СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В-КЛЕТОЧНОЙ НЕХОДЖКИНСКОЙ ЛИМФОМЫ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/00 G01N33/49 

Настоящее изобретение относится к области медицины, онкологии, гематологии, иммунологии.

В наши дни методами молекулярной диагностики устанавливается гистогенез, стадия дифференцировки и иммунофенотип опухолевых клеток, свойственный злокачественной зрелоклеточной лимфопролиферации - неходжкинским В-клеточным лимфомам, НХЛ. В основе В-клеточных НХЛ (далее - НХЛ) лежит злокачественная пролиферация В-лимфоцитов, которые в основном, формируют опухоли локально, прежде всего, в лимфоузлах, в тканях, ассоциированных со слизистыми оболочками (вне нодальные формы), в селезенке, печени и других органах); реже (при распространении процесса) наблюдается лейкемизация: поражается костный мозг, сопровождающийся выходом опухолевых клеток в кровь. Это группа онкологических заболеваний, отличающихся между собой по степени злокачественности, скорости развития опухолевого процесса и симптоматике. [Chiorazzi N., Rai K.R., Ferrarini М. Chronic lymphocytic leukemia // N Engl J Med. - 2005. - T. 352, вып. 8. - С. 804 -815.]. Выявлены сотни маркеров, отражающих особенности этой группы заболеваний [Hallek М. Chronic lymphocytic leukemia: 2020 update on diagnosis, risk stratification and treatment. Am J Hematol. 2019;94:1266-1287. https://doi.org/10.1002/ajh.25595]. В охране генетического гомеостаза организма иммунная система использует механизмы, в которых участвует многокомпонентный состав ее клеток и их продуценты. Описаны дисфункции иммунитета, генетические особенности и иммунофенотипы опухолевых В-клеток при зрелоклеточной лимфопролиферации [Д.Б. Казанский. Т-лимфоциты в развитии хронического лимфоцитарного лейкоза. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. Ж-л Клиническая онкогематология, 2012, Т. 5, №2, С 84-95], [А.И. Свирновский. Хронический лимфоцитарный лейкоз: парадигмы и парадоксы. Медицинские новости. - 2008. - №13. - С. 7-19.], [С.А. Луговская, М.Е. Почтарь. Гематологический атлас, М, 2016, 296], [Кузьмина Е.Г., Мушкарина Т.Ю., Константинова Т.В., Зацаренко С.В. и др., Субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток периферической крови при В-клеточном хроническом лимфоцитарном лейкозе/лимфоме из малых лимфоцитов. Клиническая Онкогематология, 2020 Т 13, №4 С. - 395-405], [Beekman R, Chapaprieta V, Russinol N, et al. The reference epigenome and regulatory chromatin landscape of chronic lymphocytic leukemia. Nat Med. 2018;24:868-880], [Hacken E, Burger JA. Microenvironment interactions and В cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia: implications for disease pathogenesis and treatment. In: Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research, Amsterdam: Elsevier B.V.; 2016, v. 1863.401-13]. Степень нарушения иммунокомпетентности в сочетании с присутствием в крови опухолевых клеток представляют собой комплексный образ (многомерный паттерн), отражающий динамическое взаимодействие в системе «иммунитет-опухоль». Этот многомерный образ, как правило, отражает определенные изменения состава и численности клеток периферической крови. Таким образом, разные патологии крови формируют уникальные паттерны признаков.

На современном этапе развития науки, для диагностики НХЛ необходима не только характеристика ее морфогенетических и других молекулярных признаков, но и сопоставление их размерности с качеством противоопухолевого иммунитета.

Ближайшим аналогом заявленного способа является иммунофенотипирование образцов периферической крови и костного мозга при лейкемизации заболевания и клеток, выделенных из эксцизионных биоптатов лимфоузлов и образцов тканей [Луговская С.А., Почтарь М.Е. Гематологический атлас. 4-е издание, дополненное. М.: Триада, 2016. 434 с.; Российские клинические рекомендации по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний. Под ред. И.В. Поддубной, В.Г. Савченко. М., 2018. 356 с.]. Для осуществления процедуры иммунофенотипирования клетки в составе исследуемого образца обрабатывают флуоресцентно меченными моноклональными антителами к различным поверхностным антигенам. Для анализа используются проточный цитофлуориметр. Исследование производится следующим образом. Лазерный луч направляется на кварцевую кювету, через которую поочередно поступают клетки, вызывая прямое и боковое светорассеяние лазера. На первом этапе производится оценка параметров рассеяния, которые отражают размер и гранулярность клеток в составе исследуемого образца. Данный подход позволяет выделить как минимум три типа клеток: лимфоциты (клетки мелкого размера без зернистости, моноциты (клетки с промежуточными характеристиками), и гранулоциты (клетки более крупного размера с зернистостью). Затем каждый тип клеток может быть проанализирован более детально. Так, при лимфопролиферативных заболеваниях анализируется состав т.н. лимфоцитарного гейта. При облучении клеток лазером происходит испускание монохроматического излучения определенной длины волны за счет антител, специфично связанных с антигенами на поверхности клеток и меченых различными флуорохромами. Оценивая интенсивность эмиссии, лимфоцит относят к определенному типу антигенположительных клеток (Т-, В-, NK-клетки). Сочетание различных флуорохромов и антител позволяет обнаруживать одновременно несколько антигенных детерминант на клетке интересующего типа. Основную проблему при проточной цитофлуориметрии представляет формирование панели моноклональных антител. При диагностике злокачественных лимфом и хронического лимфоцитарного лейкоза основное внимание при иммунофенотипировании уделяется учету бокового светорассеяния для выделения лимфоцитарного гейта, составу набора антител для определения основных характеристик пролиферирующих клеток и их клональности. Указанный метод является трудозатратным в связи с необходимостью забора материала лимфоузлов и костного мозга, а также в связи с необходимостью оценки большого количества различных антигенных детерминант, и, следовательно, использования панелей, включающих большое количество различных антител. Также указанный метод ограничен по точности.

Таким образом, техническим результатом заявленного изобретения является снижение трудоемкости процедуры определения НХЛ, повышение ее точности, а также повышение вероятности определения НХЛ на ранних стадиях заболевания за счет возможности организации исследования, например, в рамках периодического осмотра пациентов, входящих в группу риска развития заболевания.

Указанный технический результат достигается за счет способа определения неходжкинской лимфомы, включающий забор у пациента образца периферической крови, подсчет количества лейкоцитов и лимфоцитов в образце периферической крови, оценка доли популяции лимфоцитов HLADR+, лимфоцитов CD3+CD19+-, В-лимфоцитов CD19+CD3-, Т-хелперов CD4+CD8-, Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+CD4-, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, NK-клеток CD16+56+CD3- и оценка иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+, в образце периферической крови, и:

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет не менее 25,5% от общего количества лимфоцитов, и иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ равен не менее 2,07644, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет не менее 25,5% от общего количества лимфоцитов, и иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет менее 2,04555, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 25,5% от общего количества лимфоцитов и доля NK-клеток CD16+56+CD3- составляет не менее 3% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 22,5%, но не менее 20,5% от общего количества лимфоцитов и иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет менее 1,05357, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+составляет менее 22,5%, но не менее 20,5%, от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 1,05357 и доля В-лимфоцитов CD19+ составляет менее 6,5% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5%, но не менее 10% от общего количества лимфоцитов и доля В-лимфоцитов CD19+ менее 3,5% от общего количества, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 10% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ менее 3,5% от общего количества лимфоцитов и доля Т-хелперов CD4+ составляет менее 58% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов и доля лимфоцитов составляет менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов и доля лимфоцитов CD3+ составляет менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов и доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов и иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет менее 0,964286, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286 и абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови менее 4,05*10⁹/л, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286 и абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 9,6*10⁹/л, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286, абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 4,05*10⁹/л, но менее 9,6*10⁹/л и доля лимфоцитов составляет не менее 51,7722% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286, абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 4,05*10⁹/л, но менее 9,6*10⁹/л, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922, но менее 51,7722% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5%, но менее 79,5% от общего количества лимфоцитов и доля лимфоцитов HLADR+составляет менее 7% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286, абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 4,05*10⁹/л, но менее 9,6*10⁹/л, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 79,5% от общего количества лимфоцитов, доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составляет не менее 4,5% от общего количества лимфоцитов и доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922, но менее 27,3864% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

- в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286, абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 4,05*10⁹/л, но менее 9,6*10⁹/л, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 79,5% от общего количества лимфоцитов, доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составляет не менее 4,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 33,6158 от общего количества лейкоцитов и доля NK-клеток CD16+ составляет менее 7,5% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

Как вариант, в рамках реализации указанного способа оценка доли популяции лимфоцитов HLADR+, лимфоцитов CD3+, В-лимфоцитов CD19+, Т-хелперов CD4+, Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, NK-клеток CD16+ в образце периферической крови может проводиться методом иммунофенотипирования. При этом, как вариант, иммунофенотипирование может проводиться с использованием моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным антигенам на клетках иммунной системы методом проточной цитофлуорометрии.

Авторами изобретения разработан алгоритм и выполнена серия системных исследований по сопоставлению состояния иммунитета и признаков опухолевого роста по данным периферической крови при НХЛ. На первом этапе был проведен многомерный сравнительный анализ данных пациентов с НХЛ и практически здоровых людей. Проведено клинико-иммунологическое обследование 352 пациентов с В-клеточной НХЛ. Группу контроля составили данные 184 практически здоровых человека, преимущественно доноров крови; на момент взятия крови у которых не было отклонений в состоянии здоровья. Средний возраст пациентов с НХЛ составил 60 лет, практически здоровых людей - 58 лет. Для диагностики НХЛ использованы критерии классификации ВОЗ опухолей лимфоидной и кроветворной системы: объективный анализ ультразвукового, магнитно-резонансного обследования пациентов, иммуногистохимического исследования материала лимфатических узлов, тканей и костного мозга, иммунофенотипирование опухолевых клеток крови и костного мозга [С.А. Луговская, М.Е. Почтарь. Гематологический атлас, М, 2016, 296].

По гемограмме подсчитывали количество лейкоцитов, относительное и абсолютное число лимфоцитов. Состав ядросодержащих клеток оценивали в цельной крови после предварительного лизиса эритроцитов лизирующим раствором фирмы BD Biosciences. Далее в лимфоцитарном гейте определяли фенотипы субпопуляций иммунокомпетентных клеток и опухолевых В-лимфоцитовметодами 2-6-цветной проточной цитометрии на приборе FACSCan или FACSCanto II (BD Biosciences) по известной методике [Swerdlow S.H., Campo Е., Pileri S.A. et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood 2016;19;127(20):2375-90. DOI: 10.1182/blood-2016-01-643569].

Для многомерного анализа состояния иммунитета и признаков В-клеточной пролиферации для каждого пациента использовано по 13 показателей. Это: количество лейкоцитов, Лц абс, ×10⁹ кл/л, доля Лф, общих Т-клеток, CD3+CD16-; Т-хелперы, CD3+CD4+; Т-киллеры, CD3+CD8+; иммунорегуляторный индекс, CD4/CD8; доля NK-клеток, (CD16+CD3-); активированных Т-клеток, CD3+HLADR+; HLADR⁺лимфоцитов (включает активированные Т-клетки и В-лимфоциты в лимфоцитарном гейте). Идентификация В-лимфоцитов проведена по маркерам CD19+, CD20^1o+, CD22+, CD23+.

Визуализация многомерных данных, характеризующих состояние иммунитета и В-клеточной пролиферации, проведена, используя самоорганизующиеся карты (СОКК, Self Organizing Maps, SOM), разработанные Т. Кохоненом [Kohonen, Essentials of the self-organizing map, Neural Networks 37 (2013) 52-65]. Этим методом многомерные данные проецируются в пространство пониженной размерности и визуализируются в виде двух(трех)мерной карты. На основе карты возможно осуществление кластеризации за счет выделения в ней векторов (показателей анализируемых признаков) пациентов и здоровых людей с близкими (похожими) характеристиками. Авторами изобретения определены показатели в многомерных структурах, контрастирующие данные в исследуемых группах «НХЛ» и «Норма», которые затем использованы для разработки заявленного способа определения НХЛ.

Образ НХЛ, полученный с использованием СОКК, позволяет упростить способ определения данного заболевания. Предложенный подход менее трудозатратен для выявления НХЛ, и может быть использован для проведения скринингового определения заболевания.

Как вариант, заявленный способ может быть реализован следующим образом. У пациента проводится забор образца периферической крови. В полученном образце по гемограмме определяется доля и количество лимфоцитов. Затем на проточном цитофлуориметре (FACSCanto II (BD Biosciences), используя метод 2-4-цветной проточной цитофлуориметрии осуществляется оценка в образце доли популяции лимфоцитов HLADR+, лимфоцитов CD3+, В-лимфоцитов CD19+CD3-, Т-хелперов CD4+CD8-, Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+CD4-, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, NK-клеток CD16+56+CD3-, а также иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+. На следующем этапе осуществляется интерпретация полученных данных. В каждом из указанных ниже случаев:

1. Если доля лимфоцитов HLADR+составляет не менее 25,5% от общего количества лимфоцитов, и иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ равен не менее 2,07644, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ).

2. Если доля лимфоцитов HLADR+ составляет не менее 25,5% от общего количества лимфоцитов, и иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет менее 2,04555, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

3. Если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 25,5% от общего количества лимфоцитов и доля NK-клеток CD16+ составляет не менее 3% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

4. Если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 22,5%, но не менее 20,5% от общего количества лимфоцитов и иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет менее 1,05357, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

5. Если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 22,5%, но не менее 20,5%, от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 1,05357 и доля В-лимфоцитов CD19+ составляет менее 6,5% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ).

6. Еесли доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5%, но не менее 10% от общего количества лимфоцитов и доля В-лимфоцитов CD19+ менее 3,5% от общего количества, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

7. Если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 10% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ менее 3,5% от общего количества лимфоцитов и доля Т-хелперов CD4+ составляет менее 58% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ).

8. Если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов и доля лимфоцитов составляет менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

9. Если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов и доля лимфоцитов CD3+составляет менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ).

10. Если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов и доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ).

11. Если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов и иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет менее 0,964286, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ).

12. Если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286 и абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови менее 4,05*10⁹/л, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ).

13. Если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286 и абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 9,6*10⁹/л, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ).

14. Если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286, абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 4,05*10⁹/л, но менее 9,6*10⁹/л и доля лимфоцитов составляет не менее 51,7722% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ).

15. Если доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286, абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 4,05*10⁹/л, но менее 9,6*10⁹/л, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922, но менее 51,7722% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5%, но менее 79,5% от общего количества лимфоцитов и доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 7% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ).

16. Если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286, абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 4,05*10⁹/л, но менее 9,6*10⁹/л, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 79,5% от общего количества лимфоцитов, доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составляет не менее 4,5% от общего количества лимфоцитов и доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922, но менее 27,3864% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ). 17. Если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286, абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 4,05*10⁹/л, но менее 9,6*10⁹/л, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 79,5% от общего количества лимфоцитов, доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составляет не менее 4,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 33,6158 от общего количества лейкоцитов и доля NK-клеток CD16+ составляет менее 7,5% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ).

На фиг. 1 представлена схема реализации указанного способа.

На фиг. 2 представлена ROC-кривая, характеризующая точность (качество) предложенного способа.

Полученное значение AUC (площади, ограниченной ROC-кривой и осью абсцисс) свидетельствует о высокой точности заявленного способа. Чем значение AUC ближе к 1, тем выше качество предложенной модели.

Заявленное изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Реализация заявленного способа.

У пациента Р. проводился забор образца периферической крови. В полученном образце по гемограмме определялась доля и количество лимфоцитов. Затем на проточном цитофлуориметре (FACSCanto II (BD Biosciences), используя метод 2-4-цветной проточной цитофлуориметрии осуществлялась оценка доли популяции лимфоцитов HLADR+, лимфоцитов CD3+, В-лимфоцитов CD19+, Т-хелперов CD4+, Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, NK-клеток CD16+, а также оценка иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+.

Доля лимфоцитов HLADR+составила менее 19,6% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ составила 3,7% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составила не менее 20,5438% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет менее 59,0% от общего количества лимфоцитов. У пациента определена неходжкинская В-клеточная лимфома (НХЛ).

Пример 2. Реализация заявленного способа.

У пациента Р. проводился забор образца периферической крови. В полученном образце по гемограмме определялась доля и количество лимфоцитов. Затем на проточном цитофлуориметре (FACSCanto II (BD Biosciences), используя метод 2-4-цветной проточной цитофлуориметрии осуществлялась оценка доли популяции лимфоцитов HLADR+, лимфоцитов CD3+, В-лимфоцитов CD19+, Т-хелперов CD4+, Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, NK-клеток CD16+, а также оценка иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+.

Доля лимфоцитов HLADR+ составила 18,2% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ составила 4,1% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составила 21,3455% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составила 61,3% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составила 15,1% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составил 1,0034 и абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови составило 4,01*10⁹/л. У пациента определена неходжкинская В-клеточная лимфома (НХЛ).

Пример 3. Реализация заявленного способа.

У пациента Р. проводился забор образца периферической крови. В полученном образце по гемограмме определялась доля и количество лимфоцитов. Затем на проточном цитофлуориметре (FACSCanto II (BD Biosciences), используя метод 2-4-цветной проточной цитофлуориметрии осуществлялась оценка доли популяции лимфоцитов HLADR+, лимфоцитов CD3+, В-лимфоцитов CD19+, Т-хелперов CD4+, Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, NK-клеток CD16+, а также оценка иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+.

Доля лимфоцитов HLADR+ составила 19,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+составила не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составила не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составил не менее 0,964286, абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови составило не менее 4,05*10⁹/л, но менее 9,6*10⁹/л, доля лимфоцитов CD3+ составила не менее 79,5% от общего количества лимфоцитов, доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составила не менее 4,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составила не менее 33,6158 от общего количества лейкоцитов, доля NK-клеток CD16+ составила менее 7,5% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

Пример 4. Сравнительная оценка точности заявленного способа. В рамках оценки точности анализа в определении ХЛЛ с использованием заявленного способа было проведено рандомизированное сравнительное исследование 10 пациентов с диагнозом ХЛЛ, а также 10 практически здоровых пациентов (контроль) заявленным способом, а также контрольным способом, включающим определение иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови (в соответствии с ближайшим аналогом заявленного изобретения). Для подтверждения диагноза (эталонный способ определения ХЛЛ) выполнено ультразвуковое, магнитно-резонансное исследование, иммуногистохимическое исследование материала лимфатических узлов и иммунофенотипирование образцов периферической крови и костного мозга [Луговская С.А., Почтарь М.Е. Гематологический атлас. 4-е издание, дополненное. М.: Триада, 2016. 434 с.], [Российские клинические рекомендации по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний. Под ред. И.В. Поддубной, В.Г. Савченко. М., 2018. 356 с.].

Результаты исследования приведены в таблице 1.

По результатам сравнительной оценки точности анализа с использованием заявленного способа было установлено, что данный способ позволяет производить определение НХЛ с более высокой точностью, чем контрольный способ. При этом использование заявленного способа позволяет снизить трудоемкость процедуры определения НХЛ при сохранении ее точности.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, медицины, онкологии, гематологии, иммунологии. Способ определения неходжкинской лимфомы, включающий забор у пациента образца периферической крови, подсчет количества лейкоцитов и доли лимфоцитов в образце периферической крови, оценку доли популяции лимфоцитов HLADR+, лимфоцитов CD3+, В-лимфоцитов CD19+, Т-хелперов CD4+, Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, NK-клеток CD16+ и оценку иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+ в образце периферической крови. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Способ определения неходжкинской лимфомы, включающий забор у пациента образца периферической крови, подсчет количества лейкоцитов и доли лимфоцитов в образце периферической крови, оценку доли популяции лимфоцитов HLADR+, лимфоцитов CD3+, В-лимфоцитов CD19+, Т-хелперов CD4+, Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, NK-клеток CD16+ и оценку иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+ в образце периферической крови,

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет не менее 25,5% от общего количества лимфоцитов и иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ равен не менее 2,07644, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет не менее 25,5% от общего количества лимфоцитов и иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет менее 2,04555, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 25,5% от общего количества лимфоцитов и доля NK-клеток CD16+ составляет не менее 3% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 22,5%, но не менее 20,5% от общего количества лимфоцитов и иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет менее 1,05357, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 22,5%, но не менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 1,05357 и доля В-лимфоцитов CD19+ составляет менее 6,5% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5%, но не менее 10% от общего количества лимфоцитов и доля В-лимфоцитов CD19+ менее 3,5% от общего количества, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 10% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ менее 3,5% от общего количества лимфоцитов и доля Т-хелперов CD4+ составляет менее 58% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов и доля лимфоцитов составляет менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов и доля лимфоцитов CD3+ составляет менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов и доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов и иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет менее 0,964286, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286 и абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови менее 4,05*10⁹/л, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286 и абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 9,6*10⁹/л, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286, абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 4,05*10⁹/л, но менее 9,6*10⁹/л и доля лимфоцитов составляет не менее 51,7722% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286, абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 4,05*10⁹/л, но менее 9,6*10⁹/л, доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922, но менее 51,7722% от общего количества лейкоцитов, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 59,5%, но менее 79,5% от общего количества лимфоцитов и доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 7% от общего количества лимфоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286, абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 4,05*10⁹/л, но менее 9,6*10⁹/л, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 79,5% от общего количества лимфоцитов, доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составляет не менее 4,5% от общего количества лимфоцитов и доля лимфоцитов составляет не менее 19,3922, но менее 27,3864% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ),

при этом в случае, если доля лимфоцитов HLADR+ составляет менее 20,5% от общего количества лимфоцитов, доля В-лимфоцитов CD19+ не менее 3,5% от общего количества лимфоцитов, доля Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+ составляет не менее 14,5% от общего количества лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ составляет не менее 0,964286, абсолютное количество лейкоцитов в образце периферической крови не менее 4,05*10⁹/л, но менее 9,6*10⁹/л, доля лимфоцитов CD3+ составляет не менее 79,5% от общего количества лимфоцитов, доля активированных Т-клеток CD3+HLADR+ составляет не менее 4,5% от общего количества лимфоцитов, доля лимфоцитов составляет не менее 33,6158 от общего количества лейкоцитов и доля NK-клеток CD16+ составляет менее 7,5% от общего количества лейкоцитов, определяют неходжкинскую лимфому (НХЛ).

2. Способ по п. 1, где оценка доли популяции лимфоцитов HLADR+, лимфоцитов CD3+, В-лимфоцитов CD19+, Т-хелперов CD4+, Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+, активированных Т-клеток CD3+HLADR+, NK-клеток CD16+ в образце периферической крови проводится методом иммунофенотипирования.

3. Способ по п. 2, где иммунофенотипирование проводится с использованием моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным антигенам на клетках иммунной системы методом проточной цитофлуорометрии.