Покрытие для электрода устройства и устройство для количественной оценки содержания мочевины в физиологических жидкостях Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/58 G01N27/06 G01N27/327 G01N33/493 H01M4/02 

[01] Область техники

[02] Группа изобретений относится к области биотехнологии и медицины, а именно к покрытию для электрода, используемого в биосенсорных аналитических устройствах (биосенсорах) и конструкциям указанных устройств, и может быть использована для количественной оценки содержания мочевины в физиологических жидкостях, в частности слюне и моче.

[03] Уровень техники

[04] В медицинской практике для количественной оценки содержания мочевины в сыворотке (плазме) крови и моче человека применяются следующие колориметрические энзиматические анализаторы: «Мочевина-ольвекс» («Ольвекс диагностикум», Россия), «Мочевина колор абрис+» («НПФ АБРИС+», Россия), биохимический анализатор Stat Fax 1904+ («Awareness Technology)), США), автоматический биохимический анализатор «BioMajesty JCA-BM6070/C» («JEOL Ltd», Япония). Недостатками указанных анализаторов является большой расход реагентов в частности фермента уреазы, сложность осуществления количественного анализа для проведения в домашних условиях, невозможность миниатюризации аналитической системы.

[05] Более доступными для осуществления количественных анализов в домашних условиях являются анализаторы в основе которых реализуется принцип амперомет-рического ферментного биосенсора. Например, многофункциональный глюкометр «3 in 1 Meawsom» («Speedgluc», США) позволяет использовать тест-полоски на мочевую кислоту, холестерин и глюкозу для осуществления количественного определения указанных биомаркеров в крови человека. Ввиду того, что фермент уреаза является гидролазой для формирования тест-полоски необходимо провести модификацию таким образом, чтобы обеспечить наиболее быстрое детектирование аммиака, образующегося в ходе ферментативного гидролиза мочевины.

[06] Известны покрытие и модель устройства для количественной оценки содержания мочевины в целях медицинской диагностики, которые содержат платиновый электрод, рабочая поверхность которого покрыта мембраной из сополимера акрилонит-рила-метилметакрилата-натрий винилсульфоната, слоем электроосажденного родия и слоем иммобилизованной в поперечно-сшитый бычий сывороточный альбумин уреазы [Velichkova Y., Ivanov Y., Marinov I., Ramesh R., Kamini N., Dimcheva N., Horozova E., Godjevargova T. Amperometric electrode for determination of urea using electrodeposited rhodium and immobilized urease //Journal of Molecular Catalysis В: Enzymatic. 2011. V. 69.I. 3-4. PP. 168-175.]. Диапазон определяемых концентраций мочевины составляет 0,1 - 2,67 мМ. Относительное стандартное отклонение аналитического сигнала, формируемого устройством при проведении семи последовательных измерений одной и той же концентрации мочевины (2 мМ) составляет 5,1%. Долговременная стабильность составляет 27 суток, в течение которых ответ биосенсора составляет 86,8% от первоначального сигнала. Время измерения одной пробы составляет 15 секунд.

[07] Еще одним примером устройства для экспресс-оценки мочевины является лабораторная модель, которая содержит графитовый дисковый электрод, рабочая поверхность, которого модифицирована полианилином и многостенными нанотрубками, ферментом уреазы [Meibodi A. S. Е., Haghjoo S. Amperometric urea biosensor based on covalently immobilized urease on an electrochemically polymerized film of polyaniline containing MWCNTs //Synthetic Metals. 2014. V. 194. PP. 1-6]. Диапазон определяемых концентраций мочевины составляет 0,07 - 10 мМ. Относительное стандартное отклонение аналитического сигнала, формируемого устройством при проведении пяти последовательных измерений одной и той же концентрации мочевины (0,6 мМ) составляет 2,6%. Долговременная стабильность составляет 15 суток, в течение которых ответ биосенсора составляет не менее 50% от первоначального. Время измерения одной пробы составляет 50 секунд.

[08] Существенным недостатком указанных устройств является узкий диапазон определяемых концентраций мочевины, позволяющий проводить мониторинг мочевины в крови, где концентрация указанного биомаркера в состоянии покоя в норме составляет 2,5-9,2 мМ [Adeyomoye О. I, Akintayo C.O., Omotuyi К.Р., Adewumi A.N. The biological roles of urea: A review of preclinical studies //Indian journal of nephrology. - 2022. -T. 32. -№. 6. - C. 539-545], при этом концентрация мочевины в моче значительно выше и в норме составляет 150-500 мМ [Adeyomoye О. I, Akintayo C.O., Omotuyi К.Р., Adewumi A.N. The biological roles of urea: A review of preclinical studies //Indian journal of nephrology. - 2022. - T. 32. - №. 6. - C. 539-545].

[09] Ближайшим аналогом заявленной группы изобретений являются покрытие для электрода устройства и устройство для количественной оценки содержания мочевины в физиологических жидкостях, известные из источника [Лаврова Т.В. (Научныйруководитель - Харькова А.С). Формирование биосенсора на основе уреазы, иммобилизованной в композит «бычий сывороточный альбумин-сафранин-фуллерен» для определения мочевины //XIX Региональная магистерская научная конференция (20-31 мая 2024 года): сб. докладов]. Устройство содержит графито-пастовый электрод, рабочая поверхность которого покрыта последовательно расположенными слоями углеродного нанома-териала в виде фуллерена, редокс-активного полимера в виде бычьего сывороточного альбумина, модифицированного сафранином, и фермента уреазы, закрытыми диализной мембраной и закрепленными на поверхности электрода пластиковым кольцом. Данное устройство позволяет определить содержание мочевины в диапазоне концентраций от 68 до 410 мМ. Относительное стандартное отклонение пятнадцати аналитических сигналов, полученных при последовательных измерениях одной и той же концентрации мочевины, составляет 10,5%. Долговременная стабильность аналитической системы, то есть времени, в течение которого ответ биосенсора составляет не менее 50% от первоначального, составляет 4 суток. Время измерения одной пробы составляет 5 минут. Основными недостатками описанных выше устройства и покрытия являются низкий показатель долговременной стабильности, а также высокое стандартное отклонение проводимых измерений.

[010] Таким образом, технической проблемой, на решение которой направлена заявленная группа изобретений является недостаточно высокие технические характеристики известных покрытий для электрода устройств и конструкции устройств для количественной оценки содержания мочевины в физиологических жидкостях, в частности слюне и моче.

[011] Раскрытие сущности изобретения

[012] Техническим результатом группы изобретений является расширение диапазона определяемых концентраций мочевины в образцах физиологических жидкостей (слюне и моче), повышение стабильности устройства для количественной оценки содержания мочевины в физиологических жидкостях за счет снижения относительного стандартного отклонения пятнадцати аналитических сигналов, полученных при последовательных измерениях одной и той же концентрации мочевины, до 7,2%, а также увеличение долговременной стабильности устройства до 15 суток.

[013] Под долговременной стабильностью устройства следует понимать период времени, в течение которого ответ биосенсора составляет не менее 50% от первоначального.

[014] Указанный технический результат достигается в покрытии для электрода устройства для количественной оценки содержания мочевины в физиологических жидкостях, содержащем последовательно расположенные слои: углеродного наноматериала, полимерного материала на основе редокс-активного полимера и фермента уреазы, где использованы в качестве редокс-активного полимера - электрополимеризованный поли-азур, в качестве углеродного наноматериала - одностенные углеродные нанотрубки.

[015] В частном случае реализации заявленного покрытия:

[016] - слой одностенных углеродных нанотрубок получен путем нанесения на поверхность электрода суспензии одностенных углеродных нанотрубок, содержащей 1,0-2,0 мас. % одностенных углеродных нанотрубок;

[017] - слой полимерного материала на основе электрополимеризованного поли-азура получен методом электрохимической полимеризации натрий-калиевого фосфатного буферного раствора, содержащего 0,2-0,3 мас. % азур I и 12,0-13,0 мас. % сульфата натрия (Na₂SO₄) и последующего высушивания;

[018] - слой фермента уреазы получен путем нанесения на слой полимерного материала на основе электрополимеризованного полиазура раствора фермента уреазы, содержащего 0,2-0,7 мас. % фермента уреазы, и последующего высушивания.

[019] Указанный технический результат достигается также в устройстве для количественной оценки содержания мочевины в физиологических жидкостях за счет того, что оно содержит графито-пастовый электрод, поверхность которого модифицирована покрытием в соответствии с заявленным изобретением, закрепленным диализной мембраной при помощи пластикового кольца.

[020] Одним из факторов, повышающих стабильность ферментных систем в составе амперометрических биосенсоров, является сохранение каталитической активности фермента и сохранение стабильности каждого компонента аналитических систем. Увеличение стабильности заявленного устройства связано с использованием покрытия, содержащего слой углеродного наноматериала в виде одностенных углеродных нанотрубок вместо фуллеренов, используемых в ближайшем аналоге, поскольку одностенные углеродные нанотрубки обладают более высокой механической прочностью, чем фулле-рены, что повышает долговременную стабильность всей аналитической системы [Devi N. et al. Carbon-based nanomaterials: carbon nanotube, fullerene, and carbon dots //Nano-materials: Advances and Applications. - Singapore: Springer Nature Singapore, 2023. PP. 27-57].

[021] Также заявленные покрытие для электрода и устройство содержат полимерный материал на основе электрополимеризованного полиазура, в то время как покрытие в соответствии с ближайшим аналогом содержит бычий сывороточный альбумин, модифицированный сафранином. При формировании полимерного материала на основе модифицированного сафранином бычьего сывороточного альбумина используют глутаровый альдегид в качестве сшивающего компонента, который способствует изменению конформации фермента уреазы и тем самым снижает его каталитическую активность, что снижает долговременную стабильность устройства [Diaz-Gonzalez J., Arriaga L. G, Casanova-Moreno J. R. Probing the influence of crosslinkers on the properties, response, and degradation of enzymatic hydrogels for electrochemical glucose biosensing through fluorescence analysis //RSC advances. 2024. V. 14.I. 14. PP. 9514-9528].

[022] Краткое описание чертежей

[023] Группа изобретений поясняется фигурами, где:

На фигуре 1 схематично показан общий вид заявленного устройства и покрытия для электрода устройства,

На фигуре 2 показан регистрируемый сигнал от заявленного устройства в виде зависимости силы тока (нА) от времени (с),

На фигуре 3 показана градуировочная зависимость заявленного устройства,

На фигуре 4 показана химическая структура заявленного покрытия для электрода.

[024] Элементы обозначены на фигурах следующими позициями:

1 графито-пастовый электрод,

2 слой одностенных углеродных нанотрубок,

3 - слой полимерного материала на основе электрополимеризованного полиазура,

4 - слой фермента уреазы,

5 диализная мембрана,

6 пластиковое кольцо.

[025] Осуществление изобретения

[026] Заявленное покрытие для электрода устройства для количественной оценки содержания мочевины в физиологических жидкостях содержит последовательно расположенные следующие слои: слой углеродного наноматериала в виде одностенных углеродных нанотрубок (2), слой полимерного материала (3) на основе электрополимеризованного полиазура, а также слой фермента уреазы (4).

[027] Слой одностенных углеродных нанотрубок (2) получен путем нанесения на поверхность электрода суспензии одностенных углеродных нанотрубок, которая содержит, преимущественно, 1,0-2,0 мас. % одностенных углеродных нанотрубок. Слой полимерного материала (3) на основе электрополимеризованного полиазура получен методом электрохимической полимеризации натрий-калиевого фосфатного буферного раствора, содержащего, преимущественно, 0,2-0,3 мас. % азур I и 12,0-13,0 мас. % сульфата натрия (Na₂SO₄) и последующего высушивания полученного слоя. Слой фермента уреазы (4) получен путем нанесения на слой полимерного материала (3) раствора фермента уреазы, содержащем, преимущественно, 0,2-0,7 мас. % фермента уреазы, и последующего высушивания полученного слоя. Толщина описанных выше слоев заявленного покрытия для электрода устройства может составлять от 0,5 до 1,0 мм.

[028] Заявленное устройство включает графито-пастовый электрод (1), рабочая поверхность которого модифицирована (покрыта) описанным выше покрытием, соответствующим заявленному изобретению, закрепленным диализной мембраной (5) при помощи пластикового кольца (6).

[029] Ниже представлены примеры изготовления заявленного устройства и покрытия для электрода устройства.

[030] Пример 1. Для формирования графито-пастового электрода (1) готовят графитовую пасту, которая может содержать следующие компоненты: графитовая пудра -100 мг, минеральное масло - 40 мкл. Далее графитовой пастой заполняют пластмассовый корпус графито-пастового электрода (1), после чего в заполненный графитовой пастой корпус погружают платиновый проводник. Затем поверхность указанного электрода (1) покрывают заявленным покрытием.

[031] Для получения покрытия в соответствии с заявленным изобретением поверхность графитовой пасты графито-пастового электрода (1) покрывают суспензией одностенных углеродных нанотрубок (2) в количестве 10 мкл, сформированной на основе 0,33 г дисперсии 1,0 мас. % одностенных углеродных нанотрубок и 500 мкл деионизаци-онной воды. Далее на полученный слой одностенных углеродных нанотрубок (2) наносят слой полимерного материала (3) на основе электрополимеризованного полиазура. Для формирования указанного слоя (3) методом электрохимической полимеризации графито-пастовый электрод (1) помещают в измерительную кювету объемом 30 мл с 0,05 М натрий-калиевым фосфатным буферным раствором (рН=5,6), содержащим 0,2 мас. % азур I и 12,0 мас. % сульфата натрия (Na₂SO₄) и подключают к потенциостату. Далее посредством циклического изменения приложенного потенциала в диапазоне от -0,2 до +1,3 В относительно хлоридсеребряного электрода сравнения при скорости сканирования 60 мВ/с и перемешивании магнитной мешалкой в течение 60 циклов образуется равномерный слой полимерного материала (3) на основе электрополимеризованного полиазура. После чего графито-пастовый электрод (1) промывают натрий-калиевым фосфатным буферным раствором (рН=6,8) и высушивают. На высушенную поверхность графито-пастового электрода (1) наносят раствор фермента уреазы (удельная активность 200 Е/мг) в количестве 10 мкл с концентрацией фермента уреазы 0,2 мас. % и оставляют до полного высыхания. Полученное покрытие закрепляют на графито-пастовом электроде (1) диализной мембраной (5) с помощью пластикового кольца (6).

[032] Пример 2. Формирование графитово-пастового электрода (1) осуществляют аналогично примеру 1. Для получения покрытия в соответствии с заявленным изобретением поверхность графитовой пасты графито-пастового электрода (1) покрывают суспензией одностенных углеродных нанотрубок (2) в количестве 10 мкл, сформированной на основе 0,25 г дисперсии 1,5 мас. % одностенных углеродных нанотрубок и 16 мкл деионизационной воды. Далее на полученный слой одностенных углеродных нанотрубок (2) наносят слой полимерного материала (3) на основе электрополимеризованного полиазура. Для формирования указанного слоя (3) методом электрохимической полимеризации графито-пастовый электрод (1) помещают в измерительную кювету объемом 30 мл с 0,05 М натрий-калиевым фосфатным буферным раствором (рН=5,6), содержащим 0,25 мас. % азур I и 12,5 мас. % сульфата натрия (Na₂SO₄) и подключают к потенциостату. Далее посредством циклического изменения приложенного потенциала в диапазоне от -0,2 до +1,3 В относительно хлоридсеребряного электрода сравнения при скорости сканирования 60 мВ/с и перемешивании магнитной мешалкой в течение 60 циклов образуется равномерный слой полимерного материала (3) на основе электрополимеризованного полиазура. После чего графито-пастовый электрод (1) промывают натрий-калиевым фосфатным буферным раствором (рН=6,8) и высушивают. На высушенную поверхность графито-пастового электрода (1) наносят раствор фермента уреазы (удельная активность 200 Е/мг) в количестве 10 мкл с концентрацией фермента уреазы 0,5 мас. % и оставляют до полного высыхания. Полученное покрытие закрепляют на графито-пастовом электроде (1) диализной мембраной (5) с помощью пластикового кольца (6).

[033] Пример 3. Формирование графитово-пастового электрода (1) осуществляют аналогично примеру 1. Для получения покрытия в соответствии с заявленным изобретением поверхность графитовой пасты графито-пастового электрода (1) покрывают суспензией одностенных углеродных нанотрубок (2) в количестве 10 мкл, сформированной на основе 0,25 г дисперсии 2,0 мас. % одностенных углеродных нанотрубок и 6 мкл деионизационной воды. Далее на полученный слой одностенных углеродных нанотрубок (2) наносят слой полимерного материала (3) на основе электрополимеризованного полиазура. Для формирования указанного слоя (3) методом электрохимической полимеризации графито-пастовый электрод (1) помещают в измерительную кювету объемом 30 мл с 0,05 М натрий-калиевым фосфатным буферным раствором (рН=5,6), содержащим 0,3 мас. % азур I и 13,0 мас. % сульфата натрия (Na₂SO₄) и подключают к потен-циостату. Далее посредством циклического изменения приложенного потенциала в диапазоне от -0,2 до +1,3 В относительно хлоридсеребряного электрода сравнения при скорости сканирования 60 мВ/с и перемешивании магнитной мешалкой в течение 60 циклов образуется равномерный слой полимерного материала (3) на основе электрополимеризованного полиазура. После чего графито-пастовый электрод (1) промывают натрий-калиевым фосфатным буферным раствором (рН=6,8) и высушивают.На высушенную поверхность графито-пастового электрода (1) наносят раствор фермента уреазы (удельная активность 200 Е/мг) в количестве 10 мкл с концентрацией фермента уреазы 0,7 мас. % и оставляют до полного высыхания. Полученное покрытие закрепляют на графито-пастовом электроде (1) диализной мембраной (5) с помощью пластикового кольца (6).

[034] Принцип работы заявленной группы изобретений заключается в следующем.

[035] Для измерений дополнительно используют потенциостат, хлорсеребряный электрод сравнения, измерительную кювету объемом 5 мл, магнитную мешалку и портативный компьютер. В измерительную кювету погружают хлорсеребряный электрод и графито-пастовый электрод (1), таким образом, чтобы калий-натрий фосфатный буферный раствор контактировал с иммобилизованным биоматериалом слоем фермента уреазой (4).

[036] Устройство посредством платинового проводника подключают к потен-циостату, регистрирующему зависимость силы тока от времени. К потенциостату подключают хлорсеребряный электрод. Измерения проводят при постоянном потенциале +0,275 В и непрерывном перемешивании раствора с помощью магнитной мешалки (300 об/мин) при комнатной температуре. После установления стабильного уровня тока в измерительную кювету микропипеткой вводят необходимое количество раствора анализируемого вещества (образец слюны или мочи). После каждого измерения производят промывку измерительной кюветы калий-натрий фосфатным буферным раствором (рН=6,8).

Концентрацию мочевины рассчитывают по амплитуде силы тока (ответ сенсора, ΔI, мкА) по предварительно построенной с помощью стандартного раствора мочевины калибровочной кривой.

[037] Примеры результатов расчета концентрации мочевины в физиологических жидкостях с помощью заявленной группы изобретений в соответствии с вышеприведенными примерами 1-3 приведены в таблице 1.

[039] Основные характеристики заявленного устройства для количественной оценки содержания мочевины и устройства в соответствии с ближайшим аналогом приведены в таблице 2.

[041] Таким образом, заявленные покрытие для электрода устройства и устройство для количественной оценки содержания мочевины в физиологических жидкостях позволяет проводить анализ мочевины в диапазоне концентраций от 0,6 до 500 мМ, при этом время одного измерения составляет 4 минуты, относительное стандартное отклонение пятнадцати аналитических сигналов, полученных при последовательных измерениях одной и той же концентрации мочевины, составляет 7,2%, а долговременная стабильность устройства составляет 15 суток.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, а именно к покрытию для электрода, используемого в биосенсорных аналитических устройствах, и конструкциям указанных устройств, и может быть использована для количественной оценки содержания мочевины в физиологических жидкостях, в частности слюне и моче. Покрытие для электрода устройства для количественной оценки содержания мочевины в физиологических жидкостях содержит последовательно расположенные слои: углеродного наноматериала, полимерного материала на основе редокс-активного полимера и фермента уреазы, при этом использованы в качестве редокс-активного полимера электрополимеризованный полиазур, в качестве углеродного наноматериала - одностенные углеродные нанотрубки. Устройство для количественной оценки содержания мочевины в физиологических жидкостях содержит графито-пастовый электрод, поверхность которого модифицирована покрытием в соответствии с заявленным изобретением, закрепленным диализной мембраной при помощи пластикового кольца. Изобретение направлено на расширение диапазона определяемых концентраций мочевины в образцах физиологических жидкостей, повышение стабильности устройства для количественной оценки содержания мочевины в физиологических жидкостях за счет снижения относительного стандартного отклонения пятнадцати аналитических сигналов, полученных при последовательных измерениях одной и той же концентрации мочевины, до 7,2%, а также увеличение долговременной стабильности устройства до 15 суток. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Покрытие для графито-пастового электрода устройства для количественной оценки содержания мочевины в слюне и моче, содержащее последовательно расположенные слои: углеродного наноматериала, полимерного материала (3) на основе редокс-активного полимера и фермента уреазы (4), отличающееся тем, что использованы в качестве редокс-активного полимера электрополимеризованный полиазур, в качестве углеродного наноматериала - одностенные углеродные нанотрубки (2).

2. Покрытие для графито-пастового электрода устройства для количественной оценки содержания мочевины в слюне и моче по п. 1, отличающееся тем, что слой одностенных углеродных нанотрубок (2) получен путем нанесения на поверхность электрода суспензии одностенных углеродных нанотрубок, содержащей 1,0-2,0 мас. % одностенных углеродных нанотрубок.

3. Покрытие для графито-пастового электрода устройства для количественной оценки содержания мочевины в слюне и моче по п. 1, отличающееся тем, что слой полимерного материала (3) на основе электрополимеризованного полиазура получен методом электрохимической полимеризации натрий-калиевого фосфатного буферного раствора, содержащего 0,2-0,3 мас. % азура I и 12,0-13,0 мас. % сульфата натрия (Na₂SO₄), и последующего высушивания.

4. Покрытие для графито-пастового электрода устройства для количественной оценки содержания мочевины в слюне и моче по п. 1, отличающееся тем, что слой фермента уреазы (4) получен путем нанесения на слой полимерного материала (3) на основе электрополимеризованного полиазура раствора фермента уреазы, содержащего 0,2-0,7 мас. % фермента уреазы, и последующего высушивания.

5. Устройство для количественной оценки содержания мочевины в слюне и моче, представляющее собой графито-пастовый электрод (1), поверхность которого модифицирована покрытием по любому из пп. 1-4, закрепленным диализной мембраной (5) при помощи пластикового кольца (6).