РУКОВОДСТВО ПО ТЕРАПИИ И/ИЛИ МОНИТОРИНГ ТЕРАПИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ШОКА Российский патент 2025 года по МПК G01N33/68 G16H50/30 A61K38/22 A61K39/395 A61K45/06 A61P9/00 A61P43/00 

Настоящее изобретение относится к способу прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, и к вазопрессорам, агонистам рецепторов ангиотензина и/или их предшественникам, ингибиторам DPP3 и антителам против ADM для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, и к способам лечения указанного шока или рефрактерного шока.

Дипептидилпептидаза 3, также известная как дипептидиламинопептидаза III, дипептидилариламидаза III, дипептидилпептидаза III, энкефалиназа B или ангиотензиназа эритроцитов; краткое название: DPP3, DPPIII, представляет собой металлопептидазу, которая удаляет дипептиды из физиологически активных пептидов, таких как энкефалины и ангиотензины.

DPP3 был впервые идентифицирован, и его активность была измерена в экстрактах очищенной передней доли гипофиза крупного рогатого скота Ellis & Nuenke в 1967 году. Фермент, который указан как EC 3.4.14.4, имеет молекулярную массу примерно 83 кДа и является высококонсервативным у прокариот и эукариот (Prajapati & Chauhan 2011). Аминокислотная последовательность человеческого варианта представлена в SEQ ID NO 1. Дипептидилпептидаза III представляет собой главным образом цитозольную пептидазу, которая экспрессируется повсеместно. Несмотря на отсутствие сигнальной последовательности, в нескольких исследованиях сообщается о мембранной активности (Lee & Snyder 1982).

DPP3 представляет собой цинк-зависимую экзопептидазу, принадлежащую к семейству пептидаз M49. Она обладает широкой субстратной специфичностью к олигопептидам от трех/четырех до десяти аминокислот различного состава, а также способна к расщеплению после пролина. Известно, что DPP3 гидролизует дипептиды с N-конца своих субстратов, включая ангиотензин II, III и IV; Leu- и Met-энкефалин; эндоморфин 1 и 2. Металлопептидаза DPP3 имеет оптимум активности при pH 8-9 и может быть активирована добавлением ионов двухвалентных металлов, таких как Co²⁺и Mg²⁺.

Структурный анализ DPP3 выявил каталитические мотивы HELLGH (hDPP3 450-455) и EECRAE (hDPP3 507-512), а также следующие аминокислоты, важные для связывания и гидролиза субстрата: Glu316, Tyr, 318, Asp366, Asn391, Asn394, His568, Arg572, Arg577, Lys666 и Arg669 (Prajapati & Chauhan 2011; Kumar et al. 2016; нумерация относится к последовательности DPP3 человека, см. SEQ ID NO. 1). Принимая во внимание все известные аминокислоты или области последовательности, которые участвуют в связывании субстрата и гидролизе, активный сайт DPP3 человека можно определить как область между аминокислотами 316 и 669.

Наиболее заметным субстратом DPP3 является ангиотензин II (Ang II), главный эффектор ренин-ангиотензиновой системы (RAS). RAS активируется при сердечно-сосудистых заболеваниях (Dostal et al. 1997. J Mol Cell Cardiol; 29:2893-902; Roks et al. 1997. Heart Vessels. Suppl 12:119-24), сепсисе и септическом шоке (Corrêa et al. 2015. Crit Care 2015; 19:98). В частности, было показано, что Ang II модулирует многие сердечно-сосудистые функции, включая контроль артериального давления и ремоделирование сердца.

Точная биологическая функция DPP3 в клеточной физиологии не понятна, но недавние открытия указывают на ее роль не только в белковом обмене, но также в модуляции боли и воспалительных процессах (Prajapati & Chauhan 2011). Кроме того, DPP3 снижал артериальное давление у мышей с гипертензией, которым вводили AngII, без изменения частоты сердечных сокращений (Pang et al. 2016). Однако у нормотензивных мышей не было изменений артериального давления при инъекции DPP3.

Снижение артериального давления при введении DPP3 вместе с антагонистом рецептора ангиотензина у мышей, которым вводили Ang II, было аналогично снижению артериального давления при введении только DPP3 или только антагониста рецептора ангиотензина (Pang et al. 2016. Hypertension 68:630-41).

Ангиотензин II (AngII) представляет собой пептидный гормон, естественным образом вырабатываемый организмом, и регулирующий артериальное давление посредством вазоконстрикции и реабсорбции натрия. Гемодинамические эффекты введения Ang II были предметом многочисленных клинических исследований, демонстрирующих значительное влияние на системный и почечный кровоток (Harrison-Bernard 2009. Adv. Physiol Edu. 33(4): 270).

AngII-терапия в настоящее время обсуждается благодаря его положительному эффекту при вазодилататорном шоке и септическом шоке (Khanna, A. et al., 2017; Antonucci, E. et al. 2017, Tumlin, J.A. et al. 2018). Пациенты с вазодилататорным шоком (80% при септическом шоке), получавшие ангиотензин II, с большей вероятностью выживали до 28 дней и демонстрировали значительную коррекцию гипотензии (Khanna, A. et al., 2017; Tumlin, J.A. et al. 2018).

Предполагается, что ангиотензинпревращающий фермент (ACE) сильно подвержен дисрегуляции у пациентов с шоком, что приводит к изменению соотношения ангиотензин I/II, и что инфузия ангиотензина II может компенсировать такую дисрегуляцию (Tumlin, J.A. et al. 2018).

Недавно были созданы, охарактеризованы и утверждены два анализа для специфического детектирования DPP3 в биологических жидкостях человека (например, крови, плазме, сыворотке): иммунолюминесцентный анализ (LIA) для определения концентрации белка DPP3 и анализ активности ферментного захвата (ECA) для специфического детектирования активности DPP3 (Rehfeld et al. 2019 JALM 3(6):943-953). Стадия промывки в обоих методах удаляет все мешающие вещества перед фактическим детектированием белка или активности DPP3. Оба метода являются высокоспецифичными и позволяют воспроизводимо определять DPP3 в образцах крови.

Целью настоящего изобретения является предложение способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок.

Другой целью изобретения является предложение вазопрессоров, агонистов рецептора ангиотензина и/или их предшественников, ингибиторов DPP3 и антител против ADM для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок.

Объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный способ включает стадии:

определения уровня DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента;

сравнения указанного уровня определенного DPP3 с заданным пороговым значением,

где прогнозируется, что указанный пациент впадает в состояние рефрактерного шока, или у него диагностируется рефрактерный шок, если указанный определенный уровень DPP3 превышает указанное заданное пороговое значение.

Объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный способ включает стадии:

определения уровня DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента;

сравнения указанного уровня определенного DPP3 с заданным пороговым значением, и

определения уровня проадреномедуллина или его фрагментов в образце биологической жидкости указанного пациента, и

сравнения указанного уровня определенного проадреномедуллина или его фрагментов с заданным пороговым значением,

где прогнозируется, что указанный пациент впадает в состояние рефрактерного шока или у него диагностируется рефрактерный шок, если указанный определенный уровень проадреномедуллина или его фрагментов и/или указанный уровень DPP3 превышает указанное заданное пороговое значение.

В конкретном варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, указанный шок выбран из группы, включающей шок, вызванный гиповолемией, кардиогенный шок, обструктивный шок и распределительный шок.

В другом конкретном варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, указанный шок выбран из группы, включающей шок, вызванный гиповолемией, кардиогенный шок, обструктивный шок и распределительный шок, в частности, кардиогенный или септический шок.

В конкретном варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, указанный шок выбирают из группы, включающей:

в случае кардиогенного шока указанный пациент перенес острый коронарный синдром (например, острый инфаркт миокарда) или сердечную недостаточность (например, острую декомпенсированную сердечную недостаточность), миокардит, аритмию, кардиомипатию, порок сердца, расслоение аорты с острым аортальным стенозом, травматический хордальный разрыв или массивную легочную эмболию, или

в случае гиповолемического шока указанный пациент мог перенести геморрагическое заболевание, включая желудочно-кишечное кровотечение, травму, сосудистые этиологии (например, разрыв аневризмы брюшной аорты, опухоль, прорастающую в крупный кровеносный сосуд) и спонтанное кровотечение в условиях применения антикоагулянтов, или негеморрагическое заболевание, включая рвоту, диарею, почечную недостаточность, кожные потери/неощутимые потери (например, ожоги, тепловой удар) или потерю в третье пространство в условиях панкреатита, цирроза печени, кишечной непроходимости, травмы или

в случае обструктивного шока указанный пациент мог перенести тампонаду сердца, напряженный пневмоторакс, легочную эмболию или аортальный стеноз, или

в случае распределительного шока указанный пациент страдает септическим шоком, нейрогенным шоком, анафилактическим шоком или шок вследствие адреналового криза.

В другом варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, указанный способ используется для начала и/или прекращения, и/или стратификации лечения, и/или руководства по лечению.

Используемый в настоящем описании термин «руководство по терапии» или «руководство по лечению» относится к применению определенных видов терапии или медицинских вмешательств на основе значения одного или более биомаркеров, и/или клинического параметра, и/или клинических балльных оценок.

Термин «мониторинг терапии» в контексте настоящего изобретения относится к мониторингу и/или корректировке терапевтического лечения указанного пациента, например, путем получения отзывов об эффективности терапии.

Термин «стратификация терапии», в частности, относится к группировке или классификации пациентов по разным группам, таким как терапевтические группы, которые получают или не получают терапевтические процедуры в зависимости от их классификации.

Термин «прогнозирование» означает корреляцию вероятности исхода с результатом, полученным при измерении аналита. Примером этого является измерение определенного маркера, такого как DPP3, в образце, измеренный уровень которого коррелирует с вероятностью того, что у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, разовьется рефрактерный шок.

Настоящее изобретение также включает способ краткосрочного прогнозирования рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где краткосрочный означает период, равный или меньше 14 дней, предпочтительно равный или меньше 7 дней, более предпочтительно равный или меньше 3 дней, наиболее предпочтительно равный или меньше 48 часов.

В другом варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, указанное лечение начинают, и/или продолжают, и/или откладывают, и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения.

В другом варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, указанное лечение начинают и/или продолжают, и/или откладывают, и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 и/или про-адреномедуллина и/или его фрагментов выше указанного заданного порогового значения.

В предпочтительном варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, указанное лечение выбирают из группы вазопрессоров, агонистов рецептора ангиотензина или их предшественников и/или ингибиторов активности DPP3.

В другом предпочтительном варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, указанное лечение выбрано из группы вазопрессоров, агонистов рецептора ангиотензина и/или их предшественников, ингибиторов активности DPP3 и антител против адреномедуллина или фрагментов антител против адреномедуллина.

В другом варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, определяют уровень белка DPP3 и/или уровень активного DPP3 и сравнивают с заданным пороговым значением.

В другом варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, уровень DPP3 определяют путем контакта указанного образца биологической жидкости со связывающим агентом захвата, который специфически связывается с DPP3.

В другом предпочтительном варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, указанный связывающий агент захвата для определения уровня DPP3 может быть выбран из группы, состоящей из антитела, фрагмента антитела или каркаса, не относящегося к IgG.

В конкретном варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, указанный связывающий агент захвата представляет собой антитело.

В другом конкретном варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, указанный связывающий агент захвата представляет собой моноклональное антитело.

В другом варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, указанный образец биологической жидкости выбирают из группы цельной крови, плазмы и сыворотки.

В конкретном варианте осуществления указанного способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, указанный способ диагностики или прогнозирования проводят по меньшей мере дважды.

Шок характеризуется снижением доставки кислорода и/или повышенным потреблением кислорода или неадекватным использованием кислорода, что приводит к клеточной и тканевой гипоксии. Это опасное для жизни состояние недостаточности кровообращения, чаще всего проявляющееся гипотонией (систолическое артериальное давление меньше 90 мм рт.ст.или среднее артериальное давление меньше 65 мм рт.ст.). Шок подразделяется на четыре основных типа в зависимости от основной причины: гиповолемический, кардиогенный, обструктивный и распределительный шок (Vincent and De Backer 2014. N. Engl. J. Med. 370(6): 583).

Гиповолемический шок характеризуется уменьшением внутрисосудистого объема и может быть разделен на два основных подтипа: геморрагический и негеморрагический. Общие причины геморрагического гиповолемического шока включают желудочно-кишечное кровотечение, травму, сосудистые этиологии (например, разрыв аневризмы брюшной аорты, опухоль, прорастающую в крупный кровеносный сосуд) и спонтанное кровотечение на фоне применения антикоагулянтов. Общие причины негеморрагического гиповолемического шока включают рвоту, диарею, почечную недостаточность, кожные потери/нечувствительные потери (например, ожоги, тепловой удар) или потерю в третье пространство при панкреатите, циррозе печени, кишечной непроходимости, травме. Для обзора см. Koya and Paul 2018. Shock. StatPearls [Интернет]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2019-2018 Oct 27.

Кардиогенный шок (CS) определяется как состояние критической гипоперфузии эндогенных органов из-за снижения минутного сердечного выброса. Примечательно, что CS имеет спектр в диапазоне от легкой гипоперфузии до глубокого шока. Установленными критериями диагностики CS являются: (i) систолическое артериальное давление ≤90 мм рт.ст.в течение>30 мин или вазопрессоры, необходимые для достижения артериального давления ≥90 мм рт.ст.; (ii) застой в легких или повышенное давление наполнения левого желудочка; (iii) признаки нарушения перфузии органов по меньшей мере с одним из следующих критериев: (а) измененный психический статус; (b) холодная, липкая кожа; c) олигурия (<0,5 мл/кг/ч или<30 мл/ч); (d) повышенный уровень лактата в сыворотке (Reynolds and Hochman 2008. Circulation 117: 686-697). Острый инфаркт миокарда (AMI) с последующей желудочковой дисфункцией является наиболее частой причиной CS, на которую приходится примерно 80% случаев. Менее частыми причинами CS после AMI являются механические осложнения, такие как разрыв межжелудочковой перегородки (4%) или свободной стенки (2%), а также острая тяжелая митральная недостаточность (7%). (Hochman et al. 2000. J Am Coll Cardiol 36: 1063-1070). CS, не связанный с AMI, может быть вызван декомпенсированным пороком сердца, острым миокардитом, аритмией и т.д. с гетерогенными вариантами лечения. Это соответствует от 40000 до 50000 пациентов в год в США и от 60000 до 70000 в Европе. Несмотря на успехи в лечении, в основном за счет ранней реваскуляризации с последующим снижением смертности, CS остается ведущей причиной смерти при AMI, где уровень смертности по-прежнему приближается к 40-50% согласно последним данным и рандомизированным исследованиям (Goldberg et al. 2009. Circulation 119: 1211-1219.

Обструктивный шок возникает из-за физической непроходимости крупных сосудов или самого сердца. К этой форме шока могут привести несколько состояний (например, тампонада сердца, напряженный пневмоторакс, тромбоэмболия легочной артерии, аортальный стеноз). Для обзора см. Koya and Paul 2018. Shock. StatPearls [Интернет]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2019-2018 Oct 27.

В зависимости от причины выделяют четыре типа распределительного шока: нейрогенный шок (снижение симпатической стимуляции, ведущее к снижению сосудистого тонуса), анафилактический шок, септический шок и шок вследствие адреналового криза. Помимо сепсиса, распределительный шок может быть вызван синдромом системной воспалительной реакции (SIRS) из-за состояний, отличных от инфекции, таких как панкреатит, ожоги или травмы. Другие причины включают синдром токсического шока (TSS), анафилаксию (внезапная тяжелая аллергическая реакция), недостаточность надпочечников (острое ухудшение хронической недостаточности надпочечников, разрушение или удаление надпочечников, подавление функции надпочечников из-за экзогенных стероидов, гипопитуитаризм и метаболический сбой выработки гормонов), реакции на лекарственные препараты или токсины, отравление тяжелыми металлами, печеночная (печени) недостаточность и поражение ЦНС. Для обзора см. Koya and Paul 2018. Shock. StatPearls [Интернет]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2019-2018 Oct 27.

В общем, рефрактерный шок определяется как необходимость инфузии норадреналина >0,5 мкг/кг/мин, несмотря на адекватное восполнение циркулирующей крови. Смертность у этих пациентов может достигать 94%, а оценка и лечение этих пациентов требует гораздо более агрессивного подхода для выживания. Термин «рефрактерный шок» используется, когда перфузия тканей не может быть восстановлена с помощью первоначальных корректирующих мер (например, вазопрессоров), и поэтому его можно назвать «в высокой степени вазопрессор-зависимым» или «вазопрессор-резистентным» шоком (Udupa and Shetty 2018. Indian J Respir Care 7: 67-72). Пациенты с рефрактерным шоком могут иметь признаки неадекватной перфузии, такие как гипотензия (среднее артериальное давление<65 мм рт.ст.), тахикардия, холодные периферические сосуды, удлинение времени капиллярного наполнения и тахипноэ вследствие гипоксии и ацидоза. Лихорадка может наблюдаться при септическом шоке. Также могут наблюдаться другие признаки гипоперфузии, такие как изменение чувствительности, гиперлактатемия и олигурия. Эти хорошо известные признаки шока не помогают определить, связана ли проблема с помпой (сердце) или с системой (сосуды и ткани). Могут сосуществовать различные типы шока, и все формы шока могут стать рефрактерными, о чем свидетельствует нечувствительность к высоким дозам вазопрессоров (Udupa and Shetty 2018. Indian J Respir Care 7: 67-72).

В конкретном варианте осуществления изобретения указанный рефрактерный шок является устойчивым к вазопрессорам, что определяется отсутствием реакции пациента на высокие дозы вазопрессоров (например,>0,5 мкг/кг/мин норадреналина).

Последствием диагностики или прогнозирования того, что у пациента либо разовьется вазопрессорно-резистентный рефрактерный шок, либо у него диагностирован вазопрессорно-резистентный рефрактерный шок, может быть назначение лечения, такого как введение ингибиторов ангиотензина II и/или ингибиторов DPP3. Кроме того, еще одним последствием может быть отказ от вазопрессоров.

В предпочтительном варианте осуществления указанного способа прогнозирования рефрактерного шока, в частности вазопрессорно-резистентного шока, у пациента, который потенциально может столкнуться с шоком, где прогнозируется, столкнется ли указанный пациент пациент с рефрактерным шоком, в частности вазопрессорно-резистентным шоком, с момента взятия образца в течение 14 дней, или, в частности, в течение 10 дней, или, в частности, в течение 7 дней, или, в частности, в течение 5 дней, или, в частности, в течение 48 часов, или, в частности, в течение 24 часов, или в частности в диапазоне от 24 до 48 часов.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками, и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или когда лечение вазопрессорами откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения.

Другой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где лечение вазопрессорами начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в указанном образец ниже определенного порогового значения, и/или где лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 ниже указанного заданного порогового значения.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где лечение вазопрессорами начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в указанном образец ниже определенного порогового значения и/или где лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 ниже указанного заданного порогового значения и определяют уровень проадреномедуллина или его фрагментов, и где лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень проадреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше заданного порогового значения, и/или где лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или их фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с настоящим изобретением, где

указанный пациент мог страдать острым коронарным синдромом (например, острым инфарктом миокарда) или где у указанного пациента сердечная недостаточность (например, острая декомпенсированная сердечная недостаточность), миокардит, аритмия, кардиомиопатия, клапанный порок сердца, расслоение аорты с острым аортальным стенозом, травматический разрыв хорды или массивная легочная эмболия (в случае кардиогенного шока), или

указанный пациент мог страдать геморрагическим заболеванием, включая желудочно-кишечное кровотечение, травму, сосудистые этиологии (например, разрыв аневризмы брюшной аорты, опухоль, прорастающую в крупный кровеносный сосуд) и спонтанное кровотечение в условиях применения антикоагулянтов или негеморрагическое заболевание, включая рвоту, диарею, почечная потеря, потеря кожи/неощутимая потеря (например, ожоги, тепловой удар) или потеря в третье пространства в условиях панкреатита, цирроза печени, кишечной непроходимости, травмы (в случае гиповолемического шока) или

указанный пациент мог страдать тампонадой сердца, напряженным пневмотораксом, легочной эмболией или аортальным стенозом (в случае обструктивного шока), или

у указанного пациента может быть септический шок, нейрогенный шок, анафилактический шок или шок вследствие надпочечникового криза (в случае дистрибутивного шока).

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, согласно настоящему изобретению, где указанный способ используется для начала и/или прекращения, и/или стратификации лечения, и/или руководства по лечению.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок согласно настоящему изобретению, где лечение начинают и/или продолжают, и/или откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения.

Объектом настоящего изобретения являются вазопрессоры, агонисты рецепторов ангиотензина и/или их предшественники, ингибиторы активности DPP3 и/или антитела против адреномедуллина или фрагменты антител против адреномедуллина для применения в способе предотвращения или лечения рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанное прогнозирование и/или диагностика указанного рефрактерного шока были проведены с помощью способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок согласно настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления вышеупомянутых способов определяют уровень белка DPP3 и/или уровень активного DPP3 и сравнивают с заданным пороговым значением, где уровень DPP3 определяют путем контакта указанного образца биологической жидкости со связывающим агентом захвата, который специфически связывается с DPP3.

Объектом настоящего изобретения являются агонисты рецепторов ангиотензина и/или их предшественники, ингибиторы активности DPP3 для применения в способе предотвращения или лечения рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанное прогнозирование и/или диагностика указанного рефрактерного шока были проведены с помощью способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок в соответствии с настоящим изобретением, где лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или откладывают и/или прекращают лечение вазопрессорами, если указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения.

Объектом настоящего изобретения являются агонисты рецепторов ангиотензина и/или их предшественники, ингибиторы активности DPP3 для применения в способе предотвращения или лечения рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанное прогнозирование и/или диагностика указанного рефрактерного шока были проведены с помощью способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с настоящим изобретением, где лечение вазопрессорами начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в указанном образце ниже определенного порогового значения, и/или где лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 ниже указанного заданного порогового значения.

Объектом настоящего изобретения является антитело против ADM или фрагмент антитела против ADM для применения в способе предотвращения или лечения рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанное прогнозирование и/или диагностика указанного рефрактерного шока были проведены с помощью способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок согласно настоящему изобретению, где дополнительно определяют уровень проадреномедуллина или его фрагментов, и где лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или когда лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM и/или агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, если уровень проадреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, а указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения DPP3.

Объектом настоящего изобретения является антитело против ADM или фрагмент антитела против ADM и/или ингибитор активности DPP3 для применения в способе предотвращения или лечения рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у него развился шок, где указанное прогнозирование и/или диагностика указанного рефрактерного шока были проведены с помощью способа прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок согласно настоящему изобретению, где лечение с помощью антитела против ADM или фрагмента антитела против ADM, и/или агонистов рецептора ангиотензина, и/или их предшественников, и/или ингибиторов активности DPP3 начинают и/или продолжают, если уровень проадреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения DPP3.

В конкретном варианте осуществления изобретения пороговое значение находится в диапазоне пороговых значений для DPP3 в плазме, который составляет от 20 до 200 нг/мл, предпочтительно от 25 до 150 нг/мл, еще более предпочтительно от 30 до 100 нг/мл, еще более предпочтительно от 35 до 75 нг/мл, наиболее предпочтительно применяется пороговое значение 50 нг/мл.

В частности, рефрактерный шок у указанного пациента представляет собой вазопрессорно-резистентный шок.

Пептид адреномедуллин (ADM) был описан как новый гипотензивный пептид, содержащий 52 аминокислоты, который был выделен из феохромоцитомы человека (Kitamura et al. 1993. Biochemical and Biophysical Research Communications 192 (2): 553-560). Отщепление N-концевой сигнальной последовательности из 21 аминокислоты от пре-про-адреномедуллина (пре-про-ADM) приводит к образованию пептида-предшественника про-адреномедуллина (про-ADM) (SEQ ID No.: 31). Pro-ADM далее расщепляется на PAMP (SEQ ID No. 32), MR-proADM (SEQ ID No. 33), ADM-Gly (SEQ ID No.: 35) и CT-proADM. (SEQ ID No. 36). Зрелый адреномедуллиновый пептид представляет собой амидированный пептид (ADM-NH2), который содержит 52 аминокислоты (SEQ ID No: 34) и содержит аминокислоты с 95 по 146 пре-проADM, из которых он образуется путем протеолитического расщепления. Зрелый ADM, био-ADM и ADM-NH2 используются как синонимы в данной заявке и представляют собой молекулу в соответствии с SEQ ID No.: 34.

В одном варианте осуществления объекта настоящего изобретения указанный фрагмент про-адреномедуллина выбран из группы, включающей PAMP (SEQ ID No. 32), MR-proADM (SEQ ID No. 33), амидированный ADM (SEQ ID No. 34), ADM-Gly (SEQ ID No. 35) и CT-proADM (SEQ ID No. 36).

ADM можно рассматривать как полифункциональный регуляторный пептид. Он высвобождается в кровоток частично в неактивной форме, дополненной глицином (Kitamura et al. 1998. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244(2): 551-555). Существует также связывающий белок (Pio et al. 2001. The Journal of Biological Chemistry 276(15): 12292-12300), который специфичен для ADM и, вероятно, аналогичным образом модулирует эффект ADM.

Те физиологические эффекты ADM, а также PAMP, которые имеют первостепенное значение в исследованиях на сегодняшний день, представляют собой эффекты, влияющие на кровяное давление. Таким образом, ADM является эффективным сосудорасширяющим средством. Было обнаружено, что концентрации ADM, которые можно измерить в кровотоке и других биологических жидкостях, при ряде патологических состояний значительно превышают концентрации, обнаруживаемые у здоровых лиц контрольной группы. Так, уровень ADM у больных с застойной сердечной недостаточностью, инфарктом миокарда, заболеваниями почек, гипертоническими расстройствами, сахарным диабетом, в острой фазе шока, а также при сепсисе и септическом шоке достоверно повышен, хотя и в разной степени. Концентрации PAMP также увеличиваются при некоторых из указанных патологических состояний, но уровни в плазме снижаются по сравнению с ADM (Eto et al. 2001. Peptides 22: 1693-1711).

Кроме того, известно, что необычайно высокие концентрации ADM наблюдаются при сепсисе или септическом шоке (Eto et al. 2001. Peptides 22: 1693-1711; Hirata et al. 1996. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81(4): 1449-1453; Ehlenz et al.1997. Exp Clin Endocrinol Diabetes 105: 156-162; Tomoda et al. 2001. Peptides 22: 1783-1794; Ueda et al. 1999 Am.J. Respir. Crit. Care Med.160: 132-136; Wang et al. 2001. Peptides 22: 1835-1840). Полученные данные связаны с типичными гемодинамическими изменениями, известными как типичные явления течения болезни у больных с сепсисом и другими тяжелыми синдромами, такими как, например, SIRS. Адреномедуллин играет ключевую роль в развитии сепсиса (Wang, Shock 1998, 10(5):383-384; Wang et al. 1998. Archives of surgery 133(12): 1298-1304) и при многочисленных острых и хронических заболеваниях (Parlapiano et al. 1999. European Review for Medical and Pharmacological Sciences 3:53-61; Hinson et al. 2000 Endocrine Reviews 21(2):138-167).

MR-proADM был идентифицирован как прогностический маркер, способный стратифицировать риск смертности у пациентов с сепсисом с различной степенью органной недостаточности. Это может быть полезно для раннего выявления и оценки индивидуального риска сепсиса, а также может облегчить последующее клиническое ведение сепсиса и септического шока (см. обзор Önal et al. 2018. Healthcare 6: 110).

Было описано несколько методов измерения циркулирующих уровней ADM: либо ADM прямо, либо косвенно путем определения более стабильного фрагмента его родственного пептида-предшественника. Недавно был опубликован метод, описывающий анализ для измерения циркулирующего зрелого ADM (Weber et al. 2017. JALM 2: 222-233).

Были описаны другие методы количественного определения фрагментов, полученных из предшественника ADM, например, измерение MR-proADM (Morgenthaler et al. 2005. Clin Chem 51(10):1823-9), PAMP (Washimine et al. 1994. Biochem Biophys Res Commun 202(2):1081-7) и CT-proADM (EP 2 111 552). Доступен коммерческий гомогенный иммунофлуоресцентный анализ с временным разрешением для измерения MR-proADM в плазме на полностью автоматизированной системе (BRAHMS MR-proADM KRYPTOR; BRAHMS GmbH, Хеннигсдорф, Германия) (Caruhel et al. 2009. Clin Biochem 42(7-8):725-8). Поскольку эти пептиды образуются в стехиометрическом соотношении из одного и того же предшественника, их уровни в плазме в определенной степени коррелируют.

Получение антител против ADM известно в данной области (например, WO 2013072512 и WO 2019057992, включенные в настоящее описание в качестве ссылки).

Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM или фрагменту антитела против ADM для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанное антитело или фрагмент или каркас связываются с N-концевой частью (аминокислоты 1-21) зрелого ADM: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID No. 37).

В другом предпочтительном варианте осуществления указанное антитело против ADM или фрагмент антитела против ADM распознает и связывается с N-концом (aa1) ADM. N-конец означает, что аминокислота 1, то есть «Y» в SEQ ID No. 34 и 35, является обязательной для связывания антитела. Указанное антитело или его фрагмент или каркас, не относящийся к Ig, не будут связываться ни с удлиненным на N-конце, ни с модифицированным на N-конце ADM, ни с ADM, расщепленным на N-конце.

Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM или фрагменту антитела против ADM для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанное антитело или фрагмент представляет собой моноклональное антитело человека или фрагмент, которое связывается с N-концевой областью (аминокислоты 1-21) зрелого ADM (SEQ ID No. 37), или фрагмент антитела, где тяжелая цепь содержит последовательности:

GYTFSRYW (CDR1: SEQ ID NO: 38), ILPGSGST (CDR2: SEQ ID NO: 39), TEGYEYDGFDY (CDR3: SEQ ID NO: 40) и

где легкая цепь содержит последовательности:

QSIVYSNGNTY (CDR1: SEQ ID NO: 41), RVS (CDR2), FQGSHIPYT (CDR3: SEQ ID NO: 42).

Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM или фрагменту антитела против ADM для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело, содержащее следующую последовательность в качестве тяжелой цепи:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO: 43)

и где указанное моноклональное антитело содержит следующую последовательность в качестве легкой цепи:

DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 44).

Эндотелиальная дисфункция может быть результатом и/или способствовать развитию нескольких болезненных процессов, например, шока, особенно септического шока. Из доклинических экспериментов на моделях сепсиса/септического шока известно, что введение антитела против ADM вызывает увеличение концентрации био-ADM в плазме, что совпадает с увеличением выживаемости (Struck et al. 2013. Intensive Care Med Exp 1(1):22). Механизм, лежащий в основе этого эффекта, описан Geven et al. 2018 (Geven et al. 2018. SHOCK 50 (2): 132-140). Вкратце, антитело при внутривенном введении из-за своего размера не может проникнуть через эндотелиальный барьер в интерстиций, но остается в кровотоке. Напротив, ADM в виде небольшого пептида может свободно диффундировать через эндотелиальный барьер. Таким образом, антитело при введении в значительном молярном избытке по сравнению с эндогенным ADM связывает практически весь ADM в плазме и, как простое следствие достижения равновесия связывания, приводит к транслокации ADM из интерстиция в кровоток. Интерстициально расположенный ADM может связываться с гладкомышечными клетками сосудов и индуцировать релаксацию, приводящую к вазодилатации. Это уменьшается введением антитела. С другой стороны, ADM в плазме связывается с эндотелиальными клетками и тем самым стабилизирует или даже восстанавливает целостность сосудов. Таким образом, эта функция усиливается, когда уровни ADM в плазме повышаются вследствие введения антитела, которое не является нейтрализующим антителом. Наконец, связывание антитела с ADM снижает протеолитический распад ADM. В совокупности, антитело против ADM, адрецизумаб, может восстанавливать функцию эндотелия при шоке, например, при септическом шоке.

Если указанный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов выше определенного порогового значения уровня, то в качестве терапии вводят антитело против ADM или фрагмент антитела против ADM, связывающиеся с ADM.

Это означает, что в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное антитело против ADM или фрагмент антитела против ADM, связывающееся с ADM, предназначено для терапии, где образец биологической жидкости, взятый у указанных пациентов, демонстрирует повышенный уровень proADM и/или его фрагментов, имеющих по меньшей мере на 5 аминокислот выше определенного порогового значения. Таким образом, метод диагностики с использованием указанного proADM и/или его фрагментов служит дополнительным методом диагностики.

В конкретном варианте осуществления изобретения пороговое значение находится в пределах диапазона пороговых значений для ADM-NH2 в плазме, который составляет от 50 до 250 пг/мл, предпочтительно от 55 до 200 пг/мл, еще более предпочтительно от 60 до 150 пг/мл, даже более предпочтительно от 65 до 100 пг/мл, наиболее предпочтительно применяется пороговое значение 70 пг/мл.

В конкретном варианте осуществления изобретения пороговое значение находится в пределах диапазона пороговых значений для MR-proADM в плазме, который составляет от 0,5 до 3 нмоль/л, предпочтительно от 0,6 до 2 нмоль/л, еще более предпочтительно от 0,7 до 1 нг/мл, наиболее предпочтительно применяется пороговое значение 0,8 нмоль/л.

В конкретном варианте осуществления изобретения пороговое значение находится в пределах диапазона пороговых значений для CT-proADM в плазме, который составляет от 85 до 500 пмоль/л, предпочтительно от 90 до 350 пмоль/л, еще более предпочтительно от 95 до 250 пмоль/л, даже более предпочтительно от 100 до 200 пмоль/л, наиболее предпочтительно применяется пороговое значение 150 пмоль/л.

Уровни ADM-NH2 по настоящему изобретению или уровни proADM или их фрагментов, соответственно, определяли с помощью описанного анализа ADM-NH2, как указано в примерах (или анализов proADM или его фрагментов, соответственно) (Weber et al. 2017. JALM 2(2):1-4). Уровни DPP3 по настоящему изобретению определяли с помощью описанных анализов DPP3, как указано в примерах. Упомянутые выше пороговые значения могут отличаться в других анализах, если они были откалиброваны иначе, чем системы анализа, используемые в настоящем изобретении. Следовательно, упомянутые выше пороговые значения должны применяться для таких анализов с различной калибровкой, соответственно, принимая во внимание различия в калибровке. Одной из возможностей количественной оценки различий в калибровке является сравнительный анализ методов (корреляция) рассматриваемого анализа с соответствующим анализом биомаркеров, используемым в настоящем изобретении, путем измерения соответствующего биомаркера (например, био-ADM, DPP3) в образцах с использованием обоих методов. Другая возможность состоит в том, чтобы определить с помощью рассматриваемого анализа, при условии, что этот тест имеет достаточную аналитическую чувствительность, средний уровень биомаркеров репрезентативной нормальной популяции, сравнить результаты со средними уровнями биомаркеров, как описано в литературе, и пересчитать калибровку на основе полученной разницы по этому сравнению. С помощью калибровки, используемой в настоящем изобретении, были измерены образцы от нормальных (здоровых) пациентов: медиана био-ADM в плазме (зрелый ADM-NH2) составила 24,7 пг/мл, наименьшее значение 11 пг/мл и 99-й процентиль 43 пг/мл (Marino et al. 2014. Critical Care 18:R34). С помощью калибровки, используемой в настоящем изобретении, были измерены образцы от 5400 нормальных (здоровых) пациентов (шведское одноцентровое проспективное популяционное исследование (MPP-RES)): медиана (межквартильный диапазон) DPP3 в плазме составила 14,5 нг/мл (11,3 нг/мл - 19 нг/мл).

Медиана концентрации MR-proADM в плазме у нормальных (здоровых) пациентов составляла 0,41 (межквартильный диапазон 0,23-0,64) нмоль/л (Smith et al. 2009. Clin Chem 55:1593-1595) с использованием автоматизированного сэндвич-флуоресцентного анализа для детектирования MR-proADM, как описано у Caruhel et al. (Caruhel et al. 2009. Clin Biochem 42(7-8):725-8).

Средняя концентрация CT-proADM в плазме у здоровых пациентов (n=200) составила 77,6 пмоль/л (мин. 46,6 пмоль/л, макс.136,2 пмоль/л), а 95% процентиль составил 113,8 пмоль/л (EP 2111552 B1).

В конкретном варианте осуществления изобретения пороговое значение для ADM-NH2 в плазме представляет собой 5-кратную медианную концентрацию, предпочтительно 4-кратную медианную концентрацию, более предпочтительно 3-кратную медианную концентрацию, наиболее предпочтительно 2-кратную медианную концентрацию нормальной здоровой популяции.

В конкретном варианте осуществления изобретения пороговое значение для MR-proADM в плазме представляет собой 5-кратную медианную концентрацию, предпочтительно 4-кратную медианную концентрацию, более предпочтительно 3-кратную медианную концентрацию, наиболее предпочтительно 2-кратную медианную концентрацию нормальной здоровой популяции.

В конкретном варианте осуществления изобретения пороговое значение для CT-proADM в плазме представляет собой 5-кратную медианную концентрацию, предпочтительно 4-кратную медианную концентрацию, более предпочтительно 3-кратную медианную концентрацию, наиболее предпочтительно 2-кратную медианную концентрацию нормальной здоровой популяции.

В вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против ADM или фрагмент антитела против ADM для применения при лечении пациента можно вводить в дозе по меньшей мере 0,5 мг/на кг массы тела, в частности, по меньшей мере 1 мг/на кг массы тела, более конкретно, от 1 до 20 мг/на кг массы тела, например, от 2 до 10 мг/на кг массы тела, от 2 до 8 мг/на кг массы тела или от 2 до 5 мг/на кг массы тела.

Один вариант осуществления изобретения относится к вазопрессору для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже заданного порогового значения, при определении любым из способов прогнозирования или диагностики рефрактерного шока согласно настоящему изобретению.

Другой вариант осуществления изобретения относится к вазопрессору для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный вазопрессор выбран из группы, включающей дофамин, норадреналин, эквивалент норадреналина, адреналин, фенилэфрин и вазопрессин.

Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к вазопрессору для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный вазопрессор вводят указанному пациенту в виде фармацевтической композиции.

Другой вариант осуществления изобретения относится к вазопрессору для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где у указанного пациента артериальное давление равно или ниже 65 мм рт.ст.

Другой вариант осуществления изобретения относится к ингибитору активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости, который находится выше заданного порогового значения при определении методом, описанным в вышеупомянутых вариантах осуществления.

Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к ингибитору активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где ингибитор активности DPP3 выбран из группы, включающей антитело против DPP3, или фрагмент антитела против DPP3, или каркас против DPP3, не относящийся к Ig.

Один вариант осуществления изобретения относится к ингибитору активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный ингибитор имеет минимальную аффинность связывания с DPP3, равную или меньше 10^-7 М.

Другой вариант осуществления изобретения относится к ингибитору активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где ингибитором активности DPP3 является антитело.

Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к ингибитору активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный ингибитор представляет собой моноклональное антитело.

Другой вариант осуществления изобретения относится к ингибитору активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный ингибитор представляет собой моноклональное антитело, в котором определяющие комплементарность области (CDR) в тяжелой цепи содержат последовательности: SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8 и/или SEQ ID NO.: 9, а определяющие комплементарность области (CDR) в легкой цепи содержат последовательности: SEQ ID NO.: 10, KVS и/или SEQ ID NO.: 11.

Другой вариант осуществления изобретения относится к ингибитору активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный ингибитор представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или фрагмент гуманизированного моноклонального антитела, где тяжелая цепь содержит последовательность: SEQ ID NO.: 12, а легкая цепь содержит последовательность: SEQ ID NO.: 13.

Указанный ингибитор активности DPP3 можно вводить путем ингаляции.

Один вариант осуществления изобретения относится к ингибитору активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный ингибитор вводят в комбинации с агонистом рецептора ангиотензина и/или с его предшественниками.

Другой вариант осуществления изобретения относится к ингибитору активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественники выбраны из группы, включающей ангиотензин I, ангиотензин II, ангиотензин III, ангиотензин IV, в частности ангиотензин II.

Другой вариант осуществления изобретения относится к агонистам рецепторов ангиотензина и/или их предшественникам, и/или ингибиторам активности DPP3 для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где лечение указанными агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце указанного пациента выше определенного порогового значения, и/или когда лечение вазопрессорами откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения.

Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к вазопрессору для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где лечение указанным вазопрессором начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже определенного порогового значения и/или где лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 ниже указанного заданного порогового значения.

Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к вазопрессору для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где лечение указанным вазопрессором начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже определенного порогового значения и/или где лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 ниже указанного заданного порогового значения, и где определяют уровень про-адреномедуллина или его фрагментов, и где лечение указанным антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или где лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

Другой вариант осуществления изобретения относится к агонистам рецепторов ангиотензина и/или их предшественникам, и/или ингибиторам активности DPP3 для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где лечение с помощью указанного вазопрессора начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже определенного порогового значения, и/или где лечении агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками, и/или ингибиторами активности DPP3 откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 ниже указанного заданного порогового значения, и где определяют уровень про-адреномедуллина или его фрагментов, и где лечение указанным антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или когда лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM или фрагменту антитела против ADM для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где лечение указанным антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM и/или агонистами рецептора ангиотензина, и/или их предшественниками, и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, если уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения и указанный определенный уровень DPP3 выше упомянутого заданного порогового значения DPP3.

В случае определения уровня про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце и определения уровня DPP3 в указанном образце указанное определение может быть проведено с помощью устройства для оказания медицинской помощи, которое обеспечивает одновременно: тест на определение уровня про- адреномедуллин или его фрагментов и тест для определения уровня DPP3 в указанном образце.

Начало лечения агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественником показано, когда у пациента количество белка DPP3 и/или активность DPP3 в образце биологической жидкости превышает заданный пороговый уровень.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, причем указанный способ включает введение вазопрессора указанному пациенту, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже заданного порогового значения при определении способом, описанным в предыдущих вариантах осуществления.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение указанному пациенту вазопрессора, где указанный вазопрессор выбирают из группы, включающей дофамин, норадреналин, эквивалент норадреналина, эпинефрин, фенилэфрин и вазопрессин.

Конкретный вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение вазопрессора указанному пациенту, где указанный вазопрессор вводят указанному пациенту в фармацевтическом составе.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, причем указанный способ включает введение вазопрессора указанному пациенту, где указанный пациент имеет артериальное давление, равное или меньше 65 мм рт.ст.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, причем указанный способ включает введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента, который превышает заданное пороговое значение при определении способом, описанным в предыдущих вариантах осуществления.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где ингибитор активности DPP3 выбран из группы, включающей антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, или каркас против DPP3, не относящийся к Ig.

Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение указанному пациенту ингибитора активности DPP3, где указанный ингибитор обладает минимальной аффинностью связывания с DPP3, равной или меньше 10^-7 М.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где ингибитором активности DPP3 является антитело.

Один вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение указанному пациенту ингибитора активности DPP3, причем указанный ингибитор представляет собой моноклональное антитело.

Один конкретный вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, причем указанный ингибитор представляет собой моноклональное антитело, где определяющие комплементарность области (CDR) в тяжелой цепи содержат последовательности: SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8 и/или SEQ ID NO.: 9 и определяющие комплементарность области (CDR) в легкой цепи содержат последовательности: SEQ ID NO.: 10, KVS и/или SEQ ID NO.: 11.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение указанному пациенту ингибитора активности DPP3, где указанный ингибитор представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или фрагмент гуманизированного моноклонального антитела, где тяжелая цепь содержит последовательность: SEQ ID NO.: 12, а легкая цепь содержит последовательность: SEQ ID NO.: 13.

Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где указанный ингибитор вводят в комбинации с агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественниками.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где указанный агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественники выбирают из группы, включающей ангиотензин I, ангиотензин II, ангиотензин III, ангиотензин IV, в частности ангиотензин II.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный способ включает введение агонистов рецептора ангиотензина и/или их предшественников и/или ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где лечение указанными агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце указанного пациента выше определенного порогового значения и/или где лечение вазопрессорами откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения.

Один вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение вазопрессора указанному пациенту, где лечение указанными вазопрессорами начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже определенного порогового значения, и/или где лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 ниже указанного заданного порогового значения.

Один вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный способ включает введение агонистов рецептора ангиотензина и/или их предшественников и/или ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где лечение указанными агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце указанного пациента выше определенного порогового значения и/или где лечение вазопрессорами откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения, и где определяют уровень про-адреномедуллина или его фрагментов, и где лечение указанным антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или когда лечение с помощью антитела против ADM или фрагмента антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

Один конкретный вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный способ включает введение вазопрессора указанному пациенту, где лечение указанными вазопрессорами начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже определенного порогового значения и/или когда лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 ниже указанного заданного порогового значения, и где определяют уровень про-адреномедуллина или его фрагментов и где лечение указанным антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или где лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение антитела против ADM или фрагмента антитела против ADM указанному пациенту, где определяют уровень про-адреномедуллина или его фрагментов, и где лечение указанным антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или где лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения, и где лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце указанного пациента выше определенного порогового значения, и/или когда лечение вазопрессорами откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения.

Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к способу лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение антитела против ADM или фрагмента антитела против ADM указанному пациенту, где лечение указанными антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM и/или агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, если уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения DPP3.

Агонист означает химическое вещество, которое связывается с рецептором и активирует рецептор, вызывая биологический ответ.Рецепторы могут быть активированы либо эндогенными агонистами (такими как гормоны и нейротрансмиттеры), либо экзогенными агонистами (такими как лекарства), что приводит к биологическому ответу. Полные агонисты связываются с рецептором и активируют его с максимальным ответом, который агонист может вызвать на рецепторе. Частичные агонисты представляют собой лекарственные средства, которые связываются с данным рецептором и активируют его, но обладают лишь частичной эффективностью в отношении рецептора по сравнению с полным агонистом. Эффективность представляет собой количество агониста, необходимое для получения желаемого ответа. Эффективность агониста обратно пропорциональна его значению EC50. EC50 можно измерить для данного агониста путем определения концентрации агониста, необходимой для получения половины максимального биологического ответа агониста. Значение EC50 полезно для сравнения эффективности лекарственных средств с аналогичной эффективностью, производящих физиологически сходные эффекты. Чем меньше значение EC50, тем выше эффективность агониста и тем ниже концентрация лекарственного средства, необходимая для получения максимального биологического ответа.

Лечение агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественником можно продолжать до тех пор, пока у пациента уровень белка DPP3 и/или активность DPP3 в образце биологической жидкости превышает заданный пороговый уровень.

Количество белка DPP3 и/или активность DPP3 измеряют по меньшей мере каждые 24 часа, предпочтительно каждые 12 часов, более предпочтительно каждые 8 часов, еще более предпочтительно каждые 6 часов, еще более предпочтительно каждые 4 часа, еще более предпочтительно каждые 2 часа, еще более предпочтительно каждый час, наиболее предпочтительно каждые 30 минут.

Лечение агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественником может быть прекращено, когда у пациента количество белка DPP3 и/или активность DPP3 в образце биологической жидкости ниже заданного порогового уровня.

Ангиотензиновые терапевтические средства:

Ангиотензин I, также называемый проангиотензином, образуется в результате действия ренина на ангиотензиноген. Ренин расщепляет пептидную связь между остатками лейцина (Leu) и валина (Val) на ангиотензиногене, создавая декапептид (десять аминокислот) (des-Asp) ангиотензин I. Ангиотензин I превращается в ангиотензин II путем удаления двух С-концевых остатки ферментом ангиотензинпревращающим ферментом (ACE), главным образом через ACE в легких (но также присутствуют в эндотелиальных клетках, эпителиальных клетках почек и головном мозге).

Ангиотензин II, ангиотензин III и ангиотензин IV являются пептидными гормонами, естественным образом вырабатываемыми организмом, которые регулируют кровяное давление посредством вазоконстрикции и реабсорбции натрия. Гемодинамические эффекты введения ангиотензина II были предметом многочисленных клинических исследований, демонстрирующих значительное влияние на системный и почечный кровоток (Harrison-Bernard, L.M., The renal renin-angiotensin system. Adv Physiol Educ, 33(4): 270 (2009)).

Ангиотензин II представляет собой гормон, продуцируемый ренин-ангиотензин-альдостероновой системой (RAAS), который модулирует артериальное давление посредством регуляции тонуса гладкой мускулатуры сосудов и гомеостаза внеклеточной жидкости. Ангиотензин II опосредует свое действие на сосудистую сеть, индуцируя вазоконстрикцию и задержку натрия, и поэтому является мишенью многих терапий гипертонии. Помимо системных эффектов, ангиотензин II оказывает выраженное влияние на эфферентные артериолы почек, поддерживая клубочковую фильтрацию при снижении кровотока. Ангиотензин II также регулирует реабсорбцию натрия в почках, стимулируя обменники Na+/H+в проксимальных канальцах и вызывая высвобождение альдостерона и вазопрессина (Harrison-Bernard 2009. The renal renin-angiotensin system. Adv Physiol Educ, 33(4): 270 (2009)).

Терапевтическое средство на основе ангиотензина II, которое можно использовать в композициях и способах по настоящему изобретению, может представлять собой Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 13), которое также называют 5-изолейцин ангиотензин II. SEQ ID NO: 13 представляет собой октапептид, естественным образом присутствующий у человека и других видов, таких как лошади, свиньи и т.д. Изолейцин может быть заменен валином с образованием 5-валин ангиотензина II, Asp-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 14). Другие аналоги ангиотензина II, такие как [Asn¹-Phe⁴]-ангиотензин II (SEQ ID NO: 15), гексапептид Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 16), нонапептид Asn-Arg-Val-Tyr -Tyr-Val-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 17), [Asn¹Ile⁵Ile⁸]-ангиотензин II (SEQ ID NO: 18), [Asn¹-lle⁵-Ala⁸]-ангиотензин II (SEQ ID NO: 19), и [Asn¹-дийод-Tyr⁴-Ile⁵-ангиотензин II (SEQ ID NO: 20) также можно использовать. Ангиотензин II может быть синтезирован, например, с помощью твердофазного пептидного синтеза для включения модификаций, таких как С-концевое амидирование. Термин «ангиотензин II» без дополнительной конкретики предназначен для обозначения любой из этих различных форм, а также их комбинаций.

В некоторых аспектах композиция, содержащая ангиотензин II, может быть выбрана из 5-валин-ангиотензина, амида 5-валин-ангиотензина II, 5-L-изолейцин-ангиотензина II и амида 5-L-изолейцин-ангиотензина II или его фармацевтически приемлемой соли, предпочтительно полученных в текущих хороших производственных условиях (cGMP). В некоторых аспектах композиция может включать различные формы ангиотензина II в различных процентных соотношениях, например, смесь гексапептида и нонапептида ангиотензина II. Композиция, содержащая ангиотензин II, может подходить для парентерального введения, например, для инъекции или внутривенной инфузии.

Последовательность ангиотензина II, используемая в композициях и способах, раскрытых в настоящем документе, может быть гомологичной последовательностям ангиотензина II, описанным выше. В некоторых аспектах изобретение включает выделенные, синтетические или рекомбинантные аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID NO: 13., 14, 15, 16, 17, 18, 19 и/или 20. Любые такие вариантные последовательности можно использовать вместо ангиотензина II, как описано в предыдущем абзаце.

Идентичность последовательности для всех последовательностей определяется в соответствии со следующим методом: процент идентичности рассчитывается путем умножения количества совпадений в паре на 100 и деления на длину выровненной области, включая пробелы (процент идентичности=[совпадения x 100]/ Длина выровненной области [с пробелами]).

Ангиотензин III является метаболитом ангиотензина II с приблизительно 40% активностью ангиотензина II. Терапевтическое средство на основе ангиотензина III, которое можно использовать в композициях и способах по настоящему изобретению, может представлять собой Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 21). SEQ ID NO: 21 представляет собой гептапептид, естественным образом присутствующий у человека и других видов, таких как лошади, свиньи и т.д. Изолейцин может быть заменен валином с получением Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 22). Другие аналоги ангиотензина III, такие как [Phe³]-ангиотензин III (SEQ ID NO: 23), [Ile⁴-Ala⁷]-ангиотензин III (SEQ ID NO: 24) и [дииодо-Tyr³-Ile⁴]-ангиотензин III (SEQ ID NO: 25) также можно использовать. Ангиотензин III может быть синтезирован, например, с помощью твердофазного пептидного синтеза для включения модификаций, таких как С-концевое амидирование. Термин «ангиотензин III» без дополнительной конкретики предназначен для обозначения любой из этих различных форм, а также их комбинаций.

В некоторых аспектах композиция, содержащая ангиотензин III, может быть выбрана из 4-валинангиотензина III, амида 4-валинангиотензина III, 4-L-изолейцинангиотензина III и амида 4-L-изолейцин-ангиотензина III или его фармацевтически приемлемой соли, предпочтительно полученных в текущих хороших производственных условиях (cGMP). Композиция, содержащая ангиотензин III, может подходить для парентерального введения, например, для инъекции или внутривенной инфузии.

Последовательность ангиотензина III, используемая в композициях и способах, раскрытых в настоящем документе, может быть гомологичной последовательностям ангиотензина III, описанным выше. В некоторых аспектах изобретение включает выделенные, синтетические или рекомбинантные аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID NO: 13., 14, 15, 16, 17, 18, 19 и/или 20. Любые такие вариантные последовательности можно использовать вместо ангиотензина II, как описано в предыдущем абзаце.

Ангиотензин IV является метаболитом ангиотензина III с меньшей активностью, чем у ангиотензина II. Терапевтическое средство на основе ангиотензина IV, которое можно использовать в композициях и способах по настоящему изобретению, может представлять собой Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 26). SEQ ID NO: 26 представляет собой гексапептид, естественным образом присутствующий в организме человека и других видов. Изолейцин может быть заменен валином с получением Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 27). Другие аналоги ангиотензина IV, такие как [Phe²]-ангиотензин III (SEQ ID NO: 28), [Ile³-Ala⁶]-ангиотензин IV (SEQ ID NO: 29) и [дииодо-Tyr²-Ile³]-ангиотензин IV (SEQ ID NO: 30) также можно использовать. Ангиотензин IV может быть синтезирован, например, с помощью твердофазного пептидного синтеза для включения модификаций, таких как С-концевое амидирование. Термин «ангиотензин IV» без дополнительной конкретики предназначен для обозначения любой из этих различных форм, а также их комбинаций.

В некоторых аспектах композиция, содержащая ангиотензин IV, может быть выбрана из 3-валинангиотензина IV, амида 3-валинангиотензина IV, 3-L-изолейцинангиотензина IV и амида 3-L-изолейцинангиотензина IV или его фармацевтически приемлемой соли, предпочтительно произведенной в современных хороших производственных условиях (cGMP). Композиция, содержащая ангиотензин IV, может подходить для парентерального введения, например, для инъекции или внутривенной инфузии.

Последовательность ангиотензина IV, используемая в композициях и способах, раскрытых в настоящем описании, может быть гомологичной последовательностям ангиотензина IV, описанным выше. В некоторых аспектах изобретение включает выделенные, синтетические или рекомбинантные аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID NO: 13., 14, 15, 16, 17, 18, 19 и/или 20. Любые такие вариантные последовательности можно использовать вместо ангиотензина IV, как описано в предыдущем абзаце.

Терапевтическое средство на основе ангиотензина II, ангиотензина III или ангиотензина IV можно использовать в виде любой подходящей соли (например, ацетата), формы со снятой защитой, ацетилированной формы, деацетилированной формы и/или пролекарственной формы вышеупомянутых пептидов, включая пэгилированные формы пептидов или конъюгаты, как описано в патентной публикации США 2011/0081371 (включенной посредством ссылки). Термин «пролекарство» относится к любому соединению-предшественнику, которое способно генерировать или высвобождать вышеупомянутый пептид в физиологических условиях. Такие пролекарства или предшественники могут представлять собой более крупные пептиды, которые селективно расщепляются для образования пептида по изобретению. Например, в некоторых аспектах пролекарство или предшественник могут представлять собой ангиотензиноген, ангиотензин I или его гомологи, из которых может быть получен ангиотензин II под действием определенных эндогенных или экзогенных ферментов. Дополнительные пролекарства или предшественники включают пептиды с защищенными аминокислотами, например, имеющие защитные группы у одной или более карбоновых кислот и/или аминогрупп.Подходящие защитные группы для аминогрупп включают бензилоксикарбонильную, трет-бутилоксикарбонильную (BOC), флуоренилметилоксикарбонильную (FMOC), формильную и ацетильную или ацильную группу. Подходящие защитные группы для группы карбоновой кислоты включают сложные эфиры, такие как бензиловые сложные эфиры или трет-бутиловые сложные эфиры. Настоящее изобретение также предусматривает применение ангиотензина II, ангиотензина III, ангиотензина IV и/или пептидов-предшественников, содержащих аминокислотные замены, делеции, вставки, причем замены и вставки включают стандартные D- и L-аминокислоты и модифицированные аминокислоты, такие как, например, амидированные и ацетилированные аминокислоты, где терапевтическая активность основной пептидной последовательности поддерживается на фармакологически полезном уровне.

В предпочтительном варианте осуществления ангиотензин II представляет собой ацетат ангиотензина II. Ацетат ангиотензина II представляет собой L-аспартил-L-аргинил-L-валил-L-тирозил-L-изолейцил-L-гистидил-L-пролил-L-фенилаланин, ацетатную соль. Ацетат противоиона присутствует в нестехиометрическом соотношении. Молекулярная формула ацетата ангиотензина II: C50H71N13O12⋅(C2H4O2)n; (n=количество молекул ацетата; теоретическое n=3) со средней молекулярной массой 1046,2 (в виде свободного основания).

Одним из вариантов осуществления изобретения является агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник для применения при лечении заболевания у пациента, где указанный пациент имеет некоторое количество белка DPP3 и/или активность DPP3 в образце биологической жидкости выше заданного порогового значения, где определение количества белка DPP3 и/или активности DPP3 в образце биологической жидкости используется в качестве руководства по терапии и/или мониторинга терапии для указанного лечения агонистом рецепторов ангиотензина и/или его предшественником.

В одном варианте осуществления изобретения количество белка DPP3 и/или активность DPP3 в образце биологической жидкости определяют перед лечением пациента агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественником. В одном варианте осуществления изобретения количество белка DPP3 и/или активность DPP3 в образце биологической жидкости определяют во время лечения пациента агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественником по меньшей мере один раз во время лечения, предпочтительно по меньшей мере два раза или предпочтительно по меньшей мере один раз в день во время лечения. В одном варианте осуществления изобретения количество белка DPP3 и/или активность DPP3 в образце биологической жидкости определяют после лечения пациента агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественником. В одном варианте осуществления изобретения количество белка DPP3 и/или активность DPP3 в образце биологической жидкости определяют до, и/или во время, и/или после лечения пациента агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественником.

Одним из вариантов осуществления изобретения является агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный пациент имеет определенное количество белка DPP3 и/или активность DPP3 в образце биологической жидкости выше заданного порогового значения, где указанный образец биологической жидкости указанного пациента выбран из цельной крови, плазмы крови и сыворотки крови.

Одним из вариантов осуществления изобретения является агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник вводят указанному пациенту в фармацевтическом составе.

Термин «фармацевтический состав» означает фармацевтический (активный) ингредиент в комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.

Одним из вариантов осуществления изобретения является агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник представляет собой ангиотензин II, и указанный фармацевтический состав представляет собой раствор, предпочтительно раствор, готовый к применению. В другом варианте осуществления предметом настоящего изобретения является также фармацевтический состав по настоящему изобретению, где указанный фармацевтический состав находится в высушенном состоянии для восстановления перед применением.

Фармацевтический состав, описанный в настоящем документе, может также содержать разбавители, наполнители, соли, буферы, стабилизаторы, солюбилизаторы и другие материалы, хорошо известные в данной области техники. Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к нетоксичному носителю, который можно вводить пациенту вместе с терапевтически эффективным веществом (таким как ангиотензин II) по настоящему изобретению и который не нарушает фармакологическую активность терапевтически эффективного вещества. Термин «фармацевтически приемлемый» означает нетоксичный материал, который не влияет на эффективность биологической активности активного(ых) ингредиента(ов).

Характеристики носителя будут зависеть от пути введения. Термин «вспомогательная» относится к добавке в составе или композиции, которая не является фармацевтически активным ингредиентом.

Термин «фармацевтический (активный) ингредиент» означает терапевтическую композицию, которую необязательно можно комбинировать с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами для получения фармацевтического состава или лекарственной формы.

Специалисту в данной области должно быть понятно, что выбор любого вспомогательного вещества может влиять на выбор любого другого вспомогательного вещества. Например, выбор конкретного вспомогательного вещества может препятствовать использованию одного или более дополнительных вспомогательных веществ, поскольку комбинация вспомогательных веществ может вызвать нежелательные эффекты. Вспомогательные вещества по изобретению могут включать, но не ограничиваются ими, со-растворители, солюбилизирующие агенты, буферы, агенты, регулирующие рН, наполнители, поверхностно-активные вещества, инкапсулирующие агенты, агенты, регулирующие тоничность, стабилизаторы, защитные средства и модификаторы вязкости.

В некоторых аспектах может оказаться полезным включение фармацевтически приемлемого носителя в композиции, раскрытые в настоящем описании.

В некоторых аспектах может оказаться полезным включение солюбилизирующего агента в композиции по изобретению. Солюбилизирующие агенты могут быть полезны для повышения растворимости любого из компонентов состава или композиции, включая терапевтически эффективное вещество (например, ангиотензин II, ангиотензин III или ангиотензин IV) или вспомогательное вещество. Солюбилизирующие агенты, описанные в настоящем документе, не предназначены для составления исчерпывающего списка, а предоставлены просто как иллюстративные солюбилизирующие агенты, которые можно использовать в композициях по изобретению. В некоторых аспектах солюбилизирующие агенты включают, но не ограничиваются ими, этиловый спирт, трет-бутиловый спирт, полиэтиленгликоль, глицерин, метилпарабен, пропилпарабен, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон и любые фармацевтически приемлемые соли и/или их комбинации.

В некоторых аспектах может быть полезно регулировать рН композиций путем включения рН-регулирующего агента в композиции по изобретению. Модификация рН состава или композиции может оказывать благотворное влияние, например, на стабильность или растворимость терапевтически эффективного вещества, или может быть полезна при создании состава или композиции, подходящих для парентерального введения. Агенты, регулирующие рН, хорошо известны в данной области техники. Соответственно, агенты, регулирующие рН, описанные в настоящем документе, не предназначены для составления исчерпывающего списка, а предоставлены просто в качестве примеров агентов, регулирующих рН, которые можно использовать в композициях по изобретению. Агенты, регулирующие рН, могут включать, например, кислоты и основания. В некоторых аспектах агент, регулирующий рН, включает, но не ограничивается ими, уксусную кислоту, соляную кислоту, фосфорную кислоту, гидроксид натрия, карбонат натрия и их комбинации.

pH композиций, как раскрыто в настоящем документе, может быть любым pH, которое обеспечивает желаемые свойства состава или композиции. Желательные свойства могут включать, например, стабильность терапевтически эффективного вещества (например, ангиотензина II, ангиотензина III или ангиотензина IV), повышенное удержание терапевтически эффективного вещества по сравнению с композициями при других pH и улучшенную эффективность фильтрации. В некоторых аспектах рН композиций по изобретению может составлять от примерно 3 до примерно 9, например, от примерно 5 до примерно 7. В конкретных аспектах pH композиций по изобретению может составлять 5,5±0,1, 5,6±0,1, 5,7±0,1, 5,8±0,1, 5,9±0,1, 6,0±0,1, 6,1±0,1, 6,2±0,1, 6,3±0,1, 6,4±0,1 или 6,5±0,1.

В некоторых аспектах может быть полезно буферизовать рН путем включения в композиции одного или более буферов. В некоторых аспектах буфер может иметь pKa, например, примерно 5,5, примерно 6 или примерно 6,5. Специалисту в данной области должно быть понятно, что подходящий буфер для включения в композиции по изобретению может быть выбран на основе его pKa и других свойств.

Буферы хорошо известны в данной области техники. Соответственно, буферы, описанные в настоящем документе, не предназначены для составления исчерпывающего списка, а представлены только как примеры буферов, которые можно использовать в композициях по изобретению. В некоторых аспектах буфер может включать одно или более из следующих веществ: Tris, Tris НС1, фосфат калия, фосфат натрия, цитрат натрия, аскорбат натрия, комбинации фосфатов натрия и калия, Tris/Tris НС1, бикарбонат натрия, аргининфосфат, гидрохлорид аргинина, гидрохлорид гистидина, какодилат, сукцинат, 2-(N-морфолино)этансульфокислота (MES), малеат, бис-Tris, фосфат, карбонат и любые фармацевтически приемлемые соли и/или их комбинации.

В некоторых аспектах может оказаться полезным включение поверхностно-активного вещества в композиции по изобретению. Поверхностно-активные вещества, как правило, снижают поверхностное натяжение жидкой композиции. Это может обеспечить полезные свойства, такие как повышенная легкость фильтрации. Поверхностно-активные вещества также могут действовать как эмульгаторы и/или солюбилизирующие агенты. Поверхностно-активные вещества хорошо известны в данной области техники. Соответственно, поверхностно-активные вещества, описанные в настоящем документе, не предназначены для составления исчерпывающего списка, а представлены просто в качестве примеров поверхностно-активных веществ, которые можно использовать в композициях по изобретению. Поверхностно-активные вещества, которые могут быть включены, включают, но не ограничиваются ими, сложные эфиры сорбитана, такие как полисорбаты (например, полисорбат 20 и полисорбат 80), липополисахариды, полиэтиленгликоли (например, ПЭГ 400 и ПЭГ 3000), полоксамеры (например, плюроники), этиленоксиды и полиэтиленоксиды (например, Triton X-100), сапонины, фосфолипиды (например, лецитин) и их комбинации.

В некоторых аспектах может оказаться полезным включение агента, регулирующего тоничность, в композиции по изобретению. Тоничность жидкой композиции является важным фактором при введении композиции пациенту, например, путем парентерального введения. Таким образом, агенты, регулирующие тоничность, могут быть использованы для того, чтобы сделать состав или композицию пригодными для введения. Агенты, регулирующие тоничность, хорошо известны в данной области. Соответственно, агенты, регулирующие тоничность, описанные в настоящем документе, не предназначены для составления исчерпывающего списка, а представлены просто в качестве примеров агентов, регулирующих тоничность, которые можно использовать в композициях по изобретению. Агенты, регулирующие тоничность, могут быть ионными или неионными и включают, но не ограничиваются ими, неорганические соли, аминокислоты, углеводы, сахара, сахарные спирты и углеводы. Примеры неорганических солей могут включать хлорид натрия, хлорид калия, сульфат натрия и сульфат калия. Примером аминокислоты является глицин. Примеры сахаров могут включать сахарные спирты, такие как глицерин, пропиленгликоль, глюкоза, сахароза, лактоза и маннит.

В некоторых аспектах может оказаться полезным включение стабилизирующего агента в композиции по изобретению. Стабилизирующие агенты помогают повысить стабильность терапевтически эффективного вещества в композициях по изобретению. Это может происходить, например, за счет снижения деградации или предотвращения агрегации терапевтически эффективного вещества. Не желая быть связанными теорией, механизмы повышения стабильности могут включать секвестрацию терапевтически эффективного вещества из растворителя или ингибирование свободнорадикального окисления антрациклинового соединения. Стабилизирующие агенты хорошо известны в данной области техники. Соответственно, стабилизаторы, описанные в настоящем документе, не предназначены для составления исчерпывающего списка, а представлены просто в качестве примеров стабилизаторов, которые можно использовать в композициях по изобретению. Стабилизирующие агенты могут включать, но не ограничиваются ими, эмульгаторы и поверхностно-активные вещества.

Композиции, раскрытые в настоящем документе, можно вводить различными обычными способами. В некоторых аспектах композиции по изобретению подходят для парентерального введения. Эти композиции можно вводить, например, внутрибрюшинно, внутривенно, внутрипочечно, подоболочечно или путем ингаляции. В некоторых аспектах композиции по изобретению вводят внутривенно. Специалисту в данной области должно быть понятно, что способ введения терапевтически эффективного вещества в составе или композиции по изобретению будет зависеть от таких факторов, как возраст, масса и физическое состояние пациента, проходящего лечение, а также от заболевания или состояния, подлежащего лечению. Таким образом, квалифицированный специалист сможет выбрать способ введения, оптимальный для пациента в каждом конкретном случае.

Агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник можно вводить любым подходящим способом, но обычно их вводят посредством непрерывной инфузии. Соответственно, увеличение или уменьшение скорости введения может быть достигнуто за счет изменения скорости потока внутривенной капельницы, изменения концентрации агента во внутривенной капельнице и т.д. Однако способ изменения скорости введения будет зависеть от способа введения терапевтического средства. Когда терапевтическое средство вводят через слизистую оболочку или чрескожно, скорость можно увеличить, например, путем замены на пластырь с более высокой скоростью высвобождения или трансдермальную композицию. Когда терапевтическое средство вводят перорально, скорость можно увеличить, например, за счет перехода на форму с более высокой дозой, введения дополнительных доз или введения лекарственных форм с контролируемым высвобождением с более высокой скоростью высвобождения.

Когда терапевтическое средство вводят путем ингаляции, скорость можно увеличить, например, путем введения дополнительных болюсов, более концентрированного болюса или болюса с более быстрым высвобождением. Другие способы введения (через подкожную инъекционную помпу, суппозиторий и т.д.) можно модулировать аналогичным образом, и снижение скорости введения может быть достигнуто за счет действия, противоположного действию, которое увеличивает скорость введения терапевтического средства.

Одним из вариантов осуществления изобретения является агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественником является ангиотензин II, который вводят со скоростью от 0,1 до 200 нг/кг/мин, предпочтительно от 1 до 100 нг/кг/мин, более предпочтительно от 2 до 80 нг/кг/мин, еще более предпочтительно от 5 до 60 нг/кг/мин, еще более предпочтительно от 10 до 50 нг/кг/мин, еще более предпочтительно от 15 до 40 нг/кг/мин, наиболее предпочтительно при скорости 20 нг/кг/мин.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения начальная доза (начальная скорость) ангиотензина II составляет 80 нг/кг/мин, более предпочтительно 40 нг/кг/мин, наиболее предпочтительно 20 нг/кг/мин посредством непрерывной внутривенной инфузии.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения при титровании ангиотензина II отслеживают реакцию артериального давления (например, среднее артериальное давление; MAP). Титрование ангиотензина II можно проводить каждые 60 минут, более предпочтительно каждые 45 минут, еще более предпочтительно каждые 30 минут, еще более предпочтительно каждые 15 минут, еще более предпочтительно каждые 10 минут, наиболее предпочтительно каждые 5 минут. Титрование ангиотензина II можно проводить с шагом до 40 нг/кг/мин, более предпочтительно до 20 нг/кг/мин, наиболее предпочтительно до 15 нг/кг/мин по мере необходимости до достижения или поддержания целевого артериального давления. В другом предпочтительном варианте осуществления доза не должна превышать 80 нг/кг/мин ангиотензина II в течение первых 3 часов лечения. Наиболее предпочтительно, чтобы поддерживающие дозы не превышали 40 нг/кг/мин, и можно использовать дозы до 1,25 нг/кг/мин.

В некоторых вариантах осуществления у пациента исходное среднее артериальное давление (MAP) составляет не более примерно 40 мм рт.ст., примерно 45 мм рт.ст., примерно 50 мм рт.ст., 55 мм рт.ст., примерно 60 мм рт.ст., примерно 65 мм рт.ст., примерно 70 мм рт.ст.или примерно 75 мм рт.ст.перед введением композиции. Способ может включать измерение среднего артериального давления в предсердии пациента и увеличение скорости введения ангиотензина II, если среднее артериальное давление составляет менее примерно 40 мм рт.ст., примерно 45 мм рт.ст., примерно 50 мм рт.ст., 55 мм рт.ст., примерно 60 мм рт.ст., примерно 65 мм рт.ст., примерно 70 мм рт.ст.или примерно 75 мм рт.ст.

В одном варианте осуществления пациент может получать вазопрессор (например, катехоламин, такой как норадреналин, эквивалент норадреналина, эпинефрин, допамин, фенилэфрин) или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления вазопрессор представляет собой вазопрессин (например, терлипрессин, аргипрессин, десмопрессин, фелипрессин, липрессин или орнипрессин).

Одним из вариантов осуществления изобретения является агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник, в частности ангиотензин II, вводят в комбинации с ингибитором DPP3.

Одним из вариантов осуществления изобретения является агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в комбинации с ингибитором DPP3, где указанный ингибитор DPP3 выбирают из группы, включающей антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, или каркас против DPP3, не относящийся к Ig.

В соответствии с изобретением «антитело против DPP3» представляет собой антитело, которое специфически связывается с DPP3, «фрагмент антитела против DPP3» представляет собой фрагмент указанного антитела против DPP3, где указанный фрагмент специфически связывается с DPP3. «Каркас против DPP3, не относящийся к Ig», представляет собой каркас, не относящийся к Ig, который специфически связывается с DPP3.

Одним из вариантов осуществления изобретения является агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в комбинации с ингибитором DPP3, где указанный ингибитор DPP3 представляет собой антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, или каркас против DPP3, не относящийся к Ig, который связывается с SEQ ID NO. 1, в частности, который связывается с SEQ ID NO. 2.

Один из вариантов осуществления изобретения представляет собой агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в комбинации с ингибитором DPP3, где указанный ингибитор DPP3 представляет собой антитело, его фрагмент или каркас, который проявляет минимальную аффинность связывания с DPP3, равную или меньше 10^-7 M.

В соответствии с настоящим изобретением специалисту в данной области техники хорошо известно, что аффинность связывания раскрытого в настоящем документе DPP3-связывающего агента с DPP3 может быть измерена с помощью различных подходящих анализов, известных в данной области. Соответствующие примеры приведены ниже, но их не следует рассматривать как ограничивающие возможности для измерения аффинности связывания описанного в настоящем документе DPP3-связывающего агента с DPP3.

Например, можно определить аффинность связывания DPP3-связывающего агента с эпитопом. Анализ связывания можно проводить для детектирования и/или количественного определения связывания антитела, например, с иммунизирующим пептидом соответствующего связывающего агента. Например, этот иммунизирующий пептид может быть иммобилизован на твердой фазе. Исследуемый образец (например, раствор антитела) пропускают через неподвижный иммунизирующий пептид, и можно детектировать связанное антитело. Для целей настоящего описания термин «твердая фаза» может использоваться для включения любого материала или сосуда, в котором или на котором может проводиться анализ, и включает, помимо прочего, пористые материалы, непористые материалы, пробирки, лунки, стекла, магнитные сферы и т.д.

Примеры методов детектирования:

- Пометьте антитело перед контактом с твердой фазой и определите соответствующую метку (флуоресцентную, хемилюминесцентную, ферментативную и т.д.).

- Используйте меченое вторичное антитело против специфической Fc-части образца-антитела. Инкубируйте антитело, связанное в твердой фазе, со вторичным антителом (например, антителом против человеческого IgG, антителом против мышиного IgG) и детектируйте соответствующую метку (флуоресцентную, хемилюминесцентную, ферментативную и т.д.).

- Используйте меченое антитело в качестве конкурента для твердофазного связывания (например, меченое AK1967).

- Количественно оцените аффинность связывания по уменьшению сигнала.

Другой метод определения аффинности антител против DPP3, кинетика связывания DPP3 с иммобилизованным антителом, может быть определена с помощью безметочного поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Фрайбург, Германия). Обратимую иммобилизацию антител можно осуществить с помощью антитела против мышиного Fc, ковалентно связанного в высокой плотности с поверхностью сенсора CM5 (набор для захвата мышиных антител; GE Healthcare) (Lorenz et al. 2011. Antimicrob Agents Chemother. 55(1): 165-173).

Одним из вариантов осуществления изобретения является агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в комбинации с ингибитором DPP3, где указанный ингибитор DPP3 представляет собой моноспецифическое антитело или фрагмент или каркас, в одном варианте осуществления указанный ингибитор DPP3 представляет собой моноклональное антитело, фрагмент или каркас.

Моноспецифические антитела или фрагменты или каркасы, не относящиеся к Ig, согласно изобретению представляют собой антитела или фрагменты или каркасы, не относящиеся к Ig, которые все имеют аффинность к одному и тому же антигену. Моноклональные антитела являются моноспецифическими, но моноспецифические антитела также могут быть получены другими способами, кроме их получения из обычной зародышевой клетки.

В конкретном варианте осуществления указанный связывающий агент захвата, который связывается с полноразмерным DPP3, специфически ингибирует активность DPP3 менее чем на 50% в жидкофазном анализе, предпочтительно менее чем на 40%, более предпочтительно на 30%. Для определения анализа жидкой фазы см. выше. В одном конкретном варианте осуществления для предотвращения ингибирования DPP3 связывающий агент захвата не должен связываться с DPP3 в области вокруг активного центра и области связывания субстрата (аминокислоты 316-669 SEQ ID No. 1).

Одним из вариантов осуществления изобретения является агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в комбинации с ингибитором DPP3, где указанный ингибитор DPP3 представляет собой антитело, или его фрагмент, или каркас, который связывается с полноразмерным DPP3 и ингибирует активность DPP3 по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно более чем на 70%, еще более предпочтительно более чем на 80%, еще более предпочтительно более чем на 90%, еще более предпочтительно более чем на 95%.

Ингибирование активности DPP3 в жидкофазном анализе с помощью связывающего агента можно определить следующим образом: возможные связывающие агенты для захвата DPP3 инкубируют с рекомбинантным или очищенным нативным DPP3 и специфическими субстратами DPP3 в жидкофазном анализе. Предпочтительно в качестве связывающего агента захвата для ECA выбирают тот, который обладает наименьшей ингибирующей способностью. Связующий агент захвата должен ингибировать активность DPP3 менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 40%, предпочтительно менее чем на 30%. Специфический анализ активности DPP3 в жидкой фазе для определения ингибирующей способности возможных связывающих агентов захвата включает следующие стадии:

Инкубация 25 нг/мл нативного DPP3 человека с 5 мкг/мл соответствующего связывающего агента и контрольного буфера в 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5 и 100 мкМ ZnCl₂ в течение 1 часа при комнатной температуре.

Добавление флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA (20 мкл, 2 мМ).

Инкубация при 37°C и мониторинг образования свободного βNA на флуориметре для микропланшетов Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH) в течение 1 часа. Флуоресценцию βNA детектировали путем возбуждения при 340 нм и измерения испускания при 410 нм.

Рассчет наклоны (в RFU/мин) увеличения флуоресценции различных образцов. Наклон нативного DPP3 человека с буферным контролем принимают за 100% активности. Ингибирующая способность возможного связывающего агента захвата определяют как снижение нативной активности DPP3 человека при инкубации с указанным связывающим агентом захвата в процентах.

В жидкофазном анализе образцы жидкостей организма непосредственно подвергают воздействию флуорогенных субстратов (например, Arg-Arg-β-NA). Поскольку в плазме имеется множество различных аминопептидаз (Sanderink et al. 1988), возможно, используемый субстрат расщепляется другими пептидазами, отличными от DPP3. Чтобы обойти эту проблему, одним из предпочтительных методов детектирования специфической активности DPP3 является использование анализа активности захвата фермента.

В одном конкретном варианте осуществления определение активного DPP3 в анализе захвата фермента включает следующие стадии:

Приведение указанного образца в контакт со связывающим агентом для захвата, который связывается с полноразмерным DPP3, но предпочтительно ингибирует активность DPP3 в жидкофазном анализе менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 40%, более предпочтительно на 30%. Для предотвращения ингибирования DPP3 связывающий агент захвата не должен связываться с DPP3 в области вокруг активного центра и области связывания субстрата (аминокислоты 316-669 SEQ ID No. 1),

отделение DPP3, связанного с указанным связывающим агентом захвата, из образца биологической жидкости,

добавление субстрата DPP3 к указанному отделенному DPP3,

количественное определение активности DPP3 путем измерения превращения субстрата DPP3.

«Антитело» по настоящему изобретению представляет собой белок, включающий один или более полипептидов, по существу кодируемых генами иммуноглобулина, которые специфически связываются с антигеном. Известные гены иммуноглобулинов включают гены константной области каппа, лямбда, альфа (IgA), гамма (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), дельта (IgD), эпсилон (IgE) и мю (IgM), а также множество генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Полноразмерные легкие цепи иммуноглобулина обычно имеют длину примерно 25 кДа или 214 аминокислот.

Тяжелые цепи полноразмерных иммуноглобулинов обычно имеют длину примерно 50 кДа или 446 аминокислот.Легкие цепи кодируются геном вариабельной области на NH2-конце (длиной примерно 110 аминокислот) и геном константной области каппа или лямбда на СООН-конце. Аналогичным образом тяжелые цепи кодируются геном вариабельной области (длиной примерно 116 аминокислот) и одним из других генов константной области.

Основной структурной единицей антитела обычно является тетрамер, состоящий из двух идентичных пар цепей иммуноглобулина, каждая пара имеет одну легкую и одну тяжелую цепь. В каждой паре вариабельные области легкой и тяжелой цепей связываются с антигеном, а константные области опосредуют эффекторные функции. Иммуноглобулины также существуют во множестве других форм, включая, например, Fv, Fab и F(ab')2, а также бифункциональные гибридные антитела и одноцепочечные (например, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105,1987; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883, 1988; Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2nd ed., 1984; Hunkapiller and Hood, Nature 323:15-16,1986).

Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина включает каркасную область, прерываемую тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность (CDR) (см. Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983). Как отмечалось выше, CDR в первую очередь ответственны за связывание с эпитопом антигена. Иммунный комплекс представляет собой антитело, такое как моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело, или функциональный фрагмент антитела, специфически связанный с антигеном.

«Химерные антитела» представляют собой антитела, гены легкой и тяжелой цепей которых были сконструированы, как правило, с помощью генной инженерии, из генов вариабельной и константной областей иммуноглобулина, принадлежащих разным видам. Например, вариабельные сегменты генов моноклонального антитела мыши могут быть присоединены к константным сегментам человека, таким как каппа и гамма 1 или гамма 3. Таким образом, в одном примере терапевтическое химерное антитело представляет собой гибридный белок, состоящий из вариабельного или антигенсвязывающего домена мышиного антитела и константного или эффекторного домена человеческого антитела, хотя можно использовать другие виды млекопитающих, или можно использовать вариабельную область, полученную молекулярными методами. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области, например, см. Патент США No. 5916588. «Гуманизированный» иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, включающий каркасную область человека и одну или более CDR иммуноглобулина, не являющегося человеческим, (например, мышиного, крысиного или синтетического). Иммуноглобулин, не являющийся человеческим, обеспечивающий CDR, называется «донором», а иммуноглобулин человека, обеспечивающий каркас, называется «акцептором».

В одном варианте осуществления изобретения все CDR происходят от донорного иммуноглобулина в гуманизированном иммуноглобулине. Константные области не обязательно должны присутствовать, но если они есть, они должны быть по существу идентичны константным областям иммуноглобулина человека, т.е., по меньшей мере, примерно на 85-90%, например примерно на 95% или более идентичных. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением, возможно, CDR, по существу идентичны соответствующим частям последовательностей природного иммуноглобулина человека.

«Гуманизированное антитело» в соответствии с изобретением представляет собой антитело, включающее иммуноглобулин с гуманизированной легкой цепью и иммуноглобулин с гуманизированной тяжелой цепью. Гуманизированное антитело связывается с тем же антигеном, что и донорное антитело, которое обеспечивает CDR. Акцепторный каркас гуманизированного иммуноглобулина или антитела может иметь ограниченное количество замен аминокислотами, взятыми из донорного каркаса. Гуманизированные или другие моноклональные антитела могут иметь дополнительные консервативные аминокислотные замены, которые по существу не влияют на связывание антигена или другие функции иммуноглобулина. Примерами консервативных замен являются такие, как gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; и phe, tyr. Гуманизированные иммуноглобулины можно сконструировать с помощью генной инженерии (например, см. Патент США No. 6159477). Человеческое антитело представляет собой антитело, в котором гены легкой и тяжелой цепи имеют человеческое происхождение. Человеческие антитела могут быть получены с использованием способов, известных в данной области. Человеческие антитела могут быть получены путем иммортализации человеческой В-клетки, секретирующей интересующее антитело. Иммортализация может быть осуществлена, например, путем инфицирования EBV или путем слияния В-клетки человека с клеткой миеломы или гибридомы с получением клетки триомы. Человеческие антитела также могут быть получены методами фагового дисплея (см., например, Dower et al., публикация PCT No. WO 91/17271; McCafferty et al., публикация PCT No. WO 92/001047; и Winter, публикация PCT No. WO 92/20791), или выбраны из библиотеки комбинаторных моноклональных антител человека (см. веб-сайт Morphosys). Человеческие антитела также могут быть получены с использованием трансгенных животных, несущих ген человеческого иммуноглобулина (например, см. Lonberg et al., публикация PCT No. WO 93/12227; и Kucherlapati, публикация PCT No. WO 91/10741).

Таким образом, антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 в соответствии с изобретением могут иметь форматы, известные в данной области. Примерами являются антитела человека, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, антитела с трансплантированными CDR или их фрагменты антител, но не ограничиваясь ими.

В конкретном варианте осуществления изобретения антитело против DPP3 представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент. В одном варианте осуществления изобретения антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 представляет собой человеческое или гуманизированное антитело или его производное. В одном конкретном варианте осуществления одна или более (мышиных) CDR трансплантированы в человеческое антитело или фрагмент антитела.

В предпочтительном варианте осуществления антитела по настоящему изобретению представляют собой антитела, полученные рекомбинантным путем, как, например, IgG, типичный полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антител, содержащие по меньшей мере F-вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, как например, химически связанные антитела (антигенсвязывающие фрагменты), включая, но не ограничиваясь ими, Fab-фрагменты, включая Fab-миниантитела, одноцепочечные Fab-антитела, моновалентные Fab-антитела с эпитопными метками, например, Fab-V5Sx2; двухвалентный Fab (мини-антитело), димеризованный с доменом CH3; двухвалентный Fab или поливалентный Fab, например, образованный посредством мультимеризации с помощью гетерологичного домена, т.е. посредством димеризации доменов dHLX, т.е. Fab-dHLX-FSx2; F(ab’)2-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные поливалентные и/или полиспецифические scFv-фрагменты, двухвалентные и/или биспецифические диантитела, BITE® (биспецифический рекрутер Т-клеток), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, например из класса, отличного от G; однодоменные антитела, т.е. наноантитела, полученные из иммуноглобулинов верблюдовых или рыб, и многие другие.

Помимо антител против DPP3 или фрагментов антител против DPP3, другие биополимерные каркасы, так называемые каркасы, неотносящиеся к Ig, хорошо известны в данной области техники для образования комплексов с молекулой-мишенью и использовались для получения биополимеров с высокой специфичностью к мишеням. Примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины.

Каркасы, не относящиеся к Ig, в контексте изобретения могут быть белковыми каркасами и могут использоваться в качестве имитаторов антител, поскольку они способны связываться с лигандами или антигенами. Каркасы, не относящиеся к Ig, могут быть выбраны из группы, включающей каркасы, не относящиеся к Ig, на основе тетранектина (например, описанные в US 2010/0028995), фибронектиновые каркасы (например, описанные в EP 1266025; каркасы на основе липокалина (например, описанные в WO 2011/154420); убиквитиновые каркасы (например, описанные в WO 2011/073214), переносящие каркасы (например, описанные в US 2004/0023334), каркасы протеина А (например, описанные в EP 2231860), каркасы на основе анкириновых повторов (например, описанные в WO 2010/060748), микропротеиновые каркасы (предпочтительно микропротеины, образующие цистиновый узел) (например, описанные в EP 2314308), каркасы на основе домена Fyn SH3 (например, описанные в WO 2011/023685), каркасы на основе домена EGFR-A (например, описанные в WO 2005/040229) и каркасы на основе домена Кунитца (например, описанные в EP 1941867). Каркасы, не относящиеся к Ig, могут представлять собой пептидные или олигонуклеотидные аптамеры. Аптамеры обычно создаются путем их выбора из большого пула случайных последовательностей и представляют собой короткие цепи олигонуклеотидов (ДНК, РНК или XNA; Xu et al. 2010, Deng et al. 2014) или короткие вариабельные пептидные домены, прикрепленные к белковому каркасу (Li et al. 2011).

В альтернативном варианте осуществления формат антитела против DPP3 выбирают из группы, включающей фрагмент Fv, фрагмент scFv, фрагмент Fab, фрагмент scFab, фрагмент F(ab)2 и слитый белок scFv-Fc. В другом предпочтительном варианте осуществления формат антитела выбирают из группы, включающей фрагмент scFab, фрагмент Fab, фрагмент scFv и их конъюгаты с оптимизированной биодоступностью, такие как пегилированные фрагменты.

В контексте изобретения термин «антитело» обычно включает моноклональные и поликлональные антитела и их связывающие фрагменты, в частности Fc-фрагменты, а также так называемые «одноцепочечные антитела» (Bird et al. 1988), химерные, гуманизированные, в частности CDR-трансплантированные антитела и ди- или тетрантитела (Holliger et al. 1993). Также включены иммуноглобулиноподобные белки, которые отбирают с помощью методов, включающих, например, фаговый дисплей для специфического связывания с интересующей молекулой, содержащейся в образце. В данном контексте термин «специфическое связывание» относится к антителам, вырабатываемым против интересующей молекулы или ее фрагмента. Антитело считается специфическим, если его аффинность к интересующей молекуле или ее вышеупомянутому фрагменту по меньшей мере предпочтительно в 50 раз выше, более предпочтительно в 100 раз выше, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз выше, чем в отношении других молекул, включенных в образец, содержащий интересующую молекулу. В данной области хорошо известно, как получать антитела и выбирать антитела с заданной специфичностью.

В конкретном варианте осуществления изобретения указанное антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, связывающееся с эпитопом последовательности SEQ ID NO.: 2, где указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональном производном, представляет собой моноклональное антитело или фрагмент этого моноклонального антитела. В одном варианте осуществления изобретения антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, связывающееся с эпитопом последовательности SEQ ID NO.: 2, где указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональном производном, представляет собой человеческое или гуманизированное антитело или их производное, или фрагмент гуманизированного антитела, или его производное.

В одном конкретном варианте осуществления одна или более (мышиных) CDR трансплантированы в человеческое антитело или фрагмент антитела.

В другом аспекте изобретения объектом изобретения является человеческое антитело против DPP3 с трансплантированной CDR или фрагмент этого антитела против DPP3, которое направлено на эпитоп последовательности SEQ ID NO.: 2 и связывается с ним, где указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональном производном, и где указанное антитело против DPP3 с трансплантированной CDR человека или фрагмент этого антитела против DPP3 содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела (Н-цепь), содержащую:

SEQ ID NO.: 4

и/или дополнительно содержит вариабельную область легкой цепи антитела (L-цепь), содержащую:

SEQ ID NO.: 5.

Еще одним объектом настоящего изобретения в другом аспекте является человеческое антитело против DPP3 с трансплантированной CDR или фрагмент этого антитела против DPP3, которое направлено на эпитоп последовательности SEQ ID NO.: 2 и связывается с ним, где указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональном производном, и где указанное антитело против DPP3 с трансплантированной CDR человека или фрагмент этого антитела против DPP3 содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела (H-цепь), содержащую:

SEQ ID NO.: 11

и/или дополнительно содержит вариабельную область легкой цепи антитела (L-цепь), содержащую:

SEQ ID NO.: 12.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения объектом настоящего изобретения является человеческое моноклональное антитело против DPP3 или фрагмент этого моноклонального антитела против DPP3, которое направлено на эпитоп последовательности SEQ ID NO.: 2 и связывается с ним, где указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональном производном, и где тяжелая цепь содержит по меньшей мере одну CDR из:

SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 7 или SEQ ID NO.: 8

и где легкая цепь содержит по меньшей мере одну CDR из:

SEQ ID NO.: 9, KVS или SEQ ID NO.: 10.

Количество белка DPP3 и/или активность DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента можно определить различными способами, например, иммуноанализами, анализами активности, масс-спектрометрическими методами и т.д.

Количество белка DPP3 и/или активность DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента можно определить, например, одним из следующих способов:

1.Люминесцентный иммуноанализ для количественного определения концентрации белка DPP3 (LIA) (Rehfeld et al. 2019 JALM3(6):943-953).

LIA представляет собой одностадийный хемилюминесцентный сэндвич-иммуноанализ, в котором в качестве твердой фазы используются белые микропланшеты из полистирола с высоким связыванием. На эти планшеты наносят покрытие в виде моноклонального антитела против DPP3 AK2555 (захватывающее антитело). Индикаторное антитело против DPP3, AK2553, метят с помощью MA70-акридиний-NHS-эфира и используют в концентрации 20 нг на лунку. Двадцать микролитров образцов (например, сыворотки, плазмы с гепарином, цитрат-плазмы или ЭДТА-плазмы, полученной из крови пациентов) и калибраторов пипеткой вносят в белые микропланшеты с покрытием. После добавления индикаторного антитела AK2553 микропланшеты инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре и 600 об/мин. Затем несвязанный индикатор удаляют путем 4 стадий промывки (350 мкл на лунку). Оставшуюся хемилюминесценцию измеряют в течение 1 с на лунку с помощью люминометра для микропланшетов. Концентрацию DPP3 определяют с помощью 6-точечной калибровочной кривой. Калибраторы и образцы желательно анализировать в двух экземплярах.

2. Анализ активности захвата фермента для количественного определения активности DPP3 (ECA) (Rehfeld et al. 2019 JALM3(6):943-953).

ECA представляет собой анализ DPP3-специфической активности, в котором в качестве твердой фазы используют черные микропланшеты из полистирола с высоким связыванием. На эти планшеты наносят покрытие в виде моноклонального антитела против DPP3 AK2555 (захватывающее антитело). Двадцать микролитров образцов (например, сыворотка, гепарин-плазма, цитрат-плазма, ЭДТА-плазма, спинномозговая жидкость и моча) и калибраторы пипеткой вносят в черные микропланшеты с покрытием. После добавления буфера для анализа (200 мкл) микропланшеты инкубируют в течение 2 ч при 22°С и 600 об/мин. DPP3, присутствующий в образцах, иммобилизуется путем связывания с захватывающим антителом. Несвязанные компоненты образца удаляют с помощью 4 стадий промывки (350 мкл на лунку). Удельную активность иммобилизованного DPP3 измеряют путем добавления флуорогенного субстрата Arg-Arg-β-нафтиламида (Arg2-βNA) в реакционный буфер с последующей инкубацией при 37°C в течение 1 часа. DPP3 специфически расщепляет Arg2-βNA на дипептид Arg-Arg и флуоресцентный β-нафтиламин. Флуоресценцию измеряют флуорометром с использованием длины волны возбуждения 340 нм, а испускание регистрируют при 410 нм. Активность DPP3 определяют с помощью 6-точечной калибровочной кривой. Калибраторы и образцы желательно анализировать в двух экземплярах.

3. Жидкофазный анализ для количественного определения активности DPP3 (LAA) (с изменениями из Jones et al., Analytical Biochemistry, 1982).

LAA представляет собой жидкофазный анализ, в котором для измерения активности DPP3 используют черные микропланшеты из не связывающего полистирола. Двадцать микролитров образцов (например, сыворотка, гепарин-плазма, цитрат-плазма) и калибраторов вносят пипеткой в черные микропланшеты. После добавления флуорогенного субстрата Arg2-βNA в буфер для анализа (200 мкл) начальную флуоресценцию βNA (T=0) измеряют во флуориметре с использованием длины волны возбуждения 340 нм, а испускание определяют при 410 нм. Затем планшет инкубируют при 37°С в течение 1 часа. Измеряют конечную флуоресценцию (Т=60). Рассчитывают разницу между конечной и начальной флуоресценцией. Активность DPP3 определяют с помощью 6-точечной калибровочной кривой. Калибраторы и образцы желательно анализировать в двух экземплярах.

Известны различные иммунологические анализы, которые могут быть использованы для анализов и способов по настоящему изобретению, они включают: радиоиммуноанализ («RIA»), гомогенный иммуноферментный анализ («EMIT»), твердофазный иммуноферментный анализ («ИФА»), иммуноанализ реактивации апоферментов («ARIS»), хемилюминесцентные и флуоресцентные иммунные анализы, матрицы микросфер на основе Luminex, анализы белковых микрочипов и форматы экспресс-тестов, такие как, например, иммунохроматографические стрип-тесты («иммуноанализы с полосками») и иммунохроматографические анализы.

В одном варианте осуществления изобретения такой анализ представляет собой сэндвич-иммуноанализ с использованием любой технологии детектирования, включая, но не ограничиваясь этим, ферментную метку, хемилюминесцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, предпочтительно полностью автоматизированный анализ. В одном варианте осуществления изобретения такой анализ представляет собой сэндвич-анализ с меченым ферментом. Примеры автоматизированного или полностью автоматизированного анализа включают анализы, которые можно использовать для одной из следующих систем: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, Biomerieux Vidas®, Alere Triage®.

В одном варианте осуществления изобретения это может быть так называемый POC-тест (point-of-care), то есть технология тестирования, которая позволяет проводить тест менее чем за 1 час рядом с пациентом без необходимости полностью автоматизированной системы анализа. Одним из примеров этой технологии является технология иммунохроматографического тестирования.

В конкретном варианте осуществления изобретения указанный РОС-тест объединяет измерение более чем одного аналита одновременно. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанный аналит выбран из группы, состоящей из DPP3 и проадреномедуллина или их фрагментов. Во вполне конкретном варианте осуществления изобретения указанный POC-тест объединяет в себе измерение DPP3 и зрелого ADM.

В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из связывающих агентов метят для того, чтобы его можно было обнаружить.

В предпочтительном варианте осуществления указанная метка выбрана из группы, включающей хемилюминесцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, метку с радиоактивным иодом.

Анализы могут быть гомогенными или гетерогенными, конкурентными и неконкурентными. В одном варианте осуществления анализ представляет собой сэндвич-анализ, который представляет собой неконкурентный иммуноанализ, в котором молекула, подлежащая детектированию и/или количественному определению, связана с первым антителом и со вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, микросферой, поверхностью лунки или другого контейнера, чипом или тест-полоской, и второе антитело представляет собой антитело, которое помечено, например, красителем, радиоизотопом или реакционноспособным или каталитически активным фрагментом. Затем соответствующим методом измеряют количество меченого антитела, связанного с аналитом. Общая композиция и процедуры, связанные с «сэндвич-анализами», хорошо отлажены и известны специалисту в данной области (The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford; 3rd ed. (May 2005), ISBN-13: 978-0080445267; Hultschig C et al., Curr Opin Chem Biol. 1999 Feb;17(2):176-80). 1999 Feb;17(2):176-80).

В другом варианте осуществления анализ включает две молекулы захвата, предпочтительно антитела, которые оба присутствуют в виде дисперсий в жидкой реакционной смеси, где первый компонент мечения присоединен к первой молекуле захвата, где указанный первый компонент мечения является частью системы мечения, основанной на гашении или амплификации флуоресценции или хемилюминесценции, а второй компонент меяения указанной системы маркировки присоединяют ко второй молекуле захвата, так что при связывании обеих молекул захвата с аналитом генерируется измеряемый сигнал, который позволяет детектировать образованные сэндвич-комплексы в растворе, содержащем образец.

В другом варианте осуществления указанная система мечения содержит криптаты редкоземельных элементов или хелаты редкоземельных элементов в комбинации с флуоресцентным красителем или хемилюминесцентным красителем, в частности с красителем цианинового типа.

В контексте настоящего изобретения анализы на основе флуоресценции включают использование красителей, которые могут быть, например, выбраны из группы, включающей FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), IRD-700/800, цианиновые красители, такие как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, ксантен, 6-карбокси-2',4',7',4,7-гексахлорфлуоресцеин (HEX), ТЕТ, 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметодилфлуоресцеин (JOE), N, N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-X-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-6G (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, красители BODIPY, такие как BODIPY ™R, Oregon Green кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258; Фенантридины, такие как Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor, PET, этидий бромид, акридиновые красители, карбазоловые красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и т.п.

В контексте настоящего изобретения анализы на основе хемилюминесценции включают использование красителей на основе физических принципов, описанных для хемилюминесцентных материалов в (Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol.15, p.518-562, включенных сюда посредством ссылки, включая цитирования на страницах 551-562). Предпочтительными хемилюминесцентными красителями являются сложные эфиры акридиния.

Как упоминалось в настоящем документе, «анализ» или «диагностический анализ» может относиться к любому типу, применяемому в области диагностики. Такой анализ может быть основан на связывании детектируемого аналита с одним или более зондами захвата с определенной аффинностью. Что касается взаимодействия между молекулами захвата и молекулами-мишенями или интересующими молекулами, константа аффинности предпочтительно превышает 10⁸ М^-1.

Активность DPP3 можно измерить путем детектирования продуктов расщепления специфичных для DPP3 субстратов.

Известные субстраты пептидных гормонов включают Leu-энкефалин, Met-энкефалин, эндоморфины 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, ACTH (адренокортикотропный гормон) и MSH (меланоцитостимулирующий гормон; Abramić et al. 2000, Baršun et al. 2007, Dhanda et al. 2008). Расщепление указанных пептидных гормонов, а также других немеченых олигопептидов (например, Ala-Ala-Ala-Ala, Dhanda et al. 2008) можно контролировать путем детектирования соответствующих продуктов расщепления. Методы детектирования включают, помимо прочего, анализ ВЭЖХ (например, Lee & Snyder 1982), масс-спектрометрию (например, Abramić et al. 2000), анализ H1-ЯМР (например, Vandenberg et al. 1985), электрофорез в капиллярной зоне (КЭ; например, Barsun et al. 2007), тонкослойную хроматографию (например, Dhanda et al. 2008) или обращенно-фазовую хроматографию (например, Mazocco et al. 2006).

Детектирование флуоресценции благодаря гидролизу флуорогенных субстратов с помощью DPP3 является стандартной процедурой для мониторинга активности DPP3. Эти субстраты представляют собой специфические ди- или трипептиды (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe), соединенные с флуорофором. Флуорофоры включают, но не ограничиваются ими, β-нафтиламид (2-нафтиламид, βNA, 2NA), 4-метокси-β-нафтиламид-(4-метокси-2-нафтиламид) и 7-амидо-4-метилкумарин (AMC, MCA; Abramić et al. 2000, Ohkubo et al. 1999). Расщепление этих флуорогенных субстратов приводит к высвобождению флуоресцентного β-нафтиламина или 7-амино-4-метилкумарина, соответственно. В жидкофазном анализе субстрат ECA и DPP3 инкубируют, например, в формате 96-луночного планшета, и измеряют флуоресценцию с использованием детектора флуоресценции (Ellis & Nuenke, 1967). Кроме того, образцы, несущие DPP3, могут быть иммобилизованы и разделены на геле с помощью электрофореза, гели окрашиваются флуорогенным субстратом (например, Arg-Arg-βNA) и Fast Garnet GBC, а полосы флуоресцентного белка обнаруживаются с помощью флуоресцентного ридера (Ohkubo et al. 1999). Те же пептиды (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe) могут быть связаны с хромофорами, такими как п-нитроанилида диацетат.Детектирование изменения цвета благодаря гидролизу хромогенных субстратов можно использовать для мониторинга активности DPP3.

Другим вариантом детектирования активности DPP3 является анализ Protease-Glo™ (коммерчески доступный в Promega). В этом варианте осуществления указанного способа DPP3-специфические ди- или трипептиды (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe) связаны с аминолюциферином. При расщеплении DPP3 высвобождается аминолюциферин, который служит субстратом для сопряженной люциферазной реакции, при которой испускается детектируемая люминесценция.

В предпочтительном варианте осуществления активность DPP3 измеряют путем добавления флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA и мониторинга флуоресценции в режиме реального времени.

В конкретном варианте осуществления указанного способа детектирования активного DPP3 в образце биологической жидкости пациента указанный связывающий агент, реактивный в отношении DPP3, иммобилизован на твердой подложке.

Исследуемый образец пропускают через иммобилизованный связывающий агент, и DPP3, если он присутствует, связывается со связывающим агентом и сам иммобилизуется для детектирования. Затем можно добавить субстрат, и можно детектировать продукт реакции, чтобы указать на присутствие или количество DPP3 в тестируемом образце. Для целей настоящего описания термин «твердая фаза» может использоваться для обозначения любого материала или сосуда, в котором или на котором может проводиться анализ, и включает, помимо прочего: пористые материалы, непористые материалы, пробирки, лунки, предметные стекла, агарозные смолы (например, Sepharose от GE Healthcare Life Sciences), магнитные частицы (например, магнитные микросферы Dynabeads™ или Pierce™ от Thermo Fisher Scientific) и т.д.

Связывающие агенты белкового или пептидного происхождения (например, антитело, фрагменты антител, каркас, не относящийся к Ig) иммобилизуют на твердой фазе методами, включающими: физическую адсорбцию (например, посредством электростатического взаимодействия или гидрофобного взаимодействия), биоаффинную иммобилизацию (например, авидин-биотин, белок А). /G/L, His-метка и Ni2+-NTA, GST-метка и глутатион, гибридизация ДНК, аптамеры), ковалентное связывание (например, амин и N-гидроксисукцинимид) или комбинацию указанных методов иммобилизации (Kim & Herr 2013). Связыващие агенты олигонуклеотидного происхождения (например, аптамеры) могут быть иммобилизованы на твердой фазе с использованием системы (стрепт)авидин-биотин (Müller et al. 2012, Deng et al. 2014).

В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активности DPP3 в образце биологической жидкости пациента указанная стадия разделения представляет собой стадию промывания, на которой из захваченного DPP3 удаляются ингредиенты образца, не связанные с указанным связывающим агентом захвата. Эта стадия разделения может быть любой другой стадией, которая отделяет DPP3, связанный с указанным связывающим агентом захвата, от ингредиентов указанного образца биологической жидкости.

В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активности DPP3 в образце биологической жидкости пациента указанная конверсия субстрата DPP3 иммобилизованным DPP3 измеряется (детектируется) методом, выбранным из группы, включающей: флуоресценцию флуорогенных субстратов (например, Arg-Arg-βNA, Arg-Arg-AMC), изменение цвета хромогенных субстратов, люминесценцию субстратов, связанных с аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™), масс-спектрометрию, ВЭЖХ/ФЖХ (обращенно-фазовая хроматография, эксклюзионная хроматография), тонкослойную хроматографию, капиллярный зонный электрофорез, гель-электрофорез с последующим окрашиванием активности (иммобилизованный, активный DPP3) или вестерн-блотинг (продукты расщепления).

В конкретном варианте осуществления указанного способа определения активности DPP3 в образце биологической жидкости пациента указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей: Leu-энкефалин, Met-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, ACTH и MSH или ди- и трипептиды, связанные с флуорофором, хромофором или аминолюциферином (анализ Promega Protease-Glo™). Ди- или трипептиды, расщепляемые DPP3, включают, но не ограничиваются ими, Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe. Флуорофоры включают, но не ограничиваются ими, β-нафтиламид (2-нафтиламид, βNA, 2NA), 4-метокси-β-нафтиламид (4-метокси-2-нафтиламид) и 7-амидо-4-метилкумарин (AMC, MCA; Abramic и другие. 2000, Ohkubo et al. 1999). Расщепление этих флуорогенных субстратов приводит к высвобождению флуоресцентного β-нафтиламина или 7-амино-4-метилкумарина, соответственно. Хромофоры включают, но не ограничиваются ими, диацетат п-нитроанилида (pNA). Гидролиз связи пептид-pNA в хромогенных субстратах приводит к высвобождению pNA, которая, в свою очередь, меняет цвет.Таким образом, изменение поглощения (DA/мин) прямо пропорционально ферментативной активности. При использовании анализа Protease-Glo™ от Promega после расщепления DPP3 высвобождается аминолюциферин, который служит субстратом для сопряженной люциферазной реакции, которая испускает детектируемую люминесценцию.

Объектом настоящего изобретения также является способ прогнозирования исхода и/или риска нежелательного явления у пациента, у которого развился рефрактерный шок, где указанный способ включает стадии:

определения уровня DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента;

сравнения указанного уровня определенного DPP3 с заданным пороговым значением,

корреляции указанного уровня DPP3 с указанным риском нежелательного явления у указанного пациента, где повышенный уровень выше определенного порогового значения является прогностическим фактором повышенного риска указанных нежелательных явлений или,

корреляции указанного уровня DPP3 с успехом терапии или вмешательства у указанного пациента, где уровень ниже определенного порогового значения является прогностическим фактором успеха терапии или вмешательства.

В контексте настоящего изобретения термин «прогноз» означает прогнозирование того, как будет прогрессировать состояние здоровья пациента. Это может включать оценку вероятности выздоровления или вероятности нежелательного явления для указанного пациента. Нежелательное явление определяется как органная дисфункция или смертность. Органная дисфункция определяется как почечная дисфункция, сердечная дисфункция или дисфункция печени.

Другими вариантами осуществления настоящего изобретения являются:

1. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный способ включает стадии:

определения уровня DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента;

сравнения указанного уровня определенного DPP3 с заданным пороговым значением,

где прогнозируется, что указанный пациент впадает в состояние рефрактерного шока, или у него диагностируется рефрактерный шок, если указанный определенный уровень DPP3 превышает Указанное заданное пороговое значение.

2. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 1, где указанный шок выбран из группы, включающей шок, вызванный гиповолемией, кардиогенный шок, обструктивный шок и распределительный шок, в частности кардиогенный шок или септический шок.

3. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 1 и 2, где

в случае кардиогенного шока указанный пациент мог страдать острым коронарным синдромом (например, острым инфарктом миокарда) или у указанного пациента имеется сердечная недостаточность (например, острая декомпенсированная сердечная недостаточность), миокардит, аритмия, кардиомиопатия, клапанный порок сердца, расслоение аорты с острым аортальным стенозом, травматический разрыв хорды или массивная легочная эмболия, или

в случае гиповолемического шока указанный пациент мог перенести геморрагическое заболевание, включая желудочно-кишечное кровотечение, травму, сосудистые этиологии (например, разрыв аневризмы брюшной аорты, опухоль, прорастающую в крупный кровеносный сосуд) и спонтанное кровотечение в условиях применения антикоагулянтов, или негеморрагическое заболевание, включая рвоту, диарею, почечную недостаточность, кожные потери/неощутимые потери (например, ожоги, тепловой удар) или потерю в третье пространство в условиях панкреатита, цирроза печени, кишечной непроходимости, травмы или

в случае обструктивного шока указанный пациент мог перенести тампонаду сердца, напряженный пневмоторакс, легочную эмболию или аортальный стеноз, или

в случае распределительного шока у указанного пациента может быть септический шок, нейрогенный шок, анафилактический шок или шок вследствие адреналового криза.

4. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 1-3, где указанный способ используется для начала и/или прекращения, и/или стратификации лечения, и/или руководства по лечению.

5. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4, где лечение начинают, и/или продолжают, и/или откладывают, и/или прекращают, если указано определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения.

6. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 5, где указанное лечение выбрано из группы вазопрессоров, агонистов рецептора ангиотензина и/или их предшественников, ингибиторов активности DPP3 и антител против адреномедуллина или фрагментов антител против адреномедуллина.

7. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-6, где определяют и сравнивают или уровень белка DPP3 и/или уровень активного DPP3 с заданным пороговым значением.

8. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-7, где уровень DPP3 определяют путем контакта указанного образца биологической жидкости со связывающим агентом захвата, который специфически связывается с DPP3.

9. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 8, где указанный связывающий агент захвата для определения уровня DPP3 может быть выбран из группы, состоящей из антитела, фрагмента антитела или каркаса, не относящегося к IgG.

10. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 8-9, где указанный связывающий агент захвата представляет собой антитело.

11. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 8-10, где указанный связывающий агент захвата представляет собой моноклональное антитело.

12. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-11, где указанный образец биологической жидкости выбран из группы, состоящей из цельной крови, плазмы и сыворотки.

13. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-12, где указанный способ диагностики или прогнозирования проводят по меньшей мере дважды.

14. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-13, где лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками, и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или где лечение вазопрессорами откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения.

15. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-13, где лечение вазопрессорами начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в указанном образце находится ниже определенного порогового значения, и/или когда лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 ниже указанного заданного порогового значения.

16. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 8, где дополнительно определяют уровень про-адреномедуллина или его фрагментов и где лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или когда лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

17. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 14, где лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM и/или агонистами рецептора ангиотензина и/или его предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, если уровень проадреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, а указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения DPP3.

18. Вазопрессор для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже заданного порогового значения при определении методом в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-17.

19. Вазопрессор для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 18, где указанный вазопрессор выбран из группы, включающей дофамин, норадреналин, эквивалент норадреналина, адреналин, фенилэфрин и вазопрессин.

20. Вазопрессор для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 18 или 19, где указанный вазопрессор вводят указанному пациенту в фармацевтическом составе.

21. Вазопрессор для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 18-20, где указанный пациент имеет артериальное давление, равное или меньше 65 мм рт.ст.

22. Ингибитор активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента выше заданного порогового значения, при определении способом в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-17.

23. Ингибитор активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 22, где ингибитор активности DPP3 выбран из группы, включающей антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или каркас против DPP3, не относящийся к Ig.

24. Ингибитор активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 22 и 23, где указанный ингибитор имеет минимальную аффинность связывания с DPP3, равную или меньше 10^-7 М.

25. Ингибитор активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 22-24, где ингибитор активности DPP3 представляет собой антитело.

26. Ингибитор активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 22-25, где указанный ингибитор представляет собой моноклональное антитело.

27. Ингибитор активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 22-26, где указанный ингибитор представляет собой моноклональное антитело, где определяющие комплементарность области (CDR) в тяжелой цепи содержат последовательности: SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8 и/или SEQ ID NO.: 9, а определяющие комплементарность области (CDR) в легкой цепи содержат последовательности: SEQ ID NO.: 10, KVS и/или SEQ ID NO.: 11.

28. Ингибитор активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 22-27, где указанный ингибитор представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или фрагмент гуманизированного моноклонального антитела, где тяжелая цепь содержит последовательность: SEQ ID NO.: 12, а легкая цепь содержит последовательность: SEQ ID NO.: 13.

29. Ингибитор активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 22-28, где указанный ингибитор вводят в комбинации с агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественником.

30. Ингибитор активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 29, где указанный агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник выбран из группы, включающей ангиотензин I, ангиотензин II, ангиотензин III, ангиотензин IV, в частности ангиотензин II.

31. Агонисты рецепторов ангиотензина и/или их предшественники, и/или ингибиторы активности DPP3 для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где лечение указанными агонистами рецептора ангиотензина и/или его предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце указанного пациента выше определенного порогового значения, и/или откладывают и/или прекращают лечение вазопрессорами, если указано определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения.

32. Вазопрессор для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где лечение указанным вазопрессором начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже определенного порогового значения, и/или где лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 ниже указанного заданного порогового значения.

33. Вазопрессор для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 32, где дополнительно определяют уровень про-адреномедуллина или его фрагментов и где лечение антителом против ADM или фрагмент антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или когда лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

34. Агонисты рецепторов ангиотензина и/или их предшественники, и/или ингибиторы активности DPP3 для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок в соответствии с вариантом осуществления 31, и где дополнительно определяют уровень про-адреномедуллина или его фрагментов и где лечение антителом против ADM или фрагмент антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или когда лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

35. Антитело против ADM или фрагмент антитела против ADM для применения при лечении шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок в соответствии с вариантами осуществления 33-34, где лечение указанным антителом против ADM или антителом против ADM и/или агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками, и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, если уровень проадреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения и указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения DPP3.

36. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, причем указанный способ включает введение вазопрессора указанному пациенту, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже заданного порогового значения при определении способом в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-17.

37. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 35, включающий введение вазопрессора указанному пациенту,

где указанный вазопрессор выбран из группы, включающей дофамин, норадреналин, эквивалент норадреналина, эпинефрин, фенилэфрин и вазопрессин.

38. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 35-36, включающий введение вазопрессора указанному пациенту, где указанный вазопрессор вводят указанному пациенту в фармацевтическом составе.

39. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 35-37, включающий введение указанному пациенту вазопрессора,

где указанный пациент имеет кровяное давление, равное или меньшее, чем 65 мм рт.ст.

40. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента, выше заданного порогового значения при определении способом в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-17.

41. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 39, включающий введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где ингибитор активности DPP3 выбран из группы, включающей антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или каркас против DPP3, не относящийся к Ig.

42. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 39-40, включающий введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где указанный ингибитор имеет минимальную аффинность связывания с DPP3, равную или меньше 10^-7 М.

43. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 39-41, включающий введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где ингибитором активности DPP3 является антитело.

44. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 39-42, включающий введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где указанный ингибитор представляет собой моноклональное антитело.

45. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 39-43, включающий введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где указанный ингибитор представляет собой моноклональное антитело, где определяющие комплементарность области (CDR) в тяжелой цепи содержат последовательности: SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8 и/или SEQ ID NO.: 9, а области, определяющие комплементарность (CDR) в легкой цепи, содержат последовательности: SEQ ID NO.: 10, KVS и/или SEQ ID NO.: 11.

46. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 39-44, включающий введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где указанный ингибитор представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или фрагмент гуманизированного моноклонального антитела, где тяжелая цепь содержит последовательность: SEQ ID NO.: 12, а легкая цепь содержит последовательность: SEQ ID NO.: 13.

47. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 39-45, включающий введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где указанный ингибитор вводят в комбинации с агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественниками.

48. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 39-46, включающий введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где указанный агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественники выбраны из группы, включающей ангиотензин I, ангиотензин II, ангиотензин III, ангиотензин IV, в частности ангиотензин II.

49. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 39-47, где способ включает введение указанному пациенту агонистов рецептора ангиотензина и/или их предшественников, и/или ингибитора активности DPP3, где лечение указанными агонистами рецептора ангиотензина и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце указанного пациента выше определенного порогового значения, и/или где лечение вазопрессорами откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения.

50. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 35-38, включающий введение вазопрессора указанному пациенту, где лечение указанными вазопрессорами начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже определенного порогового значения и/или когда лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 ниже указанного заданного порогового значения.

51. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 49, включающий введение агонистов рецептора ангиотензина и/или их предшественников и/или ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, и где дополнительно определяют уровень про-адреномедуллина или его фрагментов, и где лечение указанным антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или когда лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

52. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 50, включающий введение вазопрессора указанному пациенту, где дополнительно определяют уровень проадреномедуллина или его фрагментов и где лечение указанным антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или когда лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

53. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 51 и 52, включающий введение антитела против ADM или фрагмента антитела против ADM указанному пациенту, где дополнительно определяют уровень про-адреномедуллин или его фрагментов, и где лечение указанным антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или где лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

54. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 51-53, где способ включает введение антитела против ADM или фрагмента антитела против ADM указанному пациенту, где лечение указанным антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM и/или агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, если уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения DPP3.

В вышеприведенном контексте следующие последовательно пронумерованные варианты осуществления обеспечивают дополнительные конкретные аспекты изобретения:

1. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный способ включает стадии:

определения уровня DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента;

сравнения указанного уровня определенного DPP3 с заданным пороговым значением, где прогнозируется, что указанный пациент впадает в состояние рефрактерного шока, или у него диагностируется рефрактерный шок, если указанный определенный уровень DPP3 превышает указанное заданное пороговое значение.

2. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок в соответствии с вариантом осуществления 1, где указанный шок выбран из группы, включающей шок, вызванный гиповолемией, кардиогенный шок, обструктивный шок и распределительный шок, в частности, кардиогенный шок или септический шок.

3. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 1 и 2, где

в случае кардиогенного шока указанный пациент мог страдать острым коронарным синдромом (например, острым инфарктом миокарда) или у указанного пациента имеется сердечная недостаточность (например, острая декомпенсированная сердечная недостаточность), миокардит, аритмия, кардиомиопатия, клапанный порок сердца, расслоение аорты с острым аортальным стенозом, травматический разрыв хорды или массивная легочная эмболия, или

в случае гиповолемического шока указанный пациент мог перенести геморрагическое заболевание, включая желудочно-кишечное кровотечение, травму, сосудистые этиологии (например, разрыв аневризмы брюшной аорты, опухоль, прорастающую в крупный кровеносный сосуд) и спонтанное кровотечение в условиях применения антикоагулянтов, или негеморрагическое заболевание, включая рвоту, диарею, почечную недостаточность, кожные потери/неощутимые потери (например, ожоги, тепловой удар) или потерю в третье пространство в условиях панкреатита, цирроза печени, кишечной непроходимости, травмы или

в случае обструктивного шока указанный пациент мог перенести тампонаду сердца, напряженный пневмоторакс, легочную эмболию или аортальный стеноз, или

в случае распределительного шока у указанного пациента может быть септический шок, нейрогенный шок, анафилактический шок или шок вследствие адреналового криза.

4. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 1-3, где указанный способ используется для начала и/или прекращения, и/или стратификации лечения, и/или руководства по лечению.

5. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4, где лечение начинают, и/или продолжают, и/или откладывают, и/или прекращают, если указано определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения.

6. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 5, где указанное лечение выбрано из группы вазопрессоров, агонистов рецептора ангиотензина и/или их предшественников, ингибиторов активности DPP3 и антител против адреномедуллина или фрагментов антител против адреномедуллина.

7. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-6, где определяют и сравнивают либо уровень белка DPP3, либо уровень активного DPP3 с заданным пороговым значением, где уровень DPP3 определяют путем контакта указанного образца биологической жидкости со связывающим агентом захвата, который специфически связывается с DPP3.

8. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-7, где лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками, и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или где лечение вазопрессорами откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения.

9. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-7, где лечение вазопрессорами начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в указанном образце находится ниже определенного порогового значения, и/или когда лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 ниже указанного заданного порогового значения.

10. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 8, где дополнительно определяют уровень про-адреномедуллина или его фрагментов, и где лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или когда лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

11. Способ прогнозирования или диагностики рефрактерного шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 8, где лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM и/или агонистами рецептора ангиотензина и/или его предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, если уровень проадреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, а указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения DPP3.

12. Вазопрессор для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже заданного порогового значения при определении методом согласно к любому из вариантов осуществления 1-10.

13. Ингибитор активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента выше заданного порогового значения при определении способом в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-10, где ингибитор активности DPP3 выбран из группы, включающей антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, или каркас против DPP3, не относящийся к Ig.

14. Ингибитор активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 13, где указанный ингибитор вводят в комбинации с агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественником.

15. Ингибитор активности DPP3 для применения в терапии шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 14, где указанный агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник выбран из группы, включающей ангиотензин I, ангиотензин II, ангиотензин III, ангиотензин IV, в частности ангиотензин II.

16. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где указанный способ включает введение вазопрессора указанному пациенту, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже заданного порогового значения при определении способом в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-10.

17. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, где способ включает введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента, выше заданного порогового значения при определении способом в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-10.

18. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 17, где способ включает введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где указанный ингибитор вводят в комбинации с агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественником.

19. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 16-17, где способ включает введение указанному пациенту агонистов рецептора ангиотензина и/или их предшественников, и/или ингибитора активности DPP3, где лечение указанными агонистами рецептора ангиотензина и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце указанного пациента выше определенного порогового значения, и/или лечение вазопрессорами откладывают и/или прекращается, если указанный определенный уровень DPP3 выше указанного заданного порогового значения.

20. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 16-17, где способ включает введение вазопрессора указанному пациенту, где лечение указанными вазопрессорами начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже определенного порогового значения и/или когда лечение агонистами рецептора ангиотензина и/или их предшественниками и/или ингибиторами активности DPP3 откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень DPP3 ниже указанного заданного порогового значения.

21. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 18, где способ включает введение агонистов рецептора ангиотензина и/или их предшественников и/или ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, и где дополнительно определяют уровень про-адреномедуллина или его фрагментов, где лечение указанным антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или когда лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

22. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантом осуществления 19, где способ включает введение вазопрессора указанному пациенту, где дополнительно определяют уровень проадреномедуллина или его фрагментов и где лечение с указанным антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или когда лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

23. Способ лечения шока у пациента, который либо впадает в состояние шока, либо у которого развился шок, в соответствии с вариантами осуществления 20 и 21, где способ включает введение антитела против ADM или фрагмента антитела против ADM указанному пациенту, где дополнительно определяют уровень про-адреномедуллина или его фрагментов, и где лечение указанным антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень про-адреномедуллина или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, и/или где лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

24. Способ прогнозирования исхода и/или риска нежелательного явления у пациента, у которого развился рефрактерный шок, причем указанный способ включает стадии:

определения уровня DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента;

сравнения указанного уровня определенного DPP3 с заданным пороговым значением,

корреляции указанного уровня DPP3 с указанным риском нежелательного явления у указанного пациента, где повышенный уровень выше определенного порогового значения является прогностическим фактором повышенного риска указанных нежелательных явлений, или

корреляции указанного уровня DPP3 с успехом терапии или вмешательства у указанного пациента, где уровень ниже определенного порогового значения является прогностическим фактором успеха терапии или вмешательства.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1 - МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ БЕЛКА DPP 3 И АКТИВНОСТИ DPP3

Генерация антител и определение способности связывания DPP3: Несколько мышиных антител получали и проверяли на их способность связываться с DPP3 человека в анализе специфического связывания (см. Таблицу 1).

Пептиды/конъюгаты для иммунизации:

Синтезировали пептиды DPP3 для иммунизации, см. Таблицу 1, (JPT Technologies, Берлин, Германия) с дополнительным N-концевым остатком цистеина (если цистеин отсутствует в выбранной последовательности DPP3) для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Пептиды были ковалентно связаны с BSA с использованием геля для связывания Sulfolink (Perbio-science, Бонн, Германия). Процедуру соединения проводили в соответствии с руководством Perbio. Рекомбинантный GST-hDPP3 получали USBio (United States Biological, Салем, Массачусетс, США).

Иммунизация мышей, слияние иммунных клеток и скрининг:

Мышам Balb/c внутрибрюшинно (i.p.) вводили 84 мкг GST-hDPP3 или 100 мкг.Конъюгаты DPP3-пептид-BSA на 0-й день (эмульгированные в адъюванте TiterMax Gold), 84 мкг или 100 мкг на 14-й день (эмульгированные в полном адъюванте Фрейнда) и 42 мкг или 50 мкг на 21-й и 28-й день (в неполном адъюванте Фрейнда). На 49-й день животному внутривенно (i.v.) вводили 42 мкг GST-hDPP3 или 50 мкг конъюгатов DPP3-пептид-BSA, растворенных в физиологическом растворе. Через три дня мышей умерщвляли и проводили слияние иммунных клеток.

Спленоциты иммунизированных мышей и клетки клеточной линии клеток миеломы SP2/0 сливали с 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°С.После промывки клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты. Гибридные клоны отбирали путем выращивания в среде HAT [питательная среда RPMI 1640 с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки и добавки HAT]. Через одну неделю среду HAT заменяли средой HT на три пассажа с последующим возвратом к нормальной культуральной среде.

Супернатанты клеточных культур в первую очередь подвергали скринингу на наличие рекомбинантных DPP3-связывающих IgG-антител через две недели после слияния. Поэтому рекомбинантный GST-меченый hDPP3 (USBiologicals, Салем, США) иммобилизовали в 96-луночных планшетах (100 нг/лунку) и инкубировали с 50 мкл супернатанта клеточной культуры на лунку в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывки планшета добавляли 50 мкл/лунку POD-кроличьего антитела против IgG мыши и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После следующей стадии промывки в каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора хромогена (3,7 мМ о-фенилендиамин в цитратно-гидрофосфатном буфере, 0,012% H₂O₂), инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре, и хромогенную реакцию останавливали с помощью добавление 50 мкл 4N серной кислоты. Поглощение детектировали при 490 мм.

Положительные протестированные микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для наращивания. После повторного тестирования отобранные культуры клонировали и повторно клонировали с использованием метода лимитирующих разведений и определяли изотипы.

Получение мышиных моноклональных антител

Антитела, индуцированные против GST-меченого человеческого DPP3 или DPP3-пептидов, получали стандартными методами получения антител (Marx et al. 1997) и очищали с помощью протеина А. Чистота антител составляла ≥ 90% на основании анализа гель-электрофореза с SDS.

Характеристика антител - связывание с hDPP3 и/или иммунизирующим пептидом

Для анализа способности связывания пептида DPP3/иммунизирующего пептида различными антителами и клонами антител проводили анализ связывания:

a) Твердая фаза

Рекомбинантный hDPP3, меченный GST (SEQ ID NO. 1) или пептид DPP3 (иммунизирующий пептид, SEQ ID NO. 2) иммобилизовали на поверхности микропланшета с высоким связыванием (96-луночные полистироловые микропланшеты, Greiner Bio-One international AG, Австрия, 1 мкг/лунку в буфере для связывания [50 мМ Трис, 100 мМ NaCl, pH 7,8], 1 ч при КТ). После блокирования 5% бычьим сывороточным альбумином микропланшеты сушили в вакууме.

b) Процедура мечения (Tracer)

100 мкг (100 мкл) различных антител против DPP3 (детектирующее антитело, 1 мг/мл в PBS, pH 7,4) смешивали с 10 мкл NHS-эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, InVent GmbH, Германия; EP 0353.971) и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Меченое антитело против DPP3 очищали гель-фильтрационной ВЭЖХ на Shodex Protein 5 мкм KW-803 (Showa Denko, Япония). Очищенное меченое антитело разводили в буфере для анализа (50 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na₂-ЭДТА, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, 1 г/л мышиного IgG, 1 г/л бычьего IgG, 50 мкмоль/л амастатина, 100 мкмоль/л лейпептина, рН 7,4). Конечная концентрация составила прибл. 5-7*10⁶ относительных световых единиц (RLU) меченого соединения (приблизительно 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. Хемилюминесценцию эфира акридиния измеряли с помощью люминометра Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).

c) Анализ связывания hDPP3

Планшеты заполняли 200 мкл меченого и разбавленного детектирующего антитела (метки) и инкубировали в течение 2-4 часов при 2-8°С.Несвязанный индикатор удаляли промывкой 4 раза 350 мкл промывочного раствора (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% Triton X-100). Хорошо связанную хемилюминесценцию измеряли с помощью люминометра Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).

Характеристика антител - анализ ингибирования hDPP3

Для анализа способности ингибировать DPP3 различными антителами и клонами антител проводили анализ активности DPP3 по известной методике (Jones et al., 1982). Рекомбинантный hDPP3, меченный GST, разводили в буфере для анализа (25 нг/мл GST-DPP3 в 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5 и 100 мкМ ZnCl2) и 200 мкл этого раствора инкубировали с 10 мкг соответствующего антитела при комнатной температуре. После 1 часа предварительной инкубации к раствору добавляли флуорогенный субстрат Arg-Arg-βNA (20 мкл, 2 мМ) и отслеживали образование свободного βNA с течением времени с помощью флуорометра для микропланшетов Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG) при 37°C. Флуоресценцию βNA детектировали путем возбуждения при 340 нм и измерения испускания при 410 нм. Рассчитывали наклоны (в RFU/мин) увеличения флуоресценции различных образцов. Наклон GST-hDPP3 с буферным контролем принимают за 100% активности. Ингибирующую способность возможного связывающего агента захвата определяли как снижение активности GST-hDPP3 при инкубации с указанным связывающим агентом захвата в процентах.

В следующей таблице представлен выбор полученных антител и скорость их связывания в относительных световых единицах (RLU), а также их относительная ингибирующая способность (%; таблица 1). Моноклональные антитела, выработанные против изображенных ниже участков DPP3, были отобраны по их способности связывать рекомбинантный DPP3 и/или иммунизирующий пептид, а также по их ингибирующему потенциалу.

Все антитела, полученные против меченной GST полноразмерной формы рекомбинантного hDPP3, демонстрируют сильное связывание с иммобилизованным hDPP3, меченным GST. Также антитела, вырабатываемые против пептида SEQ ID NO.: 2, связываются с GST-hDPP3. Антитела SEQ ID NO.: 2 также прочно связываются с иммунизирующим пептидом.

Номер последовательности Антиген/Иммуноген Область hDPP3 Клон Связывание hDPP3 [RLU] Связывание иммунизирующего пептида [RLU] Max. ингибирование hDPP3 SEQ ID NO.: 1 GST-меченый рекомбинантный FL-hDPP3 1-737 2552 3.053.621 0 65% 2553 3.777.985 0 35% 2554 1.733.815 0 30% 2555 3.805.363 0 25% SEQ ID NO.: 2 CETVINPE
TGEQIQSW
YRSGE 474-493 1963 141.822 2.163.038 60% 1964 100.802 2.041.928 60% 1965 99.493 1.986.794 70% 1966 118.097 1.990.702 65% 1967 113.736 1.909.954 70% 1968 105.696 2.017.731 65% 1969 82.558 2.224.025 70% Таблица 1: список антител, выработанных против полноразмерного hDPP3 или последовательностей hDPP3, и их способность связывать hDPP3 (SEQ ID NO.: 1) или иммунизирующий пептид (SEQ ID NO.: 2) в RLU, а также максимальное ингибирование рекомбинантного GST-hDPP3.

Недавно была описана разработка люминесцентного иммуноанализа для количественного определения концентрации белка DPP3 (DPP3-LIA), а также анализа активности захвата фермента для количественного определения активности DPP3 (DPP3-ECA) (Rehfeld et al. 2018. JALM. в печати), которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

ПРИМЕР 2 - DPP3 ДЛЯ ПРОГНОЗА КРАТКОСРОЧНОЙ СМЕРТНОСТИ

Концентрацию DPP3 в плазме пациентов с сепсисом/септическим шоком и кардиогенным шоком определяли и соотносили с краткосрочной смертностью пациентов.

Изучаемая когорта - сепсис/септический шок

В 574 образцах плазмы пациентов, участвовавших в исследовании «Адреномедуллин и Исход в случае тяжелого сепсиса и септического шока» (Adrenomedullin and Outcome in Severe Sepsis and Septic Shock) (AdrenOSS), измеряли DPP3. AdrenOSS представляет собой проспективное обсервационное многонациональное исследование, включающее 583 пациента, поступивших в отделение интенсивной терапии с сепсисом или септическим шоком (Hollinger et al., 2018). У 292 пациентов был диагностирован септический шок.

Исследовательская когорта - Кардиогенный шок

Образцы плазмы от 108 пациентов, у которых был диагностирован кардиогенный шок, скринировали на наличие DPP3. Забор крови проводили в течение 6 часов после выявления кардиогенного шока. Смертность наблюдали в течение 7 дней.

Иммуноанализ hDPP3:

Иммуноанализ (LIA) или анализ активности (ECA), определяющий количество DPP3 человека (LIA) или активность DPP3 человека (ECA), соответственно, использовали для определения уровня DPP3 в плазме пациента. Иммобилизацию антител, мечение и инкубацию проводили, как описано в Rehfeld et al. (Rehfeld et al. 2018).

Результаты

Краткосрочная выживаемость пациентов с сепсисом была связана с концентрацией DPP3 в плазме при поступлении. Пациенты с концентрацией DPP3 в плазме выше 40,5 нг/мл (3-й квартиль) имели повышенный риск смертности по сравнению с пациентами с концентрацией DPP3 в плазме ниже этого порога (Фигура 1А). Применение этого порогового значения к субкогорте пациентов с септическим шоком выявило еще более выраженный риск кратковременной смертности в связи с высокими концентрациями DPP3 в плазме (Фигура 1 В). Когда такое же пороговое значение применяется к пациентам с кардиогенным шоком, у пациентов с высоким DPP3 также наблюдается повышенный риск краткосрочной смертности в течение 7 дней (Фигура 1С).

ПРИМЕР 3. ОЧИСТКА НАТИВНОГО DPP3 ЧЕЛОВЕКА.

Лизат эритроцитов человека наносили на 100 мл смолы Сефарозы 4B (Sigma-Aldrich) и собирали элюат.Смолу промывали общим объемом 370 мл PBS-буфера, pH 7,4, и промывную фракцию объединяли с собранным элюатом, в результате чего общий объем составлял 2370 мл.

Для стадии иммуноаффинной очистки 110 мг моноклонального mAb против hDPP3 AK2552 соединяли с 25,5 мл гидразидной смолы UltraLink (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя (набор для иммобилизации GlycoLink, Thermo Fisher Scientific). Эффективность связывания составила 98%, что было определено количественным определением несвязанного антитела по методике Бредфорда. Конъюгат смола-антитело уравновешивали 10 объемами слоя промывочного буфера для связывания (PBS, 0,1% TritonX-100, pH 7,4), объединяли с 2370 мл очищенного лизата эритроцитов и инкубировали при 4°C при непрерывном перемешивании в течение 2 часов. Следовательно, 100 мл инкубационной смеси распределяли по десяти полипропиленовым колонкам объемом 15 мл, и элюат собирали путем центрифугирования при 1000xg в течение 30 секунд. Эту стадию повторяли несколько раз, в результате чего на колонку загружали 2,5 мл смолы, содержащей DPP3. Каждую колонку промывали 5 раз 10 мл буфера для промывания-связывания с использованием метода гравитационного свечения. DPP3 элюировали, помещая каждую колонку в 15-мл пробирку Falcon, содержащую 2 мл нейтрализующего буфера (1M Tris-HCl, pH 8,0), с последующим добавлением 10 мл буфера для элюирования (100 мМ Glycine-HCl, 0,1% TritonX-100, pH 3,5) на колонку и немедленное центрифугирование в течение 30 секунд при 1000xg. Стадию элюирования повторяли в общей сложности 3 раза, в результате чего было получено 360 мл объединенных элюатов. pH нейтрализованных элюатов составляло 8.

Объединенные элюаты наносили на 5 мл колонку HiTrap Q-sephare HP (GE Healthcare), уравновешенную буфером IEXбуфер A1 (100 мМ глицина, 150 мМ трис, pH 8), с использованием насоса для образцов системы Äkta Start (GE Healthcare). После загрузки образца колонку промывали пятью объемами колонки IEX буфера A2 (12 мМ NaH2PO4, pH 7,4) для удаления несвязанного белка. Элюирование DPP3 достигали путем нанесения градиента хлорида натрия на 10 объемов колонки (50 мл) в диапазоне 0-1 М NaCl с использованием IEX-буфера B (12 мМ NaH₂PO₄, 1 М NaCl, pH 7,4). Элюаты собирали фракциями по 2 мл. Буферы, используемые для ионообменной хроматографии, стерильно фильтровали с использованием 0,22 мкМ бутылочного фильтра.

Таблица очистки с соответствующими выходами и активностью каждой стадии очистки приведена в таблице 2. На Фигуре 2 показан SDS-PAGE на градиентном геле (4-20%) нативного hDPP3, очищенного из лизата эритроцитов человека.

Таблица 2: Очистка DPP 3 из эритроцитов человека Стадия Количество DPP3 в % (LIA)^a) Общий белок в мг^b) Общая активность в мкмоль/мин (ECA)^c) Выход^d) в % Удельная активность в Ед/мг^e) Фактор очистки^f) Лизат 100 204160 55 100 0,00027 - IAP 80,6 71,2 46,1 84 0,65 2407 IEX 75 6,6 38,7 70 5,9 21852 ^а) Относительное количество DPP3 определяли во всех фракциях с помощью анализа DPP3-LIA. Количество DPP3 в исходном материале принимали за 100%, а оставшееся количество DPP3 во фракциях очистки коррелировало с исходным материалом.
^b) Количество общего белка определяли по методу Лоури, модифицированному Петерсоном (Peterson, 1977. Analytical Biochemistry 356:346-356).
^c) Общую гидролизующую активность Arg2-βNA в мкмоль субстрата, преобразованного в минуту, определяли с использованием DPP3ECA, откалиброванного по β-нафтиламину (0,05-100 мкМ).
^d) Выход после очистки рассчитывали по общей гидролизующей активности Arg2-βNA. Гидролизующую активность Arg2-βNA в исходном материале принимали за 100%.
^e) Удельную активность определяли как мкмоль субстрата, преобразованного в минуту, и мг общего белка.
^f) Коэффициент очистки представляет собой отношение удельной активности после и до каждой стадии очистки.

ПРИМЕР 4. ЭФФЕКТ НАТИВНОГО DPP3 В ЖИВОТНОЙ МОДЕЛИ.

Эффект инъекции нативного hDPP3 у здоровых мышей изучали путем мониторинга фракции укорочения и индекса резистивности почек.

Мышей дикого типа Black 6 (8-12 недель, размер группы см. в таблице 3) акклиматизировали в течение 2 недель и выполняли исходную эхокардиографию. Мышей случайным образом распределяли в одну из двух групп, а затем нативный белок DPP3 или PBS вводили внутривенно с помощью ретроорбитальной инъекции в дозе 600 мкг/кг белка DPP3.

После инъекции DPP3 или PBS функцию сердца оценивали с помощью эхокардиографии (Gao et al. 2011) и функцию почек оценивали по индексу резистивности почек (Lubas et al., 2014, Dewitte et al, 2012) через 15, 60 и 120 минут (Фигура 3).

Группа Количество животных Обработка WT+PBS 3 PBS WT+DPP3 4 Нативный DPP3 Таблица 3: список экспериментальных групп

Результаты

У мышей, обработанных нативным белком DPP3, наблюдается значительно сниженная фракция укорочения по сравнению с контрольной группой, которой вводили PBS (Фиг.4A). Группа WT+DPP3 также демонстрирует ухудшение почечной функции, о чем свидетельствует увеличение индекса резистивности почек (Фигура 4 В).

ПРИМЕР 5 - РАЗРАБОТКА ПРОЦИЗУМАБА

Антитела, выработанные против SEQ ID NO. 2, были охарактеризованы более подробно (картирование эпитопов, аффинность связывания, специфичность, ингибирующий потенциал). Здесь в качестве примера показаны результаты для клона 1967 SEQ ID NO.: 2 (AK1967; «Процизумаб»).

Определение эпитопа AK1967 на DPP3:

Для картирования эпитопов AK1967 синтезировали ряд N- или C-концевых биотинилированных пептидов (PE GmbH, Хеннигсдорф, Германия). Эти пептиды включают последовательность полного иммунизирующего пептида (SEQ ID No. 2) или его фрагменты с поэтапным удалением одной аминокислоты либо с С-, либо с N-конца (полный список пептидов см. в таблице 5).

На 96-луночные планшеты с высоким связыванием наносили покрытие в виде 2 мкг авидина на лунку (Greiner Bio-One international AG, Австрия) в буфере для связывания (500 мМ Трис-HCl, pH 7,8, 100 мМ NaCl). После этого планшеты промывали и заливали специфическими растворами биотинилированных пептидов. (10 нг/лунка; буфер - 1xPBS с 0,5% BSA). Антитело против DPP3 AK1967 метили хемилюминесцентной меткой в соответствии с Примером 1.

Планшеты заполняли 200 мкл меченого и разбавленного детектирующего антитела (трассера) и инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре. Несвязанный индикатор удаляли промывкой 4 раза 350 мкл промывочного раствора (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% Triton X-100). Хорошо связанную хемилюминесценцию измеряли с помощью люминометра Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG). Связывание AK1967 с соответствующими пептидами определяли путем оценки относительных световых единиц (RLU). Любой пептид, который показывает значительно более высокий сигнал RLU, чем неспецифическое связывание AK1967, определяли как агент, связывающий AK1967. Комбинаторный анализ связывающих и несвязывающих пептидов выявляет специфический эпитоп DPP3 AK1967.

Определение аффинности связывания с помощью Octet:

Эксперимент проводили с использованием Octet Red96 (ForteBio). AK1967 захватывали биосенсорами кинетического качества против Fc человека (AHC). Затем загруженные биосенсоры погружали в серию разведений рекомбинантного GST-меченого DPP3 человека (100, 33,3, 11,1, 3,7 нМ). Ассоциацию наблюдали в течение 120 секунд, после чего следовала диссоциация в течение 180 секунд. Буферы, использованные для эксперимента, представлены в таблице 4. Кинетический анализ проводили с использованием модели связывания 1:1 и глобальной подгонки.

Буфер Композиция Аналитический буфер PBS с 0,1% BSA, 0.02% Tween-21 Регенерирующий буфер 10 мМ Глициновый буфер (pH 1,7) Нейтрализующий буфер PBS с 0,1% BSA, 0,02% Tween-21 Таблица 4: Буферы, используемые для измерений Octet

Вестерн-блот анализ специфичности связывания AK1967:

Клетки крови из крови человека с ЭДТА промывали (3 раза в PBS), разводили в PBS и лизировали повторными циклами замораживания-оттаивания. В лизате клеток крови концентрация общего белка составила 250 мкг/мл и концентрация DPP3 составила 10 мкг/мл. Разведения лизата клеток крови (1:40, 1:80, 1:160 и 1:320) и очищенного рекомбинантного человеческого His-DPP3 (31,25-500 нг/мл) подвергали SDS-PAGE и Вестерн-блот-анализу. Блоты инкубировали в 1.) блокирующем буфере (1xPBS-T с 5% сухого обезжиренного молока), 2.) растворе первичного антитела (AK1967 1:2.000 в блокирующем буфере) и 3.) меченном HRP вторичном антителе (козий антимышиный IgG, 1:1000 в блокирующем буфере). Связанное вторичное антитело детектировали с использованием реагента для детектирования вестерн-блоттинга Amersham ECL и Amersham Imager 600 UV (оба производства GE Healthcare).

Анализ ингибирования DPP3:

Для анализа способности AK1967 к ингибированию DPP3 проводили анализ активности DPP3 по известной процедуре (Jones et al., 1982), как описано в примере 1. Ингибирующую способность AK1967 определяют как снижение активности GST-hDPP3 при инкубации с указанным антителом в процентах. Полученная в результате сниженная активность DPP3 показана на кривой ингибирования на Фигуре 1C.

Картирование эпитопов:

Анализ пептидов, с которыми AK1967 связывается и с которыми не связывается, показал, что последовательность DPP3 INPETG (SEQ ID No.: 3) является необходимым эпитопом для связывания AK1967 (см. таблицу 5).

пептид ID Последовательность пептида связывание
AK1967 #1 bio a f n f d q e t v i n p E t g e q i q s w y r s g Да #2 bio a f n f d q e t v i n p E t g e q i q Да #3 bio a f n f d q e t v i n p e t g e q i Да #4 bio a f n f d q e t v i n p e t g e q Да #5 bio a f n f d q e t v i n p e t g e Да #6 bio a f n f d q e t v i n p e t g Да #7 bio a f n f d q e t v i n p e t Нет #8 bio a f n f d q e t v i n p e Нет #9 bio a f n f d q e t v i n p Нет #10 bio a f n f d q e t v i n Нет #11 e t g e q i q s w y k bio нет #12 p e t g e q i q s w y k bio нет #13 n p e t g e q i q s w y k bio нет #14 i n p e t g e q i q s w y k bio Да #15 v i n p e t g e q i q s w y k bio Да #16 t v i n p e t g e q i q s w y k bio Да #17 e t v i n p e t g e q i q s w y k bio Да Таблица 5: Пептиды, используемые для картирования эпитопов AK1967

Аффинность связывания:

AK1967 связывается с аффинностью 2,2*10-9 М с рекомбинантным GST-hDPP3 (кинетические кривые см. на Фигуре 5).

Специфичность и ингибирующий потенциал:

Единственным белком, детектированным с помощью AK1967 в качестве первичного антитела в лизате клеток крови, был DPP3 с молекулярной массой 80 кДа (Фигура 6). Общая концентрация белка в лизате составила 250 мкг/мл, тогда как расчетная концентрация DPP3 составляет примерно 10 мкг/мл. Несмотря на то, что в лизате в 25 раз больше неспецифического белка, AK1967 специфически связывается и детектирует DPP3, и никакого другого неспецифического связывания не происходит.

AK1967 ингибирует 15 нг/мл DPP3 в специфическом анализе активности DPP3 с IC50 примерно 15 нг/мл (Фигура 7).

Химеризация/Гуманизация:

Моноклональное антитело AK1967 («Процизумаб»), обладающее способностью ингибировать активность DPP3 на 70%, выбирали в качестве возможного терапевтического антитела, а также использовали в качестве матрицы для химеризации и гуманизации.

Гуманизацию мышиных антител можно проводить в соответствии со следующей процедурой:

Для гуманизации антитела мышиного происхождения анализируют последовательность антител на структурное взаимодействие каркасных областей (FR) с определяющими комплементарность областями (CDR) и антигеном. На основании структурного моделирования выбирают подходящий FR человеческого происхождения, и мышиные последовательности CDR трансплантируются в FR человека. Вариации в аминокислотной последовательности CDR или FR могут быть введены для восстановления структурных взаимодействий, которые были устранены при переключении видов для последовательности FR. Это восстановление структурных взаимодействий может быть достигнуто с помощью случайного подхода с использованием библиотек фагового дисплея или с помощью направленного подхода, основанного на молекулярном моделировании (Almagro and Fransson, 2008. Humanization of antibodies. Front Biosci. 13:1619-33).

В вышеуказанном контексте вариабельная область может быть связана с любым подклассом константных областей (IgG, IgM, IgE. IgA), либо только с каркасами, Fab-фрагментами, Fv, Fab и F(ab)2. В приведенных ниже примерах 6 и 7 использовали вариант мышиного антитела с каркасом IgG2a. Для химеризации и гуманизации использовали скелет IgG1κ человека.

Для связывания эпитопа важны только CDR. CDR для тяжелой цепи и легкой цепи мышиного антитела против DPP3 (AK1967) показаны в SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7 и SEQ ID No. 8 для тяжелой цепи и SEQ ID No. 9, последовательность KVS и SEQ ID No. 10 для легкой цепи, соответственно. Секвенирование антитела против DPP3 (AK1967) выявило вариабельную область тяжелой цепи антитела (H-цепь) согласно SEQ ID No.: 11 и легкую цепь антитела. вариабельная область (L-цепь) согласно SEQ ID No.: 12.

ПРИМЕР 6. ЭФФЕКТ ПРОЦИЗУМАБА ПРИ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ, ВЫЗВАННОЙ СЕПТИЧЕСКИМ ШОКОМ

В этом эксперименте эффект инъекции процизумаба крысам с сердечной недостаточностью, вызванной сепсисом (Rittirsch et al. 2009) изучали путем мониторинга фракции укорачивания.

Модель септического шока с пункционной перевязкой слепой кишки (CLP):

Самцов крыс Wistar (2-3 месяца, от 300 до 400 г, размер группы см. в таблице 6) из Centre d'élevage Janvier (Франция) случайным образом распределяли в одну из трех групп.Всех животных анестезировали гидрохлоридом кетамина (90 мг/кг) и ксилазином (9 мг/кг) внутрибрюшинно (i.p.). Для индукции полимикробного сепсиса CLP проводили по протоколу Риттирша с небольшими модификациями. Делали вентральный срединный разрез (1,5 см) для экстериоризации слепой кишки. Затем слепую кишку перевязывают чуть ниже илеоцекального клапана и один раз прокалывают иглой 18G. Затем брюшную полость закрывали двумя слоями с последующей инфузионной реанимацией (3 мл/на 100 г массы тела подкожно вводили физиологический раствор) и возвращали животное в клетку. Ложнопрооперированных животных подвергали хирургическому вмешательству без пункции слепой кишки. Животных CLP рандомизировали между плацебо и терапевтическим антителом.

Дизайн исследования:

Ход исследования показан на Фигуре 8. После CLP или ложной операции животным давали отдохнуть в течение 20 часов при свободном доступе к воде и пище. После этого им делали анестезию, делали трахеотомию и вставляли артериальный и венозный катетер. Через 24 часа после операции CLP вводили либо AK1967, либо носитель (физиологический раствор) в дозе 5 мг/кг в виде болюсной инъекции с последующей 3-часовой инфузией 7,5 мг/кг.В качестве меры предосторожности гемодинамику контролировали инвазивно и непрерывно от t=0 до 3 часов.

При t=0 (исходный уровень) все животные CLP находились в состоянии септического шока и у них развилось снижение функции сердца (низкое кровяное давление, низкая фракция укорочения). В этот момент вводили (i.v.) процизумаб или носитель (PBS) и начинали инфузию физиологического раствора. Имелась 1 контрольная группа и 2 группы CLP, которые суммированы в таблице ниже (таблица 6). В конце эксперимента животных подвергали эвтаназии, а органы извлекали для последующего анализа.

Группа Количество животных CLP Обработка Sham 7 Нет PBS CLP-PBS 6 Да PBS CLP-PCZ 4 Да PCZ Таблица 6: список экспериментальных групп

Инвазивное кровяное давление:

Гемодинамические показатели получали с помощью системы AcqKnowledge (BIOPAC Systems, Inc., США). Она обеспечивает полностью автоматизированную систему анализа артериального давления. Катетер подключается к системе BIOPAC через датчик давления.

Для процедуры крыс анестезировали (кетамин и ксилазин). Животных перемещали на грелку до достижения желаемой температуры тела 37-37,5°С.Датчик температурной обратной связи вводили в прямую кишку. Крыс помещали на операционный стол в положении лежа на спине. Трахею вскрывали и вводили катетер (16G) для внешнего ИВЛ без повреждения сонных артерий и блуждающих нервов. Артериальный катетер вводили в правую сонную артерию. Сонную артерию перед перевязкой отделяли от блуждающей. Через левую яремную вену вводили центральный венозный катетер, что позволяло вводить PCZ или PBS.

После операции животным давали отдохнуть для стабильного состояния перед измерением гемодинамики. Затем регистрировали исходное артериальное давление (АД). Во время сбора данных инфузию физиологического раствора через артериальный катетер останавливали.

Эхокардиография:

Животных анестезировали гидрохлоридом кетамина. Грудную клетку выбривали и крыс помещали в лежачее положение. Для трансторакальной эхокардиографии (ТТЭ) использовали коммерческую ультразвуковую систему GE Healthcare Vivid 7, оснащенную высокочастотным (14 МГц) линейным датчиком и сердечным датчиком 10 МГц. Все обследования записывались в цифровом виде и сохранялись для последующего автономного анализа.

Изображения в серых полутонах регистрировали с глубиной 2 см. Двумерные исследования начинали в парастернальной проекции по длинной оси для измерения диаметра аортального кольца и диаметра легочной артерии. М-режим также использовали для измерения размеров левого желудочка (LV) и оценки фракционного укорочения (FS%). LVFS рассчитывали как конечно-диастолический диаметр LV - конечно-систолический диаметр LV/конечно-диастолический диаметр LV и выражали в %. Поэтому время конечной диастолы определяли по максимальному диаметру LV. Соответственно, конечную систолу определяли как минимальный диаметр в одном и том же сердечном цикле. Все параметры измеряли вручную. Для каждого измерения усредняли три сердечных цикла.

Из той же парастернальной проекции по длинной оси кровоток в легочной артерии регистрировали с помощью импульсно-волновой допплерографии. Измеряли интеграл скорости кровотока для оттока по легочной артерии.

С апикальной пятикамерной проекции митральный кровоток регистрировали с помощью импульсной допплерографии на уровне кончиков митральных клапанов.

Результаты:

Крысы с сердечной недостаточностью, вызванной септическим шоком, получавшие PBS (CLP+PBS), демонстрируют уменьшенную фракцию укорочения по сравнению с ложнопрооперированными животными (Фиг.9A). Группа CLP+PBS также демонстрирует высокий уровень смертности (Фиг.9B). Напротив, применение процизумаба к крысам с сепсис-индуцированной сердечной недостаточностью улучшает фракцию укорочения (Фиг.9А) и резко снижает уровень смертности (Фиг.9 В).

ПРИМЕР 7. ВЛИЯНИЕ ПРОЦИЗУМАБА НА ФУНКЦИЮ СЕРДЦА И ПОЧЕК

Влияние процизумаба на сердечную недостаточность, индуцированную изопротеренолом, у мышей изучали путем мониторинга фракции укорочения и индекса резистивности почек.

Индуцированный изопротеренолом сердечный стресс у мышей:

Острую сердечную недостаточность индуцировали у самцов мышей в возрасте 3 месяцев с помощью двух ежедневных подкожных инъекций 300 мг/кг изопротеренола, неселективного агониста ß-адренорецепторов. (DL-изопротеренола гидрохлорид, Sigma Chemical Co) (ISO) в течение двух дней (Vergaro et al, 2016). Разбавление ISO проводили в NaCl 0,9%. Мыши, получавшие изоцианат, были случайным образом разделены на две группы (таблица 7), и PBS или процизумаб (10 мг/кг) вводили внутривенно после исходной эхокардиографии (Gao et al., 2011) и измерения индекса резистивности почек (Lubas et al., 2014, Dewitte et al, 2012) были выполнены на 3-й день (Фигура 10 А и В).

Функцию сердца оценивали с помощью эхокардиографии (Gao et al., 2011) и индекса сопротивления почек (Lubas et al., 2014, Dewitte et al, 2012) через 1 час, 6 часов и 24 часа (Фигура 10 A и B). Группу мышей, которым вводили носитель (PBS) вместо изопротеренола, не подвергали дальнейшему фармакологическому лечению и они служили контрольной группой (Таблица 7).

Группа Количество животных Обработка Sham+PBS 27 PBS HF+PBS 15 PBS HF+PCZ 20 Процизумаб (PCZ) Таблица 7: список экспериментальных групп

Результаты:

Применение процизумаба к мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной изопротеренолом, восстанавливает функцию сердца в течение первого часа после введения (Фиг.11А). Функция почек больных мышей демонстрирует значительное улучшение через 6 часов после инъекции процизумаба и сравнима с функцией почек ложнопрооперированных животных через 24 часа (Фиг.11 В).

ПРИМЕР 8. DPP3 УКАЗЫВАЕТ НА ПОТРЕБНОСТЬ В ВАЗОПРЕССОРАХ И ОТВЕТ НА ВАЗОПРЕССОРНУЮ ТЕРАПИЮ

Концентрации DPP3 в плазме пациентов с септическим шоком определяли с помощью иммуноанализа hDPP3 и связывали с необходимостью вазопрессорной терапии.

Когорта исследования - септический шок

Образцы плазмы от 292 пациентов, у которых в исследовании AdrenOSS (см. пример 2) был диагностирован септический шок, подвергали скринингу на наличие DPP3. DPP3 человека измеряли, как описано в Примере 1.

Результаты

Пациенты с повышенной потребностью во введении вазопрессоров в течение более 5 дней имели высокие концентрации DPP3 в плазме (Фиг.12А). Напротив, у пациентов, которые ответили на введение вазопрессоров и у которых введение вазопрессоров можно было прекратить в течение первых 5 дней, концентрации DPP3 в плазме были значительно снижены (Фиг.12 В). Это указывает на то, что развитие рефрактерного шока и, следовательно, повышенная потребность во введении вазопрессоров из-за сниженного ответа на эту терапию связаны с высокими концентрациями DPP3 в плазме у пациентов с септическим шоком.

Пациенты с резистентным к вазопрессорам рефрактерным септическим шоком (норадреналин>0,5 мкг/кг/мин) демонстрируют значительно более высокие концентрации DPP3 в плазме по сравнению с пациентами, которым требовались дозы норадреналина<0,5 мкг/кг/мин (p<0,001) (Фигура 16A). Кроме того, концентрация DPP3 в плазме была тесно связана со смертностью у пациентов с резистентным к вазопрессорам рефрактерным септическим шоком (Фиг.16B).

ПРИМЕР 9 - DPP3 СВЯЗАН С РЕФРАКТЕРНЫМ ШОКОМ

Концентрации DPP3 в плазме больных с кардиогенным шоком определяли с помощью иммуноанализа hDPP3 и связывали с развитием рефрактерного шока.

Исследовательская когорта - Кардиогенный шок

Образцы плазмы от 57 пациентов, у которых был диагностирован кардиогенный шок после острого инфаркта миокарда, подвергали скринингу на DPP3. DPP3 человека измеряли, как описано в Примере 1.

Результаты

У пациентов с концентрацией DPP3 в плазме выше определенного порогового значения при поступлении (59,1 нг/мл; 3-й квартиль) рефрактерный шок развивался в большей степени (47%), чем у пациентов с концентрацией DPP3 в плазме ниже 59,1 нг/мл (12%) (Фигура 13).

ПРИМЕР 10. DPP3 И БИО-ADM УКАЗЫВАЮТ НА КРАТКОСРОЧНУЮ СМЕРТНОСТЬ ПРИ ШОКЕ.

Концентрации DPP3 и bio-ADM в плазме пациентов с септическим шоком определяли с использованием hDPP3 и иммуноанализа bio-ADM и соотносили с краткосрочной смертностью пациентов.

Когорта исследования - септический шок

Образцы плазмы от 292 пациентов, у которых был диагностирован септический шок в исследовании AdrenOSS, проверяли на наличие DPP3 и био-ADM. DPP3 человека измеряли, как описано в Примере 1. bio-ADM измеряли, как описано в Weber et al. (Weber et al. 2017. JALM 2(2): 1-4).

Результаты

Концентрации в плазме bio-ADM и DPP3 измеряли у пациентов с септическим шоком. Пациенты были сгруппированы в соответствии с определенными пороговыми значениями, определенными как 3-й квартиль всех измеренных концентраций соответствующего маркера в плазме (таблица 8). Равное число пациентов имело либо высокий уровень только DPP3, либо только высокий уровень bio-ADM (15,4%), в то время как у меньшего числа пациентов наблюдались повышенные концентрации в плазме как bio-ADM, так и DPP3 (9,6%).

DPP3 низкий уровень (<48,4 нг/мл) DPP3 высокий уровень (>48,4 нг/мл) bio-ADM низкий уровень (<213 пг/мл) 174 (59,6%) 45 (15,4%) bio-ADM высокий уровень (>213 пг/мл) 45 (15,4%) 28 (9,6%) Таблица 8: Количество пациентов с низким/высоким уровнем DPP3 и низким/высоким bio-ADM. Пороги отсечки были назначены на основе Q3 (самый высокий 25%) для обоих.

Смертность в течение первых 4 недель после поступления была связана с концентрацией bio-ADM и DPP3 при поступлении. У пациентов только с высокой концентрацией в плазме bio-ADM или только с высокой концентрацией DPP3 в плазме был значительно повышен риск смерти в течение первых 4 недель по сравнению с пациентами, у которых была концентрация в плазме либо bio-ADM (Фигура 14A), либо DPP3 (Фигура 14 В) ниже определенного порогового значения (3-й квартиль). Выживаемость у пациентов с высоким bio-ADM была лучше, чем у пациентов с высоким DPP3.

Когда оба маркера, bio-ADM и DPP3, были объединены, был выявлен еще более высокий риск краткосрочной смертности по сравнению со смертностью, которая была связана с увеличением только одного из обоих маркеров (Фигура 14C). Только 28,6% пациентов с высокой концентрацией bio-ADM и высокой концентрацией DPP3 в плазме выжили в первые 4 недели после поступления.

ПРИМЕР 11. DPP3 И BIO-ADM DPP3 ВЫЯВЛЯЮТ ПОТРЕБНОСТЬ В ВАЗОПРЕССОРАХ И ОТВЕТ НА ВАЗОПРЕССОРНУЮ ТЕРАПИЮ

Концентрации DPP3 и bio-ADM в плазме пациентов с септическим шоком определяли с помощью hDPP3 и иммуноанализа bio-ADM и связывали с необходимостью вазопрессорной терапии.

Когорта исследования - септический шок

В 292 образцах плазмы от пациентов, у которых был диагностирован септический шок в исследовании AdrenOSS, были измерены концентрации DPP3 и bio-ADM. DPP3 человека измеряли, как описано в Примере 1. bio-ADM измеряли, как описано в Weber et al. (Weber et al. 2017. JALM 2(2): 1-4).

Результаты

Концентрации в плазме bio-ADM и DPP3 измеряли у пациентов с септическим шоком. Пациенты были сгруппированы в соответствии со специфическими пороговыми отсечками, определенными как 3-й квартиль всех измеренных концентраций соответствующего маркера в плазме в когорте септического шока (низкий уровень DPP3<48,4 нг/мл, низкий уровень bio-ADM<213 пг/мл; высокий уровень bio-ADM). ADM ≥213 пг/мл; высокий DPP3 ≥48,4 нг/мл).

Пациенты с высоким уровнем DPP3, но низкими концентрациями bio-ADM в плазме имели более высокую потребность в последовательном введении вазопрессоров по сравнению с пациентами, у которых был либо низкий DPP3+низкий bio-ADM, либо низкий DPP3+высокий bio-ADM (Фигура 15; Таблица 9). Напротив, у пациентов с низкой концентрацией DPP3 и низкой концентрацией bio-ADM в плазме или у пациентов с низкой концентрацией DPP3, но высокой концентрацией bio-ADM в плазме при поступлении введение вазопрессоров можно было прекратить раньше, чем у пациентов с высокой концентрацией DPP3 в плазме при поступлении (Фигура 15; Таблица 9). Это указывает на то, что вазопрессорная терапия у пациентов с септическим шоком с высоким bio-ADM может быть прекращена раньше из-за лучшего терапевтического ответа по сравнению с пациентами с септическим шоком с высоким уровнем DPP3. Эти пациенты (с высоким уровнем DPP3) нуждаются в более длительном лечении вазопрессорами из-за отсутствия ответа.

Дни с потребностью в вазопрессоре DPP3 низкий
bioADM низкий DPP3 низкий
bioADM высокий DPP3 высокий
bioADM низкий DPP3 высокий
bioADM высокий 1 42 8 5 2 2 49 11 6 2 3 25 6 8 2 4 16 4 1 2 5 8 3 2 0 6 3 1 6 1 7 31 12 17 19 Таблица 9: Пациенты с потребностью в вазопрессорах сгруппированы в соответствии с их концентрацией в плазме DPP3 и bio-ADM при поступлении.

Пороги отсечки были назначены на основе Q3 (самые высокие 25% определенных значений) для обоих; низкий DPP3<48,4 нг/мл, низкий bio-ADM<213 пг/мл; высокий bio-ADM ≥213 пг/мл; высокий DPP3 ≥ 48,4 нг/мл; 7: ≥7 дней на вазопрессоре или смерть в течение 7 дней.

ПРИМЕРЫ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID No. 1 - hDPP3 aa 1-737

MADTQYILPNDIGVSSLDCREAFRLLSPTERLYAYHLSRAAWYGGLAVLLQTSPEAPYIYALLSRLFRAQDPDQLRQHALAEGLTEEEYQAFLVYAAGVYSNMGNYKSFGDTKFVPNLPKEKLERVILGSEAAQQHPEEVRGLWQTCGELMFSLEPRLRHLGLGKEGITTYFSGNC™EDAKLAQDFLDSQNLSAYNTRLFKEVDGEGKPYYEVRLASVLGSEPSLDSEVTSKLKSYEFRGSPFQVTRGDYAPILQKVVEQLEKAKAYAANSHQGQMLAQYIESFTQGSIEAHKRGSRFWIQDKGPIVESYIGFIESYRDPFGSRGEFEGFVAVVNKAMSAKFERLVASAEQLLKELPWPPTFEKDKFLTPDFTSLDVLTFAGSGIPAGINIPNYDDLRQTEGFKNVSLGNVLAVAYATQREKLTFLEEDDKDLYILWKGPSFDVQVGLHELLGHGSGKLFVQDEKGAFNFDQETVINPETGEQIQSWYRSGETWDSKFSTIASSYEECRAESVGLYLCLHPQVLEIFGFEGADAEDVIYVNWLNMVRAGLLALEFYTPEAFNWRQAHMQARFVILRVLLEAGEGLVTITPTTGSDGRPDARVRLDRSKIRSVGKPALERFLRRLQVLKSTGDVAGGRALYEGYATVTDAPPECFLTLRDTVLLRKESRKLIVQPNTRLEGSDVQLLEYEASAAGLIRSFSERFPEDGPELEEILTQLATADARFWKGPSEAPSGQA

SEQ ID No. 2 - hDPP3 aa 474-493 (N-Cys) - иммунизирующий пептид с дополнительным N-концевым Цистеином

CETVINPETGEQIQSWYRSGE

SEQ ID No. 3 - hDPP3 aa 477-482 - эпитоп AK1967

INPETG

SEQ ID No. 4 - вариабельная область мышиного AK1967 в тяжелой цепи

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMSVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNDNKSYNPALKSRLTISRDTSNNQVFLKIASVVTADTGTYFCARNYSYDYWGQGTTLTVSS

SEQ ID No. 5 - вариабельная область мышиного AK1967 в легкой цепи

DVVVTQTPLSLSVSLGDPASISCRSSRSLVHSIGSTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK

SEQ ID No. 6 - CDR1 мышиного AK1967 в тяжелой цепи

GFSLSTSGMS

SEQ ID No. 7 - CDR2 мышиного AK1967 в тяжелой цепи

IWWNDNK

SEQ ID No. 8 - CDR 3 мышиного AK1967 в тяжелой цепи

ARNYSYDY

SEQ ID No. 9 - CDR1 мышиного AK1967 в легкой цепи

RSLVHSIGSTY

CDR2 мышиного AK1967 в легкой цепи

KVS

SEQ ID No. 10 - CDR3 мышиного AK1967 в легкой цепи

SQSTHVPWT

SEQ ID No. 11 - гуманизированное AK1967 - последовательность тяжелой цепи (IgG1κ остов)

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLAHIWWNDNKSYNPALKSRLTITRDTSKNQVVL™TNMDPVDTGTYYCARNYSYDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID No. 12 - гуманизированное AK1967 - последовательность легкой цепи (IgG1κ остов)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSRSLVHSIGSTYLYWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID No. 13 - Ангиотензин II (синоним: 5-изолейцин-ангиотензин II)

DRVYIHPF

SEQ ID No. 14 - Аналог Ангиотензина II (5-валин-ангиотензин II)

DRVYVHPF

SEQ ID No. 15 - Аналог Ангиотензина II (Asn¹-Phe⁴)

NRVFIHPF

SEQ ID No. 16 - гексапептид Ангиотензина II

VYIHPF

SEQ ID No. 17 - нонапептид Ангиотензина II

NRVYYVHPF

SEQ ID No. 18 - аналог Ангиотензина II ([Asn¹-Ile⁵-Ile⁸]-ангиотензин II)

NRVYIHPI

SEQ ID No. 19 - аналог Ангиотензина II ([Asn¹-Ile⁵-Ala⁸]-ангиотензин II)

NRVYIHPA

SEQ ID No. 20 - аналог Ангиотензина II ([Asn¹-дийод-Tyr⁴-Ile⁵]-ангиотензин II

NRVYIHPF

SEQ ID No. 21 - Ангиотензин III

RVYIHPF

SEQ ID No. 22 - аналог Ангиотензина III (Val⁴-ангиотензин III)

RVYVHPF

SEQ ID No. 23 - аналог Ангиотензина III (Phe³-ангиотензин III)

RVFIHPF

SEQ ID No. 24 - аналог Ангиотензина III ([Ile⁴-Ala⁷]-ангиотензин III)

RVYIHPA

SEQ ID No. 25 - аналог Ангиотензина III (дийод-Tyr³-Ile⁴]-ангиотензин III)

RVYIHPF

SEQ ID No. 26 - Ангиотензин IV

VYIHPF

SEQ ID No. 27 - аналог Ангиотензина IV (Val³-ангиотензин IV)

VYVHPF

SEQ ID No. 28 - аналог Ангиотензина IV (Phe²-ангиотензин IV)

VFIHPF

SEQ ID No. 29 - аналог Ангиотензина IV ([Ile³-Ala⁶]-ангиотензин IV)

VYIHPA

SEQ ID No. 30 - аналог Ангиотензина IV ([дийод-Tyr²-Ile³-ангиотензин IV)

VYIHPF

SEQ ID No. 31 (proADM): 164 аминокислоты (22-185 preproADM)

ARLDVASEF RKKWNKWALS RGKRELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RVKRYRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYGRRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL

SEQ ID No. 32 (Проадреномедуллин N-20 концевой пептид, PAMP): аминокислоты 22-41 preproADM

ARLDVASEF RKKWNKWALS R

SEQ ID No. 33 (Среднерегиональный проАдреномедуллин, MR-proADM): аминокислоты 45-92 preproADM

ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV

SEQ ID No. 34 (зрелый Адреномедуллин (зрелый ADM); амидированный ADM; bio-ADM; hADM): аминокислоты 95-146 -CONH₂

YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGY - CONH₂

SEQ ID No. 35 (Адреномедуллин 1-52-Gly (ADM 1-52-Gly)): аминокислоты 95-147 preproADM

YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYG

SEQ ID No. 36 (C-концевой проАдреномедуллин, CT-proADM): аминокислоты 148-185 preproADM

RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL

SEQ ID No. 37 (N-концевая часть зрелого ADM): аминокислоты 1-21 зрелого ADM

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC

SEQ ID No. 38 (CDR1 тяжелой цепи антитела против ADM)

GYTFSRYW

SEQ ID No. 39 (CDR2 тяжелой цепи антитела против ADM)

ILPGSGST

SEQ ID No. 40 (CDR3 тяжелой цепи антитела против ADM)

TEGYEYDGFDY

SEQ ID No. 41 (CDR1 легкой цепи антитела против ADM)

QSIVYSNGNTY

SEQ ID No. 42 (CDR3 легкой цепи антитела против ADM)

FQGSHIPYT

SEQ ID No. 43 (тяжелая цепь антитела против ADM (Адрецизумаб))

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 44 (легкая цепь антитела против ADM (Адрецизумаб))

DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1: Графики выживаемости Каплана-Мейера в зависимости от низких (<40,5 нг/мл) и высоких (≥ 40,5 нг/мл) концентраций DPP3. (A) 7-дневная выживаемость пациентов с сепсисом в зависимости от концентрации DPP3 в плазме; (B) 7-дневная выживаемость пациентов с кардиогенным шоком в зависимости от концентрации DPP3 в плазме; (C) 7-дневная выживаемость пациентов с септическим шоком в зависимости от концентрации DPP3 в плазме.

Фигура 2: SDS-PAGE на градиентном геле (4-20%) нативного hDPP3, очищенного из лизата эритроцитов человека. Маркер молекулярной массы указан стрелками.

Фигура 3: Схема эксперимента. Влияние нативного DPP3 на животную модель.

Фигура 4: (A) Инъекция DPP3 вызывает сокращение фракции укорочения и, следовательно, приводит к ухудшению функции сердца. (B) Снижение функции почек также наблюдается через увеличение индекса резистивности почек.

Фигура 5: Кривая ассоциации и диссоциации анализа связывания AK1967-DPP3 с использованием Octet. Нагруженные AK1967 биосенсоры погружали в серию разведений рекомбинантных GST-меченых DPP3 человека (100, 33,3, 11,1, 3,7 нМ) и отслеживали ассоциацию и диссоциацию.

Фигура 6: Вестерн-блот разведений лизата клеток крови и детектирование DPP3 с AK1967 в качестве первичного антитела.

Фигура 7: Кривая ингибирования нативного DPP3 из клеток крови ингибирующим антителом AK1967. Ингибирование DPP3 специфическим антителом зависит от концентрации, где IC50 составляет ~15 нг/мл при анализе против 15 нг/мл DPP3.

Фигура 8: Экспериментальная установка - Эффект процизумаба при сердечной недостаточности, вызванной сепсисом.

Фигура 9: Процизумаб резко улучшает фракцию укорочения (A) и уровень смертности (B) у крыс с сердечной недостаточностью, вызванной сепсисом.

Фигура 10: Схема эксперимента. Сердечный стресс, вызванный изопротеренолом, у мышей с последующим лечением процизумабом (B) и у контроля (A).

Фигура 11. Процизумаб улучшал фракцию укорочения (А) и снижал индекс резистивности почек (В) в течение 1 часа и 6 часов после введения, соответственно, у мышей с сердечной недостаточностью, индуцированной изопротеренолом.

Фигура 12: (A) Количество дней, когда требуется вазопрессорная терапия у пациентов с септическим шоком, в зависимости от концентрации DPP3 в плазме. ≥7 дней на вазопрессоре или смерть в течение 7 дней; *p<0,05 в постфактум сравнении с группами 1-4(B). Необходимость вазопрессорной терапии у пациентов с септическим шоком в зависимости от концентрации DPP3 в плазме. Пациенты, получавшие вазопрессорную терапию в течение максимум 5 дней (≤5), и пациенты, получавшие вазопрессорную терапию более 5 дней или умершие в течение 7 дней, были сгруппированы вместе (>5).

Фигура 13: DPP3 связан с рефрактерным шоком. Высокие концентрации DPP3 в плазме пациентов с кардиогенным шоком связаны с более высоким риском развития рефрактерного кардиогенного шока по сравнению с пациентами, у которых концентрация DPP3 в плазме ниже определенного порогового значения.

Фигура 14: Графики выживаемости Каплана-Мейера (А) 4-недельная выживаемость пациентов с септическим шоком в зависимости от концентрации bio-ADM в плазме; значения сгруппированы в квартили (В) 4-недельная выживаемость пациентов с септическим шоком в зависимости от концентрации DPP3 в плазме; значения сгруппированы в квартили (С) 4-недельная выживаемость пациентов с септическим шоком в зависимости от концентрации bio-ADM и DPP3 в плазме; Пороги отсечки были определены на основе 3-го квартиля всех измеренных концентраций соответствующего маркера в плазме: оба низкие, DPP3<48,4 нг/мл, bio-ADM<213 пг/мл; bio-ADM высокий ≥213 пг/мл; DPP3 высокий ≥ 48,4 нг/мл.

Фигура 15: Пациенты с вазопрессором должны быть сгруппированы в соответствии с их концентрацией DPP3 и bio-ADM в плазме при поступлении. Доля пациентов, получающих вазопрессоры в течение 1-7 дней, показана серой шкалой - более светлые тона обозначают большую продолжительность лечения. Пороги отсечки были назначены на основе Q3 (самые высокие 25% определенных значений) для обоих; низкий DPP3<48,4 нг/мл, низкий bio-ADM<213 пг/мл; высокий bio-ADM ≥213 пг/мл; высокий DPP3 ≥ 48,4 нг/мл; 7: ≥7 дней на вазопрессоре или смерть в течение 7 дней.

Фигура 16: (A) Концентрация DPP3 в плазме у пациентов с септическим рефрактерным шоком, нуждающихся в вазопрессоре норадреналин, ниже (n=186) и выше (n=95) 0,5 мкг/кг/мин (p<0,001). (B) Графики выживаемости Каплана-Мейера (A) 4-недельная выживаемость пациентов с септическим рефрактерным шоком в зависимости от концентрации DPP3 в плазме; значения сгруппированы в квартили.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Hollenberg et al. Ann Intern Med 1999;131:47-59.

2.Reynolds HR, Hochman JS. Circulation 2008;117:686-697.

3.Tarvasmäki et al. Eur J Heart Fail JohnWiley& Sons, Ltd; 2018;20:572-581.

4.Thiele et al. N Engl J Med 2012;367:1287-1296.

5.Champion S. Eur J Heart Fail 2018;20:197-198.

6.HochmanJS. Circulation 2003;107:2998-3002.

7.Shah et al. Clin Res Cardiol 2018;107:287-303.

8.Schmidt et al. Eur Heart J 2015;36:2246-2256.

9.Muller et al. Intensive Care Med 2016;42:370-378.

10.Chen et al. Crit Care 2016;20:336.

11.Harjola et al. Eur J Heart Fail John Wiley& Sons, Ltd; 2015;17:501-509.

12.Harjola et al. Eur J Heart Fail John Wiley& Sons, Ltd; 2018;20:1081-1099.

13.Bakker et al. Am J Surg 1996;171:221-226.

14.Attaná et al. Acute Card Care 2012;14:20-26.

15.ZhangZ, XuX. Crit Care Med 2014;42:2118-2125.

16.Allard et al. J Neurochem 1987;48:1553-1559.

17.Prajapati SC, Chauhan SS. FEBS J 2011;278:3256-3276.

18.Ocaranza MP, Jalil JE. Hypertens (Dallas, Tex1979) 2016;68:552-554.

19.Rehfeld L, J Appl Lab Med 2019 JALM 3(6):943-953.

20.Deniau et al. Eur J Heart Fail 2020 Feb;22(2):290-299.

21.Levy J Am Coll Cardiol 2018;72:173-182.

22.Kohsaka et al. Arch Intern Med 2005;165:1643-1650.

23.Hochman et al. N Engl J Med 1999;341:625-634.

24.Thiele et al. N Engl J Med 2012;367:1287-1296.

25.Thieleet al. N Engl J Med 2017;377:2419-2432.

26.The TRIUMPH Investigators*, Alexander JH, et al. JAMA 2007;297:1657.

27.Reyentovichet al. Nat Rev Cardiol 2016;13:481-492.

28.Mebazaa et al. Intensive Care Med 2018;44:760-773.

29.Bassi et al. Crit Care Res Pract 2013;2013:654708.

30.Baran et al. Catheter Cardiovasc Interv 2019;94:29-37.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>4TEEN4 Pharmaceuticals GmbH

<120>Руководство по терапии и/или мониторинг терапии для лечения шока

<130>T75093WO

<150>EP19194729.0

<151>2019-08-30

<150>EP19201098.1

<151>2019-10-02

<160>44

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>737

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>1

Met Ala Asp Thr Gln Tyr Ile Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Ser Ser

1 5 10 15

Leu Asp Cys Arg Glu Ala Phe Arg Leu Leu Ser Pro Thr Glu Arg Leu

20 25 30

Tyr Ala Tyr His Leu Ser Arg Ala Ala Trp Tyr Gly Gly Leu Ala Val

35 40 45

Leu Leu Gln Thr Ser Pro Glu Ala Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Ser

50 55 60

Arg Leu Phe Arg Ala Gln Asp Pro Asp Gln Leu Arg Gln His Ala Leu

65 70 75 80

Ala Glu Gly Leu Thr Glu Glu Glu Tyr Gln Ala Phe Leu Val Tyr Ala

85 90 95

Ala Gly Val Tyr Ser Asn Met Gly Asn Tyr Lys Ser Phe Gly Asp Thr

100 105 110

Lys Phe Val Pro Asn Leu Pro Lys Glu Lys Leu Glu Arg Val Ile Leu

115 120 125

Gly Ser Glu Ala Ala Gln Gln His Pro Glu Glu Val Arg Gly Leu Trp

130 135 140

Gln Thr Cys Gly Glu Leu Met Phe Ser Leu Glu Pro Arg Leu Arg His

145 150 155 160

Leu Gly Leu Gly Lys Glu Gly Ile Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Asn Cys

165 170 175

Thr Met Glu Asp Ala Lys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Asp Ser Gln Asn

180 185 190

Leu Ser Ala Tyr Asn Thr Arg Leu Phe Lys Glu Val Asp Gly Glu Gly

195 200 205

Lys Pro Tyr Tyr Glu Val Arg Leu Ala Ser Val Leu Gly Ser Glu Pro

210 215 220

Ser Leu Asp Ser Glu Val Thr Ser Lys Leu Lys Ser Tyr Glu Phe Arg

225 230 235 240

Gly Ser Pro Phe Gln Val Thr Arg Gly Asp Tyr Ala Pro Ile Leu Gln

245 250 255

Lys Val Val Glu Gln Leu Glu Lys Ala Lys Ala Tyr Ala Ala Asn Ser

260 265 270

His Gln Gly Gln Met Leu Ala Gln Tyr Ile Glu Ser Phe Thr Gln Gly

275 280 285

Ser Ile Glu Ala His Lys Arg Gly Ser Arg Phe Trp Ile Gln Asp Lys

290 295 300

Gly Pro Ile Val Glu Ser Tyr Ile Gly Phe Ile Glu Ser Tyr Arg Asp

305 310 315 320

Pro Phe Gly Ser Arg Gly Glu Phe Glu Gly Phe Val Ala Val Val Asn

325 330 335

Lys Ala Met Ser Ala Lys Phe Glu Arg Leu Val Ala Ser Ala Glu Gln

340 345 350

Leu Leu Lys Glu Leu Pro Trp Pro Pro Thr Phe Glu Lys Asp Lys Phe

355 360 365

Leu Thr Pro Asp Phe Thr Ser Leu Asp Val Leu Thr Phe Ala Gly Ser

370 375 380

Gly Ile Pro Ala Gly Ile Asn Ile Pro Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Gln

385 390 395 400

Thr Glu Gly Phe Lys Asn Val Ser Leu Gly Asn Val Leu Ala Val Ala

405 410 415

Tyr Ala Thr Gln Arg Glu Lys Leu Thr Phe Leu Glu Glu Asp Asp Lys

420 425 430

Asp Leu Tyr Ile Leu Trp Lys Gly Pro Ser Phe Asp Val Gln Val Gly

435 440 445

Leu His Glu Leu Leu Gly His Gly Ser Gly Lys Leu Phe Val Gln Asp

450 455 460

Glu Lys Gly Ala Phe Asn Phe Asp Gln Glu Thr Val Ile Asn Pro Glu

465 470 475 480

Thr Gly Glu Gln Ile Gln Ser Trp Tyr Arg Ser Gly Glu Thr Trp Asp

485 490 495

Ser Lys Phe Ser Thr Ile Ala Ser Ser Tyr Glu Glu Cys Arg Ala Glu

500 505 510

Ser Val Gly Leu Tyr Leu Cys Leu His Pro Gln Val Leu Glu Ile Phe

515 520 525

Gly Phe Glu Gly Ala Asp Ala Glu Asp Val Ile Tyr Val Asn Trp Leu

530 535 540

Asn Met Val Arg Ala Gly Leu Leu Ala Leu Glu Phe Tyr Thr Pro Glu

545 550 555 560

Ala Phe Asn Trp Arg Gln Ala His Met Gln Ala Arg Phe Val Ile Leu

565 570 575

Arg Val Leu Leu Glu Ala Gly Glu Gly Leu Val Thr Ile Thr Pro Thr

580 585 590

Thr Gly Ser Asp Gly Arg Pro Asp Ala Arg Val Arg Leu Asp Arg Ser

595 600 605

Lys Ile Arg Ser Val Gly Lys Pro Ala Leu Glu Arg Phe Leu Arg Arg

610 615 620

Leu Gln Val Leu Lys Ser Thr Gly Asp Val Ala Gly Gly Arg Ala Leu

625 630 635 640

Tyr Glu Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Pro Pro Glu Cys Phe Leu

645 650 655

Thr Leu Arg Asp Thr Val Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg Lys Leu Ile

660 665 670

Val Gln Pro Asn Thr Arg Leu Glu Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu

675 680 685

Tyr Glu Ala Ser Ala Ala Gly Leu Ile Arg Ser Phe Ser Glu Arg Phe

690 695 700

Pro Glu Asp Gly Pro Glu Leu Glu Glu Ile Leu Thr Gln Leu Ala Thr

705 710 715 720

Ala Asp Ala Arg Phe Trp Lys Gly Pro Ser Glu Ala Pro Ser Gly Gln

725 730 735

Ala

<210>2

<211>21

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>2

Cys Glu Thr Val Ile Asn Pro Glu Thr Gly Glu Gln Ile Gln Ser Trp

1 5 10 15

Tyr Arg Ser Gly Glu

20

<210>3

<211>6

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>3

Ile Asn Pro Glu Thr Gly

1 5

<210>4

<211>116

<212>белок

<213>Mus musculus

<400>4

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Ser Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Val Thr Ala Asp Thr Gly Thr Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Asn Tyr Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>5

<211>112

<212>белок

<213>Mus musculus

<400>5

Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Ile Gly Ser Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210>6

<211>10

<212>белок

<213>Mus musculus

<400>6

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Ser

1 5 10

<210>7

<211>7

<212>белок

<213>Mus musculus

<400>7

Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys

1 5

<210>8

<211>8

<212>белок

<213>Mus musculus

<400>8

Ala Arg Asn Tyr Ser Tyr Asp Tyr

1 5

<210>9

<211>11

<212>белок

<213>Mus musculus

<400>9

Arg Ser Leu Val His Ser Ile Gly Ser Thr Tyr

1 5 10

<210>10

<211>9

<212>белок

<213>Mus musculus

<400>10

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr

1 5

<210>11

<211>469

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>11

Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly

20 25 30

Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe

35 40 45

Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg

50 55 60

Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn

65 70 75 80

Asp Asn Lys Ser Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr

85 90 95

Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp

100 105 110

Pro Val Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Ser Tyr Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly

465

<210>12

<211>239

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>12

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser

20 25 30

Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Arg Ser

35 40 45

Leu Val His Ser Ile Gly Ser Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

210 215 220

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210>13

<211>8

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>13

Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe

1 5

<210>14

<211>8

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Вариант Ангиотензина II

<400>14

Asp Arg Val Tyr Val His Pro Phe

1 5

<210>15

<211>8

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Вариант Ангиотензина II

<400>15

Asn Arg Val Phe Ile His Pro Phe

1 5

<210>16

<211>6

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>16

Val Tyr Ile His Pro Phe

1 5

<210>17

<211>9

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>17

Asn Arg Val Tyr Tyr Val His Pro Phe

1 5

<210>18

<211>8

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Аналог Ангиотензина II

<400>18

Asn Arg Val Tyr Ile His Pro Ile

1 5

<210>19

<211>8

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Аналог Ангиотензина II

<400>19

Asn Arg Val Tyr Ile His Pro Ala

1 5

<210>20

<211>8

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Аналог Ангиотензина II

<400>20

Asn Arg Val Tyr Ile His Pro Phe

1 5

<210>21

<211>7

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>21

Arg Val Tyr Ile His Pro Phe

1 5

<210>22

<211>7

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Аналог Ангиотензина III

<400>22

Arg Val Tyr Val His Pro Phe

1 5

<210>23

<211>7

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Аналог Ангиотензина III

<400>23

Arg Val Phe Ile His Pro Phe

1 5

<210>24

<211>7

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Аналог Ангиотензина III

<400>24

Arg Val Tyr Ile His Pro Ala

1 5

<210>25

<211>7

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Аналог Ангиотензина III

<400>25

Arg Val Tyr Ile His Pro Phe

1 5

<210>26

<211>6

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>26

Val Tyr Ile His Pro Phe

1 5

<210>27

<211>6

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Аналог Ангиотензина IV

<400>27

Val Tyr Val His Pro Phe

1 5

<210>28

<211>6

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Аналог Ангиотензина IV

<400>28

Val Phe Ile His Pro Phe

1 5

<210>29

<211>6

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Аналог Ангиотензина IV

<400>29

Val Tyr Ile His Pro Ala

1 5

<210>30

<211>6

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Аналог Ангиотензина IV

<400>30

Val Tyr Ile His Pro Phe

1 5

<210>31

<211>164

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>31

Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp

1 5 10 15

Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro

20 25 30

Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg

35 40 45

Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro

50 55 60

Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn

65 70 75 80

Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val

85 90 95

Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp

100 105 110

Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr Gly Arg Arg

115 120 125

Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu Val Ser

130 135 140

Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly Ser Ala

145 150 155 160

Pro His Phe Leu

<210>32

<211>20

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>32

Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp

1 5 10 15

Ala Leu Ser Arg

20

<210>33

<211>48

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>33

Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys

1 5 10 15

Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala

20 25 30

Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val

35 40 45

<210>34

<211>52

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>C-концевой амид (CONH2)

<400>34

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

1 5 10 15

Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln

20 25 30

Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser

35 40 45

Pro Gln Gly Tyr

50

<210>35

<211>53

<212>белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Глицин на C-конце

<400>35

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

1 5 10 15

Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln

20 25 30

Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser

35 40 45

Pro Gln Gly Tyr Gly

50

<210>36

<211>38

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>36

Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu

1 5 10 15

Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly

20 25 30

Ser Ala Pro His Phe Leu

35

<210>37

<211>21

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>37

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

1 5 10 15

Arg Phe Gly Thr Cys

20

<210>38

<211>8

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>38

Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Trp

1 5

<210>39

<211>8

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>39

Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr

1 5

<210>40

<211>11

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>40

Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>41

<211>11

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>41

Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210>42

<211>9

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>42

Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr

1 5

<210>43

<211>448

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>43

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210>44

<211>219

<212>белок

<213>Homo sapiens

<400>44

Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<---

Группа изобретений относится к медицине, а именно к медицине критических состояний. Предложены способы прогнозирования и диагностики рефрактерного шока у пациента, включающие определение уровня DPP3 в образце пациента, где, в случае если уровень DPP3 превышает значение от 20 до 200 нг/мл, прогнозируют или определяют, что указанный пациент впадает в состояние рефрактерного шока. Предложены способы прогнозирования риска нежелательного явления и исхода у пациента, у которого развился рефрактерный шок. Предложено применение вазопрессора в терапии шока у пациента. Предложено применение ингибитора активности DPP3 в терапии шока у пациента, где ингибитор активности DPP3 представляет собой антитело против DPP3, или фрагмент антитела против DPP3, или каркас против DPP3, не относящийся к Ig. Предложены способы лечения шока у пациента, включающие введение вазопрессора или ингибитора активности DPP3 указанному пациенту. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные способы диагностики, прогнозирования рефрактерного шока, а также лечения шока у пациента за счет определения уровня DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента. 8 н. и 12 з.п. ф-лы, 16 ил., 9 табл., 11 пр.

1. Способ прогнозирования рефрактерного шока у пациента, где указанный способ включает стадии:

определения уровня DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента;

сравнения указанного уровня определенного DPP3 с заданным пороговым значением, которое составляет от 20 до 200 нг/мл,

где прогнозируется, что указанный пациент впадает в состояние рефрактерного шока, если указанный определенный уровень DPP3 превышает указанное заданное пороговое значение.

2. Способ по п. 1, где указанный шок выбран из группы, включающей шок, вызванный гиповолемией, кардиогенный шок, обструктивный шок и распределительный шок.

3. Способ по п. 1 или 2, где указанный шок представляет собой шок, устойчивый к вазопрессорам.

4. Способ по п. 2, где

в случае кардиогенного шока указанный пациент мог страдать острым коронарным синдромом, в частности острым инфарктом миокарда, или у указанного пациента имеется сердечная недостаточность, в частности острая декомпенсированная сердечная недостаточность, миокардит, аритмия, кардиомиопатия, клапанный порок сердца, расслоение аорты с острым аортальным стенозом, травматический разрыв хорды или массивная легочная эмболия, или

в случае гиповолемического шока указанный пациент мог перенести геморрагическое заболевание, включая желудочно-кишечное кровотечение, травму, разрыв аневризмы брюшной аорты, опухоль, прорастающую в крупный кровеносный сосуд, и спонтанное кровотечение в условиях применения антикоагулянтов, или негеморрагическое заболевание, включая рвоту, диарею, почечную недостаточность, ожоги, тепловой удар, или потерю в третье пространство в условиях панкреатита, цирроза печени, кишечной непроходимости, травмы, или

в случае обструктивного шока указанный пациент мог перенести тампонаду сердца, напряженный пневмоторакс, легочную эмболию или аортальный стеноз, или

в случае распределительного шока у указанного пациента может быть септический шок, нейрогенный шок, анафилактический шок или шок вследствие адреналового криза.

5. Способ диагностики рефрактерного шока у пациента, где указанный способ включает стадии:

определения уровня DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента;

сравнения указанного уровня определенного DPP3 с заданным пороговым значением, которое составляет от 20 до 200 нг/мл,

где у указанного пациента диагностируется рефрактерный шок, если указанный определенный уровень DPP3 превышает указанное заданное пороговое значение.

6. Способ по п. 5, где указанный шок выбран из группы, включающей шок, вызванный гиповолемией, кардиогенный шок, обструктивный шок и распределительный шок.

7. Способ по п. 5 или 6, где указанный шок представляет собой шок, устойчивый к вазопрессорам.

8. Способ по п. 6, где

в случае кардиогенного шока указанный пациент мог страдать острым коронарным синдромом, в частности острым инфарктом миокарда, или у указанного пациента имеется сердечная недостаточность, в частности острая декомпенсированная сердечная недостаточность, миокардит, аритмия, кардиомиопатия, клапанный порок сердца, расслоение аорты с острым аортальным стенозом, травматический разрыв хорды или массивная легочная эмболия, или

в случае гиповолемического шока указанный пациент мог перенести геморрагическое заболевание, включая желудочно-кишечное кровотечение, травму, разрыв аневризмы брюшной аорты, опухоль, прорастающую в крупный кровеносный сосуд, и спонтанное кровотечение в условиях применения антикоагулянтов, или негеморрагическое заболевание, включая рвоту, диарею, почечную недостаточность, ожоги, тепловой удар, или потерю в третье пространство в условиях панкреатита, цирроза печени, кишечной непроходимости, травмы, или

в случае обструктивного шока указанный пациент мог перенести тампонаду сердца, напряженный пневмоторакс, легочную эмболию или аортальный стеноз, или

в случае распределительного шока у указанного пациента может быть септический шок, нейрогенный шок, анафилактический шок или шок вследствие адреналового криза.

9. Способ прогнозирования исхода у пациента, у которого развился рефрактерный шок, где указанный способ включает стадии:

определения уровня DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента;

корреляции указанного определенного уровня DPP3 с успехом терапии или вмешательства у указанного пациента, где уровень ниже определенного порогового значения, которое составляет от 20 до 200 нг/мл, является прогностическим фактором успеха терапии или вмешательства.

10. Способ прогнозирования риска нежелательного явления у пациента, у которого развился рефрактерный шок, где указанный способ включает стадии:

определения уровня DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента;

корреляции указанного определенного уровня DPP3 с риском нежелательного явления у указанного пациента, где повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, которое составляет от 20 до 200 нг/мл, является прогностическим фактором повышенного риска указанных нежелательных явлений.

11. Применение вазопрессора в терапии шока у пациента, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже заданного порогового значения, которое составляет от 20 до 200 нг/мл.

12. Применение ингибитора активности DPP3 в терапии шока у пациента, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента выше заданного порогового значения, которое составляет от 20 до 200 нг/мл, где ингибитор активности DPP3 выбирают из группы, включающей антитело против DPP3, или фрагмент антитела против DPP3, или каркас против DPP3, не относящийся к Ig.

13. Применение по п. 12, где указанный ингибитор предназначен для введения в комбинации с агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественником.

14. Применение по п. 13, где указанный агонист рецептора ангиотензина и/или его предшественник выбран из группы, включающей ангиотензин I, ангиотензин II, ангиотензин III, ангиотензин IV, в частности ангиотензин II.

15. Способ лечения шока у пациента, где способ включает введение вазопрессора указанному пациенту, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента ниже заданного порогового значения, которое составляет от 20 до 200 нг/мл.

16. Способ по п. 15, где дополнительно определяют уровень ADM-NH2 или его фрагментов и где начинают и/или продолжают лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM, когда уровень ADM-NH2 или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, которое составляет от 50 до 250 пг/мл, и/или когда лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень ADM-NH2 или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.

17. Способ лечения шока у пациента, где способ включает введение ингибитора активности DPP3 указанному пациенту, где указанный пациент имеет уровень DPP3 в образце биологической жидкости указанного пациента выше заданного порогового значения, которое составляет от 20 до 200 нг/мл.

18. Способ по п. 17, где указанный ингибитор активности DPP3 вводят в комбинации с агонистом рецептора ангиотензина и/или его предшественником.

19. Способ по п. 18, где лечение указанными агонистами рецептора ангиотензина и/или ингибиторами активности DPP3 начинают и/или продолжают, когда уровень DPP3 в образце указанного пациента выше определенного порогового значения, которое составляет от 20 до 200 нг/мл.

20. Способ по п. 19, где дополнительно определяют уровень ADM-NH2 или его фрагментов, где лечение указанным антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM начинают и/или продолжают, когда уровень ADM-NH2 или его фрагментов в указанном образце выше определенного порогового значения, которое составляет от 50 до 250 пг/мл, и/или когда лечение антителом против ADM или фрагментом антитела против ADM откладывают и/или прекращают, если указанный определенный уровень ADM-NH2 или его фрагментов ниже указанного заданного порогового значения.