СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЦИТАРНОГО ЛЕЙКОЗА Российский патент 2025 года по МПК G01N33/50 C12N1/00 

Настоящее изобретение относится к области медицины, онкологии, гематологии, иммунологии.

В наши дни методами молекулярной диагностики устанавливается гистогенез, стадия дифференцировки и иммунофенотип опухолевых клеток, свойственный одному из видов злокачественной зрелоклеточной лимфопролиферации - хроническому лимфоцитарному лейкозу (ХЛЛ). ХЛЛ - злокачественное клональное лимфопролиферативное заболевание, характеризующееся накоплением атипичных зрелых CD5/CD19/CD23-положительных В-лимфоцитов преимущественно в крови, костном мозге, лимфатических узлах, печени и селезёнке [Chiorazzi N., Rai K. R., Ferrarini М. Chronic lymphocytic leukemia // N Engl J Med. - 2005. - T. 352, вып. 8. - С. 804 -815.]. Выявлены сотни маркеров, отражающих особенности этого заболевания [Hallek М. Chronic lymphocytic leukemia: 2020 update on diagnosis, risk stratification and treatment. Am J Hematol. 2019; 94:1266-1287. https://doi.org/10.1002/ajh.25595]. В охране генетического гомеостаза организма иммунная система использует механизмы, в которых участвует многокомпонентный состав ее клеток и их продуценты. Описаны дисфункции иммунитета, генетические особенности и иммунофенотипы опухолевых В-клеток при зрелоклеточной лимфопролиферации [Д.Б. Казанский. Т-лимфоциты в развитии хронического лимфоцитарного лейкоза. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. Ж-л Клиническая онкогематология, 2012, Т. 5, №2, С. 84-95], [А. И. Свирновский. Хронический лимфоцитарный лейкоз: парадигмы и парадоксы. Медицинские новости. - 2008. - №13. - С. 7-19.], [С.А. Луговская, М.Е. Почтарь. Гематологический атлас, М, 2016, 296], [Кузьмина Е.Г., Мушкарина Т.Ю., Константинова Т.В., Зацаренко С.В. и др., Субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток периферической крови при В-клеточном хроническом лимфоцитарном лейкозе/лимфоме из малых лимфоцитов. Клиническая Онкогематология, 2020 Т 13, № 4 С. 395-405], [Beekman R, Chapaprieta V, Russinol N, et al. The reference epigenome and regulatory chromatin landscape of chronic lymphocytic leukemia. Nat Med. 2018;24:868-880], [Hacken E, Burger JA. Microenvironment interactions and В cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia: implications for disease pathogenesis and treatment. In: Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research, Amsterdam: Elsevier B.V.; 2016, v. 1863.401-13]. Степень нарушения иммунокомпетентности в сочетании с присутствием в крови опухолевых клеток представляют собой комплексный образ (многомерный паттерн), отражающий динамическое взаимодействие в системе «иммунитет-опухоль». Этот многомерный образ, как правило, отражает определенные изменения состава и численности клеток периферической крови. Таким образом, разные патологии крови формируют уникальные паттерны признаков.

На современном этапе развития науки, для диагностики ХЛЛ необходима не только характеристика ее морфогенетических и других молекулярных признаков, но и сопоставление их размерности с качеством противоопухолевого иммунитета.

Ближайшим аналогом заявленного способа является иммунофенотипирование образцов периферической крови и костного мозга [Луговская С.А., Почтарь М.Е. Гематологический атлас. 4-е издание, дополненное. М.: Триада, 2016. 434 с.], [Российские клинические рекомендации по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний. Под ред. И.В. Поддубной, В.Г. Савченко. М., 2018. 356 с.].

Для осуществления процедуры иммунофенотипирования клетки в составе исследуемого образца обрабатывают флуоресцентно мечеными моноклональными антителами к различным поверхностным антигенам. Для анализа используются проточный цитофлуориметр. Исследование производится следующим образом. Лазерный луч направляется на кварцевую кювету, через которую поочередно поступают клетки, вызывая прямое и боковое светорассеяние лазера. На первом этапе производится оценка параметров рассеяния, которые отражают размер и гранулярность клеток в составе исследуемого образца. Данный подход позволяет выделить как минимум три типа клеток: лимфоциты (клетки мелкого размера без зернистости, моноциты (клетки с промежуточными характеристиками), и гранулоциты (клетки более крупного размера с зернистостью). Затем каждый тип клеток может быть проанализирован более детально. Так, при лимфопролиферативных заболеваниях анализируется состав т.н. лимфоцитарного гейта. При облучении клеток лазером происходит испускание монохроматического излучения определенной длины волны за счет антител, специфично связанных с антигенами на поверхности клеток и меченых различными флуорохромами. Оценивая интенсивность эмиссии, лимфоцит относят к определенному типу антигенположительных клеток (Т-, В-, NK-клетки). Сочетание различных флуорохромов и антител позволяет обнаруживать одновременно несколько антигенных детерминант на клетке интересующего типа. Основную проблему при проточной цитофлуориметрии представляет формирование панели моноклональных антител. При диагностике злокачественных лимфом и хронического лимфоцитарного лейкоза основное внимание при иммунофенотипировании уделяется учету бокового светорассеяния для выделения лимфоцитарного гейта, составу набора антител для определения основных характеристик пролиферирующих клеток и их клональности. Указанный метод является трудозатратным в связи с необходимостью оценки большого количества различных антигенных детерминант, и, следовательно, с необходимостью использования панелей, включающих большое количество различных антител. Также указанный метод ограничен по точности.

Таки образом, техническим результатом заявленного изобретения является снижение трудоёмкости процедуры определения ХЛЛ, повышение ее точности, а также повышение вероятности определения ХЛЛ на ранних стадиях заболевания за счет возможности организации исследования, например, в рамках периодического осмотра пациентов, входящих в группу риска развития заболевания.

Указанный технический результат достигается за счет способа определения хронического лимфоцитарного лейкоза, включающего забор у пациента образца периферической крови, подсчет количества лимфоцитов в образце периферической крови, оценка доли Т-хелперов CD4+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, лимфоцитов HLADR+ (включающих сумму активированных Т-клеток и В-лимфоцитов в лимфоцитарном гейте) периферической крови. При этом в случае, если доля Т-хелперов CD4+ составляет меньше 29,6% от общего количества лимфоцитов, определяют ХЛЛ. В случае, если доля Т-хелперов CD4+ составляет не менее 29,6% от общего количества лимфоцитов, и доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составляет не менее 14% от общего количества лимфоцитов, определяют ХЛЛ. В случае, если доля Т-хелперов CD4+ составляет не менее 29,6%о от общего количества лимфоцитов, и доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составляет менее 14% от общего количества лимфоцитов, и доля лимфоцитов HLADR+ составляет не менее 24,5% от общего количества лимфоцитов, определяют ХЛЛ.

Как вариант, оценка доли Т-хелперов CD4+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, НЬАОК+-лимфоцитов (в лимфоцитарном гейте это В-лимфоциты и активированные Т-лимфоциты) в образце периферической крови проводится методом иммунофенотипирования. При этом, как вариант, иммунофенотипирование может проводиться с использованием моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным антигенам на клетках иммунной системы методом проточной цитофлуорометрии.

Авторами изобретения разработан алгоритм и выполнена серия системных исследований по сопоставлению состояния иммунитета и признаков опухолевого роста по данным периферической крови при ХЛЛ. На первом этапе был проведен многомерный сравнительный анализ данных пациентов с ХЛЛ и практически здоровых людей. Проведено клинико-иммунологическое обследование 315 пациентов с ХЛЛ. Группу контроля составили данные 184 практически здоровых человека, преимущественно доноров крови; на момент взятия крови у которых не было отклонений в состоянии здоровья. Средний возраст пациентов с ХЛЛ составил 62 года, практически здоровых людей - 58 лет. Для диагностики ХЛЛ использованы критерии классификации ВОЗ опухолей лимфоидной и кроветворной системы: объективный анализ ультразвукового, магнитно-резонансного обследования пациентов, иммуногистохимического исследования материала лимфатических узлов, тканей и костного мозга, иммунофенотипирование опухолевых клеток крови и костного мозга [С.А. Луговская, М.Е. Почтарь. Гематологический атлас, М, 2016, 296].

По гемограмме подсчитывали количество лейкоцитов, относительное и абсолютное число лимфоцитов. Состав ядросодержащих клеток оценивали в цельной крови после предварительного лизиса эритроцитов лизирующим раствором фирмы BD Biosciences. Далее в лимфоцитарном гейте определяли фенотипы субпопуляций иммунокомпетентных клеток и опухолевых В-лимфоцитов методами 2-6-цветной проточной цитометрии на приборе FACSCan или FACSCanto II (BD Biosciences) по известной методике [Swerdlow S.H., Campo Е., Pileri S.A. et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood 2016; 19; 127(20):2375-90. DOI: 10.1182/blood-2016-01-643569].

Для многомерного анализа состояния иммунитета и признаков В-клеточной пролиферации для каждого пациента использовано по 13 показателей. Это: количество лейкоцитов, Лц абс, ×10⁹ кл/л, доля Лф, общих Т-клеток, CD3+CD16-; Т-хелперы, CD3+CD4+; Т-киллеры, CD3+CD8+; иммунорегуляторный индекс, CD4/CD8; доля NK-клеток, (CD16+CD3-); активированных Т-клеток, CD3+HLADR+; HbAOK⁺лимфоцитов (включает активированные Т-клетки и В-лимфоциты в лимфоцитарном гейте). Идентификация В-лимфоцитов проведена по маркерам CD19+, CD20+, CD22+, CD23+.

Визуализация многомерных данных, характеризующих состояние иммунитета и В-клеточной пролиферации, проведена, используя самоорганизующиеся карты (СОКК, Self Organizing Maps, SOM), разработанные Т.Кохоненом [Kohonen, Essentials of the self-organizing map, Neural Networks 37 (2013) 52-65]. Этим методом многомерные данные проецируются в пространство пониженной размерности и визуализируются в виде двух(трех)мерной карты. На основе карты возможно осуществление кластеризации за счет выделения в ней векторов (показателей анализируемых признаков) пациентов и здоровых людей с близкими (похожими) характеристиками. Авторами изобретения определены показатели в многомерных структурах, контрастирующие данные в исследуемых группах «ХЛЛ» и «Норма», которые затем использованы для разработки заявленного способа определения ХЛЛ.

Образ ХЛЛ, полученный с использованием СОКК, позволяет упростить способ определения данного заболевания. В предложенном способе в качестве критериев определения ХЛЛ используется уровень показателей хелперного звена иммунитета в сочетании с уровнем активации Т-клеток, а также уровень В-клеток (включающих как нормальные, так и опухолевые лимфоциты). Т.е. выявлена связь в нарушениях иммунитета с величиной опухолевой пролиферации. Этот подход более прост, менее трудозатратен для выявления ХЛЛ, и может быть использован для проведения скринингового определения заболевания.

Как вариант, заявленный способ может быть реализован следующим образом. У пациента проводится забор образца периферической крови. В полученном образце по гемограмме определяется доля и количество лимфоцитов. Затем на проточном цитофлуориметре (FACSCanto II (BD Biosciences), используя метод 2-4-цветной проточной цитофлуориметрии осуществляется оценка в образце доли Т-хелперов CD4+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, лимфоцитов HLADR+.

На следующем этапе осуществляется интерпретация полученных данных. В каждом из указанных ниже случаев:

1. Если доля Т-хелперов CD4+ составляет меньше 29,6% от общего количества лимфоцитов, у пациента определяют хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ).

2. Если доля Т-хелперов CD4+ составляет не менее 29,6%) от общего количества лимфоцитов, и, при этом, доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составляет не менее 14% от общего количества лимфоцитов,

3. Если доля Т-хелперов CD4+ составляет не менее 29,6% от общего количества лимфоцитов, и доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составляет менее 14% от общего количества лимфоцитов, и доля лимфоцитов HLADR+ составляет не менее 24,5% от общего количества лимфоцитов, у пациента определяют хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ).

На фиг. 1 представлена схема реализации указанного способа.

На фиг. 2 представлена ROC-кривая, характеризующая точность (качество) предложенного способа.

Полученное значение AUC (площади, ограниченной ROC-кривой и осью абсцисс) свидетельствует о высокой точности заявленного способа. Чем значение AUC ближе к 1, тем выше качество предложенной модели.

Заявленное изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Реализация заявленного способа.

У пациента А. проводился забор образца периферической крови. В полученном образце по гемограмме определялась доля и количество лимфоцитов. Затем на проточном цитофлуориметре (FACSCanto II (BD Biosciences), используя метод 2-4-цветной проточной цитофлуориметрии осуществлялась оценка в образце доли Т-хелперов CD4+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, лимфоцитов HLADR+. На следующем этапе осуществлялась интерпретация полученных данных.

Доля Т-хелперов CD4+ в исследуемом образце составила 25,2% от общего количества лимфоцитов. У пациента определен хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ).

Пример 2. Реализация заявленного способа.

У пациента В. проводился забор образца периферической крови. В полученном образце по гемограмме определялась доля и количество лимфоцитов. Затем на проточном цитофлуориметре (FACSCanto II (BD Biosciences), используя метод 2-4-цветной проточной цитофлуориметрии осуществлялась оценка в образце доли Т-хелперов CD4+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, лимфоцитов HLADR+. На следующем этапе осуществлялась интерпретация полученных данных.

Доля Т-хелперов CD4+ в исследуемом образце составила 32% от общего количества лимфоцитов, доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составила 16% от общего количества лимфоцитов. У пациента определен хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ).

Пример 3. Реализация заявленного способа.

У пациента П. проводился забор образца периферической крови. В полученном образце по гемограмме определялась доля и количество лимфоцитов. Затем на проточном цитофлуориметре (FACSCanto II (BD Biosciences), используя метод 2-4-цветной проточной цитофлуориметрии осуществлялась оценка в образце доли Т-хелперов CD4+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, лимфоцитов HLADR+. На следующем этапе осуществлялась интерпретация полученных данных.

Доля Т-хелперов CD4+ в исследуемом образце составила 31,4 % от общего количества лимфоцитов, доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составила 13,3% от общего количества лимфоцитов, доля активированных лимфоцитов HLADR+ составила 24,7% от общего количества лимфоцитов. У пациента определен хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ).

Пример 4. Сравнительная оценка точности заявленного способа. В рамках оценки точности анализа в определении ХЛЛ с использованием заявленного способа было проведено рандомизированное сравнительное исследование 10 пациентов с диагнозом ХЛЛ, а также 10 практически здоровых пациентов (контроль) заявленным способом, а также контрольным способом, включающим определение иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови (в соответствии с ближайшим аналогом заявленного изобретения). Для подтверждения диагноза (эталонный способ определения ХЛЛ) выполнено ультразвуковое, магнитно-резонансное исследование, иммуногистохимическое исследование материала лимфатических узлов и иммунофенотипирование образцов периферической крови и костного мозга [Луговская С.А., Почтарь М.Е. Гематологический атлас. 4-е издание, дополненное. М.: Триада, 2016. 434 с.], [Российские клинические рекомендации по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний. Под ред. И.В. Поддубной, В.Г. Савченко. М., 2018. 356 с.]. Результаты исследования приведены в таблице 1.

По результатам сравнительной оценки точности анализа с использованием заявленного способа было установлено, что данный способ позволяет производить определение ХЛЛ с не меньшей точностью, чем контрольный способ. При этом использование заявленного способа позволяет снизить трудоёмкость процедуры определения ХЛЛ при повышении ее точности.

Настоящее изобретение относится к области медицины, онкологии, гематологии, иммунологии. Способ определения хронического лимфоцитарного лейкоза включает забор у пациента образца периферической крови, подсчет количества лимфоцитов в образце периферической крови, оценку доли Т-хелперов CD4+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, активированных лимфоцитов HLADR+ в образце периферической крови, при этом, в случае если доля Т-хелперов CD4+ составляет меньше 29,6% от общего количества лимфоцитов, определяют хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), при этом, в случае если доля Т-хелперов CD4+ составляет не менее 29,6% от общего количества лимфоцитов и доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составляет не менее 14% от общего количества лимфоцитов, определяют хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), при этом, в случае если доля Т-хелперов CD4+ составляет не менее 29,6% от общего количества лимфоцитов, доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составляет менее 14% от общего количества лимфоцитов и доля лимфоцитов HLADR+ составляет не менее 24,5% от общего количества лимфоцитов, определяют хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ). Изобретение позволяет эффективно определять хронический лимфоцитарный лейкоз у пациента. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Способ определения хронического лимфоцитарного лейкоза, включающий забор у пациента образца периферической крови, подсчет количества лимфоцитов в образце периферической крови, оценку доли Т-хелперов CD4+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, активированных лимфоцитов HLADR+ в образце периферической крови,

при этом, в случае если доля Т-хелперов CD4+ составляет меньше 29,6% от общего количества лимфоцитов, определяют хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ),

при этом, в случае если доля Т-хелперов CD4+ составляет не менее 29,6% от общего количества лимфоцитов и доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составляет не менее 14% от общего количества лимфоцитов, определяют хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), при этом, в случае если доля Т-хелперов CD4+ составляет не менее 29,6% от общего количества лимфоцитов, и доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составляет менее 14% от общего количества лимфоцитов, и доля лимфоцитов HLADR+ составляет не менее 24,5% от общего количества лимфоцитов, определяют хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ).

2. Способ по п. 1, где оценка доли Т-хелперов CD4+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, активированных лимфоцитов HLADR+ в образце периферической крови проводится методом иммунофенотипирования.

3. Способ по п. 2, где иммунофенотипирование проводится с использованием моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным антигенам на клетках иммунной системы методом проточной цитофлуорометрии.