Устройство для определения индекса летучих фенолов в воде Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/02 G01N27/327 G01N33/18 

[01] Область техники

[02] Изобретение относится к области экологического мониторинга окружающей среды, а именно к устройствам для определения индекса летучих фенолов в воде и может быть использовано для оценки состояния поверхностных вод и контроля процессов очистки сточной воды от летучих фенолов.

[03] Уровень техники

[04] Фенольный индекс определяется количеством летучих фенолов (в мкг/дм³). Продолжительность стандартного метода составляет 6 часов (ПНДФ 14.1:2.105-97. Методика выполнения измерений массовой концентрации летучих фенолов в природных и очищенных сточных водах фотометрическим методом после отгонки с водяным паром. - М.: 1997. - 19 с), поэтому растет потребность в разработке экспресс-анализаторов.

[05] Известно устройство для экспресс-определения летучих фенолов, которое представляет собой биосенсор для определения фенола и катехола, включающий кислородный электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе клетки актинобактерий Rhodococcus gordoniae ВКМ Ас-2845Д. (Микроорганизмы из очистных сооружений как основа для определения фенола / Т. Н. Куеичкина, Е. Н. Капаруллина, Н. В. Доронина [и др.] // Экология родного края: проблемы и пути их решения: Материалы XV Всероссийской с международным участием научно-практической конференции, Киров, 18 мая 2020 года. Том Книга 2. - Киров: Вятский государственный университет, 2020. - С.76-81). Устройство содержит физико-химический преобразователь на основе кислородного электрода Кларка и иммобилизованный биоматериал - бактерии Rhodococcus gordoniae Leto, иммобилизованные на хроматографической стеклобумаге, нейлоновую сетку. Диапазон определяемых концентраций фенола составил от 2,35 мг/дм³ до 47 мг/дм³, субстратная специфичность биосенсора на основе штамма Rhodococcus gordoniae Leto составляет 8 субстратов помимо фенола. Существенным недостатком устройства является высокая нижняя граница определяемых концентрация (2,35 мг/дм³), не позволяющая проводить анализ проб с содержанием фенола на уровне предельно-допустимых концентраций [СанПиН 2.1.4.1074-01. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества].

[06] Наиболее близким аналогом изобретения является устройство для экспресс-мониторинга индекса летучих фенолов, раскрытое в статье Перчиков, Р. П. Исследование метрологических характеристик рецепторных систем на основе медиатора ферроцена и бактерий Pseudomonas putida BS394(Pbs216) и Rhodococcus pyridinivorans SAP для определения фенолъного индекса природных вод//Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. - 2023. - Т. 19, №2. - С.32-38. Устройство содержит пластмассовый трубчатый корпус, в его полости располагается платиновый проводник, погруженный в графитовую пасту на основе минерального масла и графитовой пудры, и замешанного в нее ферроцена, рабочая поверхность покрыта слоем иммобилизованных адаптированных к фенолу бактерий Pseoudomonas putida BS394 (pBS216), которые зафиксированы диализной мембраной с помощью пластикового кольца. Бактерии Pseudomonas putida BS394 являются носителем нафталиновой плазмиды (pBS216), которая обеспечивает процесс биодеградации нафталина, оказывая детерминирующие окисление этого соединения до метаболитов цикла Кребса и оказывает положительное влияние на процесс окисления ароматических соединений. Устройство позволяет определять фенол в концентрациях от 0,5 мг/дм³, время анализа одной пробы составляет 5 минут, долговременная стабильность 2 суток, коэффициент чувствительности, составляет (0,05±0,01)⋅10^-3 мкА дм³/мг, число регистрируемых субстратов 16, включая легкоокисляемые субстраты, не входящие в фенольный индекс. Замена физико-химического преобразователя с кислородного электрода на модифицированный графитопастовый электрод позволяет работать при более низких потенциалах, определяемых свойствами электроактивных частиц - ферроцена. Использование иммобилизованных адаптированных к фенолу бактерий Pseudomonas putida BS394 (pBS216) позволяет определять более низкие значения индекса летучих фенолов.

[07] Однако технической проблемой является большое количество легкоокисляемых субстратов, не входящих в фенольный индекс и недостаточно высокий коэффициента чувствительности устройства

[08] Раскрытие сущности изобретения

[09] Техническим результатом изобретения является увеличение долговременной стабильности, сужение спектра окисляемых субстратов, не входящего в фенольный индекс, и увеличение коэффициента чувствительности устройства.

[010] Указанный технический результат достигается в устройстве для определения индекса летучих фенолов в воде, за счет того, что оно содержит измерительную кювету, электрод сравнения и рабочий электрод, выполненный в виде графитопастового электрода, поверхность которого модифицирована покрытием, удерживаемым диализной мембраной. При этом покрытие включает: редокс-слой, выполненный из композитного полимера, содержащего бычий сывороточный альбумин, ковалентно сшитый с ферроценкарбоксальдегидом, и включения углеродных нанотрубок; и слой фермента лакказы, нанесенный на редокс-слой.

[011] Предусмотрены частные варианты реализации устройства, согласно которым:

[012] - рабочий графитопастовый электрод включает: трубчатый корпус; размещенную в корпусе графитовую пасту, которая содержит графитовую пудру и минеральное масло; и погруженный в графитовую пасту металлический проводник;

[013] - диализная мембрана зафиксирована на корпусе посредством фиксирующего кольца;

[014] - устройство дополнительно включает мешалку для измерительной кюветы;

[015] - в качестве электрода сравнения использован хлоридсеребряный электрод.

[016] Указанный технический результат достигается также в покрытии рабочего электрода устройства для определения индекса летучих фенолов в воде, за счет того, что оно содержит: редокс-слой, выполненный из композитного полимера, содержащего бычий сывороточный альбумин, ковалентно сшитый с ферроценкарбоксальдегидом, и включения углеродных нанотрубок; и слой фермента лакказы, нанесенный на редокс-слой. В частном случае реализации бычий сывороточный альбумин, ковалентно сшитый с ферроценкарбоксальдегидом (БСА-ФЦ), и углеродные нанотрубки, использованы в соотношении на 3,5 мг БСА-ФЦ 0,025 мг углеродных нанотрубок.

[017] Достижение технического результата обусловлено в большей мере за счет конфигурации покрытия рабочего электрода. Увеличение коэффициента чувствительности, с одной стороны, связано с улучшением электронной проводимости за счет введение в состав редокс-слоя углеродных нанотрубок. Регистрируемый аналитический сигнал приобретает более высокие значения, и, таким образом, повышается чувствительность определения индекса летучих фенолов. С другой стороны, за счет введения в состав редокс-слоя модифицированного ферроценкарбоксальдегидом бычьего сывороточного альбумина повышается эффективность электронного переноса: ковалентносвязанный ферроцен непосредственно на более близком расстоянии может взаимодействовать с ферментом и, таким образом, ускоряет перенос электронов, образующихся в результате протекания ферментативных реакций. Увеличение долговременной стабильности обусловлено использованием в составе редокс-слоя модифицированного ферроценкарбоксальдегидом бычьего сывороточного альбумина, который является биосовместимым для ферментов и микроорганизмов. Ковалентное связывание медиатора предотвращает вымывание редокс-частиц ферроцена. Изменение числа окисляемых субстратов связано с изменением биорецепторного элемента на фермент в виде лакказы.

[018] Краткое описание чертежей

[019] Изобретение поясняется фигурами, где:

[020] На фигуре 1 показана общая схема устройства,

[021] На фигуре 2 показана схема рабочего электрода,

[022] На фигуре 3 показана схема нижней части рабочего электрода.

[023] На фигуре 4 показана калибровочная кривая устройства.

[024] Элементы обозначены на фигурах следующими позициями:

1 рабочий электрод,

2 электрод сравнения,

3 - измерительная кювета,

4 - мешалка,

5 - корпус рабочего электрода,

6 - металлический проводник,

7 - графитовая паста,

8 - покрытие,

9 - редокс-слой,

10 - слой фермента,

11 диализная мембрана,

12 фиксирующее кольцо

[025] Осуществление изобретения

[026] Заявленное устройство включает рабочий электрод (1) и электрод сравнения (2), размещаемые в измерительной кювете (3), и, при необходимости, магнитную мешалку (4) для кюветы.

[027] Рабочий электрод (1) выполнен в виде графитопастового электрода, содержащего пластмассовый трубчатый корпус (5), графитовую пасту (7) из графитовой пудры и минерального масла, размещенную в нижней части корпуса (5), и металлический (платиновый) проводник (6) погруженный одним концом в графитовую пасту (7), а другим концом выходящий из верхней части корпуса. На нижнюю часть рабочего электрода (1) нанесено покрытие (8), содержащее редокс-слой (9) из композитного материала на основе модифицированного ферроценкарбоксальдегидом бычьего сывороточного альбумина (матрица) и углеродных нанотрубок (включения) и слой фермента (10) в виде лакказы. Покрытие зафиксировано на корпусе (1) диализной мембраной (11), надетой на нижний конец корпуса (1), и фиксирующего кольца (12), надетого на конец корпуса поверх мембаны.

[028] Электрод сравнения (2), предпочтительно, представляет собой хлорсеребряный электрод.

[029] Рабочий электрод (1) собирают следующим образом. Готовят графитовую пасту (7) следующего состава: графитовая пудра - 100 мг, минеральное масло - 40 мкл. Графитовой пастой (7) заполняют нижнюю часть трубчатого корпуса (1)5. Металлический проводник (6) погружают в графитовую пасту. Затем после высыхании пасты нижнюю поверхность полученного рабочего электрода (1) зачищают и модифицируют покрытием (8). Для нанесения редокс-слоя (9) поверхность электрода покрывают 10 мкл суспензии углеродных нанотрубок 250 мг/мл. Модифицированный ферроценкарбоксальдегидом бычий сывороточный альбумин массой 0,0035 г (10 мкл) растворяют в 50 мкл фосфатного буфера (рН=6,8) и добавляют 7,5 мкл глутарового альдегида и через 10 секунд добавляют к нанесенному слою 10 мкл 2,5%-ной суспензии одностенных углеродных нанотрубок. Полученный композитный редокс-слой (9) высушивают при комнатной температуре с получением соотношения компонентов - на 3,5 мг БСА-ФЦ - 0,025 мг углеродных нанотрубок. Поверх редокс-слоя (9) наносят раствор фермента лакказы с общим титром 31,9 Ед/см³ 10 мкл, высушивают при комнатной температуре с получением слоя фермента (10). Затем на нижний конец корпуса (1) надевают диализную мембрану (11) и закрепляют ее фиксирующим кольцом (12).

[030] Для устройства для определения индекса летучих фенолов в воде используют измерительную кювету (3) объемом 5 мл, содержащую калий-натрий фосфатный буферный раствор (рН=6,8). В измерительную кювету (3) погружают электрод сравнения (2) и рабочий электрод (1) таким образом, чтобы калий-натрий фосфатный буферный раствор контактировал с иммобилизованным биоматериалом в виде слоя фермента (10).

[031] Устройство посредством металлического проводника (6) подключают к гальванопотенциостату «Corrtest», регистрирующего зависимость силы тока от времени.

К потенциостату подключают электрод сравнения (2). Измерения проводят при постоянном потенциале +450 мВ и непрерывном перемешивании раствора с помощью магнитной мешалки (300 об/мин) при комнатной температуре.

[032] После установления стабильного уровня тока в измерительную кювету микропипеткой вводят необходимое количество раствора анализируемого вещества. После каждого измерения производят промывку измерительной кюветы калий-натрий-фосфатным буферным раствором. Скорость окисления фенола и его гомологов рассчитывают по амплитуде силы тока (ответ сенсора, ΔI, мкА) и определяют значение индекса летучих фенолов по предварительно построенной с помощью стандартного раствора фенола калибровочной кривой (см. фиг.4).

[033] В таблице показаны сравнительные данные характеристик заявленного устройства и устройства согласно ближайшему аналогу

[034] Таблица. Сравнительные характеристики устройств.

[035] Заявляемое устройство обеспечивает увеличение долговременной стабильности с 2 суток (ближайший аналог) до 11 суток, сужение спектра окисляемых субстратов не входящего в фенольный индекс с 15 веществ (ближайший аналог) до 0, увеличение коэффициента чувствительности с (0,05±0,01)⋅10^-3 мкА⋅дм³/мг (ближайший аналог) до (2,1±0,1)⋅10^-3 мкА⋅дм³/мг.

[036] Таким образом, устройство для определения индекса летучих фенолов в водных средах не требует привлечения высококвалифицированного персонала и позволяет определять фенольный индекс в течение (долговременная стабильность) 11 суток, при этом устройство не генерирует ложно-положительные сигналы при введении легкоокисляемых субстратов, таких как: ксилоза, галактоза, манноза, глюкоза, сахароза, лактоза, метанол, бутанол-1, 2-метилпропанол-2, 2-метилпропанол-1, 3 - метил бутанол-1, этанол, аргинин, бензоат калия, ДДС (додецилсульфат) натрия.

[037] Нижняя граница определяемых концентраций устройства для определения летучих алкилфенолов в водных средах составляет 4,2 мг/дм³, что позволяет проводить мониторинг качества сточных вод централизованных систем водоотведения, для которых установлена предельно-допустимая концентрация суммы фенолов - 5 мг/дм³ (Постановление Правительства РФ от 29.07.2013 N644 (ред. от 30.11.2021) "Об утверждении Правил холодного водоснабжения и водоотведения и о внесении изменений в некоторые акты Правительства Российской Федерации". Приложение №5 к Правилам холодного водоснабжения и водоотведения).

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены устройство для определения индекса летучих фенолов в воде, содержащее измерительную кювету, электрод сравнения и рабочий электрод, выполненный в виде графитопастового электрода, поверхность которого модифицирована покрытием, удерживаемым диализной мембраной, и покрытие рабочего электрода устройства, содержащее редокс-слой, выполненный из композитного полимера, содержащего бычий сывороточный альбумин, ковалентно сшитый с ферроценкарбоксальдегидом, и включения углеродных нанотрубок, и слой фермента лакказы, нанесенный на редокс-слой. Изобретения обеспечивают сужение спектра легкоокисляемых субстратов, не входящих в фенольный индекс, и увеличение коэффициента чувствительности устройства при проведение мониторинга летучих алкилфенолов сточных вод централизованных систем водоотведения. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

1. Устройство для определения индекса летучих фенолов в воде, содержащее измерительную кювету (3), электрод сравнения (2) и рабочий электрод (1), выполненный в виде графитопастового электрода, поверхность которого модифицирована покрытием (8), удерживаемым диализной мембраной (11),

отличающееся тем, что покрытие (8) включает:

- редокс-слой (9), выполненный из композитного полимера, содержащего бычий сывороточный альбумин, ковалентно сшитый с ферроценкарбоксальдегидом, и включения углеродных нанотрубок;

- слой фермента (10) лакказы, нанесенный на редокс-слой (9).

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что рабочий графитопастовый электрод (1) включает: трубчатый корпус (5); размещенную в корпусе (5) графитовую пасту (7), которая содержит графитовую пудру и минеральное масло; и погруженный в графитовую пасту (7) металлический проводник (6).

3. Устройство по п.2, отличающееся тем, что диализная мембрана (11) зафиксирована на корпусе (5) посредством фиксирующего кольца (12).

4. Устройство по п.1, отличающееся тем, что дополнительно включает мешалку (4) для измерительной кюветы (3).

5. Устройство по п.1, отличающееся тем, что в качестве электрода сравнения (2) использован хлоридсеребряный электрод.

6. Покрытие (8) рабочего электрода (1) устройства для определения индекса летучих фенолов в воде, отличающееся тем, что содержит:

- редокс-слой (9), выполненный из композитного полимера, содержащего бычий сывороточный альбумин, ковалентно сшитый с ферроценкарбоксальдегидом, и включения углеродных нанотрубок, и

- слой фермента (10) лакказы, нанесенный на редокс-слой.

7. Покрытие по п.6, отличающееся тем, что бычий сывороточный альбумин, ковалентно сшитый с ферроценкарбоксальдегидом (БСА-ФЦ), и углеродные нанотрубки использованы в соотношении на 3,5 мг БСА-ФЦ 0,025 мг углеродных нанотрубок.