантации. Формирование анастомозов не сопровождалось подворачиванием краев трансплантата, а область соединения протеза с нативной артерией была в виде плотного контакта. После запуска кровотока по имплантированному протезу, не наблюдалось пропитывания кровью стенки протеза (фиг. 10). Время местного гемостаза (время от снятия зажимов с аорты до прекращения кровотечения из области анастомозов и отверстий после проколов иглой) составляло 15.12±2.35 мин. В условии пульсирующего кровотока отмечалась хорошая растяжимость протезов.

В послеоперационном периоде не наблюдалось диастаза, нагноений или других осложнений послеоперационной раны, окружающих тканей и самих протезов. Проходимость протезов оценивалась клинически, а так же при помощи ультразвукового допплеровского сканирования (Mindray DC 7, КНР) на сроках 1, 12 и 24 недель. При этом у животных с имплантированными протезами, при отсутствии специальной послеоперационной антитромботичекой терапии (антикоагулянты и дезагреганты), случаев окклюзии протезов не наблюдалось. Эти наблюдения подтверждают хорошую тромборезистентность изготовленных сосудистых протезов.

Во время эксплантации протезов на 7 сутки при макроскопическом исследовании не было выявлено видимых деформаций стенки и изменения цвета. При этом не наблюдалось выраженного фиксирования протезов к окружающим тканям и следов реваскуляризации. Во время эксплантации протезов на 24 неделе при макроскопическом исследовании так же не было выявлено видимых деформаций стенки и изменения цвета обоих типов протезов. При этом определялось достаточно плотное фиксирование протезов сосудов с окружающими тканями и участки васкуляризации (фиг. 11).

При оценке степени фомирования неоинтимы на 24-й неделе после имплантации было обнаружено, что протезы образуют достаточно тонкую неоинтиму, средняя толщина которой составила 105±12 мкм.

При проведении иммуногистохимического анализа (окраска Isolectin) выявлено, что процесс васкуляризации на 24-й неделе после имплантации в протезе выражен достаточно хорошо. Анализ срезов показал, что количество клеток (в большей степени гладкомышечных клеток, в меньшей эндотелиальных) на внутренней и внешней (гладкомышечных клеток) поверхностях исследуемого протеза увеличивается в зависимости от времени, которое протез провел в организме. Активная выработка фибронектина и коллагена в исследуемых протезах свидетельствует о жизнедеятельности клеток. Предварительные данные экспериментов in vivo демонстрируют хорошую био- и гемосовместимость протезов сосудов, изготовленных заявляемым способом.

Предлагаемый способ позволяет получать протезы сосудов с требуемой податливостью, способностью к заселению клетками, и необходимой гемосовместимостью. ПС, изготовленные заявляемым способом, не поддаются разволокнению в силу склонности внутреннего слоя к расширению, внешнего к сжатию. За счет повышенной пластичности ПС менее склонны к формированию неоинтимы и обеспечивают достоверно более высокую проходимость при длительном времени функционирования.

Использование предлагаемой группы технических решений позволит, по сравнению с прототипом:

1. Увеличить податливость синтетического сосудистого протеза;

2. Улучшить совместимость между синтетическими протезами кровеносных сосудов и нативными артериями;

3. Улучшить прохождение пульсовой волны по стенке синтетического сосудистого протеза;

4. Обеспечить более физиологичные условия для заселения и функционирования эндотелиальных клеток на синтетическом сосудистом протезе;

5. Препятствовать формированию гиперплазии неоинтимы;

6. Уменьшить частоту рестенозов и окклюзий имплантируемых синтетических сосудистых протезов;

7. Увеличить сроки отдаленной проходимости имплантируемых синтетических сосудистых протезов.

Предлагаемый способ позволяет с минимальными затратами сформировать ПС с требуемыми характеристиками податливости, гладкой внутренней поверхностью, полученной за счет того, что при уменьшении диаметра электрод-коллектор не формирует стыков.

Способ отличается простотой, воспроизводимостью и технологичностью.

Источники информации

1. Kannan RY, Salacinski HJ, Butler PE, Hamilton G, Seifalian AM. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 2005 Jul 1; 74(1): 570-81.

2. Klinkert P, Post PN, Breslau PJ, Van Bockel JH. Saphenous vein versus PTFE for above-knee femoropopliteal bypass. A review of the literature. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 2004 Apr 30; 27(4): 357-62.

3. Lemson MS, Tordoir JH, Daemen MJ, Kitslaar PJ. Intimal hyperplasia in vascular grafts. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 2000 Apr 30; 19(4): 336-50.

4. Samson RH, Morales R, Showalter DP, Lepore MR, Nair DG. Heparin-bonded expanded polytetrafluoroethylene femoropopliteal bypass grafts outperform expanded polytetrafluoroethylene grafts without heparin in a long-term comparison. Journal of vascular surgery. 2016 Sep 30; 64(3): 638-47.

5. Wise SG, Liu H, Kondyurin A, Byrom MJ, Bannon PG, Edwards GA, Weiss AS, Bao S, Bilek MM. Plasma Ion Activated Expanded Polytetrafluoroethylene Vascular Grafts with a Covalently Immobilized Recombinant Human Tropoelastin Coating Reducing Neointimal Hyperplasia. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2016 Jul 12; 2(8): 1286-97

6. Montini-Ballarin F, Calvo D, Caracciolo PC, Rojo F, Frontini PM, Abraham GA, Guinea-Totuero G. To appear in: Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2016.

7. Salacinski HJ, Goldner S, Giudiceandrea A, Hamilton G, Seifalian AM, Edwards A, Carson RJ. The mechanical behavior of vascular grafts: a review. Journal of biomaterials applications. 2001 Jan; 15(3): 241-78.

8. Sarkar S, Salacinski HJ, Hamilton G, Seifalian AM. The mechanical properties of infrainguinal vascular bypass grafts: their role in influencing patency. European journal of vascular and endovascular surgery. 2006 Jun 30; 31(6): 627-36.

9. Grasl C, Bergmeister H, Stoiber M, Schima H, W^reigel G. Electrospun polyurethane vascular grafts: in vitro mechanical behavior and endothelial adhesion molecule expression. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 2010 May 1; 93(2): 716-23.

10. Yuan L, Shu C, Zhou X, Li J, Wang L, Li X, Xiong X, Li L. Radiation suppresses neointimal hyperplasia through affecting proliferation and apoptosis of vascular smooth muscle cells. The journal of vascular access. 2017 Nov.

11. Wu H, Fan J, Chu CC, Wu J. Electrospinning of small diameter 3-D nanofibrous tubular scaffolds with controllable nanofiber orientations for vascular grafts. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2010 Dec 1; 21(12): 3207-15.

12. Chen DW, Liao JY, Liu SJ, Chan EC. Novel biodegradable sandwich-structured nanofibrous drag-elating membranes for repair of infected wounds: an in vitro and in vivo study. International journal of nanomedicine. 2012; 7: 763.

13. Montini-Ballarin F, Calvo D, Caracciolo PC, Rojo F, Frontini PM, Abraham GA, Guinea GV. Mechanical behavior of bilayered small-diameter nanofibrous structures as biomimetic vascular grafts. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. 2016 Jul 31; 60: 220-33.

14. Lee SJ, Liu J, Oh SH, Soker S, Atala A, Yoo JJ. Development of a composite vascular scaffolding system that withstands physiological vascular conditions. Biomaterials. 2008 Jul 31; 29(19): 2891-8.

15. Попова ИВ, Степанова AO, Сергеевичев ДС, Акулов АЕ, Захарова ИС, Покушалов АА, Лактионов ПП, Карпенко АА. Сравнительное исследование трех типов протезов, изготовленных методом электроспиннинга в эксперименте in vitro и in vivo. Патология кровообращения и кардиохирургия. 2015; 19(4).

16. McClure MJ, Simpson DG, Bowlin GL. Tri-layered vascular grafts composed of polycaprolactone, elastin, collagen, and silk: Optimization of graft properties. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. 2012 Jun 30; 10: 48-61.

17. Патент US 812400L опубл. 28.02.2012, на изобретение «Synthetic vascular tissue and method of forming same». Авторы: Wen X, Beachley VZ, Mironov VA, Kasyanov VA; Патентообладатель: Clemson University Research Foundation.

Группа изобретений относится к области медицины, биотехнологии и тканевой инженерии и может быть использована для изготовления протезов кровеносных сосудов малого диаметра. Способ изготовления протезов кровеносных сосудов малого диаметра путем электроспиннинга включает приготовление полимерной композиции путем растворения исходного синтетического полимера в растворителе, смешивание раствора полимера с раствором белка и проведение электроспиннинга путем нанесения полученной полимерной композиции из электрода-фильеры на электрод-коллектор с изменяемым диаметром. При этом выбранный полимер растворяют в подходящем растворителе до конечной концентрации 3,0-10,0% в готовой полимерной композиции, белок - до конечной концентрации 0,1-30,0% от веса исходного полимера, антикоагулянт - до конечной концентрации 0,5-1,5% от веса исходного полимера, затем полученные растворы смешивают, полимерную композицию помещают в электрод-фильеру, перед началом электроспиннинга, устанавливают диаметр электрода-коллектора в 1,1÷1,4 раза больше, чем исходный диаметр коллектора, путем нагнетания в него электролита и запускают процесс электроспиннинга с программой плавного линейного уменьшения диаметра электрода-коллектора до исходного диаметра. В качестве электрода-коллектора используют стальную трубку с отверстиями, на которой закреплена трубка из электропроводящего эластомера, а полученный протез сосуда обрабатывают бифункциональным сшивающим реагентом с последующей дезактивацией реакционно-способных групп обработкой щелочным раствором глицина и высушивают. Также раскрывается устройство для проведения электроспиннинга. Группа изобретений обеспечивает получение протезов кровеносных сосудов с высокой податливостью и гладкой внутренней поверхностью, высокой гемо- и биосовместимостью и с увеличенным сроком функционирования. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Способ изготовления протезов кровеносных сосудов малого диаметра путем электроспиннинга, включающий приготовление полимерной композиции путем растворения исходного синтетического полимера в растворителе, смешивания раствора полимера с раствором белка и проведение электроспиннинга путем нанесения полученной полимерной композиции из электрода-фильеры на электрод-коллектор с изменяемым диаметром, отличающийся тем, что выбранный полимер растворяют в подходящем растворителе до конечной концентрации 3,0-10,0% в готовой полимерной композиции, белок - до конечной концентрации 0,1-30,0% от веса исходного полимера, антикоагулянт - до конечной концентрации 0,5-1,5% от веса исходного полимера, затем полученные растворы смешивают, полимерную композицию помещают в электрод-фильеру, далее, перед началом электроспиннинга, устанавливают диаметр электрода-коллектора в 1,1÷1,4 раза больше, чем исходный диаметр коллектора, путем нагнетания в него электролита и запускают процесс электроспиннинга с программой плавного линейного уменьшения диаметра электрода-коллектора до исходного диаметра, при этом в качестве электрода-коллектора с уменьшающимся диаметром используют стальную трубку с отверстиями, на которой закреплена трубка из электропроводящего эластомера, далее полученный протез сосуда обрабатывают бифункциональным сшивающим реагентом с последующей дезактивацией реакционно-способных групп обработкой щелочным раствором глицина и высушивают.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве полимера используют полимер, выбранный из группы: полиуретан, поликапролактон, полибутилентерефталат, полилактид-ко-гликолид, нейлон или другие биосовместимые полимеры с близкими механическими свойствами.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве белка используют гелеобразующий белок, выбранный из группы: коллаген, желатин, эластин, в концентрации 0,1-30,0% от веса исходного полимера.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве антикоагулянта используют третбутил-аммонийную соль гепарина в концентрации 1,5% от веса исходного полимера или бивалирудин в концентрации 0,5-1,0% от веса исходного полимера.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве растворителя для полимера, белка и антикоагулянта используют гексафторизопропанол (ГФИП) или трифторэтанол (ТФЭ).

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что электроспиннинг проводят со следующими параметрами: напряжение - 15-30 кВ, скорость подачи раствора полимеров - 1,0-2,0 мл/час, расстояние между электродом-фильерой и электродом-коллектором - 15-30 см, скорость вращения коллектора - 150-400 об/мин, скорость возвратно-поступательного движения фильеры - 20-40 мм/сек.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученный протез сосудов обрабатывают 2,0-5,0% раствором глутарового альдегида в буферном растворе, содержащем 0,05 М NaHCO₃ рН 9.0.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дезактивацию реакционно-способных групп осуществляют путем инкубации протеза сначала в 0,1 М буферном растворе, содержащем глицин/HCl, рН=9.0, а затем в растворе боргидрида натрия (NaBH₄) с концентрацией 4 мг/мл.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что протез сосудов высушивают на воздухе в стерильном месте или в установке для вакуумной сушки с последующей стерилизацией этиленоксидом или облучением электронным пучком с мощностью 15-20 кГр.

10. Устройство для проведения электроспиннинга, состоящее из электрода-фильеры, соединенного с источником высокого напряжения, и заземленного электрода-коллектора с изменяемым диаметром, отличающееся тем, что электрод-коллектор выполнен в виде стальной трубки с отверстиями, на которой закреплена электропроводящая трубка из эластомера, заполненной электролитом и снабженной на конце заглушкой, при этом электрод-коллектор соединен с устройством изменения объема электролита, снабженным поршнем, выполненным с возможностью продольного перемещения, а трубка из эластомера выполнена с возможностью расширения в 1,1÷4,4 раза.

11. Устройство по п. 10, отличающееся тем, что в качестве эластомера использована силиконовая термовулканизирующаяся резина, наполненная нанотрубками МУНТ-2.

12. Устройство по п. 11, отличающееся тем, что диаметр трубки из эластомера изменяют путем нагнетания/удаления электролита при помощи поршня.