Область техники
[0001] Настоящее изобретение относится к области биомедицины и, в частности, к медицинскому продукту, содержащему человеческий альбумин, и способу его получения. Согласно настоящему изобретению термин «человеческий альбумин» включает человеческий сывороточный альбумин и рекомбинантный человеческий альбумин. Рекомбинантный человеческий альбумин также называется рекомбинантным человеческим сывороточным альбумином или мутантным рекомбинантным человеческим альбумином. Уровень техники
[0002] Основные фармакологические эффекты человеческого альбумина включают регуляцию динамического равновесия воды между тканями и кровеносными сосудами, поддержание нормального и постоянного объема плазмы крови и транспорт конкретных ионов и соединений путем обратимого связывания с ними благодаря высокой аффинности в отношении указанных веществ. Более того, человеческий альбумин обеспечивает большой запас аминокислот для организма. Упомянутые выше эффекты человеческого альбумина позволяют использовать его в различных клинических отраслях для различных терапевтических целей. Человеческий альбумин главным образом применяется в клинической практике для регулирования коллоидно-осмотического давления плазмы, увеличения объема крови, лечения травматического и геморрагического шока, тяжелых ожогов и гиперпротеинемии и широко используется для лечения распространенных заболеваний, таких как инсульт, цирроз и печеночные асциты, а также заболевания почек. Помимо непосредственного применения в области клинической терапии альбумин крайне широко использовался во многих продуктах, таких как культуральные среды, используемые для получения вакцин, фармацевтические наполнители, диагностические реагенты, новые лекарственные продукты длительного действия для лечения опухолей, косметические средства и лабораторные биореагенты.
[0003] Человеческий альбумин представляет собой одноцепочечный негликозилированный белок с сердцевидной структурой и молекулярной массой 66,438 Да, состоящий из 585 аминокислот, 17 пар дисульфидных мостиков и одной свободной сульфгидрильной группой. Период его полувыведения у человека составляет между 19 и 21 днем. Сердцевидная структура человеческого альбумина состоит из трех основных доменов, которые непрочно связаны между собой с помощью ван-дер-ваальсовых сил, и шести субдоменов, окруженных 17 дисульфидными мостиками, как видно из его кристаллической структуры. Дисульфидные мостики придают жесткость спиральной глобулярной структуре, но обеспечивают достаточную подвижность, позволяющую белку претерпевать конформационные изменения в ответ на изменения в окружающей среде.
[0004] Человеческий альбумин обычно получают с помощью фракционирования, экстрагирования и очистки из сыворотки крови человека и в общем называют человеческим сывороточным альбумином. Человеческий сывороточный альбумин был открыт и использовался в течение многих лет, при этом были разработаны полноценные и хорошо развитые процессы его получения и приготовления лекарственной формы (метод Кона -ультрафильрация или очистка - пастеризация - получение лекарственной формы (добавление каприлата натрия и/или N-ацетилтриптофана)). Его лекарственная форма стала общим стандартом для национальных фармакопей по всему миру. Альбумин, происходящий из сыворотки крови человека, характеризуется хорошей стабильностью. В соответствии с фармакопейными требованиями, конечный продукт должен храниться на водяной бане при температуре 57°С±0,5°С в течение 50 часов, при этом не должно наблюдаться визуальных изменений, за исключением слабого изменения цвета. Все конечные продукты происходящего из сыворотки альбумина должны храниться при температуре 20-25°С в течение по меньшей мере 4 недель или при температуре 30-32°С в течение по меньшей мере 14 дней. Контейнеры, в которых наблюдается помутнение или дымчатый осадок, должны подвергаться соответствующим исследованиям. Несмотря на проведение такого жесткого исследования термостабильности человеческого сывороточного альбумина, флебит, связанный с микроагрегатами и белковыми фибриллярными агрегатами, все еще встречается в клинической практике. Клинические исследования показали, что частота встречаемости флебита у пациентов составляет 20% при применении обычных систем для инфузии, включающих использование фильтров с размером пор 15 мкм для внутривенной инфузии человеческого сывороточного альбумина, но только 2,5% при применении прицельных инфузионных систем с использованием фильтров с размером пор 5 мкм. В связи с этим было продемонстрировано, что после стерилизации и удаления частиц путем фильтрования через фильтр с размером пор 0,1-0,22 мкм в процессе получения человеческого сывороточного альбумина новые микроагрегаты и микрофибриллярные белки все же появляются в медицинском продукте во время транспортировки и хранения, что приводит к большому проценту вызванного инфузией альбумина флебита у пациентов (Xiao-Ping Xue et al., Journal of Clinical Nursing, 2010 Oct, 9(5): 69-70). Таким образом, требования для прицельных инфузионных систем указаны в спецификациях человеческого сывороточного альбумина некоторых производителей. Тем не менее, упомянутый выше частично нестабильный альбумин имеет диаметр 30-100 нм и поэтому не может быть эффективно удален с помощью обычных мембран для стерилизации (0,1-0,22 мкм). Агрегаты с указанным диаметром, размер которых находится между размерами полимеров и видимых частиц, являются основной причиной неблагоприятных реакций, таких как иммуногенность.
[0005] Другим источником человеческого альбумина является рекомбинантный человеческий альбумин, который экспрессируется в организме хозяина, способного к специфичной экспрессии человеческого альбумина, такого как Pichia pastoris или Saccharomyces cerevisiae - одноклеточные грибковые микроорганизмы, культивируемые с использованием методов генетической рекомбинации, или рекомбинантный человеческий альбумин, экспрессируемый трансгенным рисом. Однако высокоочищенный конечный продукт рекомбинантного человеческого альбумина, соответствующий требованиям к составам, указанным в фармакопеях, намного менее стабилен по сравнению с альбумином, происходящим из сыворотки крови человека. С учетом указанного недостатка в заявке на китайский патент (заявка номер CN 201610017874.7) был описан способ предотвращения образования агрегатов рекомбинантного человеческого альбумина путем добавления Tween 80 или Tween 20 в стандартную лекарственную форму согласно фармакопее.
[0006] S. Baldursdottir et al. был описан стабилизирующий эффект вспомогательного вещества полисорбата 80 (Tween 80) в растворах рекомбинантного человеческого альбумина. Отмечалось, что наполнители каприлат и полисорбат 80, применяемые в лекарственной форме Recombumin Alpha®, приводили к повышению стабильности белка. Каприлат казался эффективным в защите белка при более высоких температурах, тогда как полисорбат (Tween) защищал белок от самоассоциации при более низких температурах. Кроме того, наблюдался нелинейный синергический эффект каприлата и полисорбата 80 (S. Baldursdottir, М. Tauhaybeche, J. Pajander, J.Т. Bukrinski, L. Jorgensen, Screening of formulation parameters for stabilizing recombinant human serum albumin (rHSA) in liquid formulations, Journal of Drug Delivery Science and Technology (2016), doi: 10.1016/j.jddst.2016.05.001.)
[0007] Отрицательный эффект полисорбата заключается в повышении вероятности окисления белка, катализируемого остаточными алкилоксидами в неионном поверхностно-активном веществе. Например, рекомбинантный человеческий цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) может подвергаться димеризации под действием алкилпероксида из полисорбата 80. Содержание алкилпероксидов в полисорбате 80 коррелирует с уровнем окисления рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (r hG-CSF), и опосредованное пероксидом окисление по-видимому является более сильным по сравнению с окислением, опосредованным атмосферным кислородом, присутствующим в воздушном пространстве ампулы (Knepp VM, Whatley JL, Muchnik A, Calderwood TS. 1996. Identification of antioxidants for prevention of peroxide-mediated oxidation of recombinant human ciliary neurotrophic factor and recombinant human nerve growth factor. PDA J Pharm Sci Technol 50(3): 163-171; Herman AC, Boone TC, Lu HS. 1996. Characterization, preparation, and stability of Neupogen (Filgrastim), a recombinant human granulocyte-colony stimulating factor. Pharm. Biotechnol. 9:303 328).
[0008] Человеческий альбумин содержит метионин и свободную сульфгидрильную группу для защиты клеток и органов от повреждений в результате перекисного окисления свободными радикалами. Таким образом, качество и условия хранения полисорбата должны хорошо регулироваться, и его относительное количество в белках должно поддерживаться на минимальном уровне (AGGREGATION OF THERAPEUTIC PROTEINS, P341, Edited by Wei Wang, Christopher J. Roberts, WILEY 2010), в противном случае человеческий альбумин будет частично окисляться, утрачивая соответствующую окислительно-восстановительную физиологическую активность; при этом окисленный человеческий альбумин будет способствовать дополнительному разворачиванию человеческого альбумина, ускоряя его агрегацию и фибриллирование.
[0009] Одной из очень важных физиологических функций человеческого альбумина в кровотоке является транспорт лекарственных средств, жирных кислот, витаминов, цитохромов и ионов металлов, основанный на его способности связывать лиганды. [0010] Жирные кислоты, как лиганды человеческого альбумина, играют решающую роль в структуре и термостабильности человеческого альбумина. Добавление каприлата натрия к человеческому сывороточному альбумину в качестве стабилизатора лиганда может приводить к эффективному повышению значения энтальпии и Тт (температуры плавления), усиливая таким образом термостабильность.
[0010] Brian et al. было описано применение дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) для определения способности к разворачиванию коммерческих продуктов человеческого альбумина, полученных из пула человеческой крови, трансгенных дрожжей и трансгенного риса. После добавления олеиновой кислоты исходные значения температуры плавления (Tm1) для конформационных переходов с разворачиванием продуктов человеческого альбумина по-разному повышались от 62°С до 75°С. Это исследование показало важность лигандов, представляющих собой жирные кислота, для термостабильности человеческого альбумина, однако агрегация и фибриллирование, вызванные экспонированием гидрофобного участка белка, не исследовались, и ДСК не позволяла охарактеризовать агрегацию и фибриллирование при низкой температуре и температурах окружающей среды, а также в условиях колебаний во время транспортировки (Brian Е. Lang and Kenneth D. Cole, Biotechnol. Prog., 2014, Unfolding Properties of Recombinant Human Serum Albumin Products Are Due To Bioprocessing Steps, DOI 10.1002/btpr.l996).
[0012] Помимо жирных кислот существуют дополнительные лиганды, такие как билирубин, гормоны, жирорастворимые лекарственные средства и тем, которые прочно связываются с альбумином сыворотки крови человека, повышая конформационную стабильность альбумина. Обезжиренный альбумин сыворотки крови человека обладает значительно сниженной стабильностью, что полностью согласуется с данными для высокоочищенного рекомбинантного человеческого альбумина.
[0013] Поверхностно-активные вещества, такие как Tween, при применении в качестве стабилизаторов должны добавляться в минимально возможном количестве во избежание их токсических эффектов и, что более важно, для подавления взаимного наложения эффектов Tween и других поверхностно-активных веществ, обладающих физиологическими свойствами лигандов человеческого альбумина. В противном случае следует искать более безопасные поверхностно-активные вещества с более низкими дозами.
[0014] Полоксамер представляет собой родовое название сополимеров полиоксиэтилена и полиоксипропилена. Полоксамеры, производимые компанией BASF в Германии и известные под торговым названием Pluronic, представляют собой неионные поверхностно-активные вещества. Полоксамеры представляют собой исключительно синтетические эмульгаторы, используемые в настоящее время в эмульсиях для внутривенного введения, из которых полоксамер 188 обладает наилучшей эмульгирующей способностью и безопасностью, являясь эмульгатором типа «масло в воде», который обычно применяется в концентрации, составляющей 0,3% (Wang Meng et al., Pharmaceutical and Clinical Research. 2007, 15(1): 10-13).
[0015] В качестве неионного поверхностно-активного вещества полоксамер 188 может повышать растворимость нерастворимых лекарственных средств путем образования мицелл с критической концентрацией мицелл (ККМ), составляющей примерно 0,6%. Полоксамер 188 может подавлять тромбоз, влиять на реологическую активность крови, уплотнение клеточных мембран, активацию фагоцитов (стимулированный фагоцитоз и продукция сверхотрицательных ионов) и дегрануляцию нейтрофилов и предотвращать некроз скелетных мышц у взрослых. Кроме того, полоксамер 188 можно применять для лечения повреждения мозга. Исследования показали, что полоксамер 188 может снижать воспаление и повреждение тканей у крыс, вызванное экспериментальным повреждением мозга. Более того, данные на других экспериментальных моделях показали, что он противодействует повреждению тканей. Его защитный механизм может относиться к эффектам поверхностно-активного вещества, влияющим на окислительный стресс и воспалительную реакцию. Более того, полоксамер 188 может усиливать выживаемость клеток. Исследования показали, что одна внутривенная доза полоксамера 188 является эффективной для восстановления поврежденных тканей при интактном кровообращении. Полоксамер 188 способен стабилизировать дефекты в клеточных мембранах, вызванные различными причинами. Исследования на крысах показали, что одна доза полоксамера 188 противодействует раннему нейрональному повреждению после кровотечения, но является неэффективной в случае нейронального повреждения, вызванного продолжительным кровотечением. Однако ежедневное введение полоксамера 188 может создавать длительную и эффективную защиту нейронов.
[0016] В заявке на китайский патент номер CN 200480003079.8 описано применение полоксамера в качестве поверхностно-активного вещества для стабилизации гемопоэтических факторов, паратиреоидных гормонов или антител. В данном патенте для жирных кислот не наблюдали эффекта лиганда в отношении белков, поэтому добавляли более высокую дозу полоксамера для стабилизации белков и во избежание окислительного повреждения, опосредованного Tween. Поскольку гемопоэтические факторы, паратиреоидные гормоны или антитела содержатся в препаратах для инъекций в небольшом объеме (мкг-мг/ампула), общее содержание полоксамера является незначительным даже в случае добавления его более высоких концентраций. Однако человеческий альбумин содержится в препаратах для инъекций в большом объеме с инъекционной дозой 5-12,5 г/ампула, таким образом, общее содержание Tween или полоксамера больше даже в случае добавления их в небольшой концентрации.
[0017] Таким образом, специалисты в данной области техники заинтересованы в исследовании медицинского продукта, содержащего человеческий альбумин, или способа его получения для подавления образования агрегатов и фибриллярных микрочастиц человеческого альбумина и для повышения безопасности и переносимости человеческого альбумина в клиническом применении с предотвращением токсичности, опосредованной Tween, и окислительной денатурации белков, вызванной оксидами Tween, присутствующими в лекарственных формах, описанных в публикациях.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0018] Техническая задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, представляет собой повышение стабильности препаратов человеческого альбумина.
[0019] Для решения поставленной технической задачи в настоящем изобретении предложен способ получения медицинского продукта, содержащего человеческий альбумин, включающий: повышение стабильности человеческого альбумина в медицинском продукте путем регулирования содержания длинноцепочечных жирных кислот в указанном медицинском продукте и добавления полоксамера к указанному медицинскому продукту.
[0020] Предпочтительно, способ дополнительно включает: повышение стабильности человеческого альбумина в медицинском продукте путем снижения агрегации и фибриллирования человеческого альбумина.
[0021] Предпочтительно, способ дополнительно включает: повышение стабильности человеческого альбумина в медицинском продукте таким образом, чтобы не происходило образования частиц диаметром более 30 нм в результате агрегации и/или фибриллирования человеческого альбумина после получения медицинского продукта.
[0022] Предпочтительно, способ дополнительно включает: повышение стабильности человеческого альбумина в медицинском продукте таким образом, чтобы не происходило образования частиц диаметром более 100 нм в результате агрегации и/или фибриллирования человеческого альбумина после получения препарата.
[0023] Предпочтительно, способ дополнительно включает: повышение стабильности человеческого альбумина в медицинском продукте таким образом, чтобы не происходило образования частиц диаметром более 200 нм в результате агрегации и/или фибриллирования человеческого альбумина после получения препарата.
[0024] Предпочтительно, способ дополнительно включает: повышение стабильности человеческого альбумина в медицинском продукте таким образом, чтобы стабильность отвечала требованиям в соответствии с национальными фармакопеями.
[0025] Предпочтительно, способ дополнительно включает: повышение стабильности человеческого альбумина в медицинском продукте таким образом, чтобы стабильность удовлетворяла следующим условиям: отсутствие помутнения или образования видимых частиц во время инкубирования при 57°С в течение 50 часов, инкубирования при 30°С в течение 14 дней и инкубирования при 20°С в течение 28 дней.
[0026] Предпочтительно, человеческий альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин, и указанный способ включает: повышение стабильности человеческого альбумина в медицинском продукте путем добавления полоксамера.
[0027] Предпочтительно, человеческий альбумин представляет собой рекомбинантный человеческий альбумин, и указанный способ включает: повышение стабильности человеческого альбумина в медицинском продукте путем добавления длинноцепочечных жирных кислот и полоксамера.
[0028] Предпочтительно, длинноцепочечную кислоту добавляют в виде соли.
[0029] Предпочтительно, длинноцепочечную кислоту добавляют в виде соли натрия.
[0030] Предпочтительно, способ дополнительно включает следующее условие: после получения медицинского продукта молярное отношение длинноцепочечных жирных кислот и человеческого альбумина составляет 0,2-3,0.
[0031] Предпочтительно, способ дополнительно включает следующее условие: после получения медицинского продукта молярное отношение длинноцепочечных жирных кислот и человеческого альбумина составляет 0,3-2,0.
[0032] Предпочтительно, способ дополнительно включает следующее условие: после получения медицинского продукта содержание полоксамера составляет 10-500 мкг/г человеческого альбумина.
[0033] Предпочтительно, полоксамер представляет собой один или более полоксамеров, выбранных из полоксамера 124, полоксамера 188, полоксамера 237, полоксамера 338 и полоксамера 407.
[0034] Предпочтительно, полоксамер представляет собой полоксамер 188.
[0035] Предпочтительно, длинноцепочечная жирная кислота представляет собой одну или более кислот, выбранных из миристиновой кислоты (С14:0), пальмитиновой кислоты (С16:0), стеариновой кислоты (С18:0), олеиновой кислоты (С18:1), линолевой кислоты (С18:2), линоленовой кислоты (С18:3) и арахидоновой кислоты (С20:4).
[0036] Предпочтительно, длинноцепочечная жирная кислота представляет собой соевую жирную кислоту или полностью гидрогенизированную соевую жирную кислоту.
[0037] Предпочтительно, способ дополнительно включает: добавление ингредиентов в количествах в соответствии с национальными фармакопеями.
[0038] Предпочтительно, ингредиенты, требуемые в соответствии с национальными фармакопеями, включают каприлат натрия и/или N-ацетилтриптофан.
[0039] Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен медицинский продукт, содержащий человеческий альбумин, полученный в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.
[0040] Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен медицинский продукт, содержащий человеческий альбумин, который не содержит частиц диаметром более 30 нм, образованных в результате агрегации и/или фибриллирования человеческого альбумина.
[0041] Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен медицинский продукт, содержащий человеческий альбумин, который не содержит частиц диаметром более 100 нм, образованных в результате агрегации и/или фибриллирования человеческого альбумина.
[0042] Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен медицинский продукт, содержащий человеческий альбумин, который не содержит частиц диаметром примерно 200 нм, образованных в результате агрегации и/или фибриллирования человеческого альбумина.
[0043] Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен медицинский продукт, содержащий человеческий альбумин, где указанный способ дополнительно включает следующее условие: стабильность человеческого альбумина в медицинском продукте удовлетворяет следующим требованиям: отсутствие помутнения или образования видимых частиц во время инкубирования при 57°С в течение 50 часов, инкубирования при 30°С в течение 14 дней и инкубирования при 20°С в течение 28 дней.
[0044] Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен медицинский продукт, содержащий человеческий альбумин, который содержит полоксамер и длинноцепочечные жирные кислоты.
[0045] Предпочтительно молярное отношение длинноцепочечных жирных кислот и человеческого альбумина в медицинском продукте составляет 0,2-3,0.
[0046] Предпочтительно молярное отношение длинноцепочечных жирных кислот и человеческого альбумина в медицинском продукте составляет 0,3-2,0.
[0047] Предпочтительно способ дополнительно включает следующее условие: содержание полоксамера в медицинском продукте составляет 10-500 мкг/г человеческого альбумина.
[0048] Предпочтительно полоксамер представляет собой один или более полоксамеров, выбранных из полоксамера 124, полоксамера 188, полоксамера 237, полоксамера 338 и полоксамера 407.
[0049] Предпочтительно полоксамер представляет собой полоксамер 188.
[0050] Длинноцепочечная жирная кислота предпочтительно представляет собой одну или более кислот, выбранных из миристиновой кислоты (С 14:0), пальмитиновой кислоты (С16:0), стеариновой кислоты (С18:0), олеиновой кислоты (С18:1), линолевой кислоты (С18:2), линоленовой кислоты (С18:3) и арахидоновой кислоты (С20:4).
[0051] Длинноцепочечная жирная кислота предпочтительно представляет собой соевую жирную кислоту или полностью гидрогенизированную соевую жирную кислоту.
[0052] Предпочтительно медицинский продукт дополнительно содержит ингредиенты в количествах в соответствии с национальными фармакопеями.
[0053] Предпочтительно указанные ингредиенты, требуемые в соответствии с национальными фармакопеями, включают каприлат натрия и/или N-ацетилтриптофан.
[0054] Настоящее изобретение направлено на повышение стабильности человеческого альбумина на основе снижения термической денатурации путем применения лигандов, представляющих собой жирные кислоты, где стабильность улучшают путем снижения агрегации и фибриллирования при низкой температуре, температуре окружающей среды и высокой температуре или во время колебаний при транспортировке на основе применения полоксамера в качестве гидрофобных «заплат», экранирующих гидрофобные взаимодействия и межповерхностные гидрофобные взаимодействия. Диаметр таких агрегатов и фибриллярных частиц составляет 30-300 нм, главным образом, между 100 и 200 нм, что не позволяет выявлять их с помощью анализа на основе эксклюзионной ВЭЖХ, а также эффективно отфильтровывать с помощью мембранных систем с размером пор 0,1-0,2 мкм и, что более важно, такие агрегаты непрерывно образуются в нестабильных системах раствора альбумина (даже если агрегаты и фибриллярные частицы были полностью удалены) во время хранения и транспортировки и продолжают расти с образованием видимых частиц, имеющих диаметр микронного и субмиллиметрового диапазона.
[0055] Для обеспечения подавления агрегации и фибриллирования человеческого альбумина при различных условиях авторы настоящего изобретения провели чрезвычайно подробные исследования для анализа альбумина из плазмы крови человека. Было обнаружено, что от 0,3 до 0,8 моль длинноцепочечных жирных кислот содержится в каждом моле альбумина из плазмы крови человека. В то же время, от 0,5 до 2,5 моль длинноцепочечных жирных кислот содержится в каждом моле человеческого альбумина, циркулирующего в организме человека, для обеспечения физиологических функций мобилизации и хранения жирных кислот. асть длинноцепочечных жирных кислот теряется в процессе очистки во время получения альбумина из пула крови человека. В соответствии с томом III Китайской фармакопеи издания 2015 г., 0,140-0,180 ммоль каприлата натрия добавляют к пастеризованному медицинскому продукту на 1 г альбумина; или используют каприлат натрия вместе с ацетилтриптофаном, при этом добавляют 0,064-0,096 ммоль каприлата натрия и 0,064-0,096 ммоль ацетилтриптофана на 1 г альбумина. В то же время, являясь препаратом для инъекции в большом объеме, медицинский продукт должен соответствовать физиологическим условиям организма человека. Значение рН должно составлять 6,4-7,4, и осмоляльность должна составлять 210-400 мОсм/кг.
[0056] Независимо от того, каким образом экспрессируется рекомбинантный человеческий альбумин, многоэтапный процесс очистки, включая фракционирование, хроматографию, ультрафильтрование и диализ и т.д., требуется для полного удаления белков, полисахаридов, эндотоксинов и различных примесей, попадающих из организма хозяина, в то же время лиганды, представляющие собой жирные кислоты, также полностью удаляются, что приводит к получению обезжиренного человеческого альбумина. Таким образом, стабильность рекомбинантного человеческого альбумина, утратившего жирные кислоты или различные другие лиганды, присутствующие в организме человека, значительно ниже стабильности альбумина, происходящего из плазмы крови человека. Таким образом, некоторое количество поверхностно-активных веществ должно добавляться в концентрации ниже ККМ для выполнения функции гидрофобной «заплатки» для альбумина в отсутствие лигандов для предотвращения агрегации после разворачивания в результате взаимодействий на различных гидрофобных поверхностях контакта, таких как альбумин/воздух/контейнер/пузырьки воздуха, образующиеся в результате колебаний, и т.д.
[0057] Таким образом, на основе Общих требований для препаратов и человеческого сывороточного альбумина согласно Китайской фармакопее, Американской фармакопее, Европейской фармакопее и другим фармакопеям, определенное количество полоксамера добавляют к продукту и отношение длинноцепочечных жирных кислот доводят согласно настоящему изобретению таким образом, чтобы обеспечить соответствие требованиям по стабильности человеческого альбумина при условиях, указанных в каждой национальной фармакопее.
[0058] Преимуществом настоящего изобретения является то, что непосредственное добавление лигандов, представляющих собой длинноцепочечные жирные кислоты, с обеспечением соотношения, характерного для кровотока в организме человека, вместе с небольшим количеством полоксамера или применение существующих стандартных лекарственных форм человеческого альбумина с добавлением дополнительного небольшого количества полоксамера приводит к термостабильности человеческого альбумина и отсутствию агрегации и фибриллирования во время хранения и транспортировки. Диаметр таких агрегатов и фибриллярных частиц составляет 50-300 нм, главным образом, между 100-200 нм, что не позволяет выявлять их с помощью анализа с использованием эксклюзионной ВЭЖХ, а также эффективно отфильтровывать с помощью мембранных систем с размером пор 0,1-0,2 мкм и, что более важно, такие агрегаты постоянно образуются в нестабильных системах раствора альбумина (даже если агрегаты были полностью удалены) во время хранения и транспортировки и продолжают расти с образованием видимых частиц с диаметром микронного и субмиллиметрового диапазона.
[0059] Идея, специфическая структура и итоговые технические эффекты настоящего изобретения будут дополнительно описаны далее в настоящей заявке вместе с сопутствующими графическими материалами для обеспечения полного понимания цели, признаков и эффектов настоящего изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0060] Фиг. 1 представляет собой хроматограмму по результатам хроматографии с использованием динамического рассеяния света (ДРС-хроматограмму) образца 1 (человеческий сывороточный альбумин, содержащий каприлат натрия и ацетилтриптофан) согласно варианту реализации изобретения 1.
[0061] Фиг. 2 представляет собой ДРС-хроматограмму образца 2 (человеческий сывороточный альбумин, содержащий каприлат натрия и ацетилтриптофан с добавлением полоксамера) согласно варианту реализации изобретения 1.
[0062] Фиг. 3 представляет собой ДРС-хроматограмму образца 3 (коммерческий человеческий сывороточный альбумин, содержащий только каприлат натрия) согласно варианту реализации изобретения 2.
[0063] Фиг. 4 представляет собой ДРС-хроматограмма образца 4 (коммерческий человеческий сывороточный альбумин, содержащий только каприлат натрия с добавлением полоксамера) согласно варианту реализации изобретения 2.
[0064] Фиг. 5 представляет собой ДРС-хроматограмму образца 5 (рекомбинантный человеческий альбумин, содержащий каприлат натрия и ацетилтриптофан без добавления полоксамера или длинноцепочечных жирных кислот) согласно варианту реализации изобретения 3.
[0065] Фиг. 6 представляет собой ДРС-хроматограмму образца 6 (рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин, содержащий каприлат натрия и ацетилтриптофан с добавлением только длинноцепочечной жирной кислоты (олеиновой кислоты)) согласно варианту реализации изобретения 4.
[0066] Фиг. 7 представляет собой ДРС-хроматограмму образца 7 (рекомбинантный человеческий альбумин, содержащий каприлат натрия и ацетилтриптофан с добавлением только полоксамера) согласно варианту реализации изобретения 5.
[0067] Фиг. 8 представляет собой ДРС-хроматограмму образца 8 (рекомбинантный человеческий альбумин, содержащий каприлат натрия и ацетилтриптофан с добавлением полоксамера и длинноцепочечной жирной кислоты (олеиновой кислоты)) согласно варианту реализации изобретения 6.
[0068] Фиг. 9 представляет собой ДРС-хроматограмму образца 9 (рекомбинантный человеческий альбумин, содержащий каприлат натрия и ацетилтриптофан с добавлением полоксамера и длинноцепочечной жирной кислоты (соят натрия)) согласно варианту реализации изобретения 7.
[0069] Фиг. 10 представляет собой ДРС-хроматограмму образца 10 (рекомбинантный человеческий альбумин, содержащий каприлат натрия и ацетилтриптофан с добавлением полоксамера и длинноцепочечных жирных кислот (смесь стеарата натрия и олеата натрия)) согласно варианту реализации изобретения 8.
[0070] Фиг. 11 представляет собой ДРС-хроматограмму образца 11 (рекомбинантный человеческий альбумин, содержащий каприлат натрия с добавлением полоксамера и длинноцепочечных жирных кислот (смесь стеарата натрия и олеата натрия)) согласно варианту реализации изобретения 9.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0071] Варианты реализации настоящего изобретения проиллюстрированы далее с помощью конкретных примеров. Другие преимущества и эффекты настоящего изобретения будут хорошо понятны специалисту в данной области техники на основе описания, приведенного в заявке. Изобретение также можно реализовывать или применять в соответствии с другими различными вариантами реализации. Детали, приведенные в настоящей заявке, также можно модифицировать или изменять различным образом в соответствии с различными намерениями и применениями в пределах сущности настоящего изобретения. Следует отметить, что следующие далее варианты реализации изобретения и признаки указанных вариантов реализации изобретения можно объединять друг с другом при отсутствии противоречий.
[0072] Далее следуют определения и объяснение терминов, используемых в настоящей заявке.
[0073] Термин «человеческий альбумин» означает человеческий сывороточный альбумин или рекомбинантный человеческий альбумин, где указанный рекомбинантный человеческий альбумин также называется рекомбинантным человеческим сывороточным альбумином или мутантным рекомбинантным человеческим альбумином. Рекомбинантный человеческий альбумин включает по меньшей мере человеческий альбумин, происходящий из микроорганизма с генетической рекомбинацией, рекомбинантный человеческий альбумин из эукариотической клетки, рекомбинантный человеческий альбумин из трансгенного растения и рекомбинантный человеческий альбумин из трансгенного животного и т.д.
[0074] Следует понимать, что термин «медицинский продукт» включает по меньшей мере продукт в виде раствора, продукт, полученный в результате замораживания-высушивания, или продукт, полученный в результате низкотемпературного распыления-высушивания, предпочтительно, продукт в виде раствора, который, как правило, помещают в асептических условиях в стеклянный или пластиковый контейнер определенного объема.
[0075] Следует понимать, что термин «медицинский продукт, содержащий человеческий альбумин», означает медицинские продукты для клинических инъекций, культуральных сред, наполнителей лекарственных средств, медицинских устройств, наполнителей вакцин, косметических продуктов, аналитических диагностических реагентов и многих других продуктов, содержащих человеческий альбумин в различной концентрации, например, в концентрации, составляющей 1%-30%, предпочтительно, 10%-25%.
[0076] Полоксамер представляет собой неионное поверхностно-активное вещество блок-сополимер этиленоксида и 1,2-эпоксипропана с общей формулой Н(С2Н4О) а(С3Н6О) b(C2H4O) аОН. Полоксамер 188 обладает высокой степенью биобезопасности и входит в список эмульгаторов для жировых эмульсий для внутривенного введения и стабилизаторов для инъекций антител в соответствии с Китайской фармакопеей издания 2015 г., Фармакопеей США и Европейской фармакопеей и для применения в одобренных лекарственных средствах.
[0077] Следует понимать, что термин «длинноцепочечные жирные кислоты» относится к жирным кислотам, содержащим более 12 атомов углерода в углеводородной цепи, и означает жирные кислоты различного происхождения (синтетические или выделенные), которые являются приемлемыми для человека, или жирные кислоты, присутствующие в различных формах (например, солей, в частности, солей натрия), включая, но не ограничиваясь указанными, одну или более из миристиновой кислоты (С14:0), пальмитиновой кислоты (С16:0), стеариновой кислоты (С18:0), олеиновой кислоты (С18:1), линолевой кислоты (С18:2), линоленовой кислоты (С18:3) и арахидоновой кислоты (С20:4).
[0078] Термин «регулирование» по отношению к содержанию длинноцепочечной жирной кислоты в медицинском продукте, содержащем человеческий альбумин, означает поддержание содержания длинноцепочечных жирных кислот в медицинском продукте, содержащем человеческий альбумин, в пределах данного диапазона: в случае длинноцепочечных жирных кислот, характерных для содержащего человеческий альбумин медицинского продукта, полученного с помощью существующих способов (такого как медицинский продукт, содержащий человеческий альбумин, происходящий их крови человека), если содержание длинноцепочечных жирных кислот ниже данного диапазона, «регулирование» означает добавление длинноцепочечных жирных кислот в процессе получения указанного медицинского продукта, содержащего человеческий альбумин, таким образом, чтобы количество длинноцепочечных жирных кислот в конечном медицинском продукте, содержащем человеческий альбумин, находилось в пределах данного диапазона; если содержание длинноцепочечных жирных кислот уже находится в пределах данного диапазона, «регулирование» означает, что никаких действий не требуется в процессе получения указанного медицинского продукта, содержащего человеческий альбумин; если медицинский продукт, содержащий человеческий альбумин, полученный с помощью существующего способа, не содержит или содержит очень малое количество длинноцепочечных жирных кислот, «регулирование» означает добавление длинноцепочечных жирных кислот в процессе получения указанного медицинского продукта, содержащего человеческий альбумин, таким образом, чтобы содержание указанных длинноцепочечных жирных кислот в конечном медицинском продукте, содержащем человеческий альбумин, находилось в пределах данного диапазона.
[0079] Следует понимать, что термин «длинноцепочечные жирные кислоты» представляет собой устоявшуюся фразу, где отсутствует логическая связь между наличием заместителя «О-R» в указанной жирной кислоте и содержанием указанной фразы. В случае расчета содержания «длинноцепочечных жирных кислот» термин «длинноцепочечные жирные кислоты» относится к сумме значений количества каждой длинноцепочечной жирной кислоты. Для обеспечения содержания длинноцепочечных жирных кислот в пределах данного диапазона можно добавлять любую длинноцепочечную кислоту или смесь длинноцепочечных жирных кислот.
[0080] Следует понимать, что термин «содержание длинноцепочечных жирных кислот» означает содержание длинноцепочечных жирных кислот в конечном медицинском продукте, содержащем человеческий альбумин, включая количество остающихся длинноцепочечных жирных кислот в ходе процесса получения благодаря наличию длинноцепочечных жирных кислот, характерных для материала-источника, и количество дополнительно добавленных длинноцепочечных жирных кислот (если имеет место добавление в процессе «регулирования»).
[0081] Следует понимать, что термин «добавлять» при использовании по отношению к полоксамеру, означает добавление полоксамера в процессе получения медицинского продукта, содержащего человеческий альбумин, таким образом, чтобы содержание указанного полоксамера в конечном медицинском продукте, содержащем человеческий альбумин, находилось в пределах данного диапазона.
[0082] Следует понимать, что этапы «регулирования» и «добавления» осуществляют в процессе получения медицинского продукта, содержащего человеческий альбумин, таким образом, что содержание длинноцепочечных жирных кислот и содержание полоксамера в конечном медицинском продукте, содержащем человеческий альбумин, находятся в пределах данного диапазона. Например, указанные этапы можно осуществлять после получения конечной нерасфасованной лекарственной формы, или указанные этапы можно осуществлять на стадии процессов ультрафильтрации и диализа, или полоксамер и длинноцепочечные жирные кислоты можно добавлять в качестве стабилизатора белка до процесса пастеризации, или указанные этапы можно осуществлять на последней одной или нескольких стадиях процесса очистки с помощью хроматографии для получения диапазона значений содержания полоксамера и длинноцепочечных жирных кислот, указанного согласно настоящему изобретению, в конечном медицинском продукте, содержащем человеческий альбумин.
[0083] Следует понимать, что термин «улучшение» означает более высокую стабильность медицинского продукта, содержащего человеческий альбумин, согласно настоящему изобретению по сравнению со стабильностью существующего человеческого альбумина, например, согласно настоящему изобретению достигается предотвращение образования частиц диаметром 30-300 нм во время хранения, транспортировки или культивирования при температуре окружающей среды в результате агрегации или фибриллирования человеческого альбумина.
[0084] Следует понимать, что термин «частица» означает вещество с диаметром, находящимся в определенном диапазоне, и образованное во время хранения, транспортировки и культивирования при температуре окружающей среды медицинского продукта, содержащего человеческий альбумин, в результате агрегации или фибриллирования человеческого альбумина, где предпочтительный диаметр частиц согласно настоящему изобретению составляет 30-300 нм.
[0085] Медицинский продукт, содержащий человеческий альбумин, согласно настоящему изобретению можно применять для подавления образования агрегатов, агломератов и фибриллирования в результате замораживания и оттаивания при холодной сушке, сушке замораживанием и низкотемпературной сушке распылением, и для ускорения восстановления.
[0086] Медицинский продукт, содержащий человеческий альбумин, согласно настоящему изобретению включает, но не ограничивается указанными, альбумин, происходящий из сыворотки крови человека, полученный с помощью метода Кона и шлифовки, и рекомбинантный человеческий альбумин, очищенный с помощью различных этапов.
[0087] Диапазон рН медицинского продукта, содержащего человеческий альбумин, согласно настоящему изобретению составляет 6-8, предпочтительно, 6,4-7,4. Значения рН указаны в спецификациях в соответствии с каждой национальной фармакопеей.
[0088] Медицинский продукт, содержащий человеческий альбумин, согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать разбавители, буферы, солюбилизаторы, наполнители, регуляторы рН, серосодержащие восстанавливающие агенты, антиоксиданты и т.д. Серосодержащие восстанавливающие агенты включают N-ацетил-DL-триптофан (N-ацетилтриптофан), N-ацетил-L-триптофан, N-ацетилметионин, N-ацетил-L-метионин и т.д. Обычно применяемые буферы и разбавители включают раствор хлорида натрия, буферный раствор фосфата натрия, раствор ацетата натрия и раствор цитрата натрия, предпочтительно в пределах диапазона, указанного в спецификациях в соответствии с каждой национальной фармакопеей.
[0089] Медицинский продукт, содержащий человеческий альбумин, согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать жирные кислоты со средней длиной цепи, такие как каприлат натрия, гептаноат натрия, деканоат натрия и предпочтительно каприлат натрия согласно спецификации в соответствии с фармакопеей.
[0090] Применение медицинского продукта, содержащего человеческий альбумин, согласно настоящему изобретению включает, но не ограничивается такими продуктами, как клинические препараты для инъекции, культуральные среды, наполнители лекарственных средств, медицинские устройства, наполнители вакцин, косметические продукты и аналитические диагностические реагенты.
[0091] Варианты реализации настоящего изобретения проиллюстрированы далее с помощью конкретных примеров.
[0092] Вариант реализации изоберетния 1
[0093] Использовали коммерческий человеческий сывороточный альбумин (образец 1, Shanghai RAAS blood products Co., Ltd., серийный номер: 201708A010) в следующей лекарственной форме: человеческий альбумин с наполнителями каприлатом натрия и ацетилтриптофаном. Данная лекарственная форма соответствует фармакопейным требованиям, т.е. 0,079 ммоль каприлата натрия добавляли на 1 г альбумина и 0,076 ммоль ацетилтриптофана добавляли на 1 г альбумина, рН составлял 6,8. Содержание остаточных длинноцепочечных жирных кислот после очистки альбумина, происходящего из сыворотки крови человека, исследовали с помощью газовой хроматографии. Далее приведено подробное описание способа анализа человеческого альбумина с помощью газовой хроматографии (ГХ):
[0094] Газовая хроматография: модель: 7890А; производитель: Agilent Technologies Co., Ltd.
[0095] Колонка для ГХ: капиллярная колонка, заполненная дезактивированным кислотой полиэтиленгликолем, TG-WAXMS А компании Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.; спецификация: 30 м × 0,32 мм × 0,25 мкм;
[0096] Материалы и реагенты: гептадекановая кислота (С 17): категория: стандартный образец США; серийный номер: N-17A-JY16X; концентрация: >100 мг; содержание: ≥99,0%; пальмитиновая кислота: категория: национальный сертифицированный стандартный образец; серийный номер: 190032-201603; концентрация: 200 мг/ампула; стеариновая кислота: категория: национальный сертифицированный стандартный образец; серийный номер: 190032-201603; концентрация: 200 мг/ампула; олеиновая кислота: категория: национальный сертифицированный стандартный образец; серийный номер: 111621-2015-06; концентрация: 100 мг/ампула; содержание: ≥99,0%; линолевая кислота: категория: стандартный образец США; серийный номер: U-59A-J6-Y; концентрация: >100 мг/ампула; содержание: ≥99,0%; линоленовая кислота: категория: стандартный образец США; серийный номер: U-62A-S20-B; концентрация: >100 мг/ампула; содержание: ≥99,0%; хлороформ: категория: AR; серийный номер: 20170410; концентрация: 500 мл/бутылка; содержание: ≥99,0%; производитель: Sinopharm.
[0097] Экспериментальный способ: в соответствии с фармакопеей Китайской Народной Республики издания 2015 г.: добавляли вещество, представляющее собой внутренний стандарт, гептадекановую кислоту (С17) и рассчитывали абсолютную площадь пика для пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, линоленовой кислоты и гептадекановой кислоты (С17), строили линейную регрессию с отношением площади пика референсного раствора каждой жирной кислоты к внутреннему стандарту в зависимости от количества указанного референсного раствора каждой жирной кислоты, получали уравнение линейной регрессии и рассчитывали абсолютную площадь пика для каждой жирной кислоты в исследуемом растворе с получением, таким образом, рассчитанного содержания каждой жирной кислоты в исследуемом образце.
[0098] Условия хроматографии: температура: 260°С; колоночный поток: 2,0 мл/мин; продувочный поток: 20 мл/мин; разделенный поток: 2 мл/мин; температурная программа: изначальное удерживание в течение 5 мин при 80°С, повышение температуры до 230°С со скоростью 10°С/мин и удерживание в течение 25 мин; в общем 45 мин; детектор: модель - FID; температура: 280°С; водород: 40 мл4 шн; воздух: 450 мл4 шн; скорость потока поддувочного газа: 45 мл4 шн.
[0099] Проводили точное взвешивание гептадекановой кислоты (С 17) для получения раствора внутреннего стандарта; проводили точное взвешивание стандартов жирных кислот и указанные стандарты перемешивали с референсным раствором. Получали стандартную кривую для расчета содержания жирных кислот в человеческом альбумине.
[0100] Результаты исследования содержания жирных кислот в препарате человеческого альбумина для инъекции (Shanghai RAAS, 201703А010):
[0101] Содержание С16:0 (пальмитиновой кислоты) (моль/моль белка): 0,241
[0102] Содержание С18:0 (стеариновой кислоты) (моль/моль белка): 0,147
[0103] Содержание С18:1 (олеиновой кислоты) (моль/моль белка): 0,077
[0104] Содержание С18:2 (линолевой кислоты) (моль/моль белка): 0,085
[0105] Содержание С18:3 (линоленовой кислоты) (моль/моль белка): не выявлено
[0106] Содержание С20:4 (арахидоновой кислоты) (моль/моль белка): не выявлено
[0107] Общее содержание перечисленных выше кислот: содержание длинноцепочечных жирных кислот (моль/моль человеческого альбумина): 0,55:1
[0108] Динамическое рассеяние света использовали для исследования:
[0109] Модель прибора для анализа с помощью динамического рассеяния света (ДРС): Litesizer 500; производитель: Anton Paar (Shanghai) Trading Co., Ltd;
[0110] кюветы: кварцевые кюветы;
[0111] образец: исследовали раствор образца нерасфасованного продукта.
[0112] Способ: угол измерения: автоматический; температурный диапазон: 25°С-60°С; шаг: 5°С.
[0113] Частицы размером 30-300 нм из-за нестабильности коммерческого человеческого сывороточного альбумина должны быть удалены с помощью гель-фильтрации; далее приведены условия хроматографии: наполнитель G-25 (General Electric Company), хроматографическое устройство: хроматографическая система EV 50D (Lisure Science (Suzhou) Co., Ltd.), буферная система: раствор фосфорной кислоты, 0,1 моль/л, нейтральный рН, и очищенная вода. Образец концентрировали с использованием ультрафильрационной мембраны (30К) после хроматографии и получали в виде продукта для исследования в соответствии с исходной лекарственной формой продукта.
[0114] Фиг. 1 представляет собой хроматограмму по результатам хроматографии с использованием ДРС (ДРС-хроматограмму) коммерческого человеческого сывороточного альбумина (образец 1).
[0115] Частицы размером 30 нм-300 нм в образце 1 удаляли в соответствии с описанным выше способом и добавляли 75 мкг полоксамера 188 (BASF, серийный номер: WPAK527B) на 1 г человеческого альбумина для получения образца 2. ДРС-хроматограмма образца 2 показана на Фиг. 2.
[0116] Как показали результаты ДРС на Фиг. 1 и Фиг. 2, микрочастицы размером между 30 нм и 300 нм присутствовали в коммерческом человеческом сывороточном альбумине без полоксамера (образец 1) как при температуре 25°С, так и при температуре 60°С, тогда как после удаления частиц указанные микрочастицы отсутствовали при температуре 25°С и 60°С в человеческом сывороточном альбумине с небольшим количеством дополнительного полоксамера (образец 2).
[0117] В результате исследований авторами изобретения было также обнаружено в соответствии с настоящей заявкой, что, в качестве вариации данного конкретного варианта реализации изобретения, полоксамер 188 также можно заменять на один из полоксамера 124, полоксамера 188, полоксамера 237, полоксамера 338 и полоксамера 407 и, альтернативно, можно применять одновременно несколько полоксамеров из полоксамера 188, полоксамера 124, полоксамера 188, полоксамера 237, полоксамера 338 или полоксамера. Исследования показали, что таких же эффектов можно достигать при использовании указанных полоксамеров, т.е. после удаления частиц микрочастицы диаметром между 30 нм и 300 нм отсутствовали как при температуре 25°С, так и при температуре 60°С в человеческом сывороточном альбумине с небольшим количеством дополнительного полоксамера.
[0118] В результате исследования авторы изобретения в соответствии с настоящей заявкой также обнаружили, что желаемый эффект может быть достигнут посредством добавления только небольшого количества полоксамеров. В целом, при использовании дополнительных 10 мкг или более полоксамеров/грамм человеческого альбумина микрочастицы диаметром между 30 нм и 300 нм по сути не выявлялись или присутствовали только в небольшом количестве; и при использовании дополнительных более 500 мкг полоксамеров/грамм человеческого альбумина наблюдалось значительное повышение количества микрочастиц диаметром между 30 нм и 300 нм.
[0119] Вариант реализации 2
[0120] Использовали коммерческий человеческий сывороточный альбумин (образец 3, Shantou Weilun Bio-pharmaceutical Co., Ltd., серийный номер: 20170104), в котором ингредиенты его лекарственной формы представляли собой человеческий альбумин с наполнителями каприлатом натрия и хлоридом натрия. Лекарственная форма соответствовала фармакопейным требованиям, т.е. 0,159 ммоль каприлата натрия добавляли на 1 грамм альбумина без дополнительного N-ацетилтриптофана. Значение рН составляло 6,7, и содержание общего натрия не превышало 160 ммоль/л. Способ согласно варианту реализации изобретения 1 адаптировали для определения содержания остаточных длинноцепочечных жирных кислот в образце 3. Содержание длинноцепочечных жирных кислот (моль/моль человеческого альбумина) составляло 0,34:1.
[0121] Фиг. 3 представляет собой ДРС-хроматограмму образца 3.
[0122] Частицы размером 30-300 нм в образце 3 удаляли в соответствии со способом согласно варианту реализации изобретения 1 и добавляли 100 мкг полоксамера 188 (BASF, серийный номер WPAK527B) на 1 г человеческого альбумина с получением образца 4. ДРС-хроматограмма образца 4 показана на Фиг. 4.
[0123] Как показано с помощью результатов ДРС на Фиг. 3 и Фиг. 4, микрочастицы размером между 30 нм и 300 нм присутствовали в коммерческом человеческом сывороточном альбумине без полоксамера как при температуре 25°С, так и при температуре 60°С. После удаления частиц микрочастицы отсутствовали при температуре 25°С и 60°С в человеческом сывороточном альбумине с небольшим количеством дополнительного полоксамера.
[0124] Варианты реализации изобретения 1 и 2 показали, что частицы диаметром примерно 200 нм присутствуют в обеих стандартных лекарственных формах человеческого сывороточного альбумина согласно фармакопее без добавления полоксамера; в случае небольшого количества дополнительного полоксамера может наблюдаться как эффективное подавление, так и предотвращение образования микрочастиц.
[0125] В результате исследований авторами настоящего изобретения также было обнаружено, что в качестве вариации данного конкретного варианта реализации полоксамер 188 также можно заменять на один из полоксамера 124, полоксамера 188, полоксамера 237, полоксамера 338 и полоксамера 407, и, альтернативно, можно применять одновременно несколько полоксамеров из полоксамера 188, полоксамера 124, полоксамера 188, полоксамера 237, полоксамера 338 или полоксамера 407. Исследования показали, что такие же эффекты могут быть достигнуты при использовании указанных полоксамеров, т.е. после удаления частиц микрочастицы диаметром между 30 нм и 300 нм отсутствовали как при температуре 25°С, так и при температуре 60°С в человеческом сывороточном альбумине с небольшим количеством дополнительного полоксамера.
[0126] В результате исследований авторами изобретения также было обнаружено в соответствии с настоящей заявкой, что желаемый эффект можно обеспечить путем добавления только небольшого количества полоксамеров. В целом, при использовании дополнительно 10 мкг или более полоксамеров/грамм человеческого альбумина микрочастицы диаметром между 30 нм и 300 нм по сути не выявлялись или присутствовали только в небольшом количестве; а при использовании дополнительно более чем 500 мкг полоксамеров/грамм человеческого альбумина наблюдалось существенное повышение количества микрочастиц диаметром между 30 нм и 300 нм.
[0127] Вариант реализации 3
[0128] В настоящей заявке использовали нерасфасованный рекомбинантный человеческий альбумин высокой степени чистоты, полученный после улучшенной очистки в соответствии со способом, описанным в заявке на китайский патент (заявка номер 201010124935.2). Исследуемое остаточное содержание длинноцепочечных жирных кислот в очищенном рекомбинантном человеческом альбумине, выраженное как отношение количества указанных длинноцепочечных жирных кислот (моль/моль человеческого альбумина), составляло 0,059:1, что примерно в 10 раз ниже по сравнению с содержанием длинноцепочечных жирных кислот в альбумине, происходящем из сыворотки крови человека. Образец 5 получали только в соответствии с требованиями для способа согласно Китайской фармакопеи издания 2015 г. без добавления каких-либо длинноцепочечных жирных кислот или полоксамеров, т.е. добавляли 0,071 ммоль каприлата натрия (Chengdu Huayi Pharmaceutical Excipients Manufacturing Co., Ltd, серийный номер 20170901) на 1 г альбумина и 0,085 ммоль ацетилтриптофана (Adamas Reagent Co., Ltd, серийный номер Р230264) на 1 г альбумина при значении рН, составляющем 6,8, при этом общее содержание натрия регулировали таким образом, чтобы оно не превышало 160 ммоль/л. [0129] Фиг. 5 представляет собой ДРС-хроматограмму рекомбинантного человеческого альбумина без добавления полоксамера или длинноцепочечных жирных кислот (образец 5).
[0130] Вариант реализации 4
[0131] Получение образца 6: брали нерасфасованный рекомбинантный человеческий альбумин высокой степени чистоты, полученный с помощью способа согласно варианту реализации изобретения 3, выше; добавляли олеат натрия (BBI Life Sciences, серийный номер: Е802 ВА0026) к указанному нерасфасованному продукту до достижения молярного отношения 1,0:1,0 между длинноцепочечными жирными кислотами и рекомбинантным человеческим альбумином (считали остаточные длинноцепочечные жирные кислоты в нерасфасованном продукте); добавляли 0,081 ммоль каприлата натрия (Chengdu Huayi Pharmaceutical Excipients Manufacturing Co., Ltd, серийный номер 20170901) на 1 г альбумина и 0,067 ммоль ацетилтриптофана (Adamas Reagent Co., Ltd, серийный номер Р230264) на 1 г альбумина при значении рН, составляющем 6,7, при этом общее содержание натрия регулировали таким образом, чтобы оно не превышало 160 ммоль/л.
[0132] Фиг. 6 представляет собой ДРС-хроматограмму содержащего рекомбинантный человеческий альбумин медицинского продукта с добавлением только длинноцепочечных жирных кислот (образец 6).
[0133] Вариант реализации 5
[0134] Получение образца 7: брали нерасфасованный рекомбинантный человеческий альбумин высокой степени чистоты, полученный с помощью способа согласно варианту реализации изобретения 3, выше, добавляли 100 мкг полоксамера 188 (BASF, серийный номер WPAK527B) на 1 г человеческого альбумина, добавляли 0,079 ммоль каприлата натрия (Chengdu Huayi Pharmaceutical Excipients Manufacturing Co., Ltd, серийный номер 20170901) на 1 г альбумина и 0,066 ммоль ацетилтриптофана (Adamas Reagent Co., Ltd, серийный номер Р230264) на 1 г альбумина при значении рН, составляющем 6,6, при этом общее содержание натрия регулировали таким образом, чтобы оно не превышало 160 ммоль/л.
[0135] Фиг. 7 представляет собой ДРС-хроматограмму рекомбинантного человеческого альбумина с добавлением только полоксамера (образец 7).
[0136] Вариант реализации 6
[0137] Получение образца 8: брали нерасфасованный рекомбинантный человеческий альбумин высокой степени чистоты, полученный с помощью способа согласно варианту реализации изобретения 3, выше, добавляли 100 мкг полоксамера 188 (BASF, серийный номер WPAK527B) на 1 грамм человеческого альбумина, добавляли олеат натрия (BBI Life Sciences, серийный номер: Е802 ВА0026) до достижения молярного отношения 1,0:1,0 между длинноцепочечными жирными кислотами и рекомбинантным человеческим альбумином (считали остаточные длинноцепочечные жирные кислоты в нерасфасованном продукте), добавляли 0,083 ммоль каприлата натрия (Chengdu Huayi Pharmaceutical Excipients Manufacturing Co., Ltd, серийный номер 20170901) на 1 г альбумина и 0,084 ммоль ацетилтриптофана (Adamas Reagent Co., Ltd, серийный номер Р230264) на 1 г альбумина при значении рН, составляющем 6,8, при этом общее содержание натрия регулировали таким образом, чтобы оно не превышало 160 ммоль/л.
[0138] Фиг. 8 представляет собой ДРС-хроматограмму рекомбинантного человеческого альбумина с добавлением полоксамера и длинноцепочечных жирных кислот (образец 8).
[0139] Вариант реализации 7
[0140] Получение образца 9: брали нерасфасованный рекомбинантный человеческий альбумин высокой степени чистоты, полученный с помощью способа согласно варианту реализации изобретения 3, выше, добавляли 100 мкг полоксамера 188 (BASF, серийный номер WP АК527 В) на 1 г человеческого альбумина, добавляли соят натрия (Qingdao Raynol Chemical Co., Ltd., серийный номер 20190121) до достижения молярного отношения 0,5:1,0 между длинноцепочечными жирными кислотами и рекомбинантным человеческим альбумином (считали остаточные длинноцепочечные жирные кислоты в нерасфасованном продукте), добавляли 0,082 ммоль каприлата натрия (Chengdu Huayi Pharmaceutical Excipients Manufacturing Co., Ltd, серийный номер 20170901) на 1 г альбумина и 0,080 ммоль ацетилтриптофана (Adamas Reagent Co., Ltd, серийный номер Р230264) на 1 г альбумина при рН, составляющем 6,9, при этом общее содержание натрия регулировали таким образом, чтобы оно не превышало 160 ммоль/л.
[0141] Фиг. 9 представляет собой ДРС-хроматограмму рекомбинантного человеческого альбумина с добавлением полоксамера и длинноцепочечной жирной кислоты (соята натрия) (образец 9).
[0142] Вариант реализации 8
[0143] Получение образца 10: брали нерасфасованный рекомбинантный человеческий альбумин высокой степени чистоты, полученный с помощью способа согласно варианту реализации изобретения 3, выше, добавляли 50 мкг полоксамера 188 (BASF, серийный номер WPAK527B) на 1 г человеческого альбумина, тщательно перемешивали стеарат натрия (Damas-beta, серийный номер: Р1042477) и олеат натрия (BBI Life Sciences, серийный номер: Е802 ВА0026) в молярном отношении 1:2 и добавляли к нерасфасованному продукту до достижения молярного отношения 0,6:1,0 между смешанными длинноцепочечными жирными кислотами и рекомбинантным человеческим альбумином (считали остаточные длинноцепочечные жирные кислоты в нерасфасованном продукте), добавляли 0,086 ммоль каприлата натрия (Chengdu Huayi Pharmaceutical Excipients Manufacturing Co., Ltd, серийный номер 20170901) на 1 г альбумина и 0,076 ммоль ацетилтриптофана (Adamas Reagent Co., Ltd, серийный номер Р230264) на 1 г альбумина при значении рН, составляющем 7,0, при этом общее содержание натрия регулировали таким образом, чтобы оно не превышало 160 ммоль/л.
[0144] Фиг. 10 представляет собой ДРС-хроматограмму рекомбинантного человеческого альбумина с дополнительным полоксамером и длинноцепочечными жирными кислотами (смесь стеарата натрия и олеата натрия) (образец 10).
[0145] Вариант реализации 9
[0146] Получение образца 11: брали нерасфасованный рекомбинантный человеческий альбумин высокой степени чистоты, полученный с помощью способа согласно варианту реализации изобретения 3, выше, добавляли 50 мкг полоксамера 188 (BASF, серийный номер WPAK527B) на 1 г человеческого альбумина, тщательно перемешивали стеарат натрия (Damas-beta, серийный номер: Р1042477) и олеат натрия (BBI Life Sciences, серийный номер: Е802 ВА0026) в молярном отношении 1:2 и добавляли к нерасфасованному продукту до достижения молярного отношения 0,6:1,0 смеси длинноцепочечной жирной кислоты и рекомбинантного человеческого альбумина (считали остаточные длинноцепочечные жирные кислоты в нерасфасованном продукте), добавляли 0,153 ммоль каприлата натрия (Chengdu Huayi Pharmaceutical Excipients Manufacturing Co., Ltd, серийный номер 20170901) на 1 г альбумина при рН, составляющем 7,0, при этом общее содержание натрия регулировали таким образом, чтобы оно не превышало 160 ммоль/л.
[0147] Фиг. 11 представляет собой ДРС-хроматограмму рекомбинантного человеческого альбумина с добавлением полоксамера и длинноцепочечной жирной кислоты (смесь стеарата натрия/олеата натрия) (образец 11). [0148] Вариант реализации 10
[0149] Инкубирование и исследование термостабильности образцов, полученных согласно вариантам реализации изобретения 1-9 (Образцы 1-11). Указанные способы проводили в соответствии с Китайской фармакопеей издания 2015 г., том III, стр. 244-245. Результаты показаны в Таблице 1.
[0150] Таблица 1. Результаты наблюдения за стабильностью образцов 1-11
[0151] Указанные выше варианты реализации продемонстрировали эффект олеиновой кислоты, соята натрия, смеси стеарата натрия и олеата натрия и смеси стеарата натрия и олеата натрия в комбинации с полоксамером в обеспечении стабильности продуктов рекомбинантного человеческого альбумина. В результате исследований авторами изобретения было также обнаружено в соответствии с настоящей заявкой, что, в качестве вариации описанных вариантов реализации изобретения, длинноцепочечные жирные кислоты также могут представлять собой одну или более кислот, выбранных из миристиновой кислоты (С14:0), пальмитиновой кислоты (С16:0), стеариновой кислоты (С18:0), олеиновой кислоты (С18:1), линолевой кислоты (С18:2), линоленовой кислоты (С18:3) и арахидоновой кислоты (С20:4). Исследования показали, что такой же эффект может достигаться с использованием указанных длинноцепочечных жирных кислот, т.е. их применение в комбинации с полоксамерами может обеспечивать стабильность продуктов рекомбинантного человеческого альбумина. Отрицательные ответы были показаны в приведенном выше исследовании стабильности.
[0152] В результате исследования авторами изобретения также было обнаружено в соответствии с настоящей заявкой, что, в качестве вариации указанных выше вариантов реализации изобретения, полоксамер 188 также можно заменять на один из полоксамера 124, полоксамера 188, полоксамера 237, полоксамера 338 и полоксамера 407, и, альтернативно, можно применять одновременно несколько из полоксамера 188, полоксамера 124, полоксамера 188, полоксамера 237, полоксамера 338 или полоксамера 407. Исследования показали, что такой же эффект достигается с использованием указанных полоксамеров; стабильность человеческого сывороточного альбумина может соответствовать требованиям при добавлении некоторого количества длинноцепочечных жирных кислот и небольшого количества полоксамера.
[0153] В результате исследований авторы изобретения в соответствии с настоящей заявкой также обнаружили, что желаемый эффект может быть достигнут путем добавления только небольшого количества полоксамера. В целом, результаты наблюдения за стабильностью по существу показывают отрицательный ответ при добавлении 10 мкг или более полоксамера/г человеческого альбумина, но при добавлении более 500 мкг полоксамера/г человеческого альбумина в исследованиях по наблюдению за стабильностью начинают выявляться положительные ответы.
[0154] В результате исследования авторами изобретения также было обнаружено в соответствии с настоящей заявкой, что стабильность медицинского продукта человеческого альбумина является наилучшей, когда молярное отношение между длинноцепочечными жирными кислотами и человеческим альбумином составляет 0,2-3,0, и в частности, 0,3-2,0. Когда молярное отношение между длинноцепочечными жирными кислотами и человеческим альбумином составляет менее 0,3 или более 2,0, в исследованиях по наблюдению за стабильностью начинает выявляться небольшое количество положительных ответов, тогда как когда молярное отношение между длинноцепочечными жирными кислотами и человеческим альбумином составляет менее 0,2 или более 3,0, в исследованиях по наблюдению за стабильностью начинает появляться большое количество
положительных ответов.
[0155] Вариант реализации 11
[0156] Образцы 5-11, полученные с помощью способа согласно вариантам реализации изобретения 3-9, подвергали анализу с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и получали хроматограммы по результатам хроматографии с использованием ДСК (ДСК-хроматограммы). Модель прибора для ДСК: Nano DSC 602000; производитель: ТА; разбавитель образца: 0,01 моль/л фосфорная кислота с нейтральным рН. Условия проведения исследования: образец нерасфасованного продукта разбавляли разбавителем до концентрации 1-5 мг/мл; температурный диапазон: 45°С - 90°С; шаг: 1°С/мин. Результаты показаны в Таблице 2.
[0157] Таблица 2. Результаты ДСК образцов 5-11
[0158] Описанные выше результаты согласно настоящему изобретению показали синергический стабилизирующий эффект полоксамеров и длинноцепочечных жирных кислот.В случае препаратов альбумина, происходящего из крови человека, характерные для него остаточные длинноцепочечные жирные кислоты и другие лиганды из кровотока в организме человека могут осуществлять подавление образования частиц диаметром 30-300 нм и улучшать термостабильность при добавлении только небольшого количества дополнительных полоксамеров с отсутствием необходимости дополнительного добавления длинноцепочечных жирных кислот.
[0159] Для рекомбинантного человеческого альбумина высокой степени чистоты, который по существу является полностью обезжиренным, требуются дополнительные полоксамеры для подавления появления частиц диаметром 30-300 нм. Сравнение результатов исследования показывает, что в случае, когда добавляют только полоксамеры, стандартный фармакопейный каприлат натрия (жирные кислоты со средней длиной цепи) и ацетилтриптофан, требования по термостабильности не могут быть выполнены из-за отсутствия взаимной поддержки различных лигандов смежных доменов альбумина, обеспечиваемой длинноцепочечными жирными кислотами, несмотря на то что жирные кислоты со средней длиной цепи могут эффективно повышать Tonset, Tm1 и Tm2.
[0160] Таким образом, регулирование содержания длинноцепочечных жирных кислот может приводить к эффективному повышению Tonset, Tm1 и Tm2, и поскольку повышается взаимосвязанная стабильность белковых доменов, требуется небольшое количество дополнительных полоксамеров для подавления гидрофобных взаимодействий. Медицинский продукт, содержащий человеческий альбумин согласно настоящему изобретению, отвечает требованиям по стабильности при инкубировании при температуре 57°С в течение 50 часов, при температуре 30°С в течение 14 дней и при температуре 20°С в течение 28 дней с превосходными показателями стабильности, соответствующими требованиям по стабильности для длительного хранения и транспортировки при 2-8°С и комнатной температуре.
[0161] Описанные выше варианты реализации изобретения приведены исключительно в целях иллюстрации принципов изобретения и их эффективности и не ограничивают настоящее изобретение. Специалист в данной области техники может вносить модификации или изменения в указанные выше варианты реализации, при условии что они не противоречат сущности и объему настоящего изобретения. Таким образом, все внесенные средним специалистом в данной области техники эквивалентные модификации или изменения в пределах сущности и технической концепции, описанной согласно настоящему изобретению, включены в формулу настоящего изобретения.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬБУМИНА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ДЕТОКСИКАЦИОННОЙ ТЕРАПИИ | 2008 |
|
RU2424822C2 |
СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ МИНИМИЗАЦИИ ЭПИТЕЛИАЛЬНО-МЕЗЕНХИМАЛЬНОГО ПЕРЕХОДА | 2017 |
|
RU2764630C2 |
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ С ЗАМЕДЛЕННЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ, СОДЕРЖАЩИЕ ПОЛОКСАМЕР | 2009 |
|
RU2482874C2 |
РАСТВОР АЛЬБУМИНА И СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ | 2004 |
|
RU2305556C2 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОБЕДНЕННОГО МОЛЕКУЛАМИ СТАБИЛИЗАТОРОВ ВОДНОГО РАСТВОРА АЛЬБУМИНА, АДСОРБЕНТ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В СПОСОБЕ, ПРИМЕНЕНИЕ ВОДНОГО РАСТВОРА АЛЬБУМИНА (ВАРИАНТЫ) | 2006 |
|
RU2420534C2 |
ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 2006 |
|
RU2337966C2 |
СТАБИЛИЗИРУЮЩИЙ ЭКСЦИПИЕНТ ДЛЯ ВАКЦИНЫ С ИНАКТИВИРОВАННЫМИ ЦЕЛЫМИ ВИРУСАМИ | 2010 |
|
RU2560675C2 |
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ РЕИНТЕГРАЦИИ РАСТВОРА ДЛЯ МНОГОКРАТНОГО ДИАЛИЗА, СОДЕРЖАЩЕГО БЕЛОК-НОСИТЕЛЬ АЛЬБУМИН | 2017 |
|
RU2754045C2 |
СПОСОБ КРУПНОМАСШТАБНОГО ПРОИЗВОДСТВА УСТОЙЧИВОЙ ПРИ ХРАНЕНИИ КОМПОЗИЦИИ ТРОМБИНА ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ СТЕПЕНИ ЧИСТОТЫ | 1995 |
|
RU2144081C1 |
НОВЫЕ ЗАЩИТНЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII | 2009 |
|
RU2510279C2 |
Группа изобретений относится к препарату, содержащему человеческий альбумин. Препарат, содержащий человеческий альбумин, при этом указанный препарат содержит полоксамер и жирные кислоты, при этом молярное отношение жирных кислот и человеческого альбумина в указанном препарате составляет 0,5-2,0:1,0, содержание полоксамера в указанном препарате составляет 10-100 мкг полоксамера / 1 г человеческого альбумина, где указанный полоксамер представляет собой один или более полоксамеров, выбранных из полоксамера 188 и полоксамера 407, где указанная жирная кислота представляет собой одну или более кислот, выбранных из миристиновой кислоты (C14:0), пальмитиновой кислоты (C16:0), стеариновой кислоты (C18:0) и олеиновой кислоты (C18:1), где человеческий альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин или человеческий рекомбинантный альбумин. Способ получения препарата, содержащего человеческий альбумин, включающий: обеспечение человеческого альбумина, добавление 10-100 мкг полоксамера на 1 г человеческого альбумина, и добавление жирных кислот до достижения молярного отношения жирных кислот к человеческому альбумину, равного 0,5-2,0:1,0, где указанный полоксамер представляет собой один или более полоксамеров, выбранных из полоксамера 188 и полоксамера 407, где указанная жирная кислота представляет собой одну или более кислот, выбранных из миристиновой кислоты (C14:0), пальмитиновой кислоты (C16:0), стеариновой кислоты (C18:0) и олеиновой кислоты (C18:1), где человеческий альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин или человеческий рекомбинантный альбумин. Вышеописанный препарат человеческого альбумина обладает повышенной стабильностью при небольшом количестве полоксамера. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл.
1. Препарат, содержащий человеческий альбумин, при этом указанный препарат содержит полоксамер и жирные кислоты,
при этом молярное отношение жирных кислот и человеческого альбумина в указанном препарате составляет 0,5-2,0:1,0,
содержание полоксамера в указанном препарате составляет 10-100 мкг полоксамера / 1 г человеческого альбумина,
где указанный полоксамер представляет собой один или более полоксамеров, выбранных из полоксамера 188 и полоксамера 407,
где указанная жирная кислота представляет собой одну или более кислот, выбранных из миристиновой кислоты (C14:0), пальмитиновой кислоты (C16:0), стеариновой кислоты (C18:0) и олеиновой кислоты (C18:1),
где человеческий альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин или человеческий рекомбинантный альбумин.
2. Препарат по п. 1, содержащий человеческий альбумин, где указанная жирная кислота представляет собой соевую жирную кислоту или полностью гидрогенизированную соевую жирную кислоту.
3. Препарат по п. 1, содержащий человеческий альбумин, где указанный препарат дополнительно содержит ингредиенты в количествах в соответствии с национальными фармакопеями, включающие каприлат натрия и/или N-ацетилтриптофан.
4. Способ получения препарата, содержащего человеческий альбумин, включающий:
обеспечение человеческого альбумина,
добавление 10-100 мкг полоксамера на 1 г человеческого альбумина, и
добавление жирных кислот до достижения молярного отношения жирных кислот к человеческому альбумину, равного 0,5-2,0:1,0,
где указанный полоксамер представляет собой один или более полоксамеров, выбранных из полоксамера 188 и полоксамера 407,
где указанная жирная кислота представляет собой одну или более кислот, выбранных из миристиновой кислоты (C14:0), пальмитиновой кислоты (C16:0), стеариновой кислоты (C18:0) и олеиновой кислоты (C18:1),
где человеческий альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин или человеческий рекомбинантный альбумин.
5. Способ по п. 4, где указанный способ дополнительно включает: добавление каприлата натрия и/или N-ацетилтриптофана в соответствии с национальными фармакопеями.
6. Препарат по п. 1, содержащий человеческий альбумин, при этом в указанном препарате отсутствует помутнение или видимые частицы в ходе инкубирования при 57°C в течение 50 часов, инкубирования при 30°C в течение 14 дней и инкубирования при 20°C в течение 28 дней.
7. Способ по п. 4, где указанные жирные кислоты добавляют в форме солей.
8. Способ по п. 4, где указанные жирные кислоты добавляют в форме солей натрия.
9. Способ по п. 4, где указанный препарат не содержит частиц диаметром более 30-200 нм, образовавшихся в результате агрегации и/или фибриллирования человеческого альбумина.
Устройство для закрепления лыж на раме мотоциклов и велосипедов взамен переднего колеса | 1924 |
|
SU2015A1 |
CN 1744912 А, 08.03.2006 | |||
DEVKUMAR MUSTAFI et al | |||
"Multi-block poloxamer surfactants suppress aggregation of denatured proteins", Biochimica et Biophysica Acta, (20080101), vol | |||
ПРИСПОСОБЛЕНИЕ, СИГНАЛИЗИРУЮЩЕЕ О НЕДОСТАТКЕ МАСЛА В ПОДШИПНИКЕ | 1924 |
|
SU1780A1 |
Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов | 1921 |
|
SU7A1 |
CN 101745103 А, 23.06.2010 | |||
CN 107674860 А, 09.02.2018 | |||
Sun Mengmeng, "Ethanol |
Авторы
Даты
2023-08-01—Публикация
2020-04-22—Подача