DPP3 ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ, МОНИТОРИНГА И СТРАТИФИКАЦИИ ТЕРАПИИ NT-ADM АНТИТЕЛАМИ У ПАЦИЕНТОВ С ШОКОМ Российский патент 2025 года по МПК G01N33/68 A61K39/395 A61P9/00 A61P43/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок. В частности, способ включает получение образца от указанного пациента, определение уровня дипептидилпептидазы 3 (DPP3 Dipeptidyl peptidase 3) в указанном образце, в котором уровень DPP3 в указанном образце является показателем того, требуется ли лечение анти-ADM антителом, или фрагментом анти-ADM антитела, или каркасом анти-ADM, не являющимся каркасом Ig. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ включает дополнительное определение в образце от указанного пациента уровня ADM-NH2. Кроме того, настоящее изобретение также относится к набору для осуществления способа по настоящему изобретению.

Предшествующий уровень техники

Дипептидилпептидаза 3 - также известная как дипептидиламинопептидаза III, дипептидилариламидаза III, энкефалиназа В или ангиотензиназа эритроцитов; краткое название: DPP3, DPPIII - металлопептидаза, удаляющая дипептиды из физиологически активных пептидов, таких как энкефалины и ангиотензины. DPP3 впервые идентифицирована, и ее активность измерена, в экстрактах очищенной передней доли гипофиза крупного рогатого скота (Ellis и Nuenke, 1967). Фермент, который обозначают ЕС 3.4.14.4, имеет молекулярную массу около 83 кДа и является высококонсервативным у прокариот и эукариот (Prajapati и Chauhan, 2011). Аминокислотная последовательность человеческого варианта представлена в SEQ ID NO: 1. Дипептидилпептидаза III представляет собой главным образом цитозольную пептидазу, которая экспрессируется повсеместно. Несмотря на отсутствие сигнальной последовательности, в нескольких исследованиях сообщается о мембранной активности (Lee и Snyder, 1982).

DPP3 представляет собой цинк-зависимую экзопептидазу, принадлежащую к семейству пептидаз М49. Обладает широкой субстратной специфичностью к олигопептидам от трех/четырех до десяти аминокислот различного состава, а также способна расщеплять после пролина. Известно, что DPP3 гидролизует дипептиды с N-конца соответствующих субстратов, включая ангиотензин II, III и IV; лей- и мет-энкефалин; эндоморфин 1 и 2. Металлопептидаза DPP3 проявляет оптимальную активность при рН 8,0-9,0 и может быть активирована добавлением ионов двухвалентных металлов, таких как Со²⁺и Mg²⁺.

Структурный анализ DPP3 выявил каталитические мотивы HELLGH (hDPP3 450-455) и EECRAE (hDPP3 507-512), а также следующие аминокислоты, важные для связывания и гидролиза субстрата: Glu316, Tyr18, Asp366, Asn391, Asn394, His568, Arg572, Arg577, Lys666 и Arg669 (Prajapati и Chauhan, 2011; Kumar с соавт.,, 2016; нумерация соответствует последовательности DPP3 человека, см. SEQ ID NO: 1). Учитывая все известные аминокислоты или области последовательности, которые участвуют в связывании субстрата и гидролизе, активный сайт DPP3 человека можно определить как область между аминокислотами 316 и 669.

Наиболее заметным субстратом DPP3 является ангиотензин II (Ang II -angiotensin II), главный эффектор ренин-ангиотензиновой системы (RAS - renin-angiotensin system). RAS активируется при сердечно-сосудистых заболеваниях (Dostal с соавт. JMol Cell Cardiol, 1997, 29: 2893-2902; Roks с соавт.,, Heart Vessels, Suppl, 1997, 12:119-124), сепсисе и септическом шоке (Соггеа с соавт., 2015. Crit Care, 2015, 19:98). В частности, было показано, что Ang II модулирует многие сердечно-сосудистые функции, включая контроль артериального давления и ремоделирование сердца.

Недавно были созданы, охарактеризованы и утверждены два анализа для специфического обнаружения DPP3 в жидкостях организма человека (например, в крови, плазме, сыворотке): иммунолюминесцентный анализ (LIA -luminescence immunoassay) для определения концентрации белка DPP3 и анализа активности по захвату фермента (ЕСА enzyme capture activity) для определения концентрации белка DPP3 (Rehfeld с соавт., JALM, 2019, 3(6): 943-953). На этапе промывки удаляются все мешающие вещества до того, как будет выполнено фактическое обнаружение активности DPP3. Оба метода высокоспецифичны и позволяют воспроизводимо обнаруживать DPP3 в образцах крови.

Было показано, что циркулирующие уровни DPP3 повышены у пациентов с кардиогенным шоком и связаны с повышенным риском краткосрочной смерти и тяжелой органной дисфункции (Deaniau с соавт., Eur J Heart Fail, 2020, 22(2): 290-299). Кроме того, DPP3, измеренная при включении пациентов с дифференцированным кардиогенным шоком, у которых развился рефрактерный шок по сравнению с нерефрактерным шоком, концентрация DPP3≥59,1 нг/мл связана с повышенным риском смерти (Takagi с соавт.,2020. Eur J Heart Fail. 22(2):279-286).

Пептид адреномедуллин (ADM - adrenomedullin) был впервые описан в 1993 г. (Kitamura с соавт., Biochem Biophys Res Comm, 1993, 192(2): 553-560) как новый гипотензивный пептид, содержащий 52 аминокислоты, который был выделен из линии клеток феохромоцитомы человека (SEQ ID NO: 20). В том же году были также описана кДНК, кодирующая пептид-предшественник, содержащий 185 аминокислот, и полная аминокислотная последовательность этого пептида-предшественника. Пептид-предшественник, который содержит, среди прочего, сигнальную последовательность из 21 аминокислоты на N-конце, называется «препроадреномедуллин» (preproadrenomedullin pre-proADM). В настоящем описании все указанные положения аминокислот обычно относятся к pre-proADM, который включает 185 аминокислот. Пептид адреномедуллин (ADM) представляет собой пептид, который содержит 52 аминокислоты (SEQ ID NO: 20) и содержит аминокислоты с 95 по 146 pre-proADM, из которых он образован протеолитическим расщеплением. На сегодняшний день более точно исследованы по существу только несколько фрагментов пептидных фрагментов, образующихся при расщеплении pre-proADM, в частности, физиологически активные пептиды ADM и «РАМР», пептид, содержащий 20 аминокислот (22-41), за которым следует 21 аминокислота сигнального пептида в pre-proADM. Открытие и характеристика ADM в 1993 г. вызвали интенсивную исследовательскую деятельность, результаты которой обобщены в различных обзорных статьях, в контексте настоящего описания со ссылками, в частности, на статьи, которые можно найти в выпуске «Peptides», в частности посвященном ADM (Takahashi, Peptides, 2001, 22:1691; Eto, Peptides, 2001, 22: 1693-1711). Другой обзор на эту тему написан Hinson с соавт., 2000 (Hinson с соавт., Endocrine Reviews, 2000, 21(2): 138-167). В проведенных до настоящего времени научных исследованиях среди прочего было обнаружено, что ADM можно рассматривать как полифункциональный регуляторный пептид. Этот пептид высвобождается в кровоток в неактивной форме за счет удлинения глицином (Kitamura с соавт., Biochem Biophys Res Commun, 1998, 244 (2): 551-555). Существует также связывающий белок (Pio с соавт., The Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(15): 12292-12300), который является специфичным для ADM и, вероятно, аналогичным образом модулирует действие ADM. Те физиологические эффекты ADM, а также РАМР, которые имеют первостепенное значение в исследованиях на сегодняшний день, являются факторами, влияющими на кровяное давление.

Следовательно, ADM является эффективным сосудорасширяющим средством, и, таким образом, можно связать гипотензивный эффект с определенными пептидными сегментами в С-концевой части ADM. Кроме того, было обнаружено, что вышеупомянутый физиологически активный пептид РАМР, образованный из pre-proADM, также проявляет гипотензивное действие, даже если его механизм действия отличается от механизма действия ADM (дополнительно к указанным выше обзорам Eto с соавт., 2001, и Hinson с соавт., 2000, см. также Kuwasaki с соавт., FEBSLett, 1997, 414(1): 105-110; Kuwasaki с соавт., Ann. Clin. Biochem, 1999, 36: 622-628; Tsuruda с соавт., Life Sci. 2001, 69(2): 239-245; EP-A2 0 622 458). Кроме того, было обнаружено, что концентрации ADM, которые можно измерить в кровотоке и других биологических жидкостях, при ряде патологических состояний значительно превышают концентрации, обнаруженные у здоровых контрольных субъектов. Установлено, что уровень ADM у больных с застойной сердечной недостаточностью, инфарктом миокарда, заболеваниями почек, гипертоническими расстройствами, сахарным диабетом, в острой фазе шока, а также при сепсисе и септическом шоке достоверно повышен, хотя и в разной степени. Концентрации РАМР также увеличиваются при некоторых из указанных патологических состояний, но уровни в плазме ниже по сравнению с ADM (Eto, Peptides, 2001, 22:1693-1711). Сообщалось, что необычно высокие 30 концентраций ADM наблюдаются при сепсисе, а самые высокие концентрации при септическом шоке (Eto, Peptides, 2001, 22:1693-1711; Hirata с соавт., Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 81(4): 1449-1453; Ehlenz с соавт., Exp Clin Endocrinol Diabetes, 1997, 105:156-162; Tomoda с соавт., Peptides, 2001, 22:1783-1794; Ueda с соавт., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1999, 160:132-136; Wang с соавт., Peptides, 2001, 22:1835-1840).

Концентрации ADM в плазме повышены у пациентов с сердечной недостаточностью и коррелируют с тяжестью заболевания (Hirayama с соавт., J Endocrinol, 1999, 160: 297-303; Yu с соавт., Heart, 2001, 86:155-160). Высокое содержание ADM в плазме является независимым отрицательным прогностическим показателем у этих субъектов (Роупег с соавт., Pharmacol Rev, 2002, 54: 233-246).

WO 2004/097423 описывает применение антител против адреномедуллина для диагностики, прогноза и лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Лечение заболеваний путем блокирования рецептора ADM также описано в данной области (например, WO 2006/027147, РСТ/ЕР 2005/012844) указанными заболеваниями могут быть сепсис, септический шок, сердечно-сосудистые заболевания, инфекции, дерматологические заболевания, эндокринологические заболевания, заболевания обмена веществ, гастроэнтерологические заболевания, рак, воспаление, гематологические заболевания, респираторные заболевания, заболевания скелетной мускулатуры, неврологические заболевания, урологические заболевания.

Сообщается, что на ранней стадии сепсиса ADM улучшает функцию сердца и кровоснабжение печени, селезенки, почек и тонкого кишечника. Анти-ADM-нейтрализующие антитела нейтрализуют вышеупомянутые эффекты на ранней стадии сепсиса (Wang с соавт., Peptides, 2001, 22:1835-1840). При других заболеваниях блокирование ADM может быть в определенной степени полезным. Однако полная нейтрализация ADM также может быть вредной, поскольку определенное количество ADM может потребоваться для нескольких физиологических функций. Во многих сообщениях подчеркивалось, что введение ADM может быть полезным при некоторых заболеваниях. В отличие от этого, в других отчетах сообщалось, что ADM опасен для жизни при введении в определенных условиях.

WO 2013/072510 описывает ненейтрализующее анти-ADM антитело для применения в терапии тяжелого хронического или острого заболевания или острого состояния пациента для снижения риска смертности указанного пациента.

WO 2013/072511 описывает ненейтрализующее анти-ADM антитело для применения в терапии хронического или острого заболевания или острого состояния пациента для предотвращения или уменьшения органной дисфункции или органной недостаточности.

WO 2013/072512 описывает ненейтрализующее анти-ADM-антитело, которое представляет собой ADM-стабилизирующее антитело, которое повышает полу-жизнь (период полуудержания t1/2) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме. Это ADM-стабилизирующее антитело блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%.

WO 2013/072513 описывает ненейтрализующее анти-ADM-антитело для применения в терапии острого заболевания или состояния пациента для стабилизации кровообращения.

WO 2013/072514 описывает ненейтрализующее анти-ADM-антитело для регулирования баланса жидкости у пациента с хроническим или острым заболеванием или острым состоянием.

WO 2017/182561 описывает способы определения общего количества или активной DPP3 в образце пациента для диагностики заболевания, связанного с некротическими процессами. Также описан способ лечения заболеваний, связанных с некрозом, с помощью антител, направленных к DPP3.

В настоящем изобретении неожиданно было установлено, что у пациентов с шоком и у пациентов, перенесших шок, уровень DPP3 в образце жидкости организма следует использовать для осуществления терапии, и/или наблюдения за терапией, и/или стратификации терапии с анти-ADM-антителом, и/или фрагментом анти-ADM-антитела, и/или анти-ADM-каркасом, не являющимся каркасом Ig.

Кроме того, результаты, полученные в настоящем изобретении, ясно показывают, что пациенты с шоком получат наибольшую пользу от терапии анти-ADM антителом, если уровень DPP3 в образце жидкости организма ниже порогового значения.

Описание изобретения

Предметом настоящего изобретения является способ осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, в котором настоящий способ включает:

- определение уровня дипептидилпептидазы 3 (DPP3) в образце телесной жидкости указанного пациента,

- сравнение указанного уровня определенного DPP3 с предварительно определенным пороговым значением, и

- уровень DPP3 в указанном образце свидетельствует о том, требуется ли лечение анти-ADM антителом, или фрагментом анти-ADM антитела, или анти-ADM-каркасом, не являющимся каркасом Ig, и где указанное анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или анти-ADM-каркас, не являющийся каркасом Ig, связывается с N-концевой частью (аминокислоты 1-21) ADM: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID NO: 14).

Предметом настоящего изобретения является способ осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, в котором настоящий способ включает:

- определение уровня дипептидилпептидазы 3 (DPP3) в образце телесной жидкости указанного пациента,

- сравнение указанного уровня определенного DPP3 с предварительно определенным пороговым значением, и

- введение антитела против адреномедуллина (анти-ADM антитела), или фрагмента анти-ADM антитела, или анти-ADM-каркаса, не являющегося каркасом Ig, если указанный определенный уровень DPP3 ниже предварительно определенного порога, и при этом указанное анти-ADM антитело, или анти-ADM-фрагмент, или анти-ADM-каркас, не являющийся каркасом Ig, связывается с N-концевой частью (аминокислоты 1-21) ADM: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID NO: 14).

Предметом настоящего изобретения является способ осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, в котором настоящий способ включает:

- определение уровня дипептидилпептидазы 3 (DPP3) в образце телесной жидкости указанного пациента,

- сравнение указанного уровня определенного DPP3 с предварительно определенным пороговым значением, и

- введение антитела против адреномедуллина (анти-ADM антитела), или фрагмента анти-ADM антитела, или анти-ADM-каркаса, не являющегося каркасом Ig, указанному пациенту,

в котором указанный пациент проходит лечение, если указанный определенный уровень DPP3 ниже предварительно определенного порога, и

где указанное анти-ADM антитело, или анти-ADM-фрагмент, или анти-ADM-каркас, не являющийся каркасом Ig, связывается с N-концевой частью (аминокислоты 1-21) ADM: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID NO: 14).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу осуществления терапии, и/или терапевтического мониторинга, и/или терапевтической стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, где указанный шок выбирают из группы, включающей шок вследствие гиповолемии, кардиогенный шок, обструктивный шок и распределительный шок в частности кардиогенный шок или септический шок.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу осуществления терапии, и/или терапевтического мониторинга, и/или терапевтической стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, где

- в случае кардиогенного шока указанный пациент может переносить острый коронарный синдром (например, острый инфаркт миокарда) или при наличии у указанного пациента сердечной недостаточности (например, острой декомпенсированной сердечной недостаточности), миокардита, аритмии, кардиомиопатии, порока сердца, расслоения аорты при остром аортальном стенозе, травматического разрыва хорды или массивной легочной эмболии, или

- в случае гиповолемического шока указанный пациент может страдать геморрагическим заболеванием, включая желудочно-кишечное кровотечение, травму, сосудистую этиологию (например, разрыв аневризмы брюшной аорты, опухоль, прорастающую в крупный кровеносный сосуд) и спонтанное кровотечение на фоне приема антикоагулянтов, не геморрагическое заболевание включая рвоту, диарею, почечную недостаточность, кожные потери/потери чувствительности (например, ожоги, тепловой удар), или потерю интестиция на фоне панкреатита, цирроза печени, кишечной непроходимости, травмы, или потеря интерстиция в условиях панкреатита, цирроза печени, кишечной непроходимости, травмы или

- в случае обструктивного шока указанный пациент может страдать тампонадой сердца, напряженным пневмотораксом, тромбоэмболией легочной артерии или аортальным стенозом, или

- в случае дистрибутивного шока у больного может быть септический шок, нейрогенный шок, анафилактический шок или шок вследствие надпочечникового криза.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где указанный предварительно определенный порог DPP3 в образце жидкости тела указанного субъекта составляет от 20 до 120 нг/мл, более предпочтительно от 30 до 80 нг/мл, еще более предпочтительно от 40 до 60 нг/мл, наиболее предпочтительно указанный порог составляет 50 нг/мл.

В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где определяют уровень белка DPP3 и/или уровень активного DPP3 и сравнивают с заранее определенным порогом.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где определяют уровень DPP3 путем контакта указанного образца жидкости тела со связующим соединением, которое специфически связывается с DPP3.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где указанное определение включает использование связующего соединения, которое специфически связывается с DPP3 полной длиной, в котором указанное связующее соединение может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или каркаса, отличного от каркаса IgG.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают осуществления настоящее изобретение относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где указанное определение включает использование связующего соединения, которое специфически связывается с DPP3 полной длиной, в котором указанное связующее соединение может быть антителом.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают осуществления настоящее изобретение относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где количество белка DPP3 и/или активность DPP3 определяют в образце жидкости организма указанного субъекта, и при этом указанное определение включает использование связующего соединения, которое специфически связывается с DPP3 полной длиной, в котором указанное связующее соединение иммобилизовано на поверхности.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где количество белка DPP3 и/или активность DPP3 определяют в образце жидкости организме указанного субъекта, в котором указанная стадия разделения представляет собой стадию промывки, на которой удаляют ингредиенты образца, не связанные с указанным улавливающим связующим, из захваченного DPP3.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают способ осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, в котором способ определения активности DPP3 в образце жидкости организма указанного субъекта включает стадии:

- приведения указанного образца в контакт с улавливающим связующим, которое специфически связывает DPP3, DPP3 полной длиной,

- отделения DPP3, связанной с указанным улавливающим связующим,

- добавления субстрата DPP3 к указанной отделенной DPP3,

- количественной оценки активности указанной DPP3 путем измерения и количественной оценки превращения субстрата DPP3.

Другой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где активность DPP3 определяют в образце жидкости организма указанного субъекта, и где превращение субстрата DPP3 определяют методом, выбранным из группы, включающей: флуоресценцию флуорогенных субстратов (например, Arg-Arg-βNA, Arg-Arg-AMC), изменение цвета хромогенных субстратов, люминесценцию субстратов, связанных с аминолюциферином (анализ Promega Protease-GloTM), масс-спектрометрию, ВЭЖХ/FPLC (обращенно-фазовую хроматографию, эксклюзионную хроматографию), тонкослойную хроматографию, электрофорез в капиллярной зоне, гель-электрофорез с последующим окрашиванием активности (иммобилизованной, активной DPP3) или вестерн-блотинг (продукты расщепления).

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где активность DPP3 определяют в образце жидкости организма указанного субъекта, и где указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей: ангиотензин II, III и IV, лей-энкефалин, мет-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, АСТН и MSH, или дипептиды, связанные с флуорофором, хромофором или аминолюциферином, где дипептидом является Arg-Arg.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где активность DPP3 определяют в образце жидкости организма указанного субъекта, и где указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей: дипептид, связанный с флуорофором, хромофором или аминолюциферином, где дипептидом является Arg-Arg.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где указанный пациент дополнительно характеризуется наличием уровня ADM-NH2 выше порогового значения.

Один конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где указанный порог ADM-NH2 в образце жидкости организма указанного пациента составляет от 40 до 100 пг/мл, более предпочтительно от 50 до 90 пг/мл, еще более предпочтительно от 60 до 80 пг/мл, наиболее предпочтительно указанный порог составляет 70 пг/мл.

Один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где уровень ADM-NH2 определяют путем контакта указанного образца жидкости организма с улавливающим связующим, которое специфически связывает ADM-NH2.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, в котором образец жидкости организма указанного пациента выбирают из группы, в которую входят кровь, сыворотка, плазма, моча, спинномозговая жидкость (ЦСЖ) и слюна.

Другой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где уровень DPP3 и уровень ADM-NH2 определяют в комбинации. Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где уровень DPP3 и уровень ADM-NH2 определяют одновременно.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где уровень DPP3 и уровень ADM-NH2 определяют с помощью устройства для оказания медицинских услуг на месте.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где указанное устройство для оказания медицинских услуг на месте является микрожидкостным устройством.

Используемое в настоящем изобретении микрожидкостное устройство имеет множество камер, расположенных в разных местах, которые соединены параллельно и в которые может быть эффективно распределено фиксированное количество жидкости без использования отдельного источника привода, при этом указанное устройство включает в себя платформу, имеющую центр вращение и включающую по крайней мере одну микрожидкостную структуру. Микрожидкостные устройства используют для проведения биологических или химических реакций путем манипулирования небольшим количеством жидкости.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где указанное анти-ADM-антитело, или фрагмент анти-ADM-антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, распознает и связывает N-конец (аминокислота 1) ADM.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где указанное антитело, фрагмент антитела или каркас, не являющийся каркасом Ig, не связывается с С-концевой частью ADM, имеющей аминокислотную последовательность 43-52 ADM: PRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO: 24).

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело, которое связывается с ADM, или его фрагмент, который связывается с ADM, в котором тяжелая цепь содержит последовательности:

CDR1: SEQ ID NO: 1

GYTFSRYW

CDR2: SEQ ID NO: 2

ILPGSGST

CDR3: SEQ ID NO: 3

TEGYEYDGFDY

где легкая цепь включает последовательности:

CDR1: SEQ ID NO: 4

QSIVYSNGNTY

CDR2:

RVS

CDR3: SEQ ID NO: 5

FQGSHIPYT.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где указанное антитело или его фрагмент содержит последовательность, выбранную из группы, содержащей в качестве области VH:

SEQ ID NO: 6 (AM-VH-C)

SEQ ID NO: 7 (AM-VH1)

SEQ ID NO: 8 (AM-VH2-E40)

SEQ ID NO: 9 (AM-VH3-T26-E55)

SEQ ID NO: 10 (AM-VH4-T26-E40-E55)

и содержит последовательность, выбранную из группы, включающей следующие последовательности в качестве области VL:

SEQ ID NO: 11 (AM-VL-C)

SEQ ID NO: 12 (AM-VL1)

SEQ ID NO: 13 (AM-VL2-E40)

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок, где указанное антитело или его фрагмент содержит последовательность в качестве тяжелой цепи:

SEQ ID NO: 32

или последовательность, которая>95% идентична ей и содержит следующую последовательность в качестве легкой цепи:

SEQ ID NO: 33

или последовательность, которая >95% идентична ей.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения или уровень белка DPP3, и/или уровень активной DPP3 определяют и сравнивают с пороговым уровнем.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения порог DPP3 в образце жидкости организма указанного пациента составляет от 20 до 120 нг/мл, более предпочтительно от 30 до 80 нг/мл, еще более предпочтительно от 40 до 60 нг/мл, наиболее предпочтительно указанный порог составляет 50 нг/мл.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения порогом для уровня DPP3 является 5-кратная медианная концентрация, предпочтительно 4-кратная медианная концентрация, более предпочтительно 3-кратная медианная концентрация, наиболее предпочтительно 2-кратная медианная концентрация нормальной здоровой популяции.

Уровень DPP3 как количество белка DPP3 и/или активности DPP3 в образце жидкости организма указанного субъекта может быть определен различными методами, например, иммуноанализами, анализами определения активности, масс-спектрометрическими методами и т.д.

Активность DPP3 можно измерить путем обнаружения продуктов расщепления специфичных для DPP3 субстратов. Известные субстраты пептидных гормонов включают Leu-энкефалин, Met-энкефалин, эндоморфины 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, адренокортикотропный гормон (АСТН - adrenocorticotropic hormone) и меланоцитостимулирующий гормон (MSH-melanocytestimulating hormone; с соавт., 2000, Barsun с соавт., 2007, Dhanda с соавт., 2008). МСГ; с соавт., 2000, Barsun с соавт., 2007, Дханда с соавт., 2008). Расщепление указанных пептидных гормонов, а также других немеченых олигопептидов (например, Ala-Ala-Ala-Ala; Dhanda с соавт., 2008) можно подвергать мониторингу путем обнаружения соответствующих продуктов расщепления. Методы обнаружения включают, но ими не ограничиваются, анализ ВЭЖХ (см., например, Lee и Snyder, 1982), масс-спектрометрию (см., например, с соавт., 2000), анализ Н1-ЯМР (см., например, Vandenberg с соавт., 1985), капиллярный зональный электрофорез (СЕ - capillary zone electrophoresis; см., например, Barsun с соавт., 2007), тонкослойную хроматографию (см., например, Dhanda с соавт., 2008) или обращенно-фазовую хроматографию (см., например, Mazocco с соавт., 2006).

Обнаружение флуоресценции из-за гидролиза флуорогенных субстратов с помощью DPP3 является стандартной процедурой для мониторинга активности DPP3. Эти субстраты представляют собой специфические ди- или трипептиды (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Sue-Ala-Ala-Phe), соединенные с флуорофором. Флуорофоры включают, но не ограничиваются ими, β-нафтиламид (2-нафтиламид, βNA, 2NA), 4-метокси-β-нафтиламид (4-метокси-2-нафтиламид) и 7-амидо-4-метилкумарин (АМС, MCA; с соавт., 2000, Ohkubo с соавт., 1999). Расщепление этих флуорогенных субстратов приводит к высвобождению флуоресцентного β-нафтиламина или 7-амино-4-метилкумарина, соответственно. В жидкофазном анализе субстрат ЕСА и DPP3 инкубируют, например, в формате 96-луночного планшета, и измеряют флуоресценцию с использованием детектора флуоресценции (Ellis и Nuenke, 1967). Кроме того, образцы, несущие ДРР3, могут быть иммобилизованы и разделены на геле с помощью электрофореза, гели окрашены флуорогенным субстратом (например, Arg-Arg-βNA) и красителем Fast Garnet GBC, а полосы флуоресцентного белка обнаруживают с помощью ридера флуоресценции (Ohkubo с соавт., 1999). Те же пептиды (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Sue-Ala-Ala-Phe) могут быть соединены с хромофорами, такими как Asp-нитроанилиддиацетат. Обнаружение изменения цвета из-за гидролиза хромогенных субстратов можно использовать для мониторинга активности DPP3.

Другим вариантом определения активности DPP3 является анализ Protease-GloTM (коммерчески доступный от фирмы Promega). В этом варианте осуществления указанного способа специфичные для DPP3 ди- или трипептиды (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-30 Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe) связаны с аминолюциферином. При расщеплении DPP3 высвобождается аминолюциферин, который служит субстратом для сопряженной люциферазной реакции, которая испускает обнаруживаемую люминесценцию.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения активность DPP3 измеряют путем добавления флуорогенного субстрата Arg-Arg-NA и мониторинга флуоресценции в режиме реального времени.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения в указанном способе определения активного DPP3 в образце жидкости организма субъекта указанное улавливающее связующее, реагирующее с DPP3, иммобилизовано на твердой фазе.

Исследуемый образец пропускают через иммобилизованное связующее, и DPP3, если она присутствует, связывается со связующим и сама иммобилизуется для обнаружения. Затем можно добавить субстрат, и можно обнаружить продукт реакции, что указать на присутствие или количество DPP3 в исследуемом образце. Для целей настоящего описания термин «твердая фаза» может использоваться применительно к любому материалу или сосуду, в котором или на котором может проводиться анализ, и включает, помимо прочего: пористые материалы, непористые материалы, пробирки, лунки, предметные стекла, агарозные смолы (например, Sepharose фирмы GE Healthcare Life Sciences), магнитные частицы (например, магнитные шарики DynabeadsTM или PierceTM фирмы Thermo Fisher Scientific) и т.д.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения уровень DPP3 определяют путем контакта указанного образца жидкости организма с улавливающим связующим, которое специфически связывается с DPP3.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное улавливающее связующее для определения уровня DPP3 может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или каркаса, отличного от каркаса IgG.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное улавливающее связующее является антителом.

Количество белка DPP3 и/или активность DPP3 в образце жидкости организма указанного субъекта можно определить, например, одним из следующих методов:

1. Люминесцентный иммуноанализ для количественного определения концентрации белка DPP3 (LIA Luminescence immunoassay) (Rehfeld с соавт., J AIM, 2019, 3(6): 943-953).

LIA представляет собой одноэтапный хемилюминесцентный сэндвич-иммуноанализ, в котором в качестве твердой фазы используют белые планшеты для микротитрования с высоким связыванием из полистирола. Эти планшеты покрывают моноклональным анти-DPP3 антителом АК2555 (улавливающее антитело). Индикаторное анти-DPP3 антитело AK2553 метят МА70-акридиний-NHS-эфиром и используют из расчета 20 нг на лунку. Двадцать микролитров образцов (например, сыворотки, плазмы с гепарином, цитратной плазмы или плазмы с ЭДТА, полученные из крови пациентов) и калибраторов пипеткой вносят в белые микротитровальные планшеты с покрытием. После добавления индикаторного антитела AK2553 планшеты для микротитрования инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре и 600 об/мин. Затем несвязанный индикатор удаляют путем 4 промывок (350 мкл на лунку). Оставшуюся хемилюминесценцию измеряют в течение 1 сек на лунку с помощью люминометра для микротитровальных планшетов. Концентрацию DPP3 определяют с помощью 6-точечной калибровочной кривой. Калибраторы и образцы желательно запускать в двух экземплярах.

2. Анализ улавливающей активности фермента для количественного определения активности DPP3 (ECA enzyme capture activity) (Rehfeld с соавт., J AIM, 2019, 3(6): 943-953).

ECA представляет собой анализ активности, специфичный для DPP3, в котором в качестве твердой фазы используют черные планшеты для микротитрования из полистирола с высоким связыванием. Эти планшеты покрывают моноклональным анти-DPP3 антителом AK2555 (улавливающим антителом). Двадцать микролитров образцов (например, сыворотки, плазмы с гепарином, плазмы с цитратом, плазмы с ЭДТА, спинномозговой жидкости и мочи) и калибраторы пипеткой вносят в черные планшеты для микротитрования с покрытием. После добавления буфера для анализа (200 мкл) планшеты для микротитрования инкубируют в течение 2 ч при 22°С и 600 об/мин. DPP3, присутствующую в образцах, иммобилизуют путем связывания с улавливающим антителом. Несвязавшиеся компоненты образца удаляют 4 этапами промывки (350 мкл на лунку). Специфическую активность иммобилизованной DPP3 измеряют путем добавления флуорогенного субстрата Arg-Arg-β-нафтиламида (Arg2-βNA) в реакционный буфер с последующей инкубацией при 37°С в течение 1 ч. DPP3 специфически расщепляет Arg2-βNA на дипептид Arg-Arg и флуоресцентный β-нафтиламин. Флуоресценцию измеряют флуориметром с использованием длины волны возбуждения 340 нм, а эмиссию регистрируют при 410 нм. Активность DPP3 определяют с помощью 6-точечной калибровочной кривой. Калибраторы и образцы желательно анализировать в двух повторах.

3. Жидкофазный анализ для количественного определения активности DPP3 (LAA liquid-phase assay of activity) (модификация анализа, описанного Jones с соавт., Analytical Biochemistry, 1982).

LAA представляет собой жидкофазный анализ, в котором для измерения активности DPP3 используют черные планшеты из полистирола для микротитрования, не предназначенные для связывания. Двадцать микролитров образцов (например, сыворотки, гепарин-плазмы, цитрат-плазмы) и калибраторы пипеткой вносят в черные планшеты для микротитрования, не предназначенные для связывания. После добавления флуорогенного субстрата Arg2-βNA в буфер для анализа (200 мкл) начальную флуоресценцию pNA (Т=0) измеряют во флуориметре с использованием длины волны возбуждения 340 нм, а эмиссию определяют при 410 нм. Затем планшет инкубируют при 37°С в течение 1 ч.

Измеряют конечную флуоресценцию (Т=60). Рассчитывают разницу между конечной и начальной флуоресценцией. Активность DPP3 определяют с помощью 6-точечной калибровочной кривой. Калибраторы и образцы желательно анализировать в двух повторах.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения для определения уровня DPP3 используют анализ, чувствительность которого позволяет количественно определить DPP3 у здоровых субъектов, которая составляет <20 нг/мл, предпочтительно <30 нг/мл и более предпочтительно <40 нг/мл.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное связующее проявляет связывающую аффинность с DPP3, составляющую по меньшей мере 10⁷ М^-1, предпочтительно 10⁸ М^-1, более предпочтительно аффинность больше 10⁹ М^-1, наиболее предпочтительно больше 10¹⁰ М^-1. Специалисту в данной области известно, что можно рассматривать возможность компенсации более низкой аффинности путем применения более высокой дозы соединений, и эта мера не выходит за рамки настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный образец жидкости организма выбирают из группы, включающей цельную кровь, плазму и сыворотку.

Термины «зрелый ADM», «био-ADM» и «ADM-NH2», используемые в настоящем изобретении в качестве синонимов, являются молекулой, представленной в SEQ ID NO: 20.

Жидкость по настоящему изобретению в одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения представляет собой образец крови. Образец крови может быть выбран из группы, включающей цельную кровь, сыворотку и плазму. В конкретном воплощении способа указанный образец выбирают из группы, включающей цитратную плазму человека, плазму с гепарином и плазму с ЭДТА.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения для определения уровня ADM-NH2 используют метод, чувствительность которого позволяет количественно определять зрелый ADM-NH2 у здоровых субъектов, составляющий <70 пг/мл, предпочтительно <40 пг/мл и более предпочтительно <10 пг/мл.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения пороговое значение для ADM-NH2 составляет от 40 до 100 пг/мл, более предпочтительно от 50 до 90 пг/мл, еще более предпочтительно от 60 до 80 пг/мл, наиболее предпочтительно пороговое значение составляет 70 пг/мл.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения порог для ADM-NH2 в плазме представляет собой 5-кратную медианную концентрацию, предпочтительно 4-кратную медианную концентрацию, более предпочтительно 3-кратную медианную концентрацию, наиболее предпочтительно 2-кратную медианную концентрацию нормальной здоровой популяции.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное связующее имеет связывающую аффинность с ADM-NH2 по меньшей мере 10 М^-1, предпочтительно 10^s М^-1, более предпочтительно аффинность больше 10⁹ М^-1, наиболее предпочтительно больше 10¹⁰ М^-1. Специалисту в данной области известно, что можно рассматривать возможность компенсации более низкой аффинности путем применения более высокой дозы соединений, и эта мера не выходит за рамки настоящего изобретения.

Для определения аффинности антител к адреномедуллину опредеют кинетику связывания адреномедуллина с иммобилизованным антителом с помощью безметочного поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы Biacore 2000 (фирма GE Healthcare Europe GmbH, Фрайбург, Германия). Обратимую иммобилизацию антител проводят с использованием антитела против Fc мыши, ковалентно связанного в высокой плотности с поверхностью сенсора СМ5 в соответствии с инструкциями производителя (набор для захвата мышиных антител; фирма GE Healthcare), (Lorenz с соавт., Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(1): 165-173).

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное связующее выбрано из группы, включающей антитело, или фрагмент антитела, или каркас, не являющийся каркасом Ig, связывающееся с ADM-NH2.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения для определения уровня ADM-NH2 используют метод, представляющий сэндвич-анализ, предпочтительно полностью автоматизированный.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения такой анализ для определения уровня биомаркеров (DPP3 и/или ADM-NH2) представляет собой сэндвич-иммуноанализ с использованием любой технологии обнаружения, включая, помимо прочего, ферментную метку, хемилюминесцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, предпочтительно полностью автоматизированные. В одном варианте осуществления способа диагностики такой анализ представляет собой сэндвич-анализ с меченым ферментом. Примеры автоматизированного или полностью автоматизированного анализа включают анализы, которые можно использовать для одной из следующих систем: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, BiomerieuxVidas®, Alere Triage®.

Известны различные иммунологические анализы, которые могут быть использованы для анализов и способов по настоящему изобретению, они включают: масс-спектрометрию (MS), иммунолюминесцентный анализ (LIA), радиоиммунный анализ (RIA), гомогенный иммуноферментный анализ (EMIT). "), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноанализ с реактивацией апоферментов (ARIS), массивы шариков на основе люминесценции, массивы на основе магнитных шариков, анализы белковых микрочипов, форматы экспресс-тестов, такие как, например, иммуноанализы с измерительными полосками, иммунохроматографические стрип-тесты, анализ редких криптатов и автоматизированные системы/анализаторы.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения такой анализ представляет собой сэндвич-иммуноанализ с использованием любой технологии обнаружения, включая, но не ограничиваясь этим, ферментную метку, хемилюминесцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, предпочтительно полностью автоматизированный анализ. В одном варианте осуществления настоящего изобретения такой анализ представляет собой сэндвич-анализ с меченым ферментом. Примеры автоматизированного или полностью автоматизированного анализа включают анализы, которые можно использовать для одной из следующих систем: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, Biomerieux Vidas®, Alere Triage®.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения это может быть так называемый РОС-тест (point-of-care оказание медпомощи на месте), то есть технология тестирования, позволяющая проводить тест в течение менее 1 ч рядом с пациентом без необходимости в использовании полностью автоматизированного система анализа. Одним из примеров этой технологии является технология иммунохроматографического тестирования, например, микрожидкостное устройство.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная метка выбрана из группы, включающей хемилюминесцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, метку радиоактивного йода.

Анализы могут быть гомогенными или гетерогенными, конкурентными и неконкурентными. В одном варианте осуществления настоящего изобретения анализ является сэндвич-анализом, который представляет собой неконкурентный иммуноанализ, в котором молекула, подлежащая детекции и/или количественному определению, связана и с первым антителом, и со вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, шариком, поверхностью лунки или другого контейнера, чипом или полоской, а второе антитело представляет собой антитело, меченное, например, красителем, радиоизотопом или реакционноспособным или каталитически активным фрагментом. Затем соответствующим методом измеряют количество меченого антитела, связанного с анализируемым объектом. Общий состав и процедуры, связанные с «сэндвич-тестами», хорошо разработаны и известны специалистам в данной области (кн.: «The Immunoassay Handbook», под ред. David Wild, изд-во Elsevier LTD, Оксфорд, 3е изд., май 2005), ISBN-13: 978-0080445267; Hultschig С.с соавт., Curr Opin Chem Biol. 2006, 10(1):4-10. PMID: 16376134).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения анализ включает две захватывающие молекулы, предпочтительно антитела, которые обе присутствуют в виде дисперсий в жидкой реакционной смеси, где первый компонент-метка присоединен к первой захватывающей молекуле, при этом указанный первый компонент-метка является частью системы метки, основанной на тушения или амплификации флуоресценции или хемилюминесценции, а второй компонент-метка указанной системы маркировки присоединяют ко второй захватывающей молекуле, так что при связывании обеих захватывающих молекул с анализируемым объектом генерируется сигнал, который можно измерить, что позволяет обнаруживать образованные сэндвич-комплексы в растворе, содержащем образец.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная система нанесения метки содержит криптаты редкоземельных элементов или хелаты редкоземельных элементов в сочетании с флуоресцентным красителем или хемилюминесцентным красителем, в частности с красителем цианинового типа. В контексте настоящего изобретения анализы на основе флуоресценции включают использование красителей, которые могут быть, например, выбраны из группы, включающей FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), IRD- 700/800, цианиновые красители, такие как СУ3, CY5, СУ3.5, CY5.5, Су7, ксантен, 6-карбокси-2',4',7',4,7-гексахлорфлуоресцеин (HEX), ТЕТ, 6-Карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметодиплуоресцеин (JOE), N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-Х-родамин (ROX), 5-35 карбоксиродамин-6G (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, красители BODIPY, такие как BODIPY TMR, Oregon Green, кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258; Фенантридины, такие как Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor, PET, этидий бромид, акридиновые красители, карбазоловые красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и т.п.

В контексте настоящего изобретения анализы на основе хемилюминесценции включают использование красителей, основанных на физических принципах, описанных для хемилюминесцентных материалов в (Kirk-Othmer, кн.: «Encyclopedia of Chemical Technology)), 4-е изд., ответственный редактор J. I. Kroschwitz; редактор М., Howe-Grant, изд-во John Wiley & Sons, 1993, 15:518-562: публикация включена в настоящее изобретение в виде ссылки, включая ссылки на стр. 551-562). Предпочтительными хемилюминесцентными красителями являются сложные эфиры акридиния.

Как упоминалось в настоящем изобретении, «анализ» или «диагностический анализ» может относиться к любому типу, применяемому в области диагностики. Такой анализ может быть основан на связывании определяемого исследуемого соединения с одним или несколькими зондами улавливания с определенной аффинностью. Что касается взаимодействия между захватывающими молекулами и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами, константа сродства предпочтительно превышает 10⁸ М^-1.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одно из двух указанных связующих метят для того, чтобы его можно было обнаружить.

Уровни ADM-NH2 по настоящему изобретению определяют с помощью описанного анализа ADM-NH2 (Weber с соавт., JALM, 2017, 2(2):1-4). Уровни DPP3 по настоящему изобретению определяют с помощью описанных анализов DPP3 (Rehfeld с соавт., JALM 2019. 3(6): 943-953). Упомянутые выше пороговые значения могут отличаться в других анализах, если они были откалиброваны иначе, чем системы анализа, используемые в настоящем изобретении. Следовательно, упомянутые выше пороговые значения должны применяться для таких анализов с различной калибровкой, соответственно, принимая во внимание различия в калибровке. Одной из возможностей количественной оценки различий в калибровке является сравнительный анализ методов (корреляция) рассматриваемого анализа с соответствующим анализом биомаркеров, используемым в настоящем изобретении, путем измерения соответствующего биомаркера (например, био-ADM, DPP3) в образцах с использованием обоих методов. Другая возможность состоит в том, чтобы определить с помощью рассматриваемого анализа, при условии, что этот тест имеет достаточную аналитическую чувствительность, средний уровень биомаркеров репрезентативной нормальной популяции, сравнить результаты со средними уровнями биомаркеров, как описано в литературе, и пересчитать калибровку на основе полученной разницы по этому сравнению. С помощью калибровки, используемой в настоящем изобретении, были измерены образцы от нормальных (здоровых) субъектов: медиана био-ADM в плазме (зрелый ADM-NH2) составила 24,7 пг/мл, наименьшее значение 11 пг/мл и 99-й процентиль 43 пг/мл (Marino с соавт., Critical Care, 2014, 18:R34). С помощью калибровки, используемой в настоящем изобретении, были измерены образцы от 5400 нормальных (здоровых) субъектов (шведское одноцентровое проспективное популяционное исследование (МРР RES)): медиана (межквартильный диапазон) DPP3 в плазме составила 14,5 нг/мл (11,3 нг/мл 19 нг/мл).

Используемый в настоящем изобретении термин «осуществление терапии» относится к применению определенных видов терапии или медицинских вмешательств на основе значения одного или нескольких биомаркеров, и/или клинических параметров, и/или клинических оценок.

Термин «мониторинг терапии» в контексте настоящего изобретения относится к мониторингу и/или корректировке терапевтического лечения указанного пациента, например, путем получения обратной связи об эффективности терапии.

Термин «терапевтическая стратификация», в частности, относится к группированию или классификации пациентов по разным группам, таким как терапевтические группы, в которых пациенты получают или не получают терапевтические меры в зависимости от их классификации.

Особым преимуществом способа по настоящему изобретению является то, что пациентов с шоком или пациентов, впадающих в шок, можно стратифицировать в отношении требуемой терапии, в котором указанная терапия представляет собой введение анти-ADM антитела, или фрагмента анти-ADM антитела, или каркаса анти-ADM антитела, отличного от каркаса Ig, который связывается с N-концевой частью (аминокислоты 1-21) ADM: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID NO 14). Стратифицированные группы пациентов могут включать пациентов, которым требуется начало лечения, и пациентов, которым не требуется начинать лечение.

Другим особым преимуществом настоящего изобретения является то, что способ может выявлять пациентов, которые с большей вероятностью получат пользу от указанной терапии, и отличать от пациентов, которые вряд ли получат пользу от указанной терапии.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лечение начинают или изменяют сразу после получения результата анализа образца, указывающего на уровень DPP3 и/или ADM-NH2 в образце. В дополнительных вариантах лечение можно начинать в течение 12 ч, предпочтительно через 6, 4, 2, 1, 0,5, 0,25 ч или сразу после получения результата анализа образца.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает или состоит из однократного и/или многократного измерения DPP3 и/или ADM-NH2 в образце, взятом у пациента, в одном образце и/или нескольких образцах, полученных по существу в один и тот же момент времени, чтобы осуществить, и/или провести мониторинг, и/или стратифицировать терапию, в котором указанная терапия представляет собой введение анти-ADM антитела, или анти-ADM фрагмента, или каркаса анти-ADM антитела, не являющегося каркасом Ig, который связывается с N-концевой частью (аминокислоты 1-21) ADM:

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID NO 14).

Особенно предпочтительно определять уровень DPP3 в том же образце, в котором определяют уровень ADM-NH2, в контексте способа по настоящему изобретению. В этом варианте осуществления настоящего изобретения оба биомаркера DPP3 и ADM-NH2 могут быть определены в одном и том же образце в одно и то же время в формате мультиплексного анализа или в разные моменты времени в формате мультиплексного анализа или в формате одиночного анализа. Мультиплексные анализы могут быть дуплексными анализами для определения обоих маркеров, при этом анализ может быть анализом по месту оказания медицинской помощи, который можно проводить сразу после выделения образца в том же месте, где находится пациент.

Настоящее изобретение дополнительно относится к набору для осуществления способа по настоящему изобретению, включающему реагенты для обнаружения для определения уровня DPP3 и дополнительно для определения уровня ADMNH2 в образце, взятом у пациента.

Его также предпочтительно можно определить как анализ в месте оказания медицинской помощи, который можно проводить непосредственно в месте, где пациент сталкивается с медицинским персоналом, например, в отделении неотложной помощи или в отделении первичной помощи. Кроме того, анализ для обнаружения DPP3 и дополнительно ADM-NH2 может быть анализом, предпочтительно дуплексным анализом и/или анализом на месте, который является автоматическим или полуавтоматическим.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам и наборам для определения уровня DPP3 и дополнительно для определения уровня ADM-NH2 и, необязательно, дополнительных биомаркеров в образце, взятом у пациента.

Указанные дополнительные биомаркеры могут быть выбраны из группы, включающей прокальцитонин (ПКТ), С-реактивный белок (СРВ), лактат.

Настоящее изобретение дополнительно относится к набору для осуществления способа по настоящему изобретению, включающему реагенты для определения DPP3 и дополнительно для определения уровня ADM-NH2 в образце, взятом у пациента, и контрольные данные, такие как справочные и/или пороговый уровень, соответствующий уровню DPP3 в указанном образце от 20 до 120 нг/мл, более предпочтительно от 30 до 80 нг/мл, еще более предпочтительно от 40 до 60 нг/мл, наиболее предпочтительно 50 нг/мл, при этом указанные эталонные данные предпочтительно хранятся на электронном носителе и/или используются в виде исполняемого компьютером кода, сконфигурированного для сравнения определенного DPP3 и дополнительно для определения уровня ADM-NH2 с указанными эталонными данными.

Описанный в настоящем изобретении способ дополнительно включает сравнение определенного уровня DPP3 и дополнительно ADM-NH2 у пациентов с шоком или у пациентов, впадающих в шок, с эталонным и/или пороговым уровнем, в котором указанное сравнение проводят в процессоре компьютера с использованием исполняемого компьютером кода. Способы по настоящему изобретению могут быть частично реализованы на компьютере. Например, этап сравнения обнаруженного уровня маркера, например, DPP3 и/или ADM-NH2, с эталонным и/или пороговым уровнем может быть выполнен в компьютерной системе. Например, определенные значения могут быть введены в компьютерную систему (либо вручную медицинским работником, либо автоматически с устройства (устройств), в котором (которых) был/были определены соответствующие уровни маркеров). Компьютерная система может находиться непосредственно в месте оказания медицинской помощи (например, в отделении первичной медико-санитарной помощи или отделении неотложной помощи) или в удаленном месте, подключенном через компьютерную сеть (например, через Интернет или специализированные медицинские облачные системы, опционально комбинируемые с другими IT-системами или платформами, такими как информационные системы больниц (HIS - hospital information systems)). В качестве альтернативы или в дополнение для пользователя (обычно для медицинского работника, такого как врач) будут отображаться и/или распечатываться соответствующие рекомендации по терапии и/или стратификации терапии.

По настоящему изобретению указанный шок выбран из группы, включающей шок вследствие гиповолемии, кардиогенный шок, обструктивный шок и распределительный шок.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный шок выбран из группы, включающей шок вследствие гиповолемии, кардиогенный шок, обструктивный шок и распределительный шок, в частности кардиогенный или септический шок.

В конкретном варианте осуществления изобретения указанный шок выбран из группы, включающей:

- в случае кардиогенного шока указанный пациент перенес острый коронарный синдром (например, острый инфаркт миокарда) или сердечную недостаточность (например, острую декомпенсированную сердечную недостаточность), миокардит, аритмию, кардиомиопатию, порок сердца, расслоение аорты с острым аортальным стенозом, травматический разрыв хорды или массивную легочную эмболию, или

- в случае гиповолемического шока указанный пациент мог перенести геморрагическое заболевание, включая желудочно-кишечное кровотечение, травму, сосудистую этиологию (например, разрыв аневризмы брюшной аорты, опухоль, прорастающую в крупный кровеносный сосуд) и спонтанное кровотечение на фоне приема антикоагулянтов, или не геморрагическое заболевание, включая рвоту, диарею, почечную недостаточность, кожные потери/потери чувствительности (например, ожоги, тепловой удар), или потерю интестиция на фоне панкреатита, цирроза печени, кишечной непроходимости, травмы, или кожные потери/нечувствительные потери (например, ожоги, тепловой удар) или потерю третьего пространства на фоне панкреатита, цирроза печени, кишечной непроходимости, травмы или

- в случае обструктивного шока указанный пациент может страдать тампонадой сердца, напряженным пневмотораксом, тромбоэмболией легочной артерии или аортальным стенозом, или

- в случае дистрибутивного шока у больного может быть септический шок, нейрогенный шок, анафилактический шок или шок вследствие надпочечникового криза.

Шок характеризуется снижением доставки кислорода, и/или повышенным потреблением кислорода, или неадекватным использованием кислорода, что приводит к клеточной и тканевой гипоксии. Это опасное для жизни состояние недостаточности кровообращения, чаще всего проявляющееся гипотонией (систолическое артериальное давление менее 90 мм рт.ст. или среднее артериальное давление менее 65 мм рт.ст.). Шок подразделяется на четыре основных типа в зависимости от основной причины: гиповолемический, кардиогенный, обструктивный и распределительный шок (Vincent и De Backer, N. Engl. J. Med., 2014, 370(6): 583).

Гиповолемический шок характеризуется уменьшением внутрисосудистого объема и может быть разделен на два основных подтипа: геморрагический и не геморрагический шок. Общие причины геморрагического гиповолемического шока включают желудочно-кишечное кровотечение, травму, сосудистую этиологию (например, разрыв аневризмы брюшной аорты, опухоль, прорастающую в крупный кровеносный сосуд) и спонтанное кровотечение на фоне применения антикоагулянтов. Общие причины не геморрагического гиповолемического шока включают рвоту, диарею, почечную недостаточность, потерю кожных покровов/потерю интестиция (например, ожоги, тепловой удар) или потерю третьего пространства на фоне панкреатита, цирроза печени, кишечной непроходимости, травмы. См. обзор Коуа и Paul, 2018, Shock. StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2019-2018 Oct 27.

Кардиогенный шок (КШ) определяют как состояние критической гипоперфузии эндогенных органов из-за пониженного сердечного выброса. Примечательно, что КШ формирует спектр вариаций от легкой гипоперфузии до глубокого шока. Установленными критериями диагностики кардиогенного шока: (i) систолическое артериальное давление <90 мм рт.ст. в течение >30 мин или вазопрессоры, необходимые для достижения артериального давления >90 мм рт.ст.; (ii) застой в легких или повышенное давление наполнения левого желудочка; (iii) признаки нарушения перфузии органов по крайней мере с одним из следующих критериев: (а) измененный психический статус; (б) холодная, липкая кожа; в) олигурия (<0,5 мл/кг/ч или <30 мл/ч); (г) повышенный уровень лактата в сыворотке (Reynolds и Hochman, Circulation, 2008. 117: 686-697). Острый инфаркт миокарда (ОИМ) с последующей желудочковой дисфункцией является наиболее частой причиной кардиогенного шока, на которую приходится примерно 80% случаев. Менее частыми причинами кардиогенного шока после ОИМ являются механические осложнения, такие как разрыв межжелудочковой перегородки (4%) или свободной стенки (2%), а также острая тяжелая митральная недостаточность (7%). (Hochman с соавт., J Am Coll Cardiol, 2000, 36: 1063-1070). КС, не связанный с ОИМ, может быть вызван декомпенсацией клапанного порока сердца, острым миокардитом, аритмиями и т.д. с гетерогенными вариантами лечения. Количество заболеваний составляет от 40000 до 50000 пациентов в год в США и от 60000 до 70000 в Европе. Несмотря на успехи в лечении, в основном за счет ранней реваскуляризации с последующим снижением смертности, КС остается ведущей причиной смерти при ОИМ, при этом уровень смертности все еще приближается к 40-50%, согласно последним регистрам и рандомизированным исследованиям (Goldberg с соавт., Circulation, 2009, 119:1211-1219). Обструктивный шок возникает из-за физической непроходимости крупных сосудов или самого сердца. К этой форме шока могут привести несколько состояний (например, тампонада сердца, напряженный пневмоторакс, тромбоэмболия легочной артерии, аортальный стеноз). См. обзор Коуа и Paul, 2018, Shock. StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2019-2018 Oct 27.

В зависимости от причины выделяют четыре типа распределительного шока: нейрогенный шок (снижение симпатической стимуляции, ведущее к снижению сосудистого тонуса), анафилактический шок, септический шок и шок вследствие надпочечникового криза. Помимо сепсиса, распределительный шок может быть вызван синдромом системной воспалительной реакции (SIRS -systemic inflammatory response syndrome) из-за состояний, отличных от инфекции, таких как панкреатит, ожоги или травмы. К другим причинам относят синдром токсического шока, анафилаксию (внезапная тяжелая аллергическая реакция), недостаточность надпочечников (острое ухудшение хронической недостаточности надпочечников, разрушение или удаление надпочечников, подавление функции надпочечников из-за экзогенных стероидов, гипопитуитаризм и метаболический сбой выработки гормонов), реакции на лекарственные препараты или токсины, отравление тяжелыми металлами, печеночная недостаточность и поражение ЦНС. См. обзор Коуа и Paul, 2018, Shock. StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2019-2018 Oct 27.

Рефрактерный шок определяют как необходимость инфузии норадреналина >0,5 мкг/кг/мин, несмотря на адекватную реанимацию. Смертность у этих пациентов может достигать 94%, а оценка и лечение этих пациентов требуют гораздо более агрессивного подхода к выживанию. Термин «рефрактерный шок» используют, когда перфузия тканей не может быть восстановлена с помощью первоначальных корректирующих мер (например, вазопрессоров), и поэтому его можно назвать «высоким вазопрессор-зависимым» или «вазопрессорно-резистентным» шоком (Udupa и Shetty, Indian J Respir Care, 2018, 7:67-72). У пациентов с рефрактерным шоком могут быть признаки неадекватной перфузии, такие как гипотензия (среднее артериальное давление <65 мм рт.ст.), тахикардия, холодные периферические сосуды, удлинение времени наполнения капилляров и тахипноэ вследствие гипоксии и ацидоза. Лихорадка может наблюдаться при септическом шоке. Также могут наблюдаться другие признаки гипоперфузии, такие как изменение чувствительности, гиперлактатемия и олигурия. Эти хорошо известные признаки шока не помогают определить, связана ли проблема с насосом (сердце) или с системой (сосуды и ткани). Различные типы шока могут сосуществовать, и все формы шока могут стать рефрактерными, о чем свидетельствует нечувствительность к высоким дозам вазопрессоров (Udupa и Shetty, Indian J Res pi г Care, 2018, 7: 67-72).

Септический шок является потенциально смертельным заболеванием, которое возникает, когда сепсис, представляющий собой повреждение органов или повреждение в ответ на инфекцию, приводит к опасно низкому кровяному давлению и нарушениям клеточного метаболизма. Третье международное консенсусное определение сепсиса и септического шока (Сепсис-3) определяет септический шок как разновидность сепсиса, при которой особенно глубокие циркуляторные, клеточные и метаболические нарушения связаны с более высоким риском смерти, чем при одном сепсисе. Пациентов с септическим шоком можно клинически идентифицировать по потребности в вазопрессорах для поддержания среднего артериального давления на уровне 65 мм рт.ст. или выше и уровня лактата в сыворотке выше 2 ммоль/л (>18 мг/дл) при отсутствии гиповолемии. Эта комбинация связана с госпитальной смертностью более 40% (Singer с соавт., JAMA, 2016, 315(8): 801-810). Первичная инфекция чаще всего вызывается бактериями, но также может быть вызвана грибками, вирусами или паразитами. Он может локализоваться в любой части тела, но чаще всего в легких, головном мозге, мочевыводящих путях, коже или органах брюшной полости. Это может вызвать синдром полиорганной дисфункции (ранее известный как полиорганная недостаточность) и смерть. Часто людей с септическим шоком лечат в отделениях интенсивной терапии. Это чаще всего поражает детей, людей с ослабленным иммунитетом и пожилых людей, поскольку их иммунная система не может справляться с инфекцией так же эффективно, как у здоровых взрослых. Смертность от септического шока составляет примерно 25-50%.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный пациент представляет собой больного в критическом состоянии, имеющего шок или впадающего в состояние шока во время взятия пробы телесной жидкости указанного пациента.

Понятие «пациент, впадающий в состояние шока» определяют таким образом, что пациент в критическом состоянии, у которого не было шока на момент забора у него жидкости организма, имеет повышенный риск развития шока.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный шок представляет собой септический шок или кардиогенный шок.

Эффективность не нейтрализующих антител, направленных против N-конца ADM, анализировали при исследовании выживания при индуцированном сепсисе у мышей, вызванном методом лигирования и пункции слепой кишки (CLP). Предварительное лечение ненейтрализующими антителами приводит к снижению скорости инфузии катехоламинов, дисфункции почек и, в конечном итоге, к улучшению выживаемости (Struck с соавт., Intensive Care Med Exp, 2013, 1(1):22; Wagner с соавт., Intensive Care Med Exp, 2013, 1(1): 21).

Благодаря этим положительным результатам для дальнейшей клинической разработки была создана гуманизированная версия N-концевого анти-ADM антитела, названная адрецизумабом. Положительное влияние адрецизумаба на функцию сосудистого барьера и выживаемость недавно было продемонстрировано на доклинических моделях системного воспаления и сепсиса (Geven с соавт., Shock, 2018, 50(6):648-654). В этом исследовании предварительное лечение адрецизумабом ослабляло утечку из почечных сосудов у крыс с эндотоксемией, а также у мышей с сепсисом, вызванным CLP, что совпадало с повышенной почечной экспрессией защитного пептида Ang-1 и снижением экспрессии вредного пептидного фактора роста эндотелия сосудов. Кроме того, предварительное лечение адрецизумабом улучшало 7-дневную выживаемость при сепсисе, вызванном CLP, у мышей с 10 до 50% при однократном и с 0 до 40% при повторном введении дозы. Более того, в исследовании фазы I была продемонстрирована отличная безопасность и переносимость (см. пример 6): не наблюдалось серьезных нежелательных явлений, не было обнаружено признаков побочных явлений, более частых у субъектов, получавших адрецизумаб, и не было выявлено соответствующих изменений других параметров безопасности (Geven с соавт., Intensive Care Med Exp 2017, 5 (приложение 2):0427). Особый интерес представляет предполагаемый механизм действия адрецизумаба. Данные как на животных, так и на людях показывают мощное дозозависимое увеличение циркулирующего ADM после введения этого антитела. Основываясь на фармакокинетических данных и отсутствии увеличения MR-proADM (неактивный пептидный фрагмент, полученный из того же прогормона, что и ADM), повышенные уровни циркулирующего ADM нельзя объяснить его повышенной продукцией.

Механистическим объяснением этого увеличения может быть то, что избыток антител в кровеносном русле может привести к дренированию ADM из интерстиция в кровеносное русло, поскольку ADM достаточно мал, чтобы преодолеть эндотелиальный барьер, в то время как антитело не проникает (Geven с соавт., Shock, 2018, 50(2): 132-140). Кроме того, связывание антитела с ADM приводит к увеличению периода полужизни ADM. Несмотря на то, что NT-ADM антитела частично ингибируют ADM-опосредованную передачу сигналов, значительное увеличение циркулирующего ADM приводит к общему «чистому» увеличению активности ADM в кровяном русле, где он оказывает благотворное влияние на эндотелиальные клетки (преимущественно стабилизация барьера), в то время как вредное воздействие ADM на клетки гладкой мускулатуры сосудов (VSMC vascular smooth muscle cells; вазодилатация) в интерстиции снижается.

Во всем описании «антитела», или «фрагменты антител», или «каркасы, не относящиеся к Ig» в соответствии с настоящим изобретением способны связывать ADM и, таким образом, направлены против ADM, и, таким образом, могут упоминаться как «анти-ADM антитела», «фрагменты анти-ADM антител» или «каркасы анти-ADM, не являющиеся каркасами Ig».

Термин «антитело» обычно включает моноклональные и поликлональные антитела и их связывающие фрагменты, в частности Fc-фрагменты, а также так называемые «одноцепочечные антитела» (Bird с соавт., 1988), химерные, гуманизированные, в частности антитела с привитыми CDR, и диа- или тетратела (Holliger с соавт., 1993). Также включены иммуноглобулиноподобные белки, которые отбирают с помощью методов, включая, например, фаговый дисплей для специфического связывания с изучаемой молекулой, содержащейся в образце. В данном контексте термин «специфическое связывание» относится к антителам, вырабатываемым против представляющей интерес молекулы или ее фрагмента. Антитело считается специфичным, если его аффинность к представляющей интерес молекуле или ее вышеупомянутому фрагменту по меньшей мере предпочтительно в 50 раз выше, более предпочтительно в 100 раз выше, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз выше, чем в отношении других молекул, входящих в состав в образце, содержащем интересующую молекулу. В данной области хорошо известно, как получать антитела и выбирать антитела с заданной специфичностью.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело против адреномедулина (анти-ADM антитело), или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, является моноспецифическим.

Моноспецифическое антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент моноспецифического антитела против адреномедуллина, или каркас моноспецифического анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, означает, что указанное антитело, или фрагмент антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, связывается с одной специфической областью, охватывающей по меньшей мере 5 аминокислот внутри мишени ADM. Моноспецифическое антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент моноспецифического антитела против адреномедуллина, или каркас моноспецифического анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, представляют собой антитела против адреномедуллина (ADM) или фрагменты антитела против адреномедуллина или каркасы не-Ig анти-ADM, которые все обладают аффинностью к одному и тому же антигену. Моноклональные антитела являются моноспецифическими, но моноспецифические антитела также могут быть получены другими способами, кроме их получения из обычной зародышевой клетки.

Указанное анти-ADM антитело, или фрагмент антитела, связывающийся с ADM, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, связывающийся с ADM, может быть не нейтрализующим анти-ADM-антителом, или фрагментом антитела, связывающимся с ADM, или каркасом анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, связывающимся с ADM.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное анти-ADM антитело, или фрагмент антитела, связывающийся с ADM, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, связывающийся с ADM, представляет собой не нейтрализующее антитело, фрагмент или не-Ig-каркас.

Нейтрализующее анти-ADM-антитело, фрагмент анти-ADM-антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, будет блокировать биологическую активность ADM почти на 100%, по меньшей мере на более чем 90%, предпочтительно по меньшей мере на более чем 95%.

Напротив, не нейтрализующее анти-ADM-антитело, или фрагмент анти-ADM-антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, блокирует биологическую активность ADM менее чем на 100%, предпочтительно на менее чем 95%, предпочтительно на менее чем 90%, более предпочтительно на менее чем 80% и еще более предпочтительно на менее чем 50%. Это означает, что биоактивность ADM снижается до менее чем 100%, до 95% и менее, но не более, до 90% и менее, но не более, до 80% и менее, но не более, до 50% и менее, но не более. Это означает, что остаточная биологическая активность ADM, связанного с не нейтрализующим анти-ADM антителом, или фрагментом анти-ADM антитела, или каркасом анти-ADM, не являющимся каркасом Ig, может быть более 0%, предпочтительно более 5%, более предпочтительно более 20%, более предпочтительно более 50%.

В этом контексте (а) молекула (молекулы), представляющая собой антитело, или фрагмент антитела, или каркас, не относящийся к каркасу Ig, с «не нейтрализующей анти-ADM активностью», вместе именуемые здесь для простоты как «не нейтрализующие» анти-ADM, фрагмент антитела или каркас, не относящийся к Ig, которые, например, блокируют биологическую активность ADM менее чем на 80%, определяются как

- молекула или молекулы, связывающиеся с ADM, которые при добавлении к культуре эукариотической клеточной линии, которая экспрессирует функциональный человеческий рекомбинантный рецептор ADM, состоящий из CRLR (рецептор, подобный рецептору кальцитонина) и RAMP3 (белок 3, модифицирующий активность рецептора), снижает количество цАМФ, продуцируемого клеточной линией под действием параллельно добавленного синтетического пептида ADM человека, где указанный добавленный синтетический ADM человека добавляют в количестве, которое в отсутствие анализируемого не нейтрализующего антитела приводит к полумаксимальной стимуляции синтеза цАМФ, при этом восстановление цАМФ за счет связывания указанной молекулы (молекул) с ADM происходит не более чем на 80%, даже при добавлении не нейтрализующей молекулы (молекул), связывающейся с анализируемым ADM в количестве, которое в 10 раз превышает количество, необходимое для получения максимального снижения синтеза цАМФ, достигаемого с анализируемым не нейтрализующим антителом.

То же определение применимо и к другим диапазонам; 95%, 90%, 50% и т.д.

Антитело или его фрагмент по настоящему изобретению представляет собой белок, включающий один или несколько полипептидов, в значительной степени кодируемых генами иммуноглобулина, которые специфически связываются с антигеном. Известные гены иммуноглобулинов включают гены константной области каппа, лямбда, альфа (IgA), гамма (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), дельта (IgD), эпсилон (IgE) и мю (IgM), а также бесчисленное множество генов вариабельной области иммуноглобулинов. Полноразмерные легкие цепи иммуноглобулина обычно имеют длину около 25 кД или 214 аминокислот.

Полноразмерные тяжелые цепи иммуноглобулинов обычно имеют длину около 50 кДа или 446 аминокислот. Легкие цепи кодируются геном вариабельной области на NH2-конце (длиной около 110 аминокислот) и геном константной области каппа или лямбда на СООН-конце. Аналогичным образом тяжелые цепи кодируются геном вариабельной области (длиной около 116 аминокислот) и одним из других генов константной области.

Основной структурной единицей антитела обычно является тетрамер, состоящий из двух идентичных пар цепей иммуноглобулина, каждая пара имеет одну легкую и одну тяжелую цепь. В каждой паре вариабельные области легкой и тяжелой цепей связываются с антигеном, а константные области опосредуют эффекторные функции. Иммуноглобулины также существуют во множестве других форм, включая, например, Fv, Fab и (Fab')2, а также бифункциональные гибридные антитела и одноцепочечные антитела (например, Lanzavecchia с соавт., Eur. J. Immunol, 1987, 17:105; Huston с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85:5879-5883; Bird с соавт., Science, 1988, 242: 423-426; Hood с соавт., «Immunology», Бенджамин, Нью-Йорк, 1984, 2e изд.; Hunkapiller и Hood, Nature, 1986, 323:15-16). Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина включает каркасную область, прерываемую тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность (CDR) (см. кн. Е. Kabat с соавт.: «Sequences of Proteins ofImmunological Interest», 1983, U.S. Department of Health and Human Services). Как отмечалось выше, CDR в первую очередь ответственны за связывание с эпитопом антигена. Иммунный комплекс представляет собой антитело, такое как моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека, или функциональный фрагмент антитела, специфически связанный с антигеном.

Химерные антитела представляют собой антитела, гены легкой и тяжелой цепей которых были сконструированы, как правило, с помощью генной инженерии, из генов вариабельной и константной областей иммуноглобулинов, принадлежащих разным видам. Например, вариабельные сегменты генов мышиного моноклонального антитела могут быть присоединены к человеческим константным сегментам, таким как каппа и гамма 1 или гамма 3. Таким образом, в одном примере терапевтическое химерное антитело представляет собой гибридный белок, состоящий из вариабельного или антигенсвязывающего домена мышиного антитела и константного или эффекторного домена человеческого антитела, хотя могут быть использованы и другие виды млекопитающих, или вариабельная область может быть получена молекулярными методами. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области, например, см. US 5807715. «Гуманизированный» иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, включающий каркасную область человека и одну или более CDR из нечеловеческого (такого как мышиный, крысиный или синтетический) иммуноглобулина. Иммуноглобулин нечеловеческого происхождения, обеспечивающий CDR, называется «донором», а иммуноглобулин человека, обеспечивающий каркас, называется «акцептором». В одном варианте осуществления все CDR происходят от донорного иммуноглобулина в гуманизированном иммуноглобулине. Константные области не обязательно должны присутствовать, но если они есть, они должны быть по существу идентичны константным областям иммуноглобулина человека, т.е. по меньшей мере примерно на 85-90%, например примерно на 95% или более идентичны. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением, возможно, CDR, по существу идентичны соответствующим частям последовательностей природного иммуноглобулина человека. «Гуманизированное антитело» представляет собой антитело, содержащее гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина. Гуманизированное антитело связывается с тем же антигеном, что и донорское антитело, которое обеспечивает CDR. Акцепторный каркас гуманизированного иммуноглобулина или антитела может иметь ограниченное количество замен аминокислотами, взятыми из донорного каркаса. Гуманизированные или другие моноклональные антитела могут иметь дополнительные консервативные аминокислотные замены, которые практически не влияют на связывание антигена или другие функции иммуноглобулина. Примерами консервативных замен являются такие, как gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; and phe, tyr. Гуманизированные иммуноглобулины могут быть сконструированы с помощью генной инженерии (например, см. US 5585089). Антитело человека представляет собой антитело, в котором гены легкой и тяжелой цепи происходят от человека. Антитела человека могут быть получены с использованием способов, известных в данной области. Антитела человека могут быть получены путем иммортализации В-клетки человека, секретирующей интересующее антитело. Иммортализация может быть осуществлена, например, путем инфицирования EBV или путем слияния В-клетки человека с клеткой миеломы или гибридомы с получением клетки триомы. Антитела человека также могут быть получены методами фагового дисплея (см., например, WO 91/17271; WO 92/001047; WO 92/20791) или выбраны из библиотеки комбинаторных моноклональных антител человека (см. вебсайт Morphosys). Антитела человека также могут быть получены с использованием трансгенных животных, несущих ген иммуноглобулина человека (см., например, WO 93/12227; WO 91/10741).

Таким образом, анти-ADM антитело может иметь форматы, известные в данной области. Примерами являются антитела человека, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, антитела с привитыми CDR. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению представляют собой рекомбинантно полученные антитела, такие как, например, IgG, типичный полноразмерный иммуноглобулин или фрагменты антител, содержащие по меньшей мере F-вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, например, химически связанные антитела (фрагмент связывания антигена), включая, но не ограничиваясь ими, Fab-фрагменты, включая мини-тела Fab, одноцепочечные Fab-антитела, моновалентные Fab-антитела с эпитопными метками, например, Fab-V5Sx2; двухвалентное Fab (мини-антитело), димеризованное с доменом СН3; двухвалентный Fab или поливалентный Fab, например, образованный путем мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, путем димеризации доменов dHLX, например, Fab-dHLX-FSx2; F(ab')2-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные поливалентные и/или мультиспецифические scFv-фрагменты, бивалентные и/или биспецифические диатела, BITE® (биспецифическое привлекающее средство для Т-клеток), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из класса, отличного от G; однодоменные антитела, например, нанотела, полученные из иммуноглобулинов верблюдовых или рыб, и многие другие.

В дополнение к анти-ADM антителам хорошо известны другие биополимерные каркасы, образующие комплексы с молекулой-мишенью, которые использовались для получения биополимеров с высокой специфичностью к мишеням. Примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины. Для иллюстрации форматов антител, пожалуйста, см. фиг. 1а, 1б и 1в.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения формат анти-ADM антитела выбран из группы, включающей фрагмент Fv, фрагмент scFv, фрагмент Fab, фрагмент scFab, фрагмент F(ab)2 и слитый белок scFv-Fc. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения формат антитела выбирают из группы, включающей фрагмент scFab, фрагмент Fab, фрагмент scFv и их конъюгаты с оптимизированной биодоступностью, такие как пегилированные фрагменты. Одним из наиболее предпочтительных форматов является формат scFab.

Каркасы, не являющиеся каркасами Ig, могут быть белковыми каркасами и могут использоваться в качестве имитаторов антител, поскольку они способны связываться с лигандами или антигенами. Каркасы, не являющиеся каркасами Ig, могут быть выбраны из группы, включающей каркасы, не являющиеся каркасами Ig, на основе тетранектина (например, описанные в US 2010/0028995), каркасы фибронектина (например, описанные в ЕР 1266025; каркасы на основе липокалина (например, описанные в WO 2011/154420); каркасы на основе убиквитина (например, описанные в WO 2011/073214), каркасы на основе трансферина (например, описанные в US 2004/0023334), каркасы на основе белка А (например, описанные в ЕР 2231860), каркасы на основе анкириновых повторов (например, описанные в WO 2010/060748), микропротеины, предпочтительно микропротеины, образующие каркасы цистеиновых узлов (например, описанные в ЕР 2314308), каркасы на основе домена Fyn SH3 (например, описанные в WO 2011/023685) каркасы на основе EGFR-А-домена (например, описанные в WO 2005/040229) и каркасы на основе домена Кунитца (например, описанные в ЕР 194867).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ADM антитела по настоящему изобретению могут быть получены, как описано в примере 1, путем синтеза фрагментов ADM в качестве антигенов. После этого связующее вещество для указанных фрагментов идентифицируют с использованием описанных ниже способов или других способов, известных в данной области.

Гуманизация антител мыши может быть проведена в соответствии со следующей процедурой: для гуманизации антитела мышиного происхождения последовательность антитела анализируют на структурное взаимодействие каркасных областей (FR) с областями, определяющими комплементарность (CDR), и антигеном. На основании структурного моделирования выбирают подходящую FR человеческого происхождения, и последовательности CDR мыши трансплантируют в FR человека. Вариации в аминокислотной последовательности CDR или FR могут быть введены для восстановления структурных взаимодействий, которые были устранены при переключении видов на последовательности FR. Это восстановление структурных взаимодействий может быть достигнуто с помощью случайного подхода с использованием библиотек фагового дисплея или с помощью направленного подхода, управляемого молекулярным моделированием (Almagro и Fransson, Front Biosci, 2008(13): 1619-1633)).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения формат анти-ADM антитела выбран из группы, включающей фрагмент Fv, фрагмент scFv, фрагмент Fab, фрагмент scFab, фрагмент F(ab)2 и слитый белок scFv-Fc.B другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения формат антитела выбирают из группы, включающей фрагмент scFab, фрагмент Fab, фрагмент scFv и их конъюгаты с оптимизированной биодоступностью, такие как пегилированные фрагменты. Одним из наиболее предпочтительных форматов является формат scFab.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения анти-ADM антитело, фрагмент анти-ADM антитела или каркас молекулы анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, является антителом полной длины, фрагментом антитела или каркасом молекулы, не являющимся каркасом Ig-

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас молекулы анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, направлены к эпитопу и могут быть связаны с эпитопом, состоящим по меньшей мере из 5 аминокислот в длину, содержащимся в ADM.

В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас молекулы анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, направлены к эпитопу и могут быть связаны с эпитопом, состоящим по меньшей мере из 4 аминокислот в длину, содержащимся в ADM.

В одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с адреномедуллином или каркасом, не являющимся каркасом Ig анти-ADM антитела, связывание с адреномедуллином предназначено для применения в терапии или профилактике шока у пациента, в котором указанное антитело или его фрагмент или каркас не являются ADM-связывающим белком-1 (фактор комплемента Н).

В одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения анти-адреномедулиновое (ADM) антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с адреномедуллином, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, связывающегося с адреномедуллином, предусмотрены для применения в терапии или профилактике шока у пациента, в котором указанное антитело, или фрагмент, или каркас связываются с участком предпочтительно по меньшей мере из 4 или по меньшей мере из 5 аминокислот в последовательности аминокислот 1-21 зрелого ADM человека: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC SEQ ID NO: 14.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас молекулы анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, связывается с областью или эпитопом ADM, расположенным в N-концевой части (аминокислоты 1-21) адреномедуллина.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас молекулы анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, связывается с областью или эпитопом в аминокислотах 1-14 адреномедулина: YRQSMNNFQGLRSF (SEQ ID NO: 25), то есть с N-концевой частью (аминокислоты 1-14) адреномедуллина.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас молекулы анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, распознает или связывается с областью или эпитопом в аминокислотах 1-10 адреномедулина: YRQSMNNFQG (SEQ ID NO: 26), то есть с N-концевой частью (аминокислоты 1-10) адреномедуллина.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас молекулы анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, распознает или связывается с областью или эпитопом в аминокислотах 1-6 адреномедулина: YRQSMN (SEQ ID NO: 27), то есть с N-концевой частью (аминокислоты 1-6) адреномедуллина. Как указано выше, указанная область или эпитоп предпочтительно содержит по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 аминокислот в длину.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас молекулы анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, распознает или связывается с N-концом (1 аминокислота) адреномедуллина. N-конец означает, что аминокислота 1, то есть «Y» в SEQ ID NO 20, 14 или 23, соответственно, является обязательной для связывания. Антитело, или его фрагмент, или каркас не будут связывать ни удлиненный N-конец, ни модифицированный N-концевой адреномедуллин, ни расщепленный на N-конце адреномедуллин. Это означает, что в другом предпочтительном варианте осуществления указанное антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас анти-ADM связывается только с областью в пределах последовательности зрелого ADM, если N-концевой конец ADM свободен. В указанном варианте осуществления настоящего изобретения анти-ADM антитело анти-ADM, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас, отличный от каркаса Ig, не будут связываться с областью в пределах последовательности зрелого ADM, если указанная последовательность, например, содержится в про-ADM. Для ясности, числа в скобках для конкретных областей ADM, такие как «N-концевая часть (аминокислоты 1-21)», понятны специалистам в данной области техники и означают, что N-концевая часть ADM состоит из аминокислот 1-21 последовательности зрелого ADM.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения в соответствии с настоящим изобретением предусмотренное в нем анти-ADM-антитело, или фрагмент анти-ADM-антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, не связывается с С-концевой частью ADM, то есть аминокислотами 43-52 в ADM: PRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO: 24).

Эпитоп, также известный как антигенная детерминанта, представляет собой часть антигена, распознаваемую иммунной системой, особенно антителами. Например, эпитоп представляет собой специфическую часть антигена, с которой связывается антитело. Часть антитела, которая связывается с эпитопом, называется паратопом. Эпитопы белковых антигенов делятся на две категории: конформационные эпитопы и линейные эпитопы, в зависимости от их структуры и взаимодействия с паратопом.

Конформационные и линейные эпитопы взаимодействуют с паратопом на основе трехмерной конформации, принятой эпитопом, которая определяется поверхностными особенностями задействованных остатков эпитопа и формой или третичной структурой других сегментов антигена. Конформационный эпитоп образован трехмерной конформацией, принятой взаимодействием несмежных аминокислотных остатков. Линейный или последовательный эпитоп представляет собой эпитоп, который распознается антителами по линейной последовательности аминокислот или первичной структуре и образован трехмерной конформацией, принятой за счет взаимодействия смежных аминокислотных остатков.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предпочтительно использовать анти-ADM-антитело, или фрагмент анти-ADM-антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, согласно настоящему изобретению, где указанное анти-ADM антитело, или указанный анти-ADM фрагмент антитела, или или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, приводит к повышению уровня ADM или иммунореактивности ADM в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно>50%, наиболее предпочтительно >100%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предпочтительно использовать анти-ADM-антитело, или фрагмент анти-ADM-антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, согласно настоящему изобретению, где указанное анти-ADM-антитело, или фрагмент анти-ADM-антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, представляет собой стабилизирующее ADM антитело, или фрагмент стабилизирующего ADM антитела, или стабилизирующий каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, увеличивающий период полувыведения (t1/2; половина времени удержания) адреномедуллина в сыворотке, крови, в плазме не менее 10%, предпочтительно не менее 50%, более предпочтительно >50%, наиболее предпочтительно >100%.

Период полувыведения (половина времени удержания) ADM можно определить в сыворотке, крови или плазме человека в отсутствие и в присутствии антитела, стабилизирующего ADM, или фрагмента антитела, стабилизирующего ADM, или каркаса, стабилизирующего ADM, не относящегося к Ig, соответственно, с использованием иммунологического анализа, для количественного определения ADM.

Могут быть проведены следующие стадии:

- ADM можно разводить в цитратной плазме человека в отсутствие и в присутствии стабилизирующего ADM антитела, или стабилизирующего адреномедуллин фрагмента антитела, или стабилизирующего адреномедуллин каркаса анти-ADM, не являющегося каркасом Ig, соответственно, и можно инкубировать при 24°С.

- Аликвоты берутся в определенные моменты времени (например, в течение 24 ч), и разложение ADM в указанных аликвотах может быть остановлено путем замораживания при -20°С.

- Количество ADM может быть определено непосредственно с помощью иммуноанализа hADM, если на выбранный анализ не влияет стабилизирующее антитело. В качестве альтернативы аликвоту можно обработать денатурирующими агентами (например, HCl) и после очистки образца (например, путем центрифугирования) можно нейтрализовать рН и количественно определить ADM с помощью иммуноанализа ADM. В качестве альтернативы для количественного определения ADM можно использовать неиммуноаналитические технологии (например, ОФ-ВЭЖХ).

- Время полужизни ADM рассчитывают для ADM, инкубированного в отсутствие и в присутствии стабилизирующего ADM антитела или фрагмента антитела, стабилизирующего адреномедуллин, или каркаса, не относящегося к Ig, стабилизирующего адреномедуллин, соответственно.

- Увеличение периода полувыведения рассчитывают для стабилизированного ADM по сравнению с ADM, который инкубируют в отсутствие стабилизирующего ADM антитела или фрагмента антитела, стабилизирующего адреномедуллин, или каркаса, не относящегося к Ig, стабилизирующего адреномедуллин.

Двукратное увеличение периода полувыведения ADM представляет собой увеличение периода полувыведения до 100%.

Период полураспада (период полувыведения) определяют как период, в течение которого концентрация определенного химического вещества или лекарственного средства падает до половины исходной концентрации в указанной жидкости или крови.

Анализ, который можно использовать для определения периода полувыведения (времени полуудержания) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме, описан в примере 3.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения анти-ADM-антитело, или фрагмент анти-ADM-антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, представляет собой ненейтрализующее антитело, фрагмент или каркас. Нейтрализующее анти-ADM-антитело, фрагмент анти-ADM-антитела или анти-ADM-каркас, не относящийся к Ig, будет блокировать биологическую активность ADM почти до 100%, по меньшей мере до более чем 90%, предпочтительно по меньшей мере до более чем 95%. Другими словами, это означает, что указанное не нейтрализующее анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, блокируют биологическую активность ADM до уровня менее 100%, предпочтительно менее 95%, предпочтительно менее 90%. В варианте осуществления настоящего изобретения указанное не нейтрализующее анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, блокирует биологическую активность ADM до менее чем 95% анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, который блокирует биологическую активность ADM более чем на 95%, выходит за рамки указанного варианта осуществления настоящего изобретения. Это означает, что в одном варианте осуществления биоактивность снижается до 95% или менее, но не более, предпочтительно до 90% или менее, более предпочтительно до 80% или менее, более предпочтительно до 50% или менее, но не более.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения не нейтрализующее антитело представляет собой антитело, связывающееся с участком не менее чем из 5 аминокислот в последовательности аминокислот 1-21 зрелого ADM человека (SEQ ID NO: 14), или антитело, связывающееся с участком не менее чем из 5 аминокислот в последовательности аминокислот 1-19 зрелого мышиного ADM (SEQ ID NO: 17).

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения не нейтрализующее антитело представляет собой антитело, связывающееся с участком не менее чем из 4 аминокислот в последовательности аминокислот 1-21 зрелого ADM человека (SEQ ID NO: 14), или антитело, связывающееся с участком не менее чем из 5 аминокислот в последовательности аминокислот 1-19 зрелого мышиного ADM (SEQ ID NO: 17).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в соответствии с настоящим изобретением используют не нейтрализующее анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, где указанное антитело против ADM или фрагмент антитела против ADM блокирует биоактивность ADM до менее 80%, предпочтительно менее 50% (от исходных значений). Следует понимать, что указанное ограниченное блокирование биологической активности (что означает снижение биологической активности) ADM происходит даже при избыточной концентрации антитела, фрагмента или каркаса, что означает избыток антитела, фрагмента или каркаса по отношению к ADM. Упомянутая ограниченная блокировка является неотъемлемым свойством самого связующего ADM в указанном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения. Это означает, что максимальное ингибирование указанного антитела, его фрагмента или каркаса составляет 80% или 50%, соответственно. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное анти-ADM-антитело, фрагмент анти-ADM-антитела или анти-ADM-каркас, не относящийся к Ig, будут блокировать биологическую активность/снижать биологическую активность анти-ADM по меньшей мере до 5%. Вышеизложенное означает, что остается приблизительно 20%, или 50%, или даже 95% остаточной биоактивности ADM, соответственно.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предлагаемые антитела против ADM, фрагменты антител против ADM и каркасы анти-ADM, не являющиеся каркасаи Ig, не нейтрализуют соответствующую биологическую активность ADM.

Биоактивность определяется как действие, которое вещество оказывает на живой организм, ткань, орган или функциональную единицу in vivo или in vitro (например, в анализе) после взаимодействия с ним. В случае биологической активности ADM это может быть эффектом ADM в функциональном анализе цАМФ рекомбинантного рецептора ADM человека. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением биоактивность определяется с помощью функционального анализа цАМФ рецептора ADM. Следующие шаги могут быть выполнены для определения биологической активности ADM в таком анализе:

- Кривые доза-ответ получают с ADM в указанном функциональном анализе цАМФ рекомбинантного ADM-рецептора человека.

- Можно рассчитать концентрацию ADM полумаксимальной стимуляции цАМФ.

- При постоянных полумаксимальных концентрациях ADM, стимулирующих цАМФ, кривые доза-ответ (до конечной концентрации до 100 мкг/мл) получают с помощью стабилизирующего ADM антитела или фрагмента стабилизирующего ADM антитела или стабилизирующего ADM каркаса не-Ig, соответственно.

Максимальное ингибирование в указанном биоанализе ADM на 50% означает, что указанное анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, соответственно, блокирует биоактивность ADM до 50% от исходных значений. Максимальное ингибирование в указанном биоанализе ADM, равное 80%, означает, что указанное анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, соответственно, блокирует биологическую активность ADM до 80%. В смысле блокирования биоактивности ADM, это не более чем на 80%. Это означает, что остается примерно 20% остаточной биоактивности ADM.

Однако согласно настоящему описанию и в вышеприведенном контексте выражение «блокирует биологическую активность ADM» в отношении описанных в настоящем изобретении анти-ADM антител, или фрагментов анти-ADM антител, или каркасов анти-ADM, не являющихся каркасами Ig, следует понимать просто как уменьшение биологической активности ADM со 100% до 20%, максимально оставшейся биологической активности ADM, предпочтительно снижение биологической активности ADM со 100% до 50%, оставшейся биологической активности ADM; но в любом случае остается биоактивность ADM, которую можно определить, как подробно описано выше.

Биологическую активность ADM можно определить в функциональном анализе человеческого рекомбинантного адреномедуллинового рецептора цАМФ (адреномедуллиновый биоанализ) в соответствии с примером 2.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения модулирующее анти-ADM антитело, или модулирующий фрагмент анти-ADM антитела, или модулирующий каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, применяют для терапии или профилактики шока у пациента.

«Модулирующее» анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, представляет собой анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, который увеличивает время полужизни (время полуудерживания t1/2) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме не менее 10%, предпочтительно не менее 50%, более предпочтительно >50%, наиболее предпочтительно >100% и блокирует биоактивность ADM до менее 80%, предпочтительно менее 50% и указанное анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, будут блокировать биологическую активность ADM по меньшей мере до 5%. Эти значения, относящиеся к периоду полураспада и блокированию биологической активности, должны быть поняты в связи с ранее упомянутыми анализами, чтобы определить эти значения. Это касается блокирования биоактивности ADM не более чем на 80% или не более чем на 50% соответственно. Такое модулирующее анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, дает преимущество, состоящее в том, что облегчается дозирование введения. Комбинация частичного блокирования или частичного снижения биологической активности ADM и увеличения периода полувыведения in vivo (повышение биологической активности ADM) приводит к выгодной простоте дозирования анти-ADM антитела, или фрагмента анти-ADM антитела, или каркаса анти-ADM, не являющегося каркасом Ig. В ситуации избытка эндогенного ADM (максимальная стимуляция, поздняя фаза сепсиса, шок, гиподинамическая фаза) эффект снижения активности является основным действием антитела или фрагмента или каркаса, ограничивающим (отрицательный) эффект ADM. В случае низких или нормальных эндогенных концентраций ADM биологический эффект анти-ADM антитела, или фрагмента анти-ADM антитела, или каркаса анти-ADM, не являющегося каркасом Ig, представляет собой комбинацию снижения (посредством частичного блокирования) и увеличения за счет увеличения полужизни ADM. Таким образом, не нейтрализующее и модулирующее анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM-антитела, или каркас анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, действует как буфер биологической активности ADM, чтобы поддерживать биологическую активность ADM в определенном физиологическом диапазоне.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело является моноклональным антителом или его фрагментом. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к анти-ADM антителу или фрагменту анти-ADM антитела, которое является антителом человека или гуманизированным антителом или его производным. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения одна или несколько CDR (от мыши) прививают в антитело человека или фрагмент антитела человека.

Предметом настоящего изобретения в одном из вариантов его осуществления является антитело человека или гуманизированное антитело с прививкой CDR или их фрагменты, которые связываются с ADM, в котором антитело человека или гуманизированное антитело с прививкой CDR или их фрагменты содержат тяжелую цепь (Н-цепь) антитела, содержащую:

GYTFSRYW (SEQ ID NO:l), ILPGSGST (SEQ ID NO: 2), и/или TEGYEYDGFDY (SEQ ID NO: 3), и/или дополнительно содержит легкую цепь антитела (L-цепь), содержащую: QSIVYSNGNTY (SEQ ID NO: 4),

RVS (не является частью перечня последовательностей), и/или FQGSHIPYT (SEQ ID NO: 5).

В одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения объектом настоящего изобретения является моноклональное антитело человека или гуманизированное моноклональное антитело, которое связывается с ADM, или фрагмент этого антитела, который связывается с ADM, в котором тяжелая цепь содержит по меньшей мере одну CDR, выбранную из группы, включающей:

GYTFSRYW (SEQ ID NO: 1),

ILPGSGST (SEQ ID NO: 2),

TEGYEYDGFDY (SEQ ID NO: 3)

и где легкая цепь содержит по меньшей мере одну CDR, выбранную из группы, включающей:

QSIVYSNGNTY (SEQ ID NO: 4),

RVS (не является частью перечня последовательностей),

FQGSHIPYT (SEQ ID NO: 5).

В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения объектом настоящего изобретения является моноклональное антитело человека, которое связывается с ADM, или фрагмент такого антитела, который связывается с ADM, где тяжелая цепь содержит последовательности:

GYTFSRYW (SEQ ID NO: 1),

ILPGSGST (SEQ ID NO: 2),

TEGYEYDGFDY (SEQ ID NO: 3)

и где легкая цепь содержит последовательности:

QSIVYSNGNTY (SEQ ID NO: 4),

RVS (не является частью перечня последовательностей),

FQGSHIPYT (SEQ ID NO: 5).

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения анти-ADM антитело содержит последовательность, выбранную из группы, включающей: SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 32 и 33.

Анти-ADM антитело, или фрагмент анти-ADM антитела, или каркас молекулы анти-ADM, не являющийся каркасом Ig, по настоящему изобретению проявляют аффинность к ADM человека таким образом, что константа аффинности превышает 10^-7 М, предпочтительно аффинность превышает 10^-8 М, предпочтительно аффинность превышает 10^-9 М, наиболее предпочтительно аффинность превышает 10^-10 М. Специалисту в данной области известно, что можно компенсировать пониженную аффинность путем применения повышенной дозы соединений, и эта мера будет находиться в области охвата настоящего изобретения. Константы аффинности можно определить в соответствии со способом, описанным в примере 1.

Объектом настоящего изобретения является моноклональное антитело человека, или гуманизированное моноклональное антитело, или его фрагмент, который связывается с ADM, или его фрагмент моноклонального антитела для применения в терапии или в профилактике шока у пациента в соответствии с настоящим изобретением, в котором указанное антитело или его фрагмент содержат последовательность, выбранную из группы, включающей:

SEQ ID NO: 6 (AM-VH-C)

SEQ ID NO: 7 (AM-VH1)

SEQ ID NO: 9 (AM-VH3-T26-E55)

SEQ ID NO: 10 (AM-VH4-T26-E40-E55)

SEQ ID NO: 11 (AM-VL-C)

SEQ ID NO: 12 (AM-VL1)

SEQ ID NO: 13 (AM-VL2-E40)

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к моноклональному антителу человека, или гуманизированному моноклональному антителу, или его фрагменту, который связывается с ADM, для применения в терапии или для предупреждения шока у пациента, в котором указанное антитело или фрагмент содержат следующую последовательность в качестве тяжелой цепи:

SEQ ID NO: 32

а также содержит следующую последовательность в качестве легкой цепи:

SEQ ID NO: 33

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит следующую последовательность в качестве тяжелой цепи:

SEQ ID NO: 32

или последовательность, которая идентична ей более чем на 95%, предпочтительно более чем на 98%, предпочтительно более чем на 99%, и содержит следующую последовательность в качестве легкой цепи:

SEQ ID NO: 33

или последовательность, которая идентична ей более чем на 95%, предпочтительно более чем на 98%, предпочтительно более чем на 99%, где тяжелая цепь содержит следующие последовательности:

CDR1: SEQ ID NO: 1

GYTFSRYW

CDR2: SEQ ID NO: 2

ILPGSGST

CDR3: SEQ ID NO: 3

TEGYEYDGFDY

и где легкая цепь содержит следующие последовательности:

CDR1: SEQ ID NO: 4

QSIVYSNGNTY

CDR2:

RVS

CDR3: SEQ ID NO: 5

FQGSHIPYT.

Это означает, что в одном варианте осуществления настоящего изобретения CDR не содержат каких-либо вариаций последовательности. Любая вариация вышеуказанной последовательности находится за пределами CDR в указанном варианте осуществления настоящего изобретения.

Для оценки идентичности двух аминокислотных последовательностей проводят попарное выравнивание. Идентичность определяют по проценту аминокислот с прямым совпадением при выравнивании.

В вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ADM-антитело, или фрагмент анти-ADM-антитела для применения в лечении или профилактике шока у пациента можно вводить в дозе, составляющей по меньшей мере 0,5 мг/кг массы тела, в частности, по меньшей мере 1,0 мг/кг массы тела, точнее от 1,0 до 20,0 мг/кг массы тела, например, от 2,0 до 10 мг/кг массы тела, от 2,0 до 8,0 мг/кг массы тела или от 2,0 до 5,0 мг/кг масса тела.

Термин «фармацевтический состав» означает фармацевтический ингредиент в комбинации по крайней мере с одним фармацевтически приемлемым эксципиентом, который находится в такой форме, которая обеспечивает эффективную биологическую активность содержащегося в нем фармацевтического ингредиента, и который не содержит дополнительных компонентов, которые неприемлемо токсичны для субъекта, которому будут вводить состав.

Термин «фармацевтический ингредиент» означает терапевтическую композицию, которую можно необязательно комбинировать с фармацевтически приемлемыми эксципиентами для получения фармацевтического состава или лекарственной формы.

Объектом настоящего изобретения является фармацевтический состав для применения в терапии или профилактике шока у пациента, содержащий антитело, или его фрагмент, или каркас молекулы в соответствии с настоящим изобретением.

Объектом настоящего изобретения является фармацевтический состав для применения в терапии или профилактике шока у пациента, содержащий антитело, или его фрагмент, или каркас молекулы в соответствии с настоящим изобретением, где указанный шок выбран из группы, включающей шок вследствие гиповолемии, кардиогенный шок, обструктивный шок и распределительный шок, в частности кардиогенный шок или септический шок.

Объектом настоящего изобретения является фармацевтический состав для применения в терапии или профилактике шока у пациента в соответствии с настоящим изобретением, где указанный фармацевтический состав представляет собой раствор, предпочтительно раствор, готовый к применению.

Объектом настоящего изобретения является фармацевтический состав для применения в терапии или профилактике шока у пациента в соответствии с настоящим изобретением, где указанный фармацевтический состав представляет собой лиофилизированный раствор.

Объектом настоящего изобретения является фармацевтический состав для применения в терапии или профилактике шока у пациента в соответствии с настоящим изобретением, где указанный фармацевтический состав вводят внутримышечно.

Объектом настоящего изобретения является фармацевтический состав для применения в терапии или профилактике шока у пациента в соответствии с настоящим изобретением, где указанный фармацевтический состав вводят внутрисосудисто.

Объектом настоящего изобретения является фармацевтический состав для применения в терапии или профилактике шока у пациента в соответствии с настоящим изобретением, где указанный фармацевтический состав вводят инфузией.

Объектом настоящего изобретения является фармацевтический состав для применения в терапии или профилактике шока у пациента в соответствии с настоящим изобретением, где указанный фармацевтический состав предназначен для системного введения.

В контексте сказанного выше следующие последовательно пронумерованные варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают дополнительные конкретные объекты настоящего изобретения:

Описание фигур

Фигура 1а. Форматы антитела Fv- и scFv-варианты

Фигура 1б. Форматы антитела гетерологичные слияния и бифункциональные антитела.

Фигура 1в. Форматы антитела - бивалентные антитела и биспецифические антитела

Фигура 2.

2а: Кривая доза-ответ ADM человека. Максимальную стимуляцию цАМФ доводят до активации 100%.

2б: Кривая доза/подавление человеческого ADM 22-52 (антагонист ADM-рецептора) в присутствии 5,63 нМ hADM.

2в: Кривая доза/подавление СТ-Н в присутствии 5,63 нМ hADM.

2г: Кривая доза/подавление MR-H в присутствии 5,63 нМ hADM.

2д: Кривая доза/подавление NT-H в присутствии 5,63 нМ hADM.

2е: Кривая доза-ответ ADM мыши. Максимальную стимуляцию цАМФ доводят до активации 100%.

2ж: Кривая доза-ответ ADM человека 22-52 (антагонист ADM-рецептора) в присутствии 0,67 нМ mADM.

2з: Кривая доза-ответ СТ-М в присутствии 0,67 нМ mADM.

2и: Кривая доза-ответ MR-M в присутствии 0,67 нМ mADM.

2к: Кривая доза-ответ NT-M в присутствии 0,67 нМ mADM.

2 л: Ингибирование ADM под действием F(ab)2 NT-M и Fab NT-M.

Фигура 3. Типичная кривая доза/сигнал hADM; кривая доза/сигнал hADM в присутствии 100 мкг/мл антитела NT-H.

Фигура 4. Стабильность hADM в плазме человека (цитрат) в отсутствие и в присутствии NT-H антитела.

Фигура 5. Выравнивание Fab с гомологичными каркасными последовательностями человека.

Фигура 6. Концентрация ADM у здоровых людей после применения NT-H в различных дозах на протяжении до 60 дней.

Фигура 7. Графики выживаемости Каплана-Мейера в зависимости от низких (<40,5 нг/мл) и высоких (>40,5 нг/мл) концентраций DPP3. (А) 7-дневная выживаемость пациентов с сепсисом в зависимости от концентрации DPP3 в плазме; (Б) 7-дневная выживаемость пациентов с кардиогенным шоком в зависимости от концентрации DPP3 в плазме; (В) 7-дневная выживаемость пациентов с септическим шоком в зависимости от концентрации DPP3 в плазме.

Фигура 8. График выживаемости Каплана-Мейера для всех пациентов (14-дневная смертность пациентов, получавших плацебо (Plac) или N-концевое антитело к ADM адрецизумаб (Adz).

N-концевого анти-ADM антитела, названная адрецизумабом

Фигура 9. График выживаемости Каплана-Мейера для пациентов с DPP3 <50 нг/мл (14-дневная смертность пациентов, получавших плацебо (Plac) или N-концевое антитело к ADM адрецизумаб (Adz).

Фигура 10. График выживаемости Каплана-Мейера для пациентов с DPP3 >50 нг/мл (14-дневная смертность пациентов, получавших плацебо (Plac) или N-концевое антитело к ADM адрецизумаб (Adz).

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение антител и определение их констант аффинности

Было получено несколько человеческих и мышиных антител и определены их константы аффинности (см. табл. 1 и 2). Следует подчеркнуть, что антитела, фрагменты антител и каркасы, не являющиеся каркасами Ig, части примера в соответствии с настоящим изобретением связываются с ADM и, таким образом, их следует рассматривать как антитела против ADM/фрагменты антител/ каркасы, не являющиеся каркасами Ig.

Пептиды/конъюгаты для иммунизации:

Синтезированные пептиды для иммунизации, см. табл. 1, (фирма JPT Technologies, Берлин, Германия) содержат дополнительный N-концевым остаток цистеина (если цистеин отсутствует в выбранной последовательности ADM) для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Пептиды ковалентно связывают с БСА с использованием геля для связывания Sulfolink (Perbio-science, Бонн, Германия). Процедуру связывания проводят в соответствии с руководством фирмы Perbio.

Получение моноклональных антител мышей:

Мышь Balb/c иммунизируют конъюгатом пептид-БСА (эмульгированным в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) в количестве 100 мкг на 0 и 14 день и конъюгатом пептид-БСА (эмульгированным в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда) в количестве 50 мкг на 21 и 28 день. За три дня до проведения эксперимента по слиянию животному вводят 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкл физиологического раствора, в виде одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции. Спленоциты иммунизированной мыши и клетки линии клеток миеломы SP2/0 сливают с 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 сек при 37°С. После промывки клетки высевают в 96-луночные планшеты для культивирования клеток. Гибридные клоны отбирают путем выращивания в среде HAT [питательная среда RPMI 1640 с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки и добавки НАТ]. Через две недели среду HAT заменяют средой НТ на три пассажа с последующим возвратом к нормальной среде для культивирования клеток. Супернатанты клеточных культур подвергают первичному скринингу на антиген-специфические антитела IgG через три недели после слияния. Положительные протестированные микрокультуры переносят в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования отобранные культуры клонируют и затем повторно клонируют методом предельных разведений и определяли изотипы (см. также Lane R.D., J. Immunol. Meth. 1985. 81: 223-228; Ziegler с соавт., Horm. Metab. Res., 1996. 28: 11-15).

Антитела получают стандартными методами получения антител (Marx с соавт., Monoclonal Antibody Production, ATLA, 1997, 25, 121) и очищают с применением белка А. Чистота антител составляла >95% на основании анализа методом гель-электрофореза с SDS.

Антитела человека:

Антитела человека получают методом фагового дисплея в соответствии со следующей процедурой. Библиотеки генов наивных антител человека HAL7/8 используют для выделения рекомбинантных одноцепочечных вариабельных доменов Fv (scFv) против пептида адреномедуллина. Библиотеки генов антител подвергают скринингу с использованием стратегии пэннинга, включающей использование пептидов, содержащих биотиновую метку, связанную через два разных спейсера с последовательностью пептида адреномедуллина. Смесь раундов пэннинга с использованием неспецифически связанного антигена и антигена, связанного со стрептавидином, используют для минимизации фона неспецифических связывающих. Элюированные фаги из третьего раунда пэннинга используют для получения штаммов Е. coli, экспрессирующих моноклональные scFv. Супернатант от культивирования этих клональных штаммов был непосредственно используют для тестирования антигена методом ELISA (см. также Hust с соавт., Journal of Biotechnology 2011, 152, 159-170; Schutte с соавт., PLoS One, 2009, 4, e6625). Положительные клоны отбирают на основании положительного сигнала ELISA для антигена и отрицательного для покрытых стрептавидином микротитровальных планшетов. Для дальнейших характеристик открытую рамку считывания scFv клонируют в экспрессирующей плазмиде рОРЕ107 (Hust с соавт., J. Biotechn. 2011), захваченной из культурального супернатанта с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов, и очищают с помощью эксклюзионной хроматографии.

Константы аффинности: Для определения аффинности антител к ADM определяют кинетику связывания ADM с иммобилизованным антителом с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса без метки с использованием системы Biacore 2000 (фирма GE Healthcare Europe GmbH, Фрайбург, Германия). Обратимую иммобилизацию антител проводят с использованием антитела против мышиного Fc, ковалентно связанного с высокой плотностью с поверхностью сенсора СМ5 в соответствии с инструкциями производителя (набор для захвата мышиных антител; фирма GE Healthcare). (Lorenz с соавт., Antimicrob Agents Chemother. 2011, 55(1): 165-173).

Моноклональные антитела были разработаны против представленных ниже участков ADM человеческого и мышиного ADM, соответственно. В следующей таблице приводят отобранные полученные антитела, используемые в дальнейших экспериментах. Выбор основан на целевой области:

Получение фрагментов антител путем ферментативного расщепления: Получение Fab- и F(ab)2-фрагментов осуществляют путем ферментативного расщепления мышиного полноразмерного антитела NT-M. Антитело NT-M расщепляют с использованием а) набора для подготовки F(ab)2 на основе пепсина (фирма Pierce, номер в каталоге 44988) и б) набора для подготовки Fab на основе папаина (фирма Pierce, номер в каталоге 44985). Процедуру фрагментации проводят в соответствии с инструкциями поставщика. Расщепление проводят в случае F(ab)2-фрагментации в течение 8 ч при 37°С. Расщепление Fab-фрагментации проводят в течение 16 ч, соответственно.

Методика получения и очистки Fab: Иммобилизованный папаин уравновешивают промывкой смолы 0,5 мл буфера для расщепления и центрифугируют колонку при 5000 g в течение 1 мин. После этого буфер удаляют.Колонку для обессоливания готовят, удаляя раствор для хранения и промывая буфером для расщепления с последующим центрифугированием каждый раз при 1000 g в течение 2 мин. 0,5 мл приготовленного образца IgG добавляют в пробирку спин-колонки, содержащую уравновешенный иммобилизованный папаин. Время инкубации реакции расщепления составляет 16 ч на настольной качалке при 37°С. Колонку центрифугируют в режиме 5000 g в течение 1 мин, чтобы отделить гидролизат от иммобилизованного папаина. После этого смолу промывают 0,5 мл ФСБ и центрифугируют в режиме 5000×g в течение 1 мин. Фракцию промывки добавляют к расщепленному антителу, при этом общий объем образца составляет 1,0 мл. Колонку Nab Protein А уравновешивают ФСБ и элюирующим буфером IgG при комнатной температуре. Колонку центрифугируют в течение 1 мин для удаления раствора для хранения (содержит 0,02% азида натрия) и уравновешивают добавлением 2 мл ФСБ, снова центрифугируют в течение 1 мин и проходящий поток выбрасывают. Образец вносят в колонку и ресуспендируют переворачиванием. Инкубацию проводят при комнатной температуре при непрерывном перемешивании в течение 10 мин. Колонку центрифугируют в течение 1 мин, сохраняя проходящий поток с Fab-фрагментами. (Литературные источники: Coulter и Harris, J. Immunol. Meth., 1983, 59, 199-203; Lindner с соавт., Cancer Res, 2010, 70, 277-287; Kaufmann с соавт., PNAS,2010, 107, 18950-5.; Chen с соавт., PNAS, 2010, 107, 14727-32; Uysal с соавт., J. Exp.Med., 2009, 206, 449-462; Thomas с соавт., J. Exp.Med., 2009, 206, 1913-1927; Kong с соавт., J. Cell Biol, 2009, 185, 1275-1840).

Методика получения и очистки фрагментов F(ab')₂: Иммобилизованный пепсин уравновешивают промывкой смолы 0,5 мл буфера для расщепления и центрифугируют колонку в режиме 5000 g в течение 1 мин. После этого буфер удаляют. Колонку для обессоливания готовят, удаляя раствор для хранения и промывая буфером для расщепления с последующим центрифугированием каждый раз при 1000 g в течение 2 мин. 0,5 мл приготовленного образца IgG добавляют в пробирку спин-колонки, содержащую уравновешенный иммобилизованный пепсин. Время инкубации реакции расщепления составляет 16 ч на настольной качалке при 37°С. Колонку центрифугируют в режиме 5000 g в течение 1 мин, чтобы отделить гидролизат от иммобилизованного папаина. После этого смолу промывают 0,5 мл ФСБ и центрифугируют в режиме 5000×g в течение 1 мин. Фракцию промывки добавляют к расщепленному антителу, при этом общий объем образца составляет 1,0 мл. Колонку Nab Protein А уравновешивают ФСБ и элюирующим буфером IgG при комнатной температуре. Колонку центрифугируют в течение 1 мин для удаления раствора для хранения (содержит 0,02% азида натрия) и уравновешивают добавлением 2 мл ФСБ, снова центрифугируют в течение 1 мин и проходящий поток выбрасывают. Образец вносят в колонку и ресуспендируют переворачиванием. Инкубацию проводят при комнатной температуре при непрерывном перемешивании в течение 10 мин. Колонку центрифугируют в течение 1 мин, сохраняя проходящий поток с Fab-фрагментами. (Литературные источники: Mariani с соавт., Mol. Immunol., 1991, 28: 69-77; Beale, Exp Сотр Immunol, 1987, 11: 287-296; Ellerson с соавт., FEBS Letters, 1972, 24(3):318-322; Kerbel и Elliot, Meth Enzymol, 1983, 93: 113-147; Kulkarni с соавт., Cancer Immunol Immunotherapy, 1985, 19: 211-214; Lamoyi, Meth Enzymol, 1986, 121: 652-663; Parham с соавт., J Immunol Meth, 1982, 53: 133-173; Raychaudhuri с соавт., Mol Immunol, 1985, 22(9): 1009-1019; Rousseaux с соавт., Mol Immunol, 1980, 17: 469-482; Rousseaux с соавт., J Immunol Meth, 1983, 64: 141-146; Wilson с соавт., J Immunol Meth, 1991, 138: 111-119).

Гуманизация фрагмента NT-H-антитела: Фрагмент антитела гуманизируют методом прививки CDR (Jones с соавт., Nature, 1986, 321, 522-525).

Для получения гуманизированной последовательности выполняют следующие этапы: Экстракция тотальной РНК: Тотальную РНК экстрагируют из гибридом NT-H с использованием набора Qiagen. Первый раунд ОТ-ПЦР: используют набор QIAGEN® OneStep RT-PCR (номер в каталоге 210210). ОТ-ПЦР проводят с наборами праймеров, специфичных для тяжелых и легких цепей. Для каждого образца РНК устанавливают 12 индивидуальных реакций тяжелой цепи и 11 реакций легкой цепи ОТ-ПЦР с использованием смесей вырожденных прямых праймеров, покрывающих лидерные последовательности вариабельных областей. Обратные праймеры расположены в константных областях тяжелых и легких цепей. В праймеры не встраивают сайты рестрикции.

Подготовка реакции: 5х QIAGEN® OneStep RT-PCR Buffer 5,0 мкл, смесь dNTP (содержащая 10 мМ каждого dNTP) 0,8 мкл, набор праймеров 0,5 мкл, смесь ферментов QIAGEN® OneStep RT-PCR Enzyme Mix 0,8 мкл, матричная РНК 2,0 мкл, вода без РНКазы - до 20,0 мкл, общий объем 20,0 мкл. Условия проведения ПЦР: обратная транскрипция: 50°С, 30 мин; начальная активация ПЦР: 95°С, 15 мин; циклирование: 20 циклов при 94°С, 25 сек; 54°С, 30 сек; 72°С, 30 сек; окончательное удлинение: 72°С, 10 мин. Второй раунд полувложенной ПЦР: продукты ОТ-ПЦР из реакций первого раунда дополнительно амплифицируют во втором раунде ПЦР. 12 индивидуальных реакций тяжелой цепи и 11 реакций легкой цепи ОТ-ПЦР устанавливают с использованием наборов полувложенных праймеров, специфичных для вариабельных областей антител.

Подготовка реакции: 2х смеси для ПЦР по 10 мкл; набор праймеров 2 мкл; продукт первого раунда ПЦР 8 мкл; общий объем 20 мкл; отчет о клонировании гибридомных антител, условия ПЦР: начальная денатурация 5 мин при 95°С; 25 циклов: 95°С по 25 сек, 57°С по 30 сек, 68°С по 30 сек; окончательное удлинение составляет 10 мин при 68°С.

После завершения ПЦР образцы реакции ПЦР переносят на агарозный гель для визуализации амплифицированных фрагментов ДНК. После секвенирования более 15 клонированных фрагментов ДНК, амплифицированных с помощью вложенной ОТ-ПЦР, несколько тяжелых и легких цепей мышиных антител были клонированы и оказались правильными. Выравнивание белковой последовательности и анализ CDR идентифицируют одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. После выравнивания с гомологичными человеческими каркасными последовательностями результирующая гуманизированная последовательность вариабельной области тяжелой цепи выглядит следующим образом: см. фиг. 5. Как аминокислоты в положениях 26, 40 и 55 в вариабельной области тяжелой цепи, так и аминокислота в положении 40 в вариабельной области легкой цепи имеют решающее значение для свойств связывания, они могут быть возвращены к мышиному оригиналу. Получившиеся кандидаты изображены ниже (Padlan, Mol. Immunol, 1991, 28, 489-498; Harris и Bajorath, Protein Sci, 1995, 4, 306-310).

Аннотация к последовательностям фрагментов антител (SEQ ID No.: 6-13; 32 и 33): жирным шрифтом и подчеркиванием выделены CDR 1, 2, 3 в хронологическом порядке; курсивом обозначены постоянные области; шарнирные области выделены жирным шрифтом; Каркасные точечные мутации имеют серый буквенный фон.

SEQ ID No.: 6 (AM-VH-C)

SEQ ID No.: 7 (AM-VH1)

SEQ ID No.: 8 (AM-VH2-E40

SEQ ID No.: 9 (AM-VH3-T26-E55)

SEQ ID No.: 10 (AM-VH4-T26-E40-E55)

SEQ ID No.: 11 (AM-VL-C)

SEQ ID No.: 12 (AM-VL1)

SEQ ID No.: 13 (AM-VL2-E40)

SEQ ID NO: 32 (Тяжелая цепь адресизумаба)

SEQ ID NO: 33 (Легкая цепь адресизумаба)

Пример 2. Влияние выбранных анти-ADM антител на анти-ADM биологическую активность

Влияние выбранных анти-ADM антител на ADM-биоактивность тестируют в функциональном анализе человеческого рекомбинантного адреномедуллинового рецептора цАМФ (адреномедуллиновый биоанализ).

Тестирование антител, нацеленных на адреномедуллин человека или мыши, в функциональном анализе человеческого рекомбинантного адреномедуллинового рецептора цАМФ (биологический анализ адреномедуллина)

Материалы: клеточная линия СНО-К1, рецептор адреномедуллина (CRLR+RAMP3), регистрационный номер рецептора Клеточная линия: CRLR: U17473; RAMP3: AJ001016

Клетки СНО-K1, экспрессирующие человеческий рекомбинантный адреномедуллиновый рецептор (FAST-027C), выращенные перед тестом в среде без антибиотика, отделяют осторожной промывкой PBS-EDTA (5 мМ EDTA), выделяют центрифугированием и ресуспендируют в буфере для анализа (KRH: 5 мМ КС1, 1,25 мМ MgS04, 124 мМ NaCl, 25 мМ HEPES, 13,3 мМ глюкозы, 1,25 мМ КН₂РO₄, 1,45 мМ СаС1₂, 0,5 г/л БСА).

Кривые доза-эффект построены параллельно с контрольными агонистами (hADM или mADM).

Тестирование антагониста (96 лунок): для тестирования антагониста 6 мкл эталонного агониста (человеческого (5,63 нМ) или мышиного (0,67 нМ) адреномедуллина) смешивают с 6 мкл испытуемых образцов при различных разведениях антагониста; или с 6 мкл буфера. После инкубации в течение 60 мин при комнатной температуре добавляют 12 мкл клеток (2500 клеток/лунку). Планшеты инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. После добавления буфера для лизиса оценивают процентное содержание DeltaF в соответствии со спецификацией производителя с помощью набора HTRF от фирмы Cis-Bio International (номер по каталогу 62АМ2 РЕВ), в качестве эталонного антагониста используют hADM 22-52.

Антитела, тестирующие анализ цАМФ-HTRF

Антитела против h-ADM (NT-H, MR-H, СТ-Н) тестируют на антагонистическую активность в функциональном анализе цАМФ рекомбинантного рецептора адреномедуллина человека (FAST-027C) в присутствии 5,63 нМ человеческого ADM 1-52 при следующих конечных концентрациях антител: 100 мкг/мл, 20 мкг/мл, 4 мкг/мл, 0,8 мкг/мл, 0,16 мкг/мл.

Антитела против m-ADM (NT-M, MR-M, СТ-М) тестируют на антагонистическую активность в функциональном анализе цАМФ человеческого рекомбинантного рецептора ADM (FAST-027C) в присутствии 0,67 нМ мышиного ADM 1-50, при следующих конечных концентрациях антител: 100 мкг/мл, 20 мкг/мл, 4 мкг/мл, 0,8 мкг/мл, 0,16 мкг/мл. Данные были нанесены на график относительного ингибирования в зависимости от концентрации антагониста (см. фиг. 2-2 1). Максимальное подавление отдельными антителами приведено в табл. 3.

Пример 3. Стабилизация hADM с помощью анти-ADM антитела

Стабилизирующий эффект человеческого ADM антителами против человеческого ADM тестируют с использованием иммуноанализа hADM.

Иммуноанализ для количественного определения адреномедуллина человека

Используемая технология представляет собой иммунолюминесцентный анализ в пробирках с многослойным покрытием, основанный на нанесении метки в виде сложного эфира акридиния.

Меченое соединение (метка): 100 мкг (100 мкл) СТ-Н (1 мг/мл в ФСБ, рН 7,4, фирма AdrenoMed AG, Германия) смешивают с 10 мкл NHS-эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, фирма In Vent GmbH, Германия) (ЕР 0353971) и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Меченый СТ-Н очищают с помощью гель-фильтрационной ВЭЖХ на Bio-Sil SEC 400-5 (фирма Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Очищенный СТ-Н разводят в: 300 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na-ЭДТА, 5 г/л альбумина бычьей сыворотки, рН 7,0. Конечная концентрация составляет примерно 800000 относительных световых единиц (RLU) меченого соединения (около 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. Хемилюминесценцию акридиниевого эфира измеряют с использованием AutoLumat LB 953 (фирма Berthold Technologies GmbH & Co. KG).

Твердая фаза: пробирки из полистирола (фирма Greiner Bio-One International AG, Австрия) покрывают (18 ч при комнатной температуре) MR-H (фирма AdrenoMed AG, Германия) (1,5 мкг MR-H/0,3 мл 100 ммоль/л NaCl, 50 ммоль /л ТРИС/НС1, рН 7,8). После блокирования 5% бычьим сывороточным альбумином пробирки промывают ФСБ, рН 7,4, и сушат в вакууме.

Калибровка: анализ калибруют с использованием разведений hADM (фирма ВАСНЕМ AG, Швейцария) в 250 ммоль/л NaCl, 2 г/л Triton Х-100, 50 г/л бычьего сывороточного альбумина, 20 таблеток/л коктейля ингибиторов протеазы (фирма Roche Diagnostics AG, Швейцария).

Иммуноанализ hADM: 50 мкл образца (или калибратора) пипетируют в пробирки с покрытием, после добавления меченого СТ-Н (200 мкл) пробирки инкубируют в течение 4 ч при 4°С. Несвязавшийся индикатор удаляют промывкой 5 раз (каждый раз 1 мл) промывочным раствором (20 мМ PBS, рН 7,4, 0,1% Triton Х-100).

Хемилюминесценцию в пробирке измеряют с использованием LB 953: на фиг. 3 показана типичная кривая доза/сигнал hADM и кривая сигнала/дозы hADM в присутствии 100 мкг/мл антитела NT-H. NTH не влияет на описанный иммуноанализ hADM.

Стабильность адреномедуллина человека: ADM человека разводят в цитратной плазме человека (конечная концентрация 10 нМ) и инкубируют при 24°С. В выбранные моменты времени деградацию hADM останавливают замораживанием при -20°С. Инкубацию проводят в отсутствие и в присутствии NT-H (100 мкг/мл). Оставшийся hADM количественно определяют с использованием иммуноанализа hADM, описанного выше.

На фиг. 4 показана стабильность hADM в плазме человека (цитрат) в отсутствие и в присутствии к NT-H антитела. Период полужизни одного hADM составляет 7,8 ч, а в присутствии NT-H период полужизни составляет 18,3 ч (стабильность в 2,3 раза выше).

Пример 4. Смертность от сепсиса

а) Раннее лечение сепсиса

Животная модель: для исследования используют самцов мышей С57 В1/6 в возрасте 12-15 недель (фирма Charles River Laboratories, Германия). Перитонит вызывают хирургическим путем под легкой изофлурановой анестезией. Разрезы производят в левом верхнем квадранте брюшной полости (нормальное расположение слепой кишки). Обнажают слепую кишку и накладывают тугую лигатуру вокруг слепой кишки со швами дистальнее места прикрепления тонкой кишки. Была сделана одна колотая рана с помощью иглы 24 калибра в слепую кишку, и небольшое количество содержимого слепой кишки выдавлено через рану. Слепую кишку вытесняют в брюшную полость и закрывают место лапаротомии. Затем животных возвращают в клетки со свободным доступом к пище и воде. 500 мкл физиологического раствора вводили подкожно в качестве замены жидкости.

Применение и дозировка соединения (NT-M, MR-M. СТ-М): Мышей лечат сразу после CLP (раннее лечение). CLP является аббревиатурой для лигирования и пункции слепой кишки (CLP cecal ligation and puncture).

Группы исследования: три соединения тестируют и сравнивают с разбавителем и лечением контрольным соединением. Каждая группа содержит 5 мышей для забора крови через 1 день для определения АМК (анализ азота мочевины в сыворотке крови). В течение 4 дней наблюдают за десятью мышами в каждой группе.

Лечение по группам (10 мкл/г массы тела) доза/ последующее наблюдение:

1 NT-M, выживаемость 0,2 мг/мл в течение 4 дней

2 MR-M, выживаемость 0,2 мг/мл в течение 4 дней

3 СТ-М, выживаемость 0,2 мг/мл в течение 4 дней

4 неспецифических мышиных IgG, выживаемость 0,2 мг/мл в течение 4 дней

5 контроль - ФСБ 10 мкл/г массы тела, выживаемость в течение 4 дней

Клиническая химия:

Концентрации азота мочевины крови (АМК) для

почечной функции измеряют исходно и в первый день после CLP. Образцы крови получают из кавернозного синуса капилляром под легким эфирным наркозом. Измерения проводят с использованием мультианализатора AU 400 Olympus. 4-дневная смертность и средние показатели АМК приведены в табл.4.

Из табл.4 видно, что антитело NT-M значительно снижает смертность. Через 4 дня 70% мышей выжили при лечении антителом NT-M. При лечении антителом MR-M выжило 30% животных, а при лечении антителом СТ-М через 4 дня выжило 10% животных. В противоположность этому все мыши погибли через 4 дня после введения неспецифического мышиного IgG. Такой же результат был получен в контрольной группе, где мышам вводили ФСБ (забуференный фосфатом физиологический раствор). Анализ азота мочевины крови или азота мочевины используется для оценки функции почек, диагностики заболевания почек и наблюдения за пациентами с острой или хронической почечной дисфункцией или недостаточностью. Результаты теста S-BUN показали, что антитело NT-M было наиболее эффективным для защиты почек.

б) Позднее лечение сепсиса

Животная модель: для исследования используют самцов мышей С57 В1/6 в возрасте 12-15 недель (фирма Charles River Laboratories, Германия). Перитонит вызывают хирургическим путем под легкой изофлурановой анестезией. Разрезы производят в левом верхнем квадранте брюшной полости (нормальное расположение слепой кишки). Обнажают слепую кишку и накладывают тугую лигатуру вокруг слепой кишки со швами дистальнее места прикрепления тонкой кишки. Была сделана одна колотая рана с помощью иглы 24 калибра в слепую кишку, и небольшое количество содержимого слепой кишки было выдавлено через рану. Слепую кишку вытеснили в брюшную полость и закрыли место лапаротомии. Затем животных возвращают в клетки со свободным доступом к пище и воде. 500 мкл физиологического раствора вводят подкожно в качестве замены жидкости.

Применение и дозировка препарата (NT-M FAB2): NT-M FAB2 тестируют в сравнении с обработкой носителем и контрольным соединением. Лечение проводят после полного развития сепсиса, через 6 часов после CLP (позднее лечение). Каждая группа состоит из 4 мышей и наблюдалась в течение 4 дней.

Групповое лечение (10 мкл/г массы тела) доза/последующее наблюдение:

1 NT-M, FAB2 0,2 мг/мл, выживаемость в течение 4 дней

2 контрольных неспецифических мышиных IgG, выживаемость 0,2 мг/мл в течение 4 дней

3 носитель: - ФСБ 10 мкл/г массы тела, выживаемость в течение 4 дней.

Из табл. 5 видно, что антитело NT-M FAB 2 значительно снижает смертность. Через 4 дня 75% мышей выжили при лечении антителом NT-M FAB 2. В противоположность этому все мыши умерли через 4 дня после обработки неспецифическим мышиным IgG. Такой же результат был получен в контрольной группе, где мышам вводили ФСБ (фосфатом солевой буфер).

Пример 5. Введение NT-H здоровым людям

Исследование проводят на здоровых субъектах мужского пола в виде рандомизированного, двойного слепого, плацебо-контролируемого исследования с однократными нарастающими дозами антитела NT-H, вводимого в виде внутривенной (в/в) инфузии в 3 последовательных группах по 8 здоровых субъектов мужского пола в каждой (1-я группа 0,5 мг/кг, 2-я группа 2 мг/кг, 3-я группа 8 мг/кг) здоровых мужчин (n=6 активных, n=2 плацебо в каждой группе). Основными критериями включения были письменное информированное согласие, возраст от 18 до 35 лет, согласие на использование надежного способа контрацепции и индексом массы тела (ИМТ) от 18 до 30 кг/м². Субъекты получают одну внутривенную дозу антитела NT-H (0,5 мг/кг; 2 мг/кг; 8 мг/кг) или плацебо путем медленного вливания в течение 1 ч в исследовательском отделении. Исходные значения ADM в 4 группах не различаются. Медианные значения ADM составляют 7,1 пг/мл в группе плацебо, 6,8 пг/мл в первой группе лечения (0,5 мг/кг), 5,5 пг/мл во второй группе лечения (2 мг/кг) и 7,1 пг/мл в третьей группе лечения группа лечения (8 мг/мл). Результаты показывают, что значения ADM быстро увеличиваются в течение первых 1,5 ч после введения антитела NT-H у здоровых людей, затем достигают плато и медленно снижаются (фиг. 6).

Пример 6. Способы измерения белка DPP3 и активности DPP3 Генерация антител и определение способности связывания DPP3: получено несколько мышиных антител и проведен скрининг их способности связывать DPP3 человека в анализе специфического связывания (см. табл. 6).

Пептиды/конъюгаты для иммунизации: пептиды DPP3 для иммунизации были синтезированы, см. табл.6, (фирма JPT Technologies, Берлин, Германия) с дополнительным N-концевым остатком цистеина (если цистеин отсутствует в выбранной последовательности DPP3) для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Пептиды ковалентно связывают с БСА с использованием геля для связывания Sulfolink (фирма Perbio-science, Бонн, Германия). Процедуру соединения проводят в соответствии с руководством фирмы Perbio. Рекомбинантный GST-hDPP3 произведен USBio (фирма United States Biological, Салем, Массачусетс, США).

Иммунизация мышей, слияние иммунных клеток и скрининг: Мышам Balb/c вводят внутрибрюшино (в.б.) 84 мкг GST-hDPP3 или 100 мкг конъюгатов ОРР3-пептид-БСА в день 0 (эмульгированных в адъюванте TiterMax Gold Adjuvant), 84 мкг или 100 мкг на 14й день (эмульгированных в полном адъюванте Фрейнда) и 42 мкг или 50 мкг на 21 и 28 день (в неполном адъюванте Фрейнда). На 49-й день животному делают 10 внутривенных (в.в.) инъекций 42 мкг GST-hDPP3 или 50 мкг конъюгатов БРР3-пептид-БСА, растворенных в физиологическом растворе. Через три дня мышей умерщвляли и проводили слияние иммунных клеток.

Спленоциты иммунизированных мышей и клетки линии клеток миеломы SP2/0 сливают с 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 сек при 37°С. После промывки клетки высевают в 96-луночные культуральные планшеты. Гибридные клоны отбирают путем выращивания в среде HAT [питательная среда RPMI 1640 с добавлением 20% фетальной сыворотки теленка и НАТ-добавки]. Через одну неделю среду HAT заменяют средой НТ на три пассажа с последующим возвратом к нормальной среде для культивирования клеток. Супернатанты клеточных культур в первую очередь подвергают скринингу на наличие рекомбинантных DPPS-связывающих IgG-антител через две недели после слияния. Поэтому рекомбинантный GST-меченый hDPP3 (фирма USBiologicals, Салем, США) иммобилизуют в 96-луночных планшетах (100 нг/лунку) и инкубируют с 50 мкл супернатанта клеточной культуры на лунку в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки планшета добавляют 50 мкл/лунку POD-кроличьего IgG против IgG мыши и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После следующего этапа промывки в каждую лунку добавляют по 50 мкл раствора хромогена (3,7 мМ о-фенилендиамин в цитратно-гидрофосфатном буфере, 0,012% H₂O₂), инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре, и хромогенная реакция останавливется добавлением 50 мкл 4н серной кислоты. Поглощение детектируют при 490 нм.

Положительные протестированные микрокультуры переносят в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования отобранные культуры клонируют и повторно клонируют с использованием метода предельных разведений и определяют изотипы.

Получение моноклональных антител мыши

Антитела, индуцированные против GST-меченого человеческого DPP3 или ОРР3-пептидов, получают с помощью стандартных методов получения антител (Marx с соавт., 1997) и очищают с помощью белка А. Чистота антител составляет ≥90% на основании анализа гель-электрофореза в SDS.

Характеристика антител связывание с hDPP3 и/или пептидом для иммунизации

Для анализа способности связывания DPP3/пептида для иммунизации с различными антителами и клонами антител проводят анализ связывания:

Твердая фаза: рекомбинантная hDPP3, меченный GST (SEQ ID NO. 34) или пептид DPP3 (пептид для иммунизации, SEQ ID NO. 35) иммобилизуют на поверхности планшета для микротитрования с высоким связыванием (96-луночные полистироловые микропланшеты, фирма Greiner Bio-One International AG, Австрия, 1 мкг/лунку в буфере для связывания [50 мМ Трис, 100 мМ NaCl, рН 7,8], 1 ч при комнатной температуре). После блокирования 5% бычьим сывороточным альбумином микропланшеты сушат в вакууме.

Метод нанесения метки: 100 мкг (100 мкл) различных анти-DPP3 антител (детектирующее антитело, 1 мг/мл в ФСБ, рН 7,4) смешивают с 10 мкл NHS-эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, фирма InVent GmbH, Германия; ЕР 0353971) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Меченое анти-ОРР3-антитело очищают гель-фильтрационной ВЭЖХ на Shodex Protein 5 мкм KW-803 (фирма Showa Denko, Япония). Очищенное меченое антитело разводят в буфере для анализа (50 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na2-ЭДТА, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, 1 г/л мышиного IgG, 1 г/л бычий IgG, 50 мкмоль/л ламастатин, 100 мкмоль/л лейпептин, рН 7,4). Конечная концентрация составила около 5-7×10⁶ относительных световых единиц (RLU) меченого соединения (примерно 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. Хемилюминесценцию эфира акридиния измеряют с помощью люминометра Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).

Анализ связывания hDPP3: планшеты заполняют 200 мкл меченого и разведенного детектирующего антитела (индикатора) и инкубируют в течение 2-4 ч при 2-8°С. Несвязавшийся индикатор удаляют промывкой 4 раза по 350 мкл промывочного раствора (20 мМ PBS, рН 7,4, 0,1% Triton Х-100). Хорошо связанную хемилюминесценцию измеряют с использованием люминометра Centro LB 960 (фирма Berthold Technologies GmbH & Co. KG).

Характеристика антител - анализ ингибирования hDPP3

Для анализа способности ингибировать DPP3 различными антителами и клонами антител проводят анализ активности DPP3 по известной методике (Jones с соавт., 1982). Рекомбинантную hDPP3, меченный GST, разводят в буфере для анализа (25 нг/мл GST-DPP3 в 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5 и 100 мкМ ZnCl2) и 200 мкл этого раствора инкубируют с 10 мкг соответствующего антитела при комнатной температуре. После 1 ч предварительной инкубации к раствору добавляют флуорогенный субстрат Arg-Arg-βNA (20 мкл, 2 мМ) и отслеживают образование свободного βNA с течением времени с помощью флуорометра для микропланшетов Twinkle LB 970 (фирма Berthold Technologies GmbH & Co. KG) при 37°C. Флуоресценцию βNA обнаруживают путем возбуждения при 340 нм и измерения эмиссии при 410 нм. Рассчитывают наклоны (в RFU/мин) увеличения флуоресценции различных образцов. Наклон GST-hDPP3 с буферным контролем принимают за 100% активности. Ингибирующую способность возможного связывающего вещества определяют как снижение активности GST-hDPP3 при инкубации с указанным связывающим веществом в процентах.

В следующей таблице представлен выбор полученных антител и степень их связывания в относительных световых единицах (RLU), а также их относительная ингибирующая способность (%; табл. 6). Моноклональные антитела, выработанные против изображенных ниже участков DPP3, выбраны по их способности связывать рекомбинантную DPP3 и/или пептид для иммунизации, а также по их ингибирующему потенциалу.

Все антитела, полученные против GST-меченной полноразмерной формы рекомбинантной hDPP3, демонстрируют сильное связывание с иммобилизованной hDPP3, меченной GST. Антитела, индуцированные против пептида SEQ ID NO.: 35, также связываются с GST-hDPP3. Антитела SEQ ID NO.: 35 также прочно связываются с иммунизирующим пептидом.

Таблица 6. Перечень антител, вырабатываемых против hDPP3 полной длины или последовательностей и их способность связывать hDPP3 (SEQ ID NO.: 34) или пептид для иммунизации (SEQ ID NO.: 35) в RLU, а также максимальное ингибирование рекомбинантной GST-hDPP3.

Недавно была описана разработка люминесцентного иммуноанализа для количественного определения концентрации белка DPP3 (DPP3-LIA), а также анализа активности захвата фермента для количественного определения активности DPP3 (DPP3-ECA) (Rehfeld с соавт., JALM, 2019, 3(6): 943-953); сущность публикации включена в настоящее изобретение в виде ссылки.

Пример 7. DPP3 при шоке

Концентрацию DPP3 определяют в плазме больных с сепсисом/септическим шоком и кардиогенным шоком и связывают с краткосрочной смертностью больных.

а) Группа исследования сепсис/септический шок

В 574 образцах плазмы пациентов, участвовавших в исследовании «Адреномедуллин и результаты лечения тяжелого сепсиса и септического шока» (AdrenOSS-1), измеряли DPP3. AdrenOSS-1 - проспективное обсервационное многонациональное исследование, включающее 583 пациента, поступивших в отделение интенсивной терапии с сепсисом или септическим шоком (Hollinger с соавт., 2018). У 292 пациентов был диагностирован септический шок. б) Группа исследования - кардиогенный шок

Образцы плазмы от 108 пациентов, у которых был диагностирован кардиогенный шок, были проверены на наличие DPP3. Кровь брали в течение 6 ч с момента выявления кардиогенного шока. Смертность наблюдали в течение последующих 7 дней.

Иммуноанализ hDPP3: Иммуноанализ (LIA) или анализ активности (ЕСА), определяющий количество DPP3 человека (LIA) или активность DPP3 человека (ЕСА), соответственно, используют для определения уровня DPP3 в плазме пациента. Иммобилизацию антител, нанесение метки и инкубацию проводят, как описано в публикации Rehfeld с соавт.(Rehfeld с соавт., JALM, 2019, 3(6): 943-953).

Результаты: Кратковременная выживаемость пациентов с сепсисом связана с концентрацией DPP3 в плазме при поступлении. Пациенты с концентрацией DPP3 в плазме выше 40,5 нг/мл (3-й квартиль) имеют повышенный риск смертности по сравнению с пациентами с концентрацией DPP3 в плазме ниже этого порога (фиг. 7А). Применение этого порогового значения к подгруппе пациентов с септическим шоком выявило еще более выраженный риск краткосрочной смертности в связи с высокими концентрациями DPP3 в плазме (рис. 7Б). При применении того же порогового значения к пациентам с кардиогенным шоком также наблюдается повышенный риск краткосрочной смертности в течение 7 дней у пациентов с высоким DPP3 (фиг.7 В).

Пример 8. NT-АРМ антитела у пациентов с септическим шоком (AdrenOSS-21 AdrenOSS-2 это двойное слепое, плацебо-контролируемое, рандомизированное, многоцентровое клиническое исследование фазы II для проверки концепции и подбора дозы для изучения безопасности, переносимости и эффективности N-концевого антитела к ADM, называемого адрецизумаб, у пациентов с септическим шоком и повышенным адреномедуллином (Geven с соавт., BMJ Open, 2019; 9:е024475). В общей сложности 301 пациент с септическим шоком и концентрацией био-ADM >70 пг/мл был рандомизирован (2:1:1) для лечения однократной внутривенной инфузией в течение примерно 1 ч либо плацебо (n=152), либо адрецизумаба 2 нг/кг (n=72), либо адрецизумаба 4 нг/кг (n=77). Смертность от всех причин в течение 28 (90) дней после включения составила 25,8% (34,8%). Средний возраст составил 68,4 года, 61% из них были мужчинами. Для анализа по протоколу n=294 пациента оставались подходящими, а 14-дневная смертность от всех причин составила 18,5%.

У пациентов, получавших адрецизумаб (обе дозы вместе, согласно протоколу), наблюдалась тенденция к снижению краткосрочной смертности (через 14 дней после госпитализации) по сравнению с плацебо (отношение рисков (ОР) 0,701 [0,408-1,21], р=0,100)) (фиг. 8). Неожиданно было установлено, что у больных с концентрацией DPP3 при поступлении ниже 50 нг/мл эффект лечения был более выражен (n=244, ОР 0,426, р=0,007) (фиг. 9), а у больных с повышенным DPP3 (выше 50 нг/мл, n=44), результат был сопоставим для адрецизумаба и плацебо (HR 1,69, р=0,209) (фиг. 10).

Эффекты лечения для различных порогов DPP3 (14-дневная смертность) обобщены в табл. 7.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> 4ТИН4 ФАРМАСЬЮТИКЛЗ МГБХ

<120> DPP3 ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ, МОНИТОРИНГА И СТРАТИФИКАЦИИ ТЕРАПИИ NT-ADM

АНТИТЕЛАМИ У ПАЦИЕНТОВ С ШОКОМ

<130> T75115WO

<150> 20159848.9

<151> 2020-02-27

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Trp

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr

1 5

<210> 6

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys

210 215

<210> 7

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys

210 215

<210> 8

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys

210 215

<210> 9

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys

210 215

<210> 10

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys

210 215

<210> 11

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Asp Val Leu Leu Ser Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 12

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 13

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 14

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

1 5 10 15

Arg Phe Gly Thr Cys

20

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln

1 5 10

<210> 16

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Cys Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 19

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe

1 5 10 15

Gly Thr Cys

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln

1 5 10

<210> 19

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 19

Cys Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr

1 5 10

<210> 20

<211> 52

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

1 5 10 15

Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln

20 25 30

Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser

35 40 45

Pro Gln Gly Tyr

50

<210> 21

<211> 50

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 21

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe

1 5 10 15

Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu Thr

20 25 30

Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln

35 40 45

Gly Tyr

50

<210> 22

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

1 5 10 15

Arg Phe Gly Thr Cys

20

<210> 23

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

1 5 10 15

Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln

20 25 30

Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala

35 40

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr Asn His

1 5 10

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe

1 5 10

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly

1 5 10

<210> 27

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Tyr Arg Gln Ser Met Asn

1 5

<210> 28

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

1 5 10 15

Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln

20 25 30

<210> 29

<211> 40

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 29

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe

1 5 10 15

Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu Thr

20 25 30

Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala

35 40

<210> 30

<211> 31

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 30

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe

1 5 10 15

Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu

20 25 30

<210> 31

<211> 164

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp

1 5 10 15

Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro

20 25 30

Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg

35 40 45

Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro

50 55 60

Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn

65 70 75 80

Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val

85 90 95

Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp

100 105 110

Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr Gly Arg Arg

115 120 125

Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu Val Ser

130 135 140

Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly Ser Ala

145 150 155 160

Pro His Phe Leu

<210> 32

<211> 448

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 33

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 34

<211> 737

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Met Ala Asp Thr Gln Tyr Ile Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Ser Ser

1 5 10 15

Leu Asp Cys Arg Glu Ala Phe Arg Leu Leu Ser Pro Thr Glu Arg Leu

20 25 30

Tyr Ala Tyr His Leu Ser Arg Ala Ala Trp Tyr Gly Gly Leu Ala Val

35 40 45

Leu Leu Gln Thr Ser Pro Glu Ala Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Ser

50 55 60

Arg Leu Phe Arg Ala Gln Asp Pro Asp Gln Leu Arg Gln His Ala Leu

65 70 75 80

Ala Glu Gly Leu Thr Glu Glu Glu Tyr Gln Ala Phe Leu Val Tyr Ala

85 90 95

Ala Gly Val Tyr Ser Asn Met Gly Asn Tyr Lys Ser Phe Gly Asp Thr

100 105 110

Lys Phe Val Pro Asn Leu Pro Lys Glu Lys Leu Glu Arg Val Ile Leu

115 120 125

Gly Ser Glu Ala Ala Gln Gln His Pro Glu Glu Val Arg Gly Leu Trp

130 135 140

Gln Thr Cys Gly Glu Leu Met Phe Ser Leu Glu Pro Arg Leu Arg His

145 150 155 160

Leu Gly Leu Gly Lys Glu Gly Ile Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Asn Cys

165 170 175

Thr Met Glu Asp Ala Lys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Asp Ser Gln Asn

180 185 190

Leu Ser Ala Tyr Asn Thr Arg Leu Phe Lys Glu Val Asp Gly Glu Gly

195 200 205

Lys Pro Tyr Tyr Glu Val Arg Leu Ala Ser Val Leu Gly Ser Glu Pro

210 215 220

Ser Leu Asp Ser Glu Val Thr Ser Lys Leu Lys Ser Tyr Glu Phe Arg

225 230 235 240

Gly Ser Pro Phe Gln Val Thr Arg Gly Asp Tyr Ala Pro Ile Leu Gln

245 250 255

Lys Val Val Glu Gln Leu Glu Lys Ala Lys Ala Tyr Ala Ala Asn Ser

260 265 270

His Gln Gly Gln Met Leu Ala Gln Tyr Ile Glu Ser Phe Thr Gln Gly

275 280 285

Ser Ile Glu Ala His Lys Arg Gly Ser Arg Phe Trp Ile Gln Asp Lys

290 295 300

Gly Pro Ile Val Glu Ser Tyr Ile Gly Phe Ile Glu Ser Tyr Arg Asp

305 310 315 320

Pro Phe Gly Ser Arg Gly Glu Phe Glu Gly Phe Val Ala Val Val Asn

325 330 335

Lys Ala Met Ser Ala Lys Phe Glu Arg Leu Val Ala Ser Ala Glu Gln

340 345 350

Leu Leu Lys Glu Leu Pro Trp Pro Pro Thr Phe Glu Lys Asp Lys Phe

355 360 365

Leu Thr Pro Asp Phe Thr Ser Leu Asp Val Leu Thr Phe Ala Gly Ser

370 375 380

Gly Ile Pro Ala Gly Ile Asn Ile Pro Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Gln

385 390 395 400

Thr Glu Gly Phe Lys Asn Val Ser Leu Gly Asn Val Leu Ala Val Ala

405 410 415

Tyr Ala Thr Gln Arg Glu Lys Leu Thr Phe Leu Glu Glu Asp Asp Lys

420 425 430

Asp Leu Tyr Ile Leu Trp Lys Gly Pro Ser Phe Asp Val Gln Val Gly

435 440 445

Leu His Glu Leu Leu Gly His Gly Ser Gly Lys Leu Phe Val Gln Asp

450 455 460

Glu Lys Gly Ala Phe Asn Phe Asp Gln Glu Thr Val Ile Asn Pro Glu

465 470 475 480

Thr Gly Glu Gln Ile Gln Ser Trp Tyr Arg Ser Gly Glu Thr Trp Asp

485 490 495

Ser Lys Phe Ser Thr Ile Ala Ser Ser Tyr Glu Glu Cys Arg Ala Glu

500 505 510

Ser Val Gly Leu Tyr Leu Cys Leu His Pro Gln Val Leu Glu Ile Phe

515 520 525

Gly Phe Glu Gly Ala Asp Ala Glu Asp Val Ile Tyr Val Asn Trp Leu

530 535 540

Asn Met Val Arg Ala Gly Leu Leu Ala Leu Glu Phe Tyr Thr Pro Glu

545 550 555 560

Ala Phe Asn Trp Arg Gln Ala His Met Gln Ala Arg Phe Val Ile Leu

565 570 575

Arg Val Leu Leu Glu Ala Gly Glu Gly Leu Val Thr Ile Thr Pro Thr

580 585 590

Thr Gly Ser Asp Gly Arg Pro Asp Ala Arg Val Arg Leu Asp Arg Ser

595 600 605

Lys Ile Arg Ser Val Gly Lys Pro Ala Leu Glu Arg Phe Leu Arg Arg

610 615 620

Leu Gln Val Leu Lys Ser Thr Gly Asp Val Ala Gly Gly Arg Ala Leu

625 630 635 640

Tyr Glu Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Pro Pro Glu Cys Phe Leu

645 650 655

Thr Leu Arg Asp Thr Val Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg Lys Leu Ile

660 665 670

Val Gln Pro Asn Thr Arg Leu Glu Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu

675 680 685

Tyr Glu Ala Ser Ala Ala Gly Leu Ile Arg Ser Phe Ser Glu Arg Phe

690 695 700

Pro Glu Asp Gly Pro Glu Leu Glu Glu Ile Leu Thr Gln Leu Ala Thr

705 710 715 720

Ala Asp Ala Arg Phe Trp Lys Gly Pro Ser Glu Ala Pro Ser Gly Gln

725 730 735

Ala

<210> 35

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

Cys Glu Thr Val Ile Asn Pro Glu Thr Gly Glu Gln Ile Gln Ser Trp

1 5 10 15

Tyr Arg Ser Gly Glu

20

<210> 36

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 37

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<---

Изобретение относится к способу осуществления терапии, и/или мониторинга терапии, и/или стратификации терапии у пациента с шоком и/или у пациента, впадающего в шок. В частности, способ включает получение образца от указанного пациента, определение уровня DPP3 в указанном образце, в котором уровень DPP3 в указанном образце является показателем того, требуется ли лечение анти-ADM антителом, или фрагментом анти-ADM антитела, или каркасом анти-ADM, не являющимся каркасом Ig. 26 з.п. ф-лы, 10 ил., 7 табл., 8 пр.

1. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, включающий:

• определение уровня дипептидилпептидазы 3 (DPP3) в образце жидкости организма указанного пациента, который выбирают из группы, включающей кровь, сыворотку и плазму,

• сравнение указанного уровня определенного DPP3 с предварительно определенным пороговым значением, и

• где уровень DPP3 в указанном образце ниже предварительно определенного порогового значения является показателем того, требуется ли лечение анти-ADM антителом, и

где указанное анти-ADM антитело связывается с N-концевой частью (аминокислоты 1-21) ADM: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID NO 14).

2. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по п. 1, включающий:

• определение уровня дипептидилпептидазы 3 (DPP3) в образце жидкости организма указанного пациента,

• сравнение указанного уровня определенного DPP3 с предварительно определенным пороговым значением и

• введение антиадреномедуллинового (ADM) антитела указанному пациенту, в котором указанного пациента лечат антиадреномедуллиновым (ADM) антителом, если указанный определенный уровень DPP3 ниже предварительно определенного порогового значения, и

где указанное анти-ADM антитело связывается с N-концевой частью (аминокислоты 1-21) ADM: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID NO 14).

3. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по п. 1 или 2, в котором указанный шок выбран из группы, включающей шок вследствие гиповолемии, кардиогенный шок, обструктивный шок и распределительный шок, в частности кардиогенный шок или септический шок.

4. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-3, где

• в случае кардиогенного шока у указанного пациента может быть острый коронарный синдром (например, острый инфаркт миокарда) или сердечная недостаточность (например, острая декомпенсированная сердечная недостаточность), миокардит, аритмия, кардиомиопатия, пороки клапанов сердца, расслоение аорты с острым аортальным стенозом, травматический разрыв хорды или массивная легочная эмболия, или

• в случае гиповолемического шока у указанного пациента может быть геморрагическое заболевание, включая желудочно-кишечное кровотечение, травму, сосудистую этиологию (например, разрыв аневризмы брюшной аорты, разрушение опухолью крупных кровеносных сосудов) и спонтанное кровотечение на фоне применения антикоагулянта, или негеморрагическое заболевание, включая рвоту, диарею, почечную недостаточность, потерю кожи/потерю чувствительности (например, ожоги, тепловой удар) или потерю третьей части интестиции в случае панкреатита, цирроз печени, кишечную непроходимость, или

• в случае обструктивного шока у указанного пациента может быть тампонада сердца, напряженный пневмоторакс, легочная эмболия или стеноз аорты, или

• в случае распределительного шока у указанного пациента может быть септический шок, нейрогенный шок, анафилактический шок или шок вследствие криза надпочечников.

5. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-4, в котором указанное предварительно определенное пороговое значение DPP3 в образце жидкости организма указанного субъекта составляет от 20 до 120 нг/мл, более предпочтительно от 30 до 80 нг/мл, еще более предпочтительно от 40 до 60 нг/мл, наиболее предпочтительно пороговое значение составляет 50 нг/мл.

6. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-5, в котором или уровень белка DPP3, и/или уровень активности DPP3 определяют и сравнивают с предварительно определенным пороговым значением.

7. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-6, где уровень DPP3 определяют путем контакта указанного образца жидкости организма с улавливающим связующим, которое специфически связывается с DPP3.

8. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-7, в котором указанное определение включает применение улавливающего связующего, которое специфически связывается с DPP3 полной длины, в котором указанное улавливающее связующее может быть выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или каркас молекулы, не являющийся каркасом IgG.

9. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-8, в котором количество белка DPP3 и/или активность DPP3 определяют в образце жидкости организма указанного субъекта, в котором указанное определение включает применение улавливающего связующего, которое специфически связывается с DPP3 полной длины, и указанное улавливающее связующее является антителом.

10. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-9, в котором количество белка DPP3 и/или активность DPP3 определяют в образце жидкости организма указанного субъекта, в котором указанное определение включает применение улавливающего связующего, которое специфически связывается с DPP3 полной длины, и указанное улавливающее связующее иммобилизовано на поверхности.

11. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-10, в котором количество белка DPP3 и/или активность DPP3 определяют в образце жидкости организма указанного субъекта и где указанная стадия отделения представляет стадию промывки, на которой удаляют ингредиенты образца, не связанные с указанным улавливающим связующим, от захваченной DPP3.

12. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-11, в котором способ определения активности DPP3 в образце жидкости организма указанного субъекта включает стадии:

• приведения указанного образца в контакт с улавливающим связующим, которое специфически связывается с DPP3 полной длины,

• отделения DPP3, связанной с указанным улавливающим связующим,

• добавления субстрата DPP3 к указанной отделенной DPP3,

• количественной оценки активности указанной DPP3 путем измерения и количественной оценки превращения субстрата DPP3.

13. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по пп. 1-12, в котором активность DPP3 определяют в образце жидкости организма указанного субъекта, а превращение субстрата DPP3 определяют методом, выбранным из группы, включающей: флуоресценцию флуорогенных субстратов (например, Arg-Arg-βNA, Arg-Arg-АМС), изменение цвета хромогенных субстратов, люминесценцию субстратов, связанных с аминолюциферином (анализ Promega Protease-GloTM), масс-спектрометрию, HPLC/FPLC (обращенно-фазовая хроматография, эксклюзионная хроматография), тонкослойную хроматографию, электрофорез в капиллярной зоне, гель-электрофорез с последующим окрашиванием для выявления активности (иммобилизованная, активная DPP3) или вестерн-блоттинг (продукты расщепления).

14. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-13, в котором активность DPP3 определяют в образце жидкости организма указанного субъекта и где указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей: ангиотензин II, III и IV, Leu-энкефалин, Met-энкефалин, эндоморфин 1 и 2, валорфин, β-казоморфин, динорфин, проктолин, АСТН и MSH или дипептиды, связанные с флуорофором, хромофором или аминолюциферином, где дипептид представляет собой Arg-Arg.

15. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-14, в котором активность DPP3 определяют в образце жидкости организма указанного субъекта и где указанный субстрат может быть выбран из группы, включающей дипептид, связанный с флуорофором, хромофором или аминолюциферином, где дипептид представляет собой Arg-Arg.

16. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-15, в котором указанный пациент дополнительно характеризуется уровнем ADM-NH₂ выше порогового значения.

17. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по п. 16, в котором указанное пороговое значение ADM-NH₂ в образце жидкости организма указанного пациента составляет от 40 до 100 пг/мл, более предпочтительно от 50 до 90 пг/мл, еще более предпочтительно от 60 до 80 пг/мл, наиболее предпочтительно указанное пороговое значение составляет 70 пг/мл.

18. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по пп. 16 и 17, в котором уровень ADM-NH₂ определяют путем контакта указанного образца жидкости организма с улавливающим связующим, которое специфически связывается с ADM-NH₂.

19. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-18, в котором уровень DPP3 и уровень ADM-NH₂ определяют в комбинации.

20. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по п. 19, в котором уровень DPP3 и уровень ADM-NH₂ определяют одновременно.

21. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по пп. 19 и 20, в котором уровень DPP3 и уровень ADM-NH₂ определяют с помощью прибора для оказания медицинской помощи в месте нахождения пациента.

22. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по п. 21, в котором указанным прибором для оказания медицинской помощи в месте нахождения пациента является микрофлюидный прибор.

23. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-22, в котором указанное анти-ADM антитело распознает и связывается с N-концом (аминокислота 1) ADM.

24. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-23, в котором указанное антитело не связывается с С-концевой частью ADM, имеющей аминокислотную последовательность 43-52 ADM: PRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO: 24).

25. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-24, в котором указанное антитело является моноклональным антителом, который связывается с ADM, где тяжелая цепь содержит последовательности:

CDR1: SEQ ID NO: 1

GYTFSRYW

CDR2: SEQ ID NO: 2

ILPGSGST

CDR3: SEQ ID NO: 3

TEGYEYDGFDY

и где легкая цепь содержит последовательности:

CDR1: SEQ ID NO: 4

QSIVYSNGNTY

CDR2:

RVS

CDR3: SEQ ID NO: 5

FQGSHIPYT.

26. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-25, в котором указанное антитело содержит последовательность, выбранную из группы, включающей в качестве области VH:

SEQ ID NO: 6 (AM-VH-C)

SEQ ID NO: 7 (AM-VH1)

SEQ ID NO: 8 (AM-VH2-E40)

SEQ ID NO: 9 (AM-VH3-T26-E55)

SEQ ID NO: 10 (AM-VH4-T26-E40-E55)

и содержит последовательность, выбранную из группы, включающей следующую последовательность в качестве области VL:

SEQ ID NO: 11 (AM-VL-C)

SEQ ID NO: 12 (AM-VL1)

SEQ ID NO: 13 (AM-VL2-E40)

27. Способ терапевтического мониторинга и/или стратификации пациента с шоком и/или пациента, впадающего в шок, по любому из пп. 1-25, в котором указанное антитело содержит следующую последовательность в качестве тяжелой цепи:

SEQ ID NO: 32

или последовательность, которая больше чем на 95% идентична ей и содержит следующую последовательность в качестве легкой цепи:

SEQ ID NO: 33

или последовательность, которая больше чем на 95% идентична ей, в котором тяжелая цепь содержит следующие последовательности:

CDR1: SEQ ID NO: 1

GYTFSRYW

CDR2: SEQ ID NO: 2

ILPGSGST

CDR3: SEQ ID NO: 3

TEGYEYDGFDY

и где легкая цепь содержит последовательности:

CDR1: SEQ ID NO: 4

QSIVYSNGNTY

CDR2: RVS

CDR3: SEQ ID NO: 5

FQGSHIPYT.