Область техники
Настоящее изобретение относится к области фармацевтических составов и, в частности, относится к композиции, содержащей наночастицы доцетаксела-альбумина.
Уровень техники
Доцетаксел получают путем полусинтеза нецитотоксичного предшественника (10-деацетилбаккатина III), экстрагированного из хвои Taxus chinensis, и он является аналогом паклитаксела. Он действует на клеточные микротрубочки, способствуя полимеризации тубулина, одновременно ингибируя деполимеризацию микротрубочек, задерживая клетки в фазе G2/M и ингибируя митоз, тем самым убивая опухолевые клетки. Доцетаксел обладает более сильной противоопухолевой активностью по сравнению с паклитакселом. Доцетаксел имеет относительно низкую растворимость в воде, и представленный в настоящее время коммерчески доступный состав представляет собой его обычную форму для инъекций, которая была впервые разработана компанией Sanofl под торговым наименованием TAXOTERE®. Доцетаксел обычно вводят путем внутривенной инфузии в течение 1 часа в дозе 75 мг/м2 каждые 3 недели. Тем не менее, инъекция доцетаксела, представленного в виде TAXOTERE®, характеризуется следующими недостатками из-за применения этанола и Твин-80:
(1) Может возникать тяжелая реакция гиперчувствительности; таким образом, требуется премедикация дексаметазоном, что приводит к плохой комплаентности пациентов. Твин-80 может вызывать тяжелые реакции гиперчувствительности и задержку жидкости, поэтому необходимо заранее вводить противоаллергическое лекарственное средство. Например, 16 мг дексаметазона вводят ежедневно в течение по меньшей мере 3 дней за один день до капельной инфузии для предотвращения аллергической реакции и задержки жидкости. Даже в случаях введения дексаметазона заранее все равно сообщается о тяжелых аллергических реакциях. В спецификации прямо упоминается, что "выраженную задержку жидкости наблюдали у 6,5% (6/92) пациентов, получавших 3-дневное профилактическое лечение дексаметазоном".
(2) Этанол может влиять на центральную нервную систему, и для облегчения симптомов интоксикации необходимо замедление скорости инфузии. В 2014 году FDA опубликовало "Сведения о лекарственной безопасности при внутривенной химиотерапии этанолом, содержащим доцетаксел, и риске интоксикации", предположив, что этанол в инъекциях доцетаксела может влиять на центральную нервную систему, и замедление скорости инфузии может облегчать симптомы интоксикации этанолом, и призвало к разработке составов доцетаксела, не содержащих этанола.
(3) Твин-80 вызывает аллергическую реакцию, и его можно применять только в низкой концентрации. Комплаентность пациентов является неудовлетворительной. Твин-80 может вызывать аллергическую реакцию, а при слишком высокой концентрации может вызывать гемолитическую реакцию, поэтому Твин-80 можно разводить до относительно низкой концентрации для введения, при этом время инфузии увеличивается, а комплаентность пациентов ухудшается.
(4) Продукт имеет низкие совместимость и стабильность, и для него требуется устройство для инфузии без ПВХ-материала, что является неудобным для клинического применения. В спецификации указано, что "доцетаксел для предварительной инъекции (10 мг/мл) следует использовать сразу после приготовления. Тем не менее, его физико-химические свойства свидетельствуют, что предварительная инъекция может являться стабильной в течение 8 ч независимо от того, хранят ли ее при 2-8°С или при комнатной температуре. Инъекцию (не более 0,74 мг/мл) следует использовать в течение 4 ч при комнатной температуре и вводить внутривенно капельно в течение 1 ч", что является неудобным для клинического применения; в спецификации прямо указано, что применение устройств для инфузии из ПВХ не рекомендуется, и контакт с устройствами для инфузии из ПВХ может приводить к выщелачиванию бис-(2-этилгексил)фталата из устройств для инфузии из ПВХ, что представляет потенциальную угрозу безопасности.
Во избежание многих недостатков обычных составов в документе "Development of docetaxel-loaded intravenous formulation, Nanoxel-PM™ using polymer-based delivery system" (Sa-Won Lee, Min-Hyuk Yun, Seung Wei Jeong, Journal of Controlled Release, 155 (2011) 262-271) был описан Nanoxel-PM™ (продающийся в Корее под торговым наименованием Nanoxel® M), разработанный компанией Samyang в Корее. В указанном продукте применяют полимер полиэтиленгликоль-поли(0,Ь-лактид) (mPEG-PDLLA) в качестве носителя для получения мицелл доцетаксела со средним размером частиц 10-50 нм и равномерным распределением частиц по размерам. Режим клинического применения препарата описан на официальном сайте. Для минимизации аллергической реакции требуется предварительное лечение, например, вводят 16 мг дексаметазона перорально ежедневно в течение 3 последовательных дней за один день до введения (https://www.samyangbiopharm.com/eng/ProductIntroduce/injection03). Хотя указанный продукт не содержит этанола и Твин-80, клиническая премедикация все равно требуется. Человеческий сывороточный альбумин (сокращенно ЧСА) представляет собой белок плазмы человека, состоит из 585 аминокислот и имеет молекулярную массу 66 кДа. Концентрация человеческого сывороточного альбумина в плазме составляет 42 г/л, и он составляет примерно 60% от общего количества белков плазмы. В жидкостях организма человеческий сывороточный альбумин может транспортировать жирные кислоты, желчные пигменты, аминокислоты, стероидные гормоны, ионы металлов и многие терапевтические молекулы и т.д. При этом человеческий сывороточный альбумин может поддерживать нормальное осмотическое давление и физиологическое значение рН в крови.
Белки представляют собой макромолекулы, состоящие из различных аминокислот, в которых аминокислоты упорядоченно связаны пептидными связями и дисульфидной связью, что называют первичной структурой; водородные связи могут образовываться между аминогруппами и ацильными группами внутри или между полипептидных цепей, так что основная полипептидная цепь приобретает определенную регулярную конформацию, включая α-спираль, р-лист, β-поворот, Ω-петлю и т.п., которые называются вторичными структурами белков; пептидная цепь дополнительно скручивается и складывается на основе вторичных структур с образованием полной пространственной конформации, которая называется третичной структурой; пространственная структура, образованная агрегацией множества пептидных цепей посредством нековалентных связей, называется четвертичной структурой, в которой одна пептидная цепь называется субъединицей.
Денатурация белка представляет собой результат изменений естественной структуры и свойств в результате физических или химических нарушений. Обычно полагают, что в результате денатурации изменяются или разрушаются вторичная и третичная структуры белка. Способы денатурации белков в основном делятся на химические способы и физические способы, при этом химические способы включают добавление сильных кислот, сильных оснований, солей тяжелых металлов, мочевины, ацетона и т.д.; физические способы включают нагревание, ультрафиолетовое и рентгеновское облучение, ультразвук, энергичное встряхивание или перемешивание и т.д. Майкл Докал (Michael Dockal), Дэниел К. Картер (Daniel С. Carter) и Флориан Рюкер (Florian Rüker) сообщали в статье "Conformational Transitions of the Three Recombinant Domains of Human Serum Albumin Depending on pH" (J Biol Chem, 2000, 275(5): 3042-3050), что человеческий сывороточный альбумин может подвергаться конформационным переходам при различных рН (таких как переходы N-F и F-E в кислых условиях и переход N-B в щелочных условиях), что приводит к денатурации белка. В настоящем описании альбумин, денатурированный путем добавления кислот, определяют как "кислотно-денатурированный альбумин", и рН раствора альбумина составляет менее 5,5. Процесс производства человеческого сывороточного альбумина, как импортного, так и отечественного, по существу одинаков. Человеческий сывороточный альбумин получают путем очистки плазмы здорового человека при помощи способа низкотемпературного разделения белков этанолом и нагревания при 60°С в течение 10 ч для инактивации вирусов. К коммерчески доступному альбумину в качестве термозащитного агента обычно добавляют каприлат натрия, например, к 1 г альбумина добавляют 0,16 ммоль каприлата натрия.
Поскольку человеческий сывороточный альбумин является эндогенным веществом в организме человека и обладает хорошей биосовместимостью, его можно применять в качестве естественного носителя гидрофобных лекарственных средств, и он может повышать растворимость не растворимых в воде лекарственных средств. Паклитаксел для инъекций (связанный с альбумином, торговое наименование: Abraxane®), разработанный компанией Abraxis Bioscience в США при помощи способа эмульгирования с применением человеческого сывороточного альбумина в качестве вспомогательного материала, был одобрен FDA в 2005 году для лечения рака молочной железы после неудачи комбинированной химиотерапии для метастатического заболевания или рецидива в течение 6 месяцев с момента адъювантной химиотерапии и впоследствии был одобрен для лечения немелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы и рака желудка (Япония).
По сравнению с инъекцией паклитаксела (Taxol®) в состав препарата Abraxane® не входит полиоксиэтиленовое касторовое масло, которое может вызывать тяжелые реакции гиперчувствительности, поэтому не требуется премедикация противоаллергическими лекарственными средствами. Более того, Abraxane® можно быстро вводить в высоких концентрациях, сокращая время инфузии до 30 мин и значительно улучшая комплаентность пациентов; при этом за счет повышения безопасности дозировку паклитаксела можно увеличивать со 175 мг/м2 до 260-300 мг/м2; полиоксиэтиленовое касторовое масло в Taxol® может ингибировать связывание паклитаксела с альбумином, а состав без полиоксиэтиленового касторового масла может в полной мере использовать преимущества уникального пути альбумина «gр60-кавеолин-8РАРХ» для увеличения доставки лекарственных средств к опухолям, тем самым повышая эффективность. В настоящее время исследователи в разных странах пытаются разработать наночастицы на основе человеческого сывороточного альбумина, являющиеся носителями для других лекарственных средств, например, доцетаксела.
В патенте № US2005/0004002A1, опубликованном Нилом П. Десаи (Neil P. Desai) et al, описаны наночастицы доцетаксела-альбумина, полученные при помощи способа эмульгирования, состав которых содержит только доцетаксел и человеческий сывороточный альбумин, при этом размер частиц составляет 50-220 нм и по существу одинаков до и после лиофилизации. Тем не менее, суспензии до и после лиофилизации являются стабильными лишь в течение короткого времени и не могут соответствовать клиническим требованиям.
Добавление в состав соевого масла, фосфолипида, холестерина, бензойной кислоты и т.п. в качестве стабилизаторов для улучшения стабильности суспензии впервые было опробовано в документе № CN 103054798 А, но все указанные попытки являлись неудачными. После долгих испытаний наконец было подтверждено, что стабильность суспензии можно значительно улучшать путем добавления цитрата натрия или композиции цитрата натрия и хлорида натрия. Тем не менее, большое количество солей приводит к высокому осмотическому давлению и сильному раздражению, вызываемому восстановленной суспензией, что приводит к выраженной боли при инъекции и даже к осмотическому повреждению клеток тканей местно после инъекции, что является неудобным для клинического применения.
В изобретении также указывается, что суспензии наночастиц, получаемые из безводного доцетаксела, являются более стабильными по сравнению с суспензиями, получаемыми из доцетаксела со связанной водой (такого как тригидрат доцетаксела или полугидрат доцетаксела). В примере 28 описано, что при отсутствии стабилизаторов, когда активным ингредиентом являлся безводный доцетаксел (т.е. доцетаксел), суспензии наночастиц осаждались в первый день хранения при 4°С, а осаждение полугидрата и тригидрата происходило в более короткое время; в присутствии стабилизаторов, когда активным ингредиентом являлся безводный доцетаксел (т.е. доцетаксел), суспензии наночастиц не осаждались при 4°С в течение времени вплоть до 2 дней, а осаждение полугидрата и тригидрата происходило в более короткое время. Таким образом, патент ограничивает получение наночастиц альбумина безводным доцетакселом, что значительно ограничивает диапазон выбора исходной формы доцетаксела.
В патенте также исследовали рН составов, и было обнаружено, что «увеличение рН выше 6 повысило физическую стабильность, измеренную с точки зрения размера наночастиц и осаждения состава, и при этом повысило степень разложения доцетаксела до 7-эпидоцетаксела при комнатной температуре. Приемлемый диапазон рН для физической стабильности и химической стабильности составлял от 6 до 8,5, благоприятный диапазон рН составлял 6,5-8, а оптимальный диапазон рН составлял 7,25-7,75». Хотя в документе № CN 103054798 A полагают, что добавление цитрата натрия или комбинации цитрата натрия и хлорида натрия полезно для физической стабильности составов наночастиц доцетаксела-альбумина, в патенте Китая № CN106137969A указано, что добавление винной кислоты, лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты и других органических кислот с рКа 2,5-4,5 и т.п. к композициям доцетаксела и альбумина не способно эффективно ингибировать повышение содержания 7-эпидоцетаксела, и даже происходит увеличение содержания 7-эпидоцетаксела, что приводит к неудовлетворительной химической стабильности композиций и влияет на безопасность составов. Тем не менее, избирательное добавление таких веществ, как аминокислоты, позволяет композициям доцетаксела и альбумина оставаться стабильными в течение длительного времени, значительно ингибируя образование 7-эпидоцетаксела. В частности, когда аминокислота представляет собой аргинин, содержание 7-эпидоцетаксела через 30 месяцев составляет всего 0,72%. Восстановленная суспензия приготовленного продукта может оставаться стабильной более 8 ч при комнатной температуре. В патенте определено, что в фармацевтических композициях наночастиц доцетаксела-альбумина аминокислота и доцетаксел находятся в массовом отношении не менее 0,5, предпочтительно не менее 1. В документе № WO2018/059304A1 также описан способ улучшения качества фармацевтической композиции альбумина, в котором фармацевтическая композиция содержит альбумин и по меньшей мере одну аминокислоту с относительной молекулярной массой 145-175 или ее соль. Аминокислота может представлять собой одну из аргинина, гистидина и лизина или их комбинацию, предпочтительно аргинин и/или гистидин и более предпочтительно аргинин. Аминокислота или ее соль и альбумин находятся в массовом отношении 0,1:1-10:1. Аминокислота или ее соль ингибируют образование или увеличение содержания димера альбумина при получении, хранении и применении фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция альбумина может эффективно снижать нежелательные реакции в организме человека, вызываемые агрегатами и димерами альбумина при клиническом применении, такие как сыпь, крапивница, аллергические реакции и возможные иммунные реакции, а также обеспечивать безопасность клинического лекарственного средства.
Таким образом, улучшение качества продукта доцетаксела-альбумина требует учета как физической стабильности (стабильность суспензии), так и химической стабильности (разложение доцетаксела и увеличение содержания агрегатов альбумина). В композициях доцетаксела-альбумина, описанных в предшествующем уровне техники, одно из улучшений заключается в том, что добавляют большое количество хелатирующего агента в качестве стабилизатора для улучшения физической стабильности продукта, но влияние
на химическую стабильность продукта не исследуется; кроме того, большое количество хелатирующего агента повышает стабильность и одновременно образует гипертонический раствор, что является неудобным для клинического применения. Другое улучшение заключается в том, что в продукт необходимо добавлять большое количество аминокислот для ингибирования разложения доцетаксела и увеличение содержания агрегатов альбумина, но влияние на физическую стабильность глубоко не исследовано, и упоминается только, что восстановленная суспензия может оставаться стабильной более 8 ч при комнатной температуре.
Таким образом, в данной области техники крайне важно найти способ, который может одновременно обеспечивать физическую стабильность и химическую стабильность композиции доцетаксела-альбумина.
Раскрытие сущности изобретения
В настоящем изобретении предложена композиция, содержащая наночастицы доцетаксела-альбумина, которая содержит доцетаксел и кислотно-денатурированный альбумин. Альтернативно, в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая наночастицы доцетаксела-альбумина, которая получена из доцетаксела и кислотно-денатурированного альбумина.
Альтернативно, в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая наночастицы доцетаксела-альбумина, которая получена из доцетаксела и кислотно-денатурированного альбумина, и которая необязательно содержит агент, регулирующий тоничность, или регулятор рН,
где доцетаксел предпочтительно представляет собой безводный доцетаксел, полугидрат доцетаксела или тригидрат доцетаксела.
Кислотно-денатурированный альбумин получают путем добавления кислоты к человеческому сывороточному альбумину для доведения рН до подходящего значения и последующей денатурации, и предпочтительно:
(1) кислота выбрана из кислой аминокислоты или кислого полипептида, органической кислоты и неорганической кислоты. Кислая аминокислота или кислый полипептид включает, но не ограничивается ими, гидрохлорид цистеина, глутатион и т.д.; органическая кислота включает, но не ограничивается ими, лимонную кислоту, винную кислоту и т.д.; неорганическая кислота включает, но не ограничивается ими, хлористоводородную кислоту, серную кислоту и т.д. Кислота предпочтительно представляет собой гидрохлорид цистеина, глутатион или хлористоводородную кислоту и более предпочтительно гидрохлорид цистеина; и/или
(2) подходящее значение рН предпочтительно равняется 3,5-5,5, предпочтительно 3,5-5,0, более предпочтительно 3,8-4,7 и более предпочтительно 4,0-4,5; и/или
(3) доцетаксел (в расчете на безводный доцетаксел) и человеческий сывороточный альбумин находятся в массовом отношении 1:(2,0-10,0), предпочтительно 1:(3,0-7,0) и более предпочтительно 1:(4,0-6,0); и/или
(4) содержание каприлата натрия в человеческом сывороточном альбумине составляет не более 0,08 ммоль/г белка, предпочтительно 0,03-0,08 ммоль/г белка, более предпочтительно 0,04-0,08 ммоль/г белка и еще более предпочтительно 0,04-0,07 ммоль/г белка.
В некоторых вариантах реализации наночастицы доцетаксела-альбумина имеют размер примерно 60-200 нм, предпочтительно 90-150 нм и более предпочтительно 90-135 нм. Композиция, содержащая наночастицы доцетаксела-альбумина, описанные в настоящем документе, необязательно содержит агент, регулирующий тоничность, для регулирования осмотического давления в подходящем диапазоне. Тип агента, регулирующего тоничность, конкретно не ограничен, например, он может быть выбран из хлорида натрия, глюкозы, фосфата и цитрата и т.д., предпочтительно хлорида натрия. Тип и количество агента, регулирующего тоничность, могут быть определены специалистами в данной области техники в соответствии с типом и количеством разбавителя или среды для восстановления, применяемых в клинических условиях. В некоторых вариантах реализации агент, регулирующий тоничность, представляет собой хлорид натрия, и хлорид натрия и доцетаксел находятся в массовом отношении (0,75-9): 1, предпочтительно (1-7): 1, более предпочтительно (1,5-4,5): 1 и наиболее предпочтительно 2,25:1.
Необязательно композиция, описанная в настоящем документе, содержит регулятор рН для регулирования значения рН в подходящем диапазоне, так что суспензия, из которой готовят композицию, описанную в настоящем документе, и/или восстановленная суспензия композиции согласно настоящему изобретению является стабильной при 25°С в течение по меньшей мере 24 ч, предпочтительно по меньшей мере 30 ч и/или стабильной при 2-8°С в течение по меньшей мере 7 дней, предпочтительно по меньшей мере 10 дней. Термин "стабильный", применяемый в настоящем документе, обозначает отсутствие осаждения наночастиц или мутности суспензий. Тип регулятора рН конкретно не ограничен. Предпочтительно диапазон значений рН составляет 3,4-5,8, предпочтительно 3,6-5,6 или 3,8-5,0 и более предпочтительно 3,9-4,8.
В некоторых вариантах реализации композиция, описанная в настоящем документе, представляет собой суспензию, при этом суспензия имеет значение рН 3,4-5,8, предпочтительно 3,6-5,6 или 3,8-5,0 и более предпочтительно 3,9-4,8. Наночастицы доцетаксела-альбумина в суспензии имеют размер примерно 60-200 нм, предпочтительно 90-150 нм и более предпочтительно 90-135 нм. Суспензия содержит 0-1,8% (масс/об.), предпочтительно 0,45%-1,8% (масс/об.) и более предпочтительно 0,9%-1,8% (масс/об.) хлорида натрия. В некоторых вариантах реализации суспензия содержит 2-10 мг/мл, предпочтительно 2-8 мг/мл доцетаксела. Суспензия является стабильной при 25°С в течение по меньшей мере 24 ч, предпочтительно по меньшей мере 30 ч и стабильной при 2-8°С в течение по меньшей мере 7 дней, предпочтительно по меньшей мере 10 дней. В других вариантах реализации композиция, описанная в настоящем документе, представляет собой лиофилизированный порошок. Наночастицы доцетаксела-альбумина имеют размер примерно 60-200 нм, предпочтительно 90-150 нм и более предпочтительно 90-135 нм. В некоторых вариантах реализации лиофилизированный порошок содержит хлорид натрия, и хлорид натрия и доцетаксел находятся в массовом отношении (0,75-9): 1, предпочтительно (1-7): 1, более предпочтительно (1,5-4,5): 1 и наиболее предпочтительно 2,25:1.
Лиофилизированный порошок получают путем лиофилизации суспензии, содержащей наночастицы доцетаксела-альбумина, при этом суспензия имеет значение рН 3,4-5,8, предпочтительно 3,6-5,6 или 3,8-5,0 и более предпочтительно 3,9-4,8. Наночастицы доцетаксела-альбумина в суспензии имеют размер примерно 60-200 нм, предпочтительно 90-150 нм и более предпочтительно 90-135 нм. Суспензия содержит 0-1,8% (масс/об.), предпочтительно 0,45%-1,8% (масс/об.) и более предпочтительно 0,9%-1,8% (масс/об.) хлорида натрия. Суспензия является стабильной при 25°С в течение по меньшей мере 24 ч, предпочтительно по меньшей мере 30 ч и стабильной при 2-8°С в течение по меньшей мере
7 дней, предпочтительно по меньшей мере 10 дней.
Лиофилизированный порошок восстанавливают до суспензии при помощи среды для восстановления. Среду для восстановления выбирают из воды для инъекций, раствора хлорида натрия и раствора глюкозы, предпочтительно воды для инъекций. Восстановленная суспензия имеет значение рН 3,4-5,8, предпочтительно 3,6-5,6 или 3,8-5,0 и более предпочтительно 3,9-4,8. Наночастицы доцетаксела-альбумина в восстановленной суспензии имеют размер примерно 60-200 нм, предпочтительно 90-150 нм и более предпочтительно 90-135 нм. Восстановленная суспензия содержит 0-1,8% (масс/об.), предпочтительно 0,45%-1,8% (масс/об.) и более предпочтительно 0,9%-1,8% (масс/об.) хлорида натрия. Восстановленная изоосмотическая суспензия является стабильной при 25°С в течение по меньшей мере 24 ч, предпочтительно по меньшей мере 30 ч и стабильной при 2-8°С в течение по меньшей мере 7 дней, предпочтительно по меньшей мере 10 дней.
В некоторых вариантах реализации композиция, содержащая наночастицы доцетаксела-альбумина, описанные в настоящем документе, является стабильной при 25°С в течение по меньшей мере 36 месяцев после лиофилизации. Термин "стабильный", применяемый в настоящем документе, включает, но не ограничивается ими, отсутствие значительного разрушения доцетаксела, отсутствие значительной агрегации белковых наночастиц, отсутствие значительного увеличения размера частиц и отсутствие значительных изменений содержания доцетаксела, влажности, кислотности, осмотического давления или молярной концентрации и т.д. Термин "стабильный", описанный в настоящем документе, может представлять собой одну или более из перечисленных выше ситуаций. В некоторых вариантах реализации термин "стабильный" обозначает отсутствие значительных изменений содержания агрегатов 7-эпидоцетаксела и/или альбумина.
В другом аспекте в настоящем изобретении дополнительно предложено лекарственное средство, полученное из композиции, содержащей наночастицы доцетаксела-альбумина, описанные выше. Лекарственное средство находится в клинически приемлемой лекарственной форме, предпочтительно в форме для инъекций и более предпочтительно в форме жидкости для инъекций или в форме лиофилизированного порошка для инъекций. Когда форма для инъекций представляет собой жидкость для инъекций, жидкость для инъекций имеет значение рН 3,4-5,8, предпочтительно 3,6-5,6 или 3,8-5,0 и более предпочтительно 3,9-4,8. Наночастицы доцетаксела-альбумина в жидкости для инъекций имеют размер примерно 60-200 нм, предпочтительно 90-150 нм и более предпочтительно 90-135 нм; жидкая форма для инъекций содержит 0-1,8% (масс/об.), предпочтительно 0,45%-1,8% (масс, /об.), более предпочтительно 0,9%-1,8% (масс./об.) и более предпочтительно 0,9% (масс/об.) хлорида натрия. В некоторых вариантах реализации жидкость для инъекций содержит 2-10 мг/мл, предпочтительно 2-8 мг/мл доцетаксела. Жидкость для инъекций является стабильной при 25°С в течение по меньшей мере 24 ч, предпочтительно по меньшей мере 30 ч и стабильной при 2-8°С в течение по меньшей мере 7 дней, предпочтительно по меньшей мере 10 дней. Термин "стабильный", применяемый в настоящем документе, обозначает отсутствие осаждения наночастиц или мутности жидкости для инъекций.
Когда форма для инъекций представляет собой лиофилизированный порошок для инъекций, лиофилизированный порошок для инъекций содержит хлорид натрия, и хлорид натрия и доцетаксел находятся в массовом отношении (0,75-9): 1, предпочтительно (1-7): 1, более предпочтительно (1,5-4,5): 1 и наиболее предпочтительно 2,25:1. Наночастицы доцетаксела-альбумина имеют размер примерно 60-200 нм, предпочтительно 90-150 нм и более предпочтительно 90-135 нм. Перед лиофилизацией суспензия для приготовления лиофилизированного порошка для инъекций имеет рН 3,4-5,8, предпочтительно 3,6-5,6 или 3,8-5,0 и более предпочтительно 3,9-4,8. Суспензия является стабильной при 25°С в течение по меньшей мере 24 ч и стабильной при 2-8°С в течение по меньшей мере 10 дней. Лиофилизированный порошок для инъекций восстанавливают до суспензии при помощи среды для восстановления. Среду для восстановления выбирают из воды для инъекций, раствора хлорида натрия и раствора глюкозы, предпочтительно воды для инъекций. Полученная восстановленная суспензия имеет рН 3,4-5,8, предпочтительно 3,6-5,6 или 3,8-5,0 и более предпочтительно 3,9-4,8. Наночастицы доцетаксела-альбумина в восстановленной суспензии имеют размер примерно 60-200 нм, предпочтительно 90-150 нм и более предпочтительно 90-135 нм. Восстановленная суспензия содержит 0-1,8% (масс./об.), предпочтительно 0,45%-1,8% (масс/об.), более предпочтительно 0,9%-1,8% (масс./об.) и более предпочтительно 0,9% хлорида натрия. В некоторых вариантах реализации восстановленная суспензия содержит 2-10 мг/мл, предпочтительно 2-8 мг/мл доцетаксела. Восстановленная суспензия является стабильной при 25°С в течение по меньшей мере 24 ч, предпочтительно по меньшей мере 30 ч и стабильной при 2-8°С в течение по меньшей мере 7 дней, предпочтительно по меньшей мере 10 дней.
Также в настоящем изобретении предложен способ получения композиции, который включает следующие стадии:
(1) растворение доцетаксела в органическом растворителе с получением раствора органической фазы;
(2) обеспечение раствора человеческого сывороточного альбумина и добавление кислоты для регулирования значения рН с получением раствора водной фазы кислотно-денатурированного альбумина; обеспечение еще одного солевого раствора;
(3) смешивание раствора органической фазы, раствора водной фазы и солевого раствора для загрузки лекарственного средства с получением раствора, загруженного лекарственным средством; и
(4) проведение диализа с получением диализированной суспензии;
при этом стадия (2) необязательно включает стадию разбавления раствора человеческого сывороточного альбумина водой для инъекций с получением разбавленного раствора альбумина перед добавлением кислоты для регулирования значения рН. При этом стадия (2) необязательно включает стадию инкубирования после добавления кислоты для регулирования значения рН.
При этом стадия (3) необязательно включает стадию охлаждения после смешивания для загрузки лекарственного средства.
При этом стадия (4) необязательно включает концентрирование раствора, загруженного лекарственным средством, полученного на стадии (3), с получением концентрированного раствора перед проведением диализа.
При этом стадия (4) необязательно включает стадию концентрирования или разбавления после проведения диализа для регулирования концентрации доцетаксела в диализированной суспензии.
При этом после стадии (4) способ необязательно включает стадию (5) стерилизации и фильтрования.
При этом после стадии (5) способ необязательно включает стадию (6) лиофилизации. При этом доцетаксел, описанный на стадии (1), находится в любой форме, предпочтительно в форме безводного доцетаксела, полугидрата доцетаксела или тригидрата доцетаксела. Доцетаксел (в расчете на безводный доцетаксел) и человеческий сывороточный альбумин находятся в массовом отношении 1:(2,0-10,0), предпочтительно 1:(3,0-7,0) и более предпочтительно 1:(4,0-6,0).
При этом органический растворитель, описанный на стадии (1), выбран из смешивающегося с водой растворителя, такого как этанол, метанол, ацетон и диметилсульфоксид и т.д., предпочтительно этанола. Раствор органической фазы содержит 45-90 мг/мл (в расчете на безводный доцетаксел), предпочтительно 45-70 мг/мл (в расчете на безводный доцетаксел) доцетаксела.
При этом содержание каприлата натрия в растворе человеческого сывороточного альбумина, описанном на стадии (2), составляет не более 0,12 ммоль/г белка, предпочтительно не более 0,08 ммоль/г белка и предпочтительно 0,045-0,08 ммоль/г белка. При этом на стадии (2) разбавленный раствор альбумина содержит 6-25 мг/мл, предпочтительно 10-20 мг/мл, более предпочтительно 12-18 мг/мл и более предпочтительно 15 мг/мл альбумина.
При этом на стадии (2) кислота выбрана из кислой аминокислоты или кислого полипептида, органической кислоты и неорганической кислоты. Кислая аминокислота или кислый полипептид включает, но не ограничивается ими, гидрохлорид цистеина и глутатион; органическая кислота включает, но не ограничивается ими, лимонную кислоту, винную кислоту и т.д.; неорганическая кислота включает, но не ограничивается ими, хлористоводородную кислоту, серную кислоту и т.д. Кислота предпочтительно представляет собой гидрохлорид цистеина, глутатион или хлористоводородную кислоту и более предпочтительно гидрохлорид цистеина. Значение рН предпочтительно равняется 3,5-5,5, предпочтительно 3,5-5,0, более предпочтительно 3,8-4,7 и более предпочтительно 4,0-4,5.
При этом на стадии (2) инкубирование относится к нагреванию до 35-42°С, предпочтительно 38-42°С, после добавления кислоты для регулирования значения рН и инкубированию в течение более 30 мин, предпочтительно 30-60 мин.
При этом солевой раствор, описанный на стадии (2), выбран из водного раствора хлорида натрия, хлорида калия, сульфата натрия и сульфата магния, предпочтительно водного раствора хлорида натрия; и солевой раствор имеет концентрацию не менее 2%, предпочтительно 2%-35% и более предпочтительно 10%-20%.
При этом на стадии (3) загрузку лекарственного средства осуществляют в условиях, при которых раствор органической фазы и раствор водной фазы нагревают до 35-42°С, предпочтительно 38-42°С, и три указанных компонента смешивают для загрузки лекарственного средства.
При этом охлаждение, описанное на стадии (3), относится к охлаждению до температуры ниже комнатной температуры, предпочтительно 0-20°С и более предпочтительно 7-15°С. При этом концентрированный раствор, описанный на стадии (4), содержит 4-10 мг/мл, предпочтительно 6-10 мг/мл, более предпочтительно 7-9 мг/мл и более предпочтительно 8 мг/мл доцетаксела.
При этом диализ на стадии (4) предназначен для удаления избыточных низкомолекулярных соединений. Тип и количество диализата и отсечение по молекулярной массе диализной мембраны конкретно не ограничены, и специалисты в данной области техники могут осуществлять выбор в соответствии с общими техническими знаниями или опытом. Для удобства дальнейшего получения состава и клинического применения диализат предпочтительно представляет собой водный раствор клинически приемлемого агента, регулирующего тоничность, такого как водный раствор хлорида натрия, глюкозы, фосфата или цитрата. В некоторых вариантах реализации диализ на стадии (4) осуществляют с применением раствора хлорида натрия в качестве диализата. Диализная мембрана характеризуется отсечением по молекулярной массе 10-50 кДа, предпочтительно 10-30 кДа и более предпочтительно 10 кДа или 30 кДа. Диализат имеет объем, который не менее чем в 3 раза, предпочтительно в 3-10 раз и более предпочтительно в 3-6 раз превышает объем раствора, загруженного лекарственным средством, или концентрированного раствора. Раствор хлорида натрия имеет концентрацию не более 1,8% (масс/об.), предпочтительно 0,45%-1,8% (масс/об.) и более предпочтительно 0,9%-1,8% (масс/об.).
В некоторых вариантах реализации содержание каприлата натрия, содержащегося в растворе человеческого сывороточного альбумина, применяемом на стадии (2), необходимо регулировать заранее. Специалисты в данной области техники могут выбирать подходящий способ регулирования содержания каприлата натрия в растворе человеческого сывороточного альбумина в соответствии с общими техническими знаниями или опытом, включая, но не ограничиваясь им, диализ.
В некоторых вариантах реализации способ регулирования содержания каприлата натрия в растворе человеческого сывороточного альбумина включает:
разбавление коммерчески доступного раствора человеческого сывороточного альбумина водой для инъекций или физиологическим раствором с получением разбавленного раствора альбумина; проведение диализа разбавленного раствора альбумина с применением воды для инъекций или физиологического раствора в качестве диализата и частичное удаление каприлата натрия с получением раствора человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия.
В некоторых вариантах реализации раствор человеческого сывороточного альбумина разбавляют с коэффициентом разбавления не менее 4, предпочтительно 4-7. Диализная мембрана при диализе характеризуется отсечением по молекулярной массе 10-50 кДа, предпочтительно 10-30 кДа и более предпочтительно 10 кДа или 30 кДа. Объем диализата может быть определен специалистами в данной области техники при помощи обычных испытаний в соответствии с желаемым содержанием каприлата натрия. Предпочтительно диализат имеет объем, который примерно более чем в 3 раза, предпочтительно в 3-10 раз и более предпочтительно в 3-6 раз превышает объем разбавленного раствора альбумина. Раствор человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия содержит каприлат натрия в количестве менее 0,16 ммоль/г белка, предпочтительно менее 0,12 ммоль/г белка, предпочтительно менее 0,10 ммоль/г белка и предпочтительно менее 0,08 ммоль/г белка. Раствор человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия можно применять непосредственно для получения композиции наночастиц доцетаксела-альбумина, описанной в настоящем документе, а также можно пропорционально смешивать с раствором человеческого сывороточного альбумина с дополнительным содержанием каприлата натрия с получением желаемого содержания, а затем применять для получения композиции наночастиц доцетаксела-альбумина.
В другом аспекте в настоящем изобретении также предложена композиция, содержащая наночастицы доцетаксела-альбумина, полученная в соответствии с указанным выше способом.
В способе получения на стадии диализа удаляют избыточные низкомолекулярные соединения из раствора, загруженного лекарственным средством, или концентрированного раствора. Например, в некоторых вариантах реализации кислую аминокислоту или кислый полипептид применяют на стадии (2) для регулирования рН для получения кислотно-денатурированного альбумина; на стадии диализа по существу удаляют избыточные кислые аминокислоты или кислые полипептиды; при этом композиция содержит малое количество свободных кислых аминокислот или кислых полипептидов. "Содержит малое количество свободных кислых аминокислот или кислых полипептидов" означает, что содержание свободных кислых аминокислот или кислых полипептидов в композиции составляет менее 0,25% (масс/масс.) относительно доцетаксела. Например, в некоторых вариантах реализации применяют гидрохлорид цистеина или глутатион для регулирования рН для получения кислотно-денатурированного альбумина, и содержание свободного цистеина или глутатиона в композиции составляет менее 0,25% (масс./масс.) относительно доцетаксела. Кроме того, в настоящем изобретении дополнительно предложено лекарственное средство, полученное из композиции, содержащей наночастицы доцетаксела-альбумина, полученные указанным выше способом. Лекарственное средство находится в клинически приемлемой лекарственной форме, предпочтительно в форме для инъекций и более предпочтительно в форме жидкости для инъекций или в форме лиофилизированного порошка для инъекций. В другом аспекте в настоящем изобретении дополнительно предложен способ регулирования содержания каприлата натрия в растворе человеческого сывороточного альбумина, включающий следующие стадии:
разбавление коммерчески доступного раствора человеческого сывороточного альбумина водой для инъекций или физиологическим раствором с получением разбавленного раствора альбумина; проведение диализа разбавленного раствора альбумина с применением воды для инъекций или физиологического раствора в качестве диализата и частичное удаление каприлата натрия с получением раствора человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия.
В некоторых вариантах реализации раствор человеческого сывороточного альбумина разбавляют с коэффициентом разбавления не менее 4, предпочтительно 4-7. Диализная мембрана при диализе характеризуется отсечением по молекулярной массе 10-50 кДа, предпочтительно 10-30 кДа и более предпочтительно 10 кДа или 30 кДа. Объем диализата может быть определен специалистами в данной области техники при помощи обычных испытаний в соответствии с желаемым содержанием каприлата натрия. Предпочтительно диализат имеет объем, который примерно более чем в 3 раза, предпочтительно в 3-10 раз и более предпочтительно в 3-6 раз превышает объем разбавленного раствора альбумина. Раствор человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия содержит каприлат натрия в количестве менее 0,16 ммоль/г белка, предпочтительно менее 0,12 ммоль/г белка, предпочтительно менее 0,10 ммоль/г белка и предпочтительно менее 0,08 ммоль/г белка.
Раствор человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия можно применять непосредственно для получения композиции наночастиц доцетаксела-альбумина, описанной в настоящем документе, а также можно пропорционально смешивать с раствором человеческого сывороточного альбумина с дополнительным содержанием каприлата натрия с получением желаемого содержания, а затем применять для получения композиции наночастиц доцетаксела-альбумина.
Содержание доцетаксела, описанное в настоящем документе, приведено в расчете на безводный доцетаксел.
Численные значения или числовые диапазоны, описанные в настоящем документе, могут отклоняться в большую и меньшую сторону в пределах диапазона, понятного специалистам в данной области техники, не влияя на реализацию настоящего изобретения, например, ± 20%, или ± 17%, или ± 15%, или ± 12%, или ± 10%, или ± 9%, или ± 8%, или ± 7%, или ± 6%, или ± 5%, или ± 4%, или ± 3%, или ± 2%, или ± 1%.
Выражение "получен из...", описанное в настоящем документе, представляет собой открытое выражение, которое не исключает присутствия других необязательных компонентов, например, выражение "композиция получена из доцетаксела и кислотно-денатурированного альбумина" следует понимать как "композиция получена из композиции исходного материала, содержащей доцетаксел и кислотно-денатурированный альбумин в качестве исходных материалов" или "композиция получена из исходного материала, содержащего доцетаксел и кислотно-денатурированный альбумин в качестве основных компонентов".
Неожиданно оказалось, что в настоящем изобретении термостабилизатор каприлат натрия в альбумине оказывает относительно большое влияние на физическую стабильность продукта. Причина заключается в том, что каприлат натрия может конкурировать с лекарственным средством за связывание с гидрофобным участком альбумина, что снижает связывание лекарственного средства с белком, что приводит к нестабильности наносуспензии. При непосредственном применении коммерчески доступного раствора человеческого сывороточного альбумина (содержащего каприлат натрия в количестве 0,16 ммоль/г белка) в качестве вспомогательного вещества осаждение наночастиц происходит в течение 10 ч. Тем не менее, когда содержание каприлата натрия в растворе альбумина снижают путем диализа до уровня ниже 0,08 ммоль/г белка, стабильность полученных наночастиц значительно улучшается, и наночастицы могут оставаться стабильными при 25°С в течение по меньшей мере 24 ч и могут оставаться стабильными при 2-8°С более 10 дней.
Во-вторых, значение рН также является важным фактором, влияющим на физическую стабильность наночастиц доцетаксела-альбумина. Все значения рН суспензий наночастиц доцетаксела-альбумина, приготовленных согласно предшествующему уровню техники, превышают изоэлектрическую точку альбумина. Для поддержания стабильности суспензий необходимо добавлять большое количество органических кислот или их солей в качестве стабилизаторов, что приводит к относительно высокому осмотическому давлению лекарственного средства, вызывает выраженную боль при клиническом применении и вызывает осмотическое повреждение клеток и тканей местно после инъекции. В настоящем изобретении получают наночастицы доцетаксела-альбумина из кислотно-денатурированного альбумина, контролируют содержание каприлата натрия в растворе альбумина, не требуется дополнительного добавления других солевых стабилизаторов, и восстанавливают стабильную изоосмотическую суспензию, в результате чего обеспечивается деликатная стимуляция кровеносных сосудов.
Кроме того, в документе № CN103054798А указано, что стабильность наночастиц, полученных из безводного доцетаксела, значительно превосходит стабильность наночастиц, полученных из тригидрата и полугидрата доцетаксела. Тем не менее, в технических схемах настоящего изобретения кристаллизационная вода доцетаксела, т.е. безводного, полугидрата или тригидрата, не оказывает влияния на стабильность полученной композиции наночастиц доцетаксела-альбумина. Это значительно расширяет выбор формы доцетаксела и является ценным при промышленном применении.
В настоящем изобретении предложена физически и химически стабильная композиция доцетаксела-альбумина. Ускоренные и долгосрочные испытания стабильности композиции, предложенной в настоящем документе, свидетельствуют, что 7-эпидоцетаксел и белковые полимеры демонстрируют незначительные изменения, а завершенные ускоренные испытания стабильности свидетельствуют, что лиофилизированный порошок может сохранять стабильность при хранении при 30°С и 25°С в течение 18 месяцев, и прогноз по существующим данным показывает, что он может сохранять стабильность при хранении при 30°С в течение по меньшей мере 20 месяцев и при температуре ниже 25°С в течение по меньшей мере 36 месяцев. Завершенные испытания по наблюдению за статической стабильностью свидетельствуют, что композиция, предложенная в настоящем документе, может оставаться стабильной в течение по меньшей мере 24 ч при комнатной температуре и в течение по меньшей мере 10 дней в условиях охлаждения, и не наблюдают помутнения суспензий или осаждения наночастиц независимо от того, представляет ли композиция собой суспензию перед лиофилизацией или восстановленную суспензию после лиофилизации. В настоящее время проводят испытания стабильности на более длительных периодах времени. По сравнению с условием, при котором восстановленная суспензия коммерчески доступного продукта остается стабильной только в течение 8 ч, продукт согласно настоящему изобретению значительно снижает клинические ограничения. Кроме того, предложенная в настоящем документе композиция доцетаксела-альбумина характеризуется более высокой максимально переносимой дозой (MTD) и более низкой токсичностью по сравнению с коммерчески доступным доцетакселом для инъекций (TAXOTERE). Таким образом, ожидают, что предложенная в настоящем документе композиция доцетаксела-альбумина может улучшать клиническое введение доз доцетаксела и повышать клиническую безопасность.
Подробное описание
Следующие примеры являются конкретными иллюстрациями настоящего изобретения и не ограничивают объем настоящего изобретения.
Если не указано иное, термин "стабильный", описанный в примерах, обозначает, что не происходит осаждения наночастиц или помутнения суспензий.
Если не указано иное, "восстановленные суспензии", описанные в примерах, представляют собой изоосмотические суспензии.
Пример 1. Получение композиции доцетаксела и альбумина
Составы композиций наночастиц доцетаксела-альбумина являлись следующими: Таблица 1. Составы композиций наночастиц доцетаксела-альбумина
Примечание: а относится к рассчитанному содержанию хлорида натрия в предварительно лиофилизированной суспензии. Концентрации (масс/об.) хлорида натрия в соответствующих диализатах составляли: 0,9% в составе 1-1, 1,8% в составе 1-2, 0,45% в составе 1-3 и 0,9% в составе 1-4.
(1) 8 г безводного доцетаксела взвешивали и растворяли в 120 мл этанола с получением раствора органической фазы.
(2) Определенное количество раствора человеческого сывороточного альбумина (с содержанием каприлата натрия 0,08 ммоль/г белка) разбавляли водой для инъекций с получением раствора, содержащего 15 мг/мл альбумина, а затем добавляли необходимое
количество гидрохлорида цистеина для доведения рН до 4,1 и смешанный раствор инкубировали при 42°С в течение 30 мин с получением раствора водной фазы кислотно-денатурированного альбумина; готовили раствор хлорида натрия с концентрацией 20% с применением воды для инъекций.
(3) Раствор органической фазы и раствор водной фазы нагревали до 42°С. Раствор органической фазы, раствор водной фазы и солевой раствор смешивали для загрузки лекарственного средства и полученный материал охлаждали до 15°С на водяной бане со льдом с получением раствора, загруженного лекарственным средством.
(4) Раствор, загруженный лекарственным средством, концентрировали до достижения концентрации доцетаксела примерно 8 мг/мл с получением концентрированного раствора; проводили 5-кратный диализ концентрированного раствора с применением раствора хлорида натрия в качестве диализата с использованием диализной мембраны с отсечением по молекулярной массе 30 кДа с получением диализированной суспензии; а затем добавляли необходимое количество диализата для доведения концентрации доцетаксела в суспензии до 4 мг/мл.
(5) Суспензию стерилизовали и фильтровали через мембрану 0,45 мкм + 0,2 мкм с получением предварительно лиофилизированной суспензии.
(6) Предварительно лиофилизированную суспензию, полученную на стадии (5), лиофилизировали с получением лиофилизированного порошка.
Результаты свидетельствовали, что стадия диализа может снижать содержание каприлата натрия. В конце стадии диализа концентрация хлорида натрия в диализированной суспензии являлась по существу такой же, как исходная концентрация хлорида натрия в диализате. Размер наночастиц в суспензии определяли при помощи способа динамического светорассеяния и суспензию оставляли отстаиваться для наблюдения за осаждением. Результаты, приведенные в таблице 2, свидетельствовали, что содержание хлорида натрия в диализате не оказывает существенного влияния на размер наночастиц доцетаксела-альбумина в предварительно лиофилизированной суспензии и в восстановленной суспензии. Предварительно лиофилизированную суспензию и восстановленную суспензию каждого состава выдерживали при 25°С в течение 24 ч, при этом не наблюдали помутнения или осадка. Суспензии также выдерживали при 2-8°С в течение 10 дней, при этом не наблюдали помутнения или осадка. Полагают, что предварительно лиофилизированная суспензия и восстановленная суспензия каждого состава являются стабильными при 25°С в течение по меньшей мере 24 ч и стабильными при 2-8°С в течение по меньшей мере 10 дней. Стабильность до и после лиофилизации не претерпевала существенных изменений.
Как видно из сравнения результатов для составов 1-1 и 1-4, регулирование отношения количества доцетаксела к альбумину не оказывало существенного влияния на размер наночастиц и стабильность суспензии.
Кроме того, авторы настоящего изобретения также определяли содержание цистеина в диализированной суспензии путем высокоэффективной жидкостной хроматографии со ссылкой на Общее правило 0512 Китайской Фармакопеи, том IV, издание 2020 года (General Rule 0512, Chinese Pharmacopoeia, Volume IV, 2020 Edition). Результаты свидетельствовали, что диализированная суспензия содержала малое количество свободного цистеина (содержание менее 0,25% (масс./масс.) относительно доцетаксела). Авторы настоящего изобретения также определяли значения рН суспензии до и после диализа и обнаружили, что значения рН суспензии до и после диализа по существу не изменялись.
Таблица 2. Размер и стабильность наночастиц доцетаксела-альбумина различных составов
Примечание: а означает, что лиофилизированный порошок восстанавливали водой для инъекций до суспензии (изоосмотической суспензии). Состав 1-1 восстанавливали до изоосмотической суспензии, содержащей 4 мг/мл доцетаксела; состав 1-2 восстанавливали до изоосмотической суспензии, содержащей 2 мг/мл доцетаксела; состав 1-3 восстанавливали до изоосмотической суспензии, содержащей 8 мг/мл доцетаксела; состав 1-4 восстанавливали до изоосмотической суспензии, содержащей 4 мг/мл доцетаксела.
Пример 2
Тригидрат доцетаксела (8 г в расчете на безводный доцетаксел) взвешивали и растворяли в 160 мл абсолютного этанола с получением раствора органической фазы. Раствор человеческого сывороточного альбумина, содержащий 16 г альбумина (с содержанием каприлата натрия 0,08 ммоль/г белка), разбавляли водой для инъекций с получением раствора, содержащего 10 мг/мл альбумина, а затем к раствору добавляли необходимое количество гидрохлорида цистеина для доведения рН до 4,5 и смешанный раствор инкубировали при 40°С в течение 1 ч с получением раствора водной фазы кислотно-денатурированного альбумина. Готовили хлорид натрия в виде 10% солевого раствора с применением воды для инъекций. Раствор органической фазы и раствор водной фазы нагревали до 40°С, а затем смешивали с солевым раствором для загрузки лекарственного средства и полученный материал охлаждали до 18°С на водяной бане со льдом с получением раствора, загруженного лекарственным средством. Раствор, загруженный лекарственным средством, концентрировали до достижения концентрации доцетаксела примерно 10 мг/мл с получением концентрированного раствора. Проводили 6-кратный диализ концентрированного раствора с применением изоосмотического раствора хлорида натрия (0,9%, масс./об.) в качестве диализата с использованием диализной мембраны с отсечением по молекулярной массе 30 кДа. Диализированную суспензию стерилизовали и фильтровали через мембрану 0,45 мкм + 0,2 мкм с получением предварительно лиофилизированной суспензии. Суспензию лиофилизировали с получением лиофилизированного порошка. В предварительно лиофилизированной суспензии размер наночастиц доцетаксела-альбумина составлял 101,3 нм. После выдерживания суспензии при температуре 25°С в течение 24 ч и при температуре 2-8°С в течение 10 дней не наблюдали помутнения или осадка. Лиофилизированный порошок восстанавливали водой для инъекций с получением восстановленной суспензии (изоосмотической суспензии), при этом размер наночастиц доцетаксела-альбумина не претерпевал существенных изменений и составлял 103,5 нм. Восстановленную суспензию выдерживали при 25°С в течение 24 ч и при 2-8°С в течение 10 дней, при этом не наблюдали помутнения или осадка. Полагают, что предварительно лиофилизированная суспензия и восстановленная суспензия являются стабильными при 25°С в течение по меньшей мере 24 ч и стабильными при 2-8°С в течение по меньшей мере 10 дней.
Результаты, полученные путем высокоэффективной жидкостной хроматографии, свидетельствовали, что диализированная суспензия содержала малое количество свободного цистеина (содержание составляло примерно 0,13% (масс./масс.) относительно доцетаксела). Значения рН суспензии до и после диализа по существу не изменялись.
Пример 3
Полугидрат доцетаксела (8 г в расчете на безводный доцетаксел) взвешивали и растворяли в 80 мл 96% этанола с получением раствора органической фазы. Раствор человеческого сывороточного альбумина, содержащий 50 г альбумина (с содержанием каприлата натрия 0,08 ммоль/г белка), разбавляли водой для инъекций с получением раствора, содержащего 20 мг/мл альбумина, а затем добавляли необходимое количество гидрохлорида цистеина для доведения рН до 3,9 с получением раствора водной фазы кислотно-денатурированного альбумина. Готовили хлорид натрия в виде 2% солевого раствора с применением воды для инъекций. Раствор органической фазы и раствор водной фазы нагревали до 35°С. Раствор органической фазы, раствор водной фазы и солевой раствор смешивали для загрузки лекарственного средства и полученный материал охлаждали до 12°С на водяной бане со льдом с получением раствора, загруженного лекарственным средством. Раствор, загруженный лекарственным средством, концентрировали до достижения концентрации доцетаксела примерно 7 мг/мл с получением концентрированного раствора. Проводили 5-кратный диализ концентрированного раствора с применением изоосмотического раствора хлорида натрия (0,9%, масс./об.) в качестве диализата с использованием диализной мембраны с отсечением по молекулярной массе 10 кДа. Диализированную суспензию стерилизовали и фильтровали через мембрану 0,45 мкм + 0,2 мкм с получением предварительно лиофилизированной суспензии. Суспензию лиофилизировали с получением лиофилизированного порошка.
В предварительно лиофилизированной суспензии и восстановленной суспензии (изоосмотической суспензии), полученной путем восстановления лиофилизированного порошка водой для инъекций, размеры наночастиц доцетаксела-альбумина существенно не различались и составляли 119,7 нм до лиофилизации и 121,3 нм после восстановления. Предварительно лиофилизированную суспензию и восстановленную суспензию выдерживали при 25°С в течение 24 ч и при 2-8°С в течение 10 дней, при этом не наблюдали помутнения или осадка. Полагают, что предварительно лиофилизированная суспензия и восстановленная суспензия являются стабильными при 25°С в течение по меньшей мере 24 ч и стабильными при 2-8°С в течение по меньшей мере 10 дней. Результаты, полученные путем высокоэффективной жидкостной хроматографии, свидетельствовали, что диализированная суспензия содержала малое количество свободного цистеина (содержание составляло примерно 0,21% (масс./масс.) относительно доцетаксела). Значения рН суспензии до и после диализа по существу не изменялись.
Пример 4. Влияние форм доцетаксела на стабильность композиции
Безводный доцетаксел, полугидрат доцетаксела и тригидрат доцетаксела (все по 8 г в расчете на безводный доцетаксел) взвешивали и растворяли в 120 мл этанола, соответственно, с получением растворов органической фазы. Раствор человеческого сывороточного альбумина, содержащий 36 г альбумина (с содержанием каприлата натрия 0,08 ммоль/г белка), разбавляли водой для инъекций с получением раствора, содержащего 20 мг/мл альбумина, а затем к раствору добавляли необходимое количество гидрохлорида цистеина для доведения рН до 4,3 и смешанный раствор инкубировали при 42°С в течение 60 мин с получением раствора водной фазы кислотно-денатурированного альбумина. Готовили хлорид натрия в виде 10% солевого раствора с применением воды для инъекций. Раствор органической фазы и раствор водной фазы нагревали до 42°С, а затем смешивали с солевым раствором для загрузки лекарственного средства и полученный материал охлаждали до 12°С на водяной бане со льдом с получением раствора, загруженного лекарственным средством. Раствор, загруженный лекарственным средством, концентрировали до достижения концентрации доцетаксела примерно 7 мг/мл с получением концентрированного раствора. Проводили 5-кратный диализ концентрированного раствора с применением изоосмотического раствора хлорида натрия в качестве диализата с использованием диализной мембраны с отсечением по молекулярной массе 30 кДа. Диализированную суспензию стерилизовали и фильтровали через мембрану 0,45 мкм + 0,2 мкм с получением предварительно лиофилизированной суспензии. Суспензию лиофилизировали с получением лиофилизированного порошка.
Как показано в таблице 3 ниже, наночастицы доцетаксела-альбумина получали при помощи того же способа с применением безводного доцетаксела, полугидрата доцетаксела и тригидрата доцетаксела в качестве исходных материалов, и размеры полученных наночастиц не имели существенных различий, составляли примерно ПО нм и существенно не изменялись до и после лиофилизации. Кроме того, стабильность предварительно лиофилизированной суспензии и восстановленной суспензии (содержащей 4 мг/мл доцетаксела), полученной путем восстановления лиофилизированного порошка водой для инъекций, также существенно не различалась. Суспензии выдерживали при 25°С в течение 24 ч и при 2-8°С в течение 10 дней, при этом не наблюдали помутнения или осадка. Полагают, что предварительно лиофилизированная суспензия и восстановленная суспензия, описанные выше, могут являться стабильными при 25°С в течение по меньшей мере 24 ч и стабильными при 2-8°С в течение по меньшей мере 10 дней. Можно видеть, что является ли доцетаксел безводным или гидратированным, не влияет на реализацию настоящего изобретения.
Результаты, полученные путем высокоэффективной жидкостной хроматографии, свидетельствовали, что диализированная суспензия содержала малое количество свободного цистеина (содержание составляло менее 0,25% (масс/масс.) относительно доцетаксела).
Таблица 3. Влияние применяемой формы доцетаксела на стабильность композиции
Пример 5. Исследование химической стабильности
Лиофилизированный порошок, содержащий наночастицы доцетаксела-альбумина, полученные из состава 1-1 из примера 1, помещали во флакон и герметизировали резиновой пробкой и алюминиевым колпачком. Флаконы хранили в течение 18 месяцев при различных условиях хранения. Исследовали процентное содержание 7-эпидоцетаксела и взаимосвязь между содержанием белкового полимера и временем хранения продукта. Результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4. Стабильность продукта состава 1-1 из примера 1
Примечание: допустимым пределом для определения стабильности фармацевтической композиции является "процентное содержание 7-эпидоцетаксела < 1,0%". Н/Д* обозначает, что эксперимент еще не достиг указанного момента времени и, следовательно, данные недоступны.
Результаты в таблице 4 свидетельствовали, что образование 7-эпидоцетаксела связано с температурой хранения. Чем выше была температура хранения, тем быстрее возрастало содержание 7-эпидоцетаксела. В продукте согласно настоящему изобретению можно эффективно контролировать образование 7-эпидоцетаксела. Результаты в таблице 4 свидетельствовали, что в трех описанных выше условиях испытаний содержание 7-эпидоцетаксела в продукте согласно настоящему изобретению находилось в контролируемом диапазоне (содержание < 1,0%), а содержание белкового полимера не претерпевало существенных изменений. На основе существующих данных прогнозируют, что продукт согласно настоящему изобретению может стабильно храниться при 30°С в течение по меньшей мере 20 месяцев и при температуре ниже 25°С в течение по меньшей мере 36 месяцев.
Когда исходным материалом АФИ являлся доцетаксел в других формах, таких как полугидрат и тригидрат, изменение химической стабильности (процентное содержание 7-эпидоцетаксела и содержание белкового полимера) являлось аналогичным изменению для безводного доцетаксела в качестве исходного материала в условиях испытаний, описанных выше.
В патенте Китая № CN106137969A в составы в качестве ингибиторов добавляли аргинин, пролин и т.п., и эффект аргинина в качестве ингибитора считали лучшим. Продукт можно хранить при температуре 2-8°С в течение по меньшей мере 24 месяцев и даже вплоть до 30 месяцев. Данные, предоставленные в указанном патенте, свидетельствовали, что содержание 7-эпидоцетаксела составляло от 0,5% до 0,61% при хранении продукта при температуре 2-8°С в течение 12 месяцев. Тем не менее, в настоящем документе содержание 7-эпидоцетаксела составляло всего лишь примерно 0,41% при хранении продукта при 25°С в течение 12 месяцев, и содержание 7-эпидоцетаксела составляло всего лишь 0,14% при хранении продукта при 2-8°С в течение 12 месяцев, что достаточно для демонстрации того, что химическую стабильность доцетаксела можно более эффективно обеспечивать при помощи настоящего изобретения по сравнению с документом № CN106137969A.
Пример 6. Влияние содержания каприлата натрия на стабильность композиции
8 г безводного доцетаксела взвешивали и растворяли в 120 мл этанола с получением раствора органической фазы.
Растворы человеческого сывороточного альбумина (содержащие 36 г человеческого сывороточного альбумина), содержащие каприлат натрия в различных концентрациях, разбавляли водой для инъекций соответствующим образом с получением растворов, содержащих 15 мг/мл альбумина, а затем добавляли необходимое количество гидрохлорида цистеина для доведения рН до 4,2 и смешанный раствор инкубировали при 42°С в течение 30 мин с получением раствора водной фазы кислотно-денатурированного альбумина. Готовили хлорид натрия в виде 15% солевого раствора с применением воды для инъекций. Раствор органической фазы и раствор водной фазы нагревали до 42°С. Раствор органической фазы, раствор водной фазы и солевой раствор смешивали для загрузки лекарственного средства и полученный материал охлаждали до 15°С на водяной бане со льдом с получением раствора, загруженного лекарственным средством. Раствор, загруженный лекарственным средством, концентрировали до достижения концентрации доцетаксела примерно 8 мг/мл с получением концентрированного раствора. Проводили 5-кратный диализ концентрированного раствора с применением изоосмотического раствора хлорида натрия в качестве диализата (с использованием диализной мембраны с отсечением по молекулярной массе 30 кДа). Диализированную суспензию стерилизовали и фильтровали через мембрану 0,45 мкм + 0,2 мкм с получением предварительно лиофилизированной суспензии. Суспензию лиофилизировали с получением лиофилизированного порошка. Результаты, представленные в таблице 5, свидетельствовали, что содержание каприлата натрия в исходных материалах не оказывало существенного влияния на размер наночастиц доцетаксела-альбумина. Тем не менее, в случае наночастиц доцетаксела-альбумина, полученных непосредственно из коммерчески доступного раствора человеческого сывороточного альбумина (содержащего каприлат натрия в количестве 0,16 ммоль/г белка) в качестве исходного материала, помутнение появлялось через 10 ч при 25°С. Физическая стабильность предварительно лиофилизированной суспензии и восстановленной изоосмотической суспензии являлась низкой. Снижение содержания каприлата натрия в растворе человеческого сывороточного альбумина способствовало повышению физической стабильности суспензии наночастиц. При содержании каприлата натрия в растворе человеческого сывороточного альбумина менее 0,08 ммоль/г белка раствор мог сохранять стабильное суспендированное состояние при 25°С в течение более 24 ч, а время стабильности более чем в 2 раза превышало время стабильности для раствора, содержащего каприлат натрия в количестве 0,16 ммоль/г белка. При содержании каприлата натрия в растворе человеческого сывороточного альбумина менее 0,08 ммоль/г белка предварительно лиофилизированная суспензия и восстановленная изоосмотическая суспензия могли оставаться стабильными при 2-8°С в течение по меньшей мере более 10 дней.
Таблица 5. Влияние содержания каприлата натрия на стабильность композиции
(25 ± 2°С)
(25 ± 2°С)
исследовали
исследовали
исследовали
исследовали
Примечание: а означает, что лиофилизированный порошок восстанавливали водой для инъекций с получением восстановленной суспензии (изоосмотической суспензии).
Пример 7. Влияние значения рН раствора водной фазы на стабильность
Сравнивали влияние значения рН раствора водной фазы на стабильность продукта. Технологический состав и способ получения относились к составу 1-1 из примера 1. Только на стадии (2) рН раствора водной фазы доводили до 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,7, 4,1, 3,8 и 3,5, соответственно, с применением гидрохлорида цистеина. Исследовали размер наночастиц в предварительно лиофилизированной суспензии и восстановленной суспензии, а также изменение стабильности суспензий.
Было установлено, что при рН раствора водной фазы в пределах 3,5-5,5 размер полученных наночастиц немного увеличивался с повышением рН, но лиофилизация и восстановление не оказывали существенного влияния на размер частиц. При рН раствора водной фазы в диапазоне 3,5-5,5 полученная предварительно лиофилизированная суспензия и восстановленная суспензия могли сохранять стабильное суспендированное состояние при 25°С в течение более 20 ч и при 2-8°С в течение по меньшей мере 7 дней. Кроме того, при рН раствора водной фазы в диапазоне 3,8-4,7 стабильное суспендированное состояние все еще могло сохраняться после выдерживания предварительно лиофилизированной суспензии и восстановленной суспензии при 25°С в течение 30 ч и при 2-8°С в течение 10 дней. Лиофилизация и восстановление не оказывали существенного влияния на стабильность.
Тем не менее, при рН раствора водной фазы выше 6,0 размер полученных наночастиц значительно увеличивался. При рН 6,0 размер наночастиц увеличивался до 180 нм. Кроме того, при рН раствора водной фазы выше 6,0 стабильность суспензии значительно снижалась, в течение 1 ч появлялось помутнение, и не удавалось поддерживать стабильное суспендированное состояние наночастиц.
Таблица 6. Влияние рН водной фазы белка на наночастицы доцетаксела-альбумина
ра водной фазы
исследовали
исследовали
исследовали
исследовали
исследовали
исследовали
исследовали
исследовали
исследовали
исследовали
исследовали
исследовали
исследовали
исследовали
Примечание: а означает, что лиофилизированный порошок восстанавливали водой для
инъекций с получением восстановленной суспензии (изоосмотической суспензии).
Пример 8. Получение раствора человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия
Пример 8-1
Коммерчески доступный раствор человеческого сывороточного альбумина (с содержанием каприлата натрия 0,16 ммоль/г белка) разбавляли водой для инъекций с получением разбавленного раствора альбумина, содержащего 15 мг/мл альбумина. Проводили 6-кратный диализ разбавленного раствора альбумина с применением воды для инъекций в качестве диализата (с использованием мембраны с отсечением по молекулярной массе 30 кДа) и частично удаляли каприлат натрия из белка с получением раствора человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия.
Содержание каприлата натрия в полученном растворе белка определяли согласно способу определения каприлата натрия в растворе человеческого сывороточного альбумина, описанному в Китайской фармакопее (3111, том IV, издание 2020 г.) (Chinese Pharmacopoeia (3111, Volume IV, 2020 Edition)), и результаты свидетельствовали, что обработанный раствор белка содержал каприлат натрия в количестве примерно 0,045 ммоль/г белка. Пример 8-2
Коммерчески доступный раствор человеческого сывороточного альбумина (с содержанием каприлата натрия 0,16 ммоль/г белка) разбавляли физиологическим раствором с получением разбавленного раствора альбумина, содержащего 12 мг/мл альбумина. Проводили 5-кратный диализ разбавленного раствора альбумина с применением физиологического раствора в качестве диализата (с использованием мембраны с отсечением по молекулярной массе 10 кДа) и частично удаляли каприлат натрия из белка с получением раствора человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия. Результаты исследования свидетельствовали, что полученный раствор человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия содержал каприлат натрия в количестве примерно 0,060 ммоль/г белка. Пример 8-3
Коммерчески доступный раствор человеческого сывороточного альбумина (с содержанием каприлата натрия 0,16 ммоль/г белка) разбавляли водой для инъекций с получением разбавленного раствора альбумина, содержащего 20 мг/мл альбумина. Проводили 3-кратный диализ разбавленного раствора альбумина с применением воды для инъекций в качестве диализата (с использованием мембраны с отсечением по молекулярной массе 30 кДа) и частично удаляли каприлат натрия из белка с получением раствора человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия. Результаты исследования свидетельствовали, что полученный раствор человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия содержал каприлат натрия в количестве примерно 0,080 ммоль/г белка.
Растворы человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия в примерах с 8-1 по 8-3, приведенных выше, можно дополнительно концентрировать для удобства хранения или применения.
Пример 9. Влияние процесса на вторичную структуру белка
Загруженную лекарственным средством наносуспензию и контрольную суспензию (на стадии (1) не добавляли лекарственное средство доцетаксел) получали в соответствии с составами и способом получения для состава 1-1 из примера 1 и исследовали отношения каждой вторичной структуры белка в растворе человеческого сывороточного альбумина, контрольной суспензии и загруженной лекарственным средством наносуспензии путем кругового дихроизма. Результаты представлены в таблице 7.
Результаты свидетельствовали, что контрольная суспензия и загруженная лекарственным средством наносуспензия, полученные посредством всей технологической цепочки, отличались от раствора человеческого сывороточного альбумина с точки зрения вторичных структур белка, α-спирали, β-листа, поворота и статистического клубка, что указывает на изменение вторичных структур альбумина в указанном процессе.
Результаты исследования свидетельствовали, что вторичные структуры кислотно-денатурированного альбумина не могут быть восстановлены до состояния до денатурации даже при удалении кислоты на стадии диализа в настоящем изобретении. Кроме того, после связывания доцетаксела вторичные структуры загруженного лекарственным средством альбумина дополнительно изменяются по сравнению с кислотно-денатурированным альбумином, не загруженным лекарственным средством.
Таблица 7. Отношения вторичных структур белка
Примечание: а как контрольная суспензия, так и загруженная лекарственным средством наносуспензия, описанные в примере 9, представляли собой изоосмотические суспензии, которые восстанавливали после лиофилизации.
Пример 10. Получение согласно примеру 1 из патента № CN 106137969 В (201510157393.1)
1,5 г безводного доцетаксела взвешивали и растворяли при помощи ультразвука в 100 мл абсолютного этанола с получением раствора масляной фазы. Раствор человеческого сывороточного альбумина, содержащий 7,5 г альбумина (в концентрации 200 мг/мл), разбавляли водой для инъекций с получением раствора, содержащего 6 мг/мл альбумина, и общий объем водной фазы составлял 1250 мл. К водной фазе добавляли 500 мг L-глутатиона и смешанный раствор инкубировали при 70°С в течение 6 мин. Масляную фазу однородно диспергировали в водной фазе при высокой скорости сдвига 1000 об/мин с получением суспензии.
Суспензия являлась белой, без опалесценции, визуально мутной, и через 10 мин образовывался осадок, и не удавалось выполнить последующие операции согласно патенту, в результате чего технические специалисты оценивали стабильность полученной суспензии как неудовлетворительную. Таким образом, авторы настоящего изобретения считают, что в достаточной степени доказано, что стабильность продукта согласно настоящему изобретению значительно превосходит стабильность продукта из патента № CN 106137969 В при сравнении данных о стабильности при хранении продукта, полученного при помощи способа согласно настоящему изобретению, с данными о стабильности при хранении, приведенными в указанном патенте.
Н/Д: указанный момент времени не был доступен в исследовании стабильности
Пример 11. Исследование влияния отношения белка к лекарственному средству, равняющемуся 1,5 (при снижении концентрации белка до 5 мг/мл)
1,6 г безводного доцетаксела взвешивали и растворяли в 23,7 мл абсолютного этанола с получением раствора органической фазы с концентрацией 67,5 мг/мл. Раствор человеческого сывороточного альбумина, содержащий 2,4 г альбумина (с содержанием каприлата натрия 0,08 ммоль/г белка), разбавляли водой для инъекций с получением раствора, содержащего 5 мг/мл альбумина, а затем добавляли необходимое количество цистеина гидрохлорида для доведения рН до 4,0 и смешанный раствор инкубировали при 40°С в течение 0,5 ч с получением раствора водной фазы кислотно-денатурированного альбумина. Готовили хлорид натрия в виде 14,4% солевого раствора с применением воды для инъекций. Раствор органической фазы и раствор водной фазы нагревали до 40°С, а затем смешивали с солевым раствором для загрузки лекарственного средства и полученный материал охлаждали до 18°С на водяной бане со льдом с получением раствора, загруженного лекарственным средством. Раствор, загруженный лекарственным средством, концентрировали до достижения концентрация доцетаксела примерно 6 мг/мл с получением концентрированного раствора. Проводили 5-кратный диализ концентрированного раствора с применением изоосмотического раствора хлорида натрия (0,9%, масс/об.) в качестве диализата с использованием диализной мембраны с отсечением по молекулярной массе 30 кДа. Диализированную суспензию стерилизовали и фильтровали через мембрану 0,45 мкм + 0,2 мкм с получением предварительно лиофилизированной суспензии. Суспензию лиофилизировали с получением лиофилизированного порошка.
В предварительно лиофилизированной суспензии наночастицы доцетаксела-альбумина имели размер 91,38 нм. Через 20 ч при 25°С суспензия полностью мутнела. Лиофилизированный порошок восстанавливали водой для инъекций с получением восстановленной суспензии (изоосмотической суспензии), помутнение которой наблюдали визуально.
Пример 12. Исследование влияния различных диализатов
1,8 г безводного доцетаксела взвешивали и растворяли в 26,7 мл абсолютного этанола с получением раствора органической фазы с концентрацией 67,5 мг/мл. Раствор человеческого сывороточного альбумина, содержащий 8,1 г альбумина (с содержанием каприлата натрия 0,08 ммоль/г белка), разбавляли водой для инъекций с получением раствора, содержащего 15 мг/мл альбумина, а затем к раствору добавляли необходимое количество цистеина гидрохлорида для доведения рН до 4,0 и смешанный раствор инкубировали при 40°С в течение 0,5 ч с получением раствора водной фазы кислотно-денатурированного альбумина. Готовили хлорид натрия в виде 14,4% солевого раствора с применением воды для инъекций. Раствор органической фазы и раствор водной фазы нагревали до 40°С, а затем смешивали с солевым раствором для загрузки лекарственного средства, и полученный материал охлаждали до 18°С на водяной бане со льдом с получением раствора, загруженного лекарственным средством. Раствор, загруженный лекарственным средством, концентрировали до достижения концентрация доцетаксела примерно 6 мг/мл с получением концентрированного раствора.
(1) Проводили 5-кратный диализ концентрированного раствора с применением изоосмотического раствора глюкозы (5%, масс./об.) в качестве диализата с использованием диализной мембраны с отсечением по молекулярной массе 30 кДа. Диализированную суспензию стерилизовали и фильтровали через мембрану 0,45 мкм + 0,2 мкм с получением предварительно лиофилизированной суспензии. Суспензию лиофилизировали с получением лиофилизированного порошка.
В предварительно лиофилизированной суспензии наночастицы доцетаксела-альбумина имели размер 102,2 нм. Через 16 ч при 25°С на дне суспензии оставалось относительно большое количество осадка. Через 16 ч при 2-8°С светопропускание снижалось. Лиофилизированный порошок восстанавливали водой для инъекций с получением восстановленной суспензии (изоосмотической суспензии), при этом размер наночастиц доцетаксела-альбумина не претерпевал существенных изменений и составлял 103,3 нм. Восстановленная суспензия становилась мутной после выдерживания при 25°С в течение 2,5 ч.
(2) Проводили 5-кратный диализ концентрированного раствора с применением изоосмотического фосфатно-солевого буфера (с рН 7,31 и осмотическим давлением 320 мОсмол/кг) в качестве диализата с использованием диализной мембраны с отсечением по молекулярной массе 30 кДа. Диализированную суспензию стерилизовали и фильтровали через мембрану 0,45 мкм + 0,2 мкм с получением предварительно лиофилизированной суспензии. Суспензию лиофилизировали с получением лиофилизированного порошка. В предварительно лиофилизированной суспензии наночастицы доцетаксела-альбумина имели размер 92,43 нм. После выдерживания суспензии при 25°С в течение 16 ч на дне появлялось небольшое количество осадка. После выдерживания суспензии при 2-8°С в течение 24 ч светопропускание снижалось. Лиофилизированный порошок восстанавливали водой для инъекций с получением восстановленной суспензии (изоосмотической суспензии), при этом размер наночастиц доцетаксела-альбумина не претерпевал существенных изменений и составлял 90,91 нм. Осадок можно было обнаружить в восстановленной суспензии через 2,5 ч при 25°С.
Пример 13. Сравнение максимально переносимой дозы (MTD) и токсичности доцетаксела для инъекций (связанного с альбумином, DTX-HSA) и доцетаксела для инъекций (TAXOTERE) у бестимусных мышей
1. Лекарственные средства и материалы для испытаний
1.1. Образец для испытания
Доцетаксел для инъекций (связанный с альбумином, DTX-HSA) получали при помощи способа получения из примера 1 с применением состава 1-1 из примера 1 настоящей заявки.
1.2. Контрольное лекарственное средство
Доцетаксел для инъекций (торговое наименование: TAXOTERE)
2. Экспериментальные животные
использовали 40 мышей
3. План эксперимента
3.1. Основное правило эксперимента
Определение максимально переносимой дозы (MTD) лекарственного средства при внутривенном введении мышам в настоящем испытании: если за время наблюдения не выявлено ни гибели, ни необратимых токсических реакций, ни потери массы более 15% в течение 3 последовательных дней, указанную дозу считали максимально переносимой дозой для однократного введения большой дозы.
3.2. Установление дозы введения
Изоосмотическая концентрация DTX-HSA после разбавления составляла 3,801 мг/мл, а максимальный объем введения при медленной внутривенной инъекции мышам составлял 25 мл/кг в соответствии с рекомендациями по допустимому объему введения и объему забора крови для различных путей введения или забору крови у животных, выпущенным совместно Европейской федерацией фармацевтической промышленности и ассоциаций и Европейским центром валидации альтернативных методов в 2001 году. Лекарственные средства вводили 3 раза в течение 24 ч, и максимальная доза могла составлять 285,1 мг/кг. Предварительно выбранные дозы в указанном эксперименте составляли: доцетаксел для инъекций (связанный с альбумином): 285,1, 228,1, 182,5 и 146,0 мг/кг (градиент 1,25); и
доцетаксел для инъекций (TAXOTERE): 187,5, 150, 120 и 96 мг/кг (градиент 1,25).
4. Экспериментальный способ
4.1. Распределение по группам и маркировка животных
Здоровых мышей с относительно небольшими различиями в массе тела отбирали и сбалансированным образом распределяли в 8 групп по 5 мышей в каждой группе в зависимости от массы, т.е. группы DTX-HSA 285,1, 228,1, 182,5 и 146,0 мг/кг и группы TAXOTERE 187,5, 150, 120 и 96 мг/кг.
4.2. Введение
Путь введения: внутривенная инъекция.
Частота введения: 3 раза в течение 24 ч с интервалом 4 ч. Объем введения: 25 мл/кг. Скорость введения: низкая.
Доза введения: дозу введения рассчитывали по последнему взвешиванию.
4.3. Наблюдения за критериями оценки
Наблюдение за общим состоянием: за всеми животными наблюдали ежедневно в течение периода эксперимента, и наблюдения за критериями оценки включали, но не ограничивались ими, кожу, волосы, глаза, уши, нос, полость рта, грудную клетку, живот, мочеполовую область, конечности и другие места, а также изменения в дыхании, передвижении, мочеиспускании, дефекации и поведении. Побочные эффекты у животных представлены в таблице ниже.
Масса тела: всех животных взвешивали один раз перед экспериментом и для эксперимента отбирали животных, имеющих подходящую массу тела. Животных взвешивали один раз в день в установленное время.
Смерть и состояние агонии: для погибших животных фиксировали время смерти. Увеличивали частоту наблюдения за агонирующими животными и определяли время смерти в ходе эксперимента.
4.4. Критерии оценки
Максимально переносимой дозой (MTD) лекарственного средства в эксперименте считали максимальную дозу, при которой не наблюдали гибели, необратимых токсических симптомов или потери массы более 15% в течение 3 последовательных дней у мышей в течение периода наблюдения. 5. Результаты эксперимента
5.1. Смертность
В группах введения DTX-HSA и TAXOTERE не наблюдали гибели животных.
5.2. Клинические наблюдения
У животных в группах DTX-HSA 285,1 и 228,1 мг/кг наблюдали легкий тремор задних конечностей, начиная с D4 и D7, соответственно. Животные в группе с дозой 228,1 мг/кг вылечивались от симптома тремора задних конечностей на D20, а животные в группе с дозой 285,1 мг/кг вылечивались от симптома тремора задних конечностей на D22. Не наблюдали никаких существенных отклонений у животных в группах DTX-HSA 182,5 и 146,0 мг/кг. У животных в группах TAXOTERE 187,5 и 150 мг/кг наблюдали легкий или умеренный тремор задних конечностей, начиная с D4 и D6, соответственно. Животные в группе с дозой 150 мг/кг вылечивались от симптома тремора задних конечностей на D19, а животные в группе с дозой 187,5 мг/кг вылечивались от симптома тремора задних конечностей на D24.
Не наблюдали никаких существенных отклонений у животных в группах TAXOTERE 120 и
96 мг/кг.
5.3. Масса тела
У 1/5 животных в группе DTX-HSA 285,1 мг/кг наблюдали потерю массы более 15% в течение D5-D8, у 1/5 животных наблюдали потерю массы более 15% в DIO, D12 и D13, а в других группах введения DTX-HSA не наблюдали животных с потерей массы более 15%. У 1/5 животных в группе TAXOTERE 187,5 мг/кг наблюдали потерю массы более 15% в течение D4-D14, а в других группах введения TAXOTERE не наблюдали животных с потерей массы более 15%.
Токсичность у мышей после введения (п = 5)
существенных
отклонений.
существенных
отклонений.
существенных
отклонений.
существенных
отклонений.
MTD: максимальная доза, если за период наблюдения у мышей не наблюдали гибели,
необратимых токсических симптомов или потери массы более 15% в течение 3 последовательных дней. Время наблюдения: 24 дня. 6.
Заключение
В условиях эксперимента MTD для DTX-HSA у бестимусных мышей составляла 228,1 мг/кг; MTD для TAXOTERE у бестимусных мышей составляла 150,0 мг/кг.
Группа изобретений относится к области фармацевтических составов, в частности к композициям, содержащим наночастицы доцетаксела-альбумина, лекарственным средствам на основе таких композиций, а также к способу их получения. Предлагается композиция, содержащая наночастицы доцетаксела-альбумина, которая содержит доцетаксел и кислотно-денатурированный альбумин; и, альтернативно, композиция, содержащая наночастицы доцетаксела-альбумина, которая получена из доцетаксела и кислотно-денатурированного альбумина; при этом указанный кислотно-денатурированный альбумин получен путем добавления гидрохлорида цистеина к человеческому сывороточному альбумину для доведения pH до 3,8-4,7 и последующей денатурации; и содержание каприлата натрия в указанном альбумине составляет не более 0,08 ммоль/г белка. Предлагаются также лиофилизированный порошок, полученный из любой из указанных выше композиций; восстановленная суспензия, полученная путем восстановления такого лиофилизированного порошка; и лекарственное средство, полученное из указанных выше композиций, лиофилизированного порошка или восстановленной суспензии. Способ получения указанных выше композиций, порошка или суспензии включает стадии: (1) растворение доцетаксела в органическом растворителе с получением раствора органической фазы; (2) обеспечение раствора человеческого сывороточного альбумина и добавление гидрохлорида цистеина для доведения значения pH до 3,8-4,7 с получением раствора водной фазы кислотно-денатурированного альбумина, где содержание каприлата натрия составляет не более 0,08 ммоль/г белка; обеспечение раствора соли, выбранной из хлорида натрия, хлорида калия, сульфата натрия и сульфата магния; (3) смешивание указанных выше растворов органической фазы, водной фазы и солевого раствора для загрузки лекарственного средства с получением раствора, загруженного лекарственным средством; и (4) проведение диализа раствора, загруженного лекарственным средством, с получением композиции, содержащей наночастицы доцетаксела-альбумина. Предлагается также композиция, содержащая наночастицы доцетаксела-альбумина, полученная указанным выше способом, и лекарственное средство на ее основе. Использование указанного выше альбумина, кислотно-денатурированного при определенном значении pH, и контроль содержания каприлата натрия обеспечивают физическую и химическую стабильность предлагаемых композиций и лекарственных средств. 8 н. и 14 з.п. ф-лы, 7 табл., 13 пр.
1. Противоопухолевая композиция, содержащая наночастицы доцетаксела-альбумина, где указанная композиция содержит доцетаксел и кислотно-денатурированный альбумин; и при этом указанный кислотно-денатурированный альбумин получен путем добавления гидрохлорида цистеина к человеческому сывороточному альбумину для доведения pH до подходящего значения и последующей денатурации; при этом подходящее значение pH составляет 3,8-4,7; при этом содержание каприлата натрия в человеческом сывороточном альбумине составляет не более 0,08 ммоль/г белка.
2. Противоопухолевая композиция, содержащая наночастицы доцетаксела-альбумина, где указанная композиция получена из доцетаксела и кислотно-денатурированного альбумина; и при этом указанный кислотно-денатурированный альбумин получен путем добавления гидрохлорида цистеина к человеческому сывороточному альбумину для доведения pH до подходящего значения и последующей денатурации; при этом подходящее значение pH составляет 3,8-4,7; при этом содержание каприлата натрия в человеческом сывороточном альбумине составляет не более 0,08 ммоль/г белка.
3. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанный доцетаксел предпочтительно представляет собой безводный доцетаксел, полугидрат доцетаксела или тригидрат доцетаксела; предпочтительно:
(1) указанное подходящее значение pH составляет 4,0-4,5; и/или
(2) указанное содержание каприлата натрия в человеческом сывороточном альбумине составляет 0,03-0,08 ммоль/г белка, более предпочтительно 0,04-0,08 ммоль/г белка и более предпочтительно 0,04-0,07 ммоль/г белка; и/или
(3) указанный доцетаксел (в расчете на безводную форму) и указанный человеческий сывороточный альбумин находятся в массовом отношении 1:(2,0-10,0), предпочтительно 1:(3,0-7,0) и более предпочтительно 1:(4,0-6,0).
4. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанные наночастицы доцетаксела-альбумина имеют размер 60-200 нм, предпочтительно 90-150 нм и более предпочтительно 90-135 нм.
5. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная композиция необязательно содержит агент, регулирующий тоничность; при этом указанный агент, регулирующий тоничность, выбран из хлорида натрия, глюкозы, фосфата и цитрата; предпочтительно агент, регулирующий тоничность, представляет собой хлорид натрия, и указанный хлорид натрия и указанный доцетаксел находятся в массовом отношении (0,75-9):1, предпочтительно (1-7):1, предпочтительно (1,5-4,5):1 и наиболее предпочтительно 2,25:1.
6. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная композиция необязательно содержит регулятор pH.
7. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная композиция представляет собой суспензию; при этом указанная суспензия содержит 2-10 мг/мл, предпочтительно 2-8 мг/мл доцетаксела; указанная суспензия имеет значение pH 3,4-5,8, предпочтительно 3,6-5,6 или 3,8-5,0 и более предпочтительно 3,9-4,8; и указанная суспензия содержит 0-1,8% (масс./об.), предпочтительно 0,45-1,8% (масс./об.) и более предпочтительно 0,9-1,8% (масс./об.) хлорида натрия.
8. Противоопухолевый лиофилизированный порошок, полученный из композиции по п. 7.
9. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная композиция представляет собой лиофилизированный порошок; при этом указанный лиофилизированный порошок содержит хлорид натрия и указанный хлорид натрия и указанный доцетаксел находятся в массовом отношении (0,75-9):1, предпочтительно (1-7):1, предпочтительно (1,5-4,5):1 и наиболее предпочтительно 2,25:1; указанный лиофилизированный порошок получен путем лиофилизации суспензии, содержащей наночастицы доцетаксела-альбумина; и указанная суспензия имеет pH 3,4-5,8, предпочтительно 3,6-5,6 или 3,8-5,0 и более предпочтительно 3,9-4,8.
10. Противоопухолевая восстановленная суспензия, полученная путем восстановления лиофилизированного порошка по п. 8 или композиции по п. 9 при помощи среды для восстановления.
11. Восстановленная суспензия по п. 10, отличающаяся тем, что указанная восстановленная суспензия имеет pH 3,9-4,8; при этом указанная среда для восстановления выбрана из воды для инъекций, раствора хлорида натрия и раствора глюкозы, предпочтительно воды для инъекций.
12. Противоопухолевое лекарственное средство, полученное из композиции по любому из пп. 1-7 и 9, или лиофилизированного порошка по п. 8, или восстановленной суспензии по п. 10, где указанное лекарственное средство находится в клинически приемлемой лекарственной форме.
13. Лекарственное средство по п. 12, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство находится в форме для инъекций и более предпочтительно в форме жидкости для инъекций или в форме лиофилизированного порошка для инъекций.
14. Способ получения композиции, содержащей наночастицы доцетаксела-альбумина по любому из пп. 1-7, или лиофилизированный порошок по п. 8, или восстановленную суспензию по п. 10, включающий следующие стадии:
(1) растворение доцетаксела в органическом растворителе с получением раствора органической фазы;
(2) обеспечение раствора человеческого сывороточного альбумина и добавление гидрохлорида цистеина для доведения значения pH до 3,8-4,7 с получением раствора водной фазы кислотно-денатурированного альбумина, при этом содержание каприлата натрия в человеческом сывороточном альбумине составляет не более 0,08 ммоль/г белка; обеспечение раствора соли, выбранной из хлорида натрия, хлорида калия, сульфата натрия и сульфата магния;
(3) смешивание указанного раствора органической фазы, указанного раствора водной фазы и указанного солевого раствора для загрузки лекарственного средства с получением раствора, загруженного лекарственным средством; и
(4) проведение диализа раствора, загруженного лекарственным средством, с получением композиции, содержащей наночастицы доцетаксела-альбумина.
15. Способ получения по п. 14, отличающийся тем, что
стадия (2) необязательно включает стадию разбавления указанного раствора человеческого сывороточного альбумина водой для инъекций с получением разбавленного раствора альбумина перед добавлением указанной кислоты для регулирования значения pH;
стадия (2) необязательно включает стадию инкубирования после добавления указанной кислоты для регулирования значения pH;
стадия (3) необязательно включает стадию охлаждения после смешивания для загрузки указанного лекарственного средства;
стадия (4) необязательно включает стадию концентрирования указанного раствора, загруженного лекарственным средством, полученного на стадии (3), с получением концентрированного раствора перед проведением диализа;
стадия (4) необязательно включает стадию концентрирования или разбавления после проведения диализа;
после стадии (4) указанный способ необязательно включает стадию (5) стерилизации и фильтрования; и
после стадии (5) указанный способ необязательно включает стадию (6) лиофилизации;
на стадии (1) указанный доцетаксел находится в любой форме, предпочтительно в форме безводного доцетаксела, полугидрата доцетаксела или тригидрата доцетаксела; при этом указанный доцетаксел, в расчете на безводный доцетаксел, и указанный человеческий сывороточный альбумин находятся в массовом отношении 1:(2,0-10,0), предпочтительно 1:(3,0-7,0) и более предпочтительно 1:(4,0-6,0);
альтернативно, на стадии (1) указанный органический растворитель выбран из смешивающегося с водой растворителя, предпочтительно этанола, метанола, ацетона и диметилсульфоксида и более предпочтительно этанола; при этом указанный раствор органической фазы содержит 45-90 мг/мл (в расчете на безводную форму), предпочтительно 45-70 мг/мл (в расчете на безводную форму) доцетаксела.
16. Способ получения по п. 14, отличающийся тем, что на стадии (2) содержание каприлата натрия в указанном растворе человеческого сывороточного альбумина составляет 0,045-0,08 ммоль/г белка;
и указанное значение pH составляет 3,8-4,7 и предпочтительно 4,0-4,5;
альтернативно, на стадии (2) указанное инкубирование относится к нагреванию до 35-42°C, предпочтительно 38-42°C, после добавления указанной кислоты для регулирования указанного значения pH и инкубированию в течение более 30 мин, предпочтительно 30-60 мин;
альтернативно, на стадии (2) соль указанного солевого раствора представляет собой хлорид натрия; при этом указанный солевой раствор имеет концентрацию не менее 2%, предпочтительно 2-35% и более предпочтительно 10-20%;
альтернативно, на стадии (2) указанный разбавленный раствор альбумина представляет собой раствор, содержащий 6-25 мг/мл альбумина, предпочтительно раствор, содержащий 10-20 мг/мл альбумина, более предпочтительно раствор, содержащий 12-18 мг/мл альбумина, и более предпочтительно раствор, содержащий 15 мг/мл альбумина.
17. Способ получения по п. 14, отличающийся тем, что на стадии (3) указанную загрузку лекарственного средства осуществляют в условиях, при которых указанный раствор органической фазы и указанный раствор водной фазы нагревают до 35-42°С, предпочтительно 38-42°С, и указанный раствор органической фазы, указанный раствор водной фазы и указанный солевой раствор смешивают для загрузки указанного лекарственного средства;
альтернативно, на стадии (3) указанное охлаждение относится к охлаждению до комнатной температуры, предпочтительно 0-20°С и более предпочтительно 7-15°С.
18. Способ получения по п. 14, отличающийся тем, что на стадии (4) указанный диализ осуществляют с применением раствора хлорида натрия в качестве диализата; при этом указанный раствор хлорида натрия имеет концентрацию не более 1,8% (масс./об.), предпочтительно 0,45-1,8% (масс./об.) и более предпочтительно 0,9-1,8% (масс./об.);
альтернативно, указанный диализ на стадии (4) осуществляют с применением диализной мембраны с отсечением по молекулярной массе 10-50 кДа, предпочтительно 10-30 кДа и более предпочтительно 10 кДа или 30 кДа;
альтернативно, на стадии (4) диализат, применяемый при указанном диализе, имеет объем, который не менее чем в 3 раза, предпочтительно в 3-10 раз и более предпочтительно в 3-6 раз превышает объем указанного раствора, загруженного лекарственным средством, или указанного концентрированного раствора;
альтернативно, на стадии (4) указанный концентрированный раствор содержит 4-10 мг/мл, предпочтительно 6-10 мг/мл, более предпочтительно 7-9 мг/мл и более предпочтительно 8 мг/мл доцетаксела.
19. Способ получения по п. 14, отличающийся тем, что указанный раствор человеческого сывороточного альбумина на стадии (2) получен в соответствии со следующим способом, включающим: разбавление коммерчески доступного раствора человеческого сывороточного альбумина водой для инъекций или физиологическим раствором с получением разбавленного раствора альбумина; проведение диализа указанного разбавленного раствора альбумина с применением воды для инъекций или физиологического раствора в качестве диализата и частичное удаление каприлата натрия с получением раствора человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия; при этом указанный раствор человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия применяют непосредственно в качестве раствора человеческого сывороточного альбумина на стадии (2) или пропорционально смешивают с раствором человеческого сывороточного альбумина с дополнительным содержанием каприлата натрия с получением желаемого содержания, а затем применяют в виде раствора человеческого сывороточного альбумина на стадии (2).
20. Способ получения по п. 19, отличающийся тем, что указанный раствор человеческого сывороточного альбумина разбавляют с коэффициентом разбавления не менее 4, предпочтительно 4-7;
альтернативно, указанный диализ осуществляют с применением диализной мембраны с отсечением по молекулярной массе 10-50 кДа, предпочтительно 10-30 кДа и более предпочтительно 10 кДа или 30 кДа; при этом указанный диализат имеет объем, который более чем в 3 раза, предпочтительно в 3-10 раз и более предпочтительно в 3-6 раз превышает объем указанного разбавленного раствора альбумина;
альтернативно, указанный раствор человеческого сывороточного альбумина с низким содержанием каприлата натрия содержит каприлат натрия в количестве менее 0,16 ммоль/г белка, предпочтительно менее 0,12 ммоль/г белка, предпочтительно менее 0,10 ммоль/г белка и предпочтительно менее 0,08 ммоль/г белка.
21. Противоопухолевая композиция, содержащая наночастицы доцетаксела-альбумина, где указанная композиция содержит доцетаксел и кислотно-денатурированный альбумин; и при этом указанный кислотно-денатурированный альбумин получен путем добавления гидрохлорида цистеина к человеческому сывороточному альбумину для доведения pH до подходящего значения и последующей денатурации; при этом подходящее значение pH составляет 3,8-4,7; при этом содержание каприлата натрия в человеческом сывороточном альбумине составляет не более 0,08 ммоль/г белка, причем композиция получена способом по любому из пп. 14-20.
22. Противоопухолевое лекарственное средство, полученное из композиции, содержащей наночастицы доцетаксела-альбумина, по п. 21.
| CN 101361731 A, 11.02.2009 | |||
| CN 103202812 A, 17.07.2013 | |||
| CN 106420665 B, 16.04.2019 | |||
| ОЧИЩЕННЫЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ НАНОЧАСТИЦЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ | 2015 |
|
RU2706735C2 |
| HARM S | |||
| et al | |||
| Removal of stabilizers from human serum albumin by adsorbents and dialysis used in blood purification PLoS One, 2018 Jan 24;13(1):e0191741, [онлайн], [найдено 06.09.2024] | |||
| Найдено в PubMed, PMID: 29364955, doi: | |||
