КОМПОЗИЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ЛАКТАТА В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ Российский патент 2025 года по МПК G01N27/327 C12Q1/26 B82Y5/00 B82Y30/00 G01R19/00 

[01] Область техники

[02] Группа изобретений относится к области биотехнологии и медицины, а именно к композиционным материалам для биосенсорных аналитических устройств (биосенсоров) и конструкциям указанных устройств, и может быть использована для количественной оценки содержания лактата в физиологических жидкостях, таких как кровь и пот.

[03] Уровень техники

[04] В медицинской практике применяют следующее оборудование для определения лактата: прибор, основанный на принципе ферментного амперометрического измерения, торговой марки Lab Trend BST Bio Sensor (BST Bio Sensor Technologie GmbH, Германия), портативные устройства, к примеру, торговых марок Lactate Scout (EKF - Diagnostic GmbH, Германия) и StatStrip Lactate (NOVA Biomedical, США). Также используют более чувствительные системы, требующие меньший объем образца крови для анализа, реализованные в следующих устройствах [Dagar К., Narwal V., Pundir С.S. An enhanced L-lactate biosensor based on nanohybrid of chitosan, iron-nanoparticles and carboxylated multiwalled carbon nanotubes //Sensors International. - 2023. - T. 4. - C. 100245], [Thongkhao P. et al. Disposable Polyaniline/m-Phenylenediamine-Based Electrochemical Lactate Biosensor for Early Sepsis Diagnosis //Polymers. - 2024. - T. 16. - №. 4. - C. 473].

[05] Все вышеуказанные устройства предназначены для инвазивного метода определения лактата в плазме, сыворотке или крови человека. Однако более комфортным для человека является неинвазивный метод забора проб физиологических жидкостей, например, таких как пот.

[06] Известна следующая модель устройства для неинвазивной диагностики лактата в слюне человека, которая содержит печатный электрод, рабочая площадь поверхности которого покрыта суспензией наночастиц оксида цинка и оксида графена и ферментом лактатоксидазой [Han J., Shaohui J. Fabrication of a novel sensor for lactate screening in saliva samples before and after exercise in athletes //Alexandria Engineering Journal. - 2024. - T. 92. - С. 171-175]. Диапазон определяемых концентраций лактата составляет 0,015 1,25 мМ. Относительное стандартное отклонение аналитического сигнала, формируемого устройством при проведении семи последовательных измерений одной и той же концентрации лактата (0,25 мМ) составляет 2,9%.

[07] Еще одним примером устройства для неинвазивной экспресс-оценки лактата в поте человека является лабораторная модель, которая содержит печатный электрод, рабочая площадь поверхности которого покрыта берлинской лазурью, взятой в качестве редос-активного соединения, фермента лактатоксидазы, иммобилизованного в полимер хитозан [Плеханова Ю.В., Решетилое А.Н. Биосенсор для одновременного определения глюкозы и лактата в поте человека //Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. - 2018. - №. 3. - С. 70-79]. Устройство показало высокую оперативность генерации аналитического сигнала при введении лактата в систему и восстановления активности рецепторного элемента: время единичного замера одной пробы не более 5 минут. Линейный диапазон определяемых концентраций составил 0,04 0,16 мМ.

[08] Существенным недостатком указанных устройств неинвазивной диагностики является то, что их чувствительность позволяет проводить мониторинг лактата невысокой концентрации. Такой диапазон определяемых значений лактата подходит для оценки уровня содержания лактата в крови, который в норме в состоянии покоя составляет 0,5-2,2 мМ [Crapnell, R.D.; Tridente, A.; Banks, С.Е.; Dempsey-Hibbert, N.C. Evaluating the Possibility of Translating Technological Advances in Non-Invasive Continuous Lactate Monitoring into Critical Care. Sensors 2021, 21, 879], при этом концентрация лактата в поте значительно выше и в норме составляет 10-25 мМ [Garcia-Morales R. et al. Bioengineered Lactate Oxidase Mutants for Enhanced Electrochemical Performance at Acidic pH //ChemE-lectroChem. - 2023. - T. 10. - №. 22. - С.e202300296], а при интенсивной физической нагрузке может достигать до 100 мМ [Daboss Е. V. et al. On-body hypoxia monitor based on lactate biosensors with a tunable concentration range //Journal of Electroanalytical Chemistry. - 2023. - T 935. - C 117330].

[09] Наиболее близким аналогом заявленной группы изобретений является композиционный материал и устройство для количественной оценки содержания лактата в физиологических жидкостях, описанные в [Ma G. Electrochemical sensing monitoring of blood lactic acid levels in sweat during exhaustive exercise //International Journal of Electrochemical Science. - 2023. - T. 18. - №. 4. - C. 100064]. Указанное устройство содержит графитовый печатный электрод, поверхность которого покрыта наноматериалом в виде оксида графена, ферментом лактатоксидазой, которая иммобилизована в полимер поливинилбутиралем, а в качестве редокс-активного соединения в систему дополнительно вводится раствор гексацианоферрата (III) калия. Недостатками данного устройства и композиционного материала является то, что оно позволяет проводить определение лактата при концентрациях до 32 мМ. Относительное стандартное отклонение восьми аналитических сигналов, полученных при последовательных измерениях одной и той же концентрации лактата составило 3,50%.

[010] Таким образом, технической проблемой, на решение которой направлена заявленная группа изобретений является недостаточно высокие технические характеристики известных композиционных материалов и устройств для количественной оценки содержания лактата в физиологических жидкостях, в частности поте и крови.

[011] Раскрытие сущности изобретения

[012] Техническим результатом группы изобретений является увеличение верхней границы диапазона определяемых концентраций лактата в физиологических жидкостях до 57 мМ, а также сокращение времени, затрачиваемого на проведение единичного измерения заявленным устройством.

[013] Указанный технический результат достигается в композиционном материале для устройства для количественной оценки содержания лактата в физиологических жидкостях, содержащем полимерную матрицу, включения наноматериала и включения фермента лактатоксидазы, иммобилизованные в указанную матрицу, при этом полимерная матрица содержит полимер, модифицированный редокс-активным соединением, где в качестве полимера использован бычий сывороточный альбумин, в качестве редокс-активного соединения использован нейтральный красный, ковалентно связаный с указанным полимером, а наноматериал представляет собой одностенные углеродные нано-трубки, при этом композиционный материал содержит компоненты в следующем соотношении, мас. %: включения одностенных углеродных нанотрубок 1,0-2,0, включения фермента лактатоксидазы - 2,0-3,0, полимерная матрица - остальное.

[014] В частном случае реализации заявленного композиционного материала:

[015] - композиционный материал получен путем смешивания бычьего сывороточного альбумина, калий-натриевого фосфатного буферного раствора, суспензии одно-стенных углеродных нанотрубок, насыщенного раствора нейтрального красного, фермента лактатоксидазы и раствора глутарового альдегида.

[016] Указанный технический результат достигается также в устройстве для количественной оценки содержания лактата в физиологических жидкостях за счет того, что оно содержит рабочий электрод, поверхность которого покрыта композиционным материалом в соответствии с заявленным изобретением.

[017] В частном случае реализации заявленного устройства:

[018] - в качестве рабочего электрода используют графитовый печатный электрод или инертный металлический электрод.

[019] Зависимость аналитического сигнала биосенсоров на основе лактатоксидазы от концентрации лактата имеет типичный для ферментативных реакций вид, поэтому экспериментальные данные аппроксимируется уравнением гиперболы с двумя параметрами и интерпретируются в рамах классической кинетической модели Михаэлиса-Ментен. Верхняя граница определяемых концентраций ферментных биосенсоров определяется значением параметра, аналогичного константе Михаэлиса. Компоненты, взятые для формирования заявленного устройства, приводят к изменению микроокружения фермента лактатоксидазы, что изменяет сродство фермента к лактату и приводит к более высокой концентрации субстрата, необходимой для достижения той же каталитической эффективности, что и у свободного фермента. Таким образом, увеличение верхней границы диапазона определяемых концентраций лактата заявленным устройством по сравнению с устройством по ближайшему аналогу связано с тем, что в заявленном устройстве использована полимерная матрица, содержащая полимер, модифицированный редокс-активным соединением, где в качестве полимера использован бычий сывороточный альбумин, модифицированный нейтральным красным, и включения наноматериала в виде одностенных углеродных нанотрубок.

[020] Использование в качестве наноматериала одностенных углеродных нанотрубок приводит к формированию более развитой поверхности рабочего электрода.

[021] Фиксация редокс-активного соединения в виде нейтрального красного непосредственно в структуре полимера, используемого для иммобилизации фермента лактатоксидазы, приводит к усилению взаимодействия «фермент редокс-активное соединение», что приводит к структурным изменениям (стерическим препятствиям), которые влияют на доступность лактата для активного центра фермента и способствуют увеличению верхней границы определяемых концентраций лактата (константы Михаэлиса).

[022] Краткое описание чертежей

[023] Группа изобретений поясняется фигурами, где:

На фигуре 1 схематично показан общий вид заявленных композиционного материала и устройства,

На фигуре 2 показан общий вид заявленных композиционного материала и устройства в разрезе,

На фигуре 3 показан регистрируемый сигнал от заявленного устройства в виде зависимости силы тока (нА) от времени (с),

На фигуре 4 показана градуировочная зависимость заявленного устройства,

На фигуре 5 показан линейный участок градировочной зависимости.

[024] Элементы обозначены на фигурах следующими позициями:

1 - рабочий электрод,

2 - включения одностенных углеродных нанотрубок,

3 включения фермента лактатоксидазы,

4 полимерная матрица.

[025] Осуществление изобретения

[026] Заявленный композиционный материал содержит:

[027] - полимерную матрицу (4), включающую полимер в виде бычьего сывороточного альбумина, модифицированного редокс-активным соединением в виде нейтрального красного, преимущественно, в количестве 95,0-97,0 мас. %;

[028] - размещенные в указанной полимерной матрице включения наноматериала в виде одностенных углеродных нанотрубок (2) в количестве 1,0-2,0 мас. %

[029] - и иммобилизованные в указанную полимерную матрицу включения био-распознающего компонента в виде фермента лактатоксидазы (3) в количестве 2,0-3,0 мас. %.

[030] Для формирования пространственной структуры полимерной матрицы (4) в виде гидрогеля используют бычий сывороточный альбумин в количестве 3,7-5,0 мас. % (предпочтительно 3,7 мас. %), калий-натрий фосфатный буферный раствор с рН 6-8, который также служит в целях регулирования рН смеси, в количестве 30,0-50,0 мас. %, медиатор в виде насыщенного раствора нейтрального красного в количестве 5,0-7,0 мас. %, а также бифункциональный сшивающий агент в виде раствора глутарового альдегида в количестве 7,5-9,5 мас. %.

[031] Заявленное устройство включает рабочий электрод (1), рабочая поверхность которого модифицирована (покрыта) описанным выше композиционным материалом, соответствующим заявленному изобретению. В качестве рабочего электрода (1) может быть использован графитовый печатный электрод или инертный металлический электрод.

[032] Ниже представлены примеры получения заявленной группы изобретений.

[033] Пример 1. В пробирке к 0,0035 г бычьего сывороточного альбумина добавляют 50 мкл калий-натрий фосфатного буферного раствора с рН 6-8, 10 мкл суспензии одностенных углеродных нанотрубок, 5 мкл насыщенного раствора медиатора нейтрального красного и фермент лактатоксидазу (концентрация 20 Е/мг, объем 20 мкл). Полученную смесь встряхивают в течение 2 минут. Затем к полученной смеси добавляют 7,5 мкл 25 мас. % раствора глутарового альдегида и встряхивают в течение не более 30 секунд перед нанесением на графитовый печатный электрод. Далее 3 мкл полученной смеси наносят на рабочую поверхность графитового печатного электрода и оставляют до полного высыхания. В результате получают композиционный материал со следующим соотношением компонентов: полимерная матрица (4) - 97,0 мас. %, включения одностенных углеродных нанотрубок (2) 1,0 мас. % в пересчете на сухое вещество, включения фермента лактатоксидазы (3) - 2,0 мас. % в пересчете на сухое вещество.

[034] Пример 2. В пробирке к 0,005 г бычьего сывороточного альбумина добавляют 30 мкл калий-натрий фосфатного буферного раствора с рН 6-8, 20 мкл суспензии одностенных углеродных нанотрубок, 7 мкл насыщенного раствора медиатора нейтрального красного и фермент лактатоксидазу (концентрация 20 Е/мг, объем 30 мкл). Полученную смесь встряхивают в течение 2 минут. Затем к полученной смеси добавляют 9 мкл 25 мас. % раствора глутарового альдегида и встряхивают в течение не более 30 секунд перед нанесением на графитовый печатный электрод. Далее 3 мкл полученной смеси наносят на рабочую поверхность графитового печатного электрода и оставляют до полного высыхания. В результате получают композиционный материал со следующим соотношением компонентов: полимерная матрица (4) - 95,0 мас. %, включения одностенных углеродных нанотрубок (2) - 2,0 мас. %, включения фермента лактатоксидазы (3) - 3,0 мас. %.

[035] Пример 3. В пробирке к 0,004 г бычьего сывороточного альбумина добавляют 40 мкл калий-натрий фосфатного буферного раствора с рН 6-8, 15 мкл суспензии одностенных углеродных нанотрубок, 6 мкл насыщенного раствора медиатора нейтрального красного и фермент лактатоксидазу (концентрация 20 Е/мг, объем 25 мкл). Полученную смесь встряхивают в течение 2 минут. Затем к полученной смеси добавляют 8 мкл 25 мас. % раствора глутарового альдегида и встряхивают в течение не более 30 секунд перед нанесением на графитовый печатный электрод. Далее 3 мкл полученной смеси наносят на рабочую поверхность графитового печатного электрода и оставляют до полного высыхания. В результате получают композиционный материал со следующим соотношением компонентов: полимерная матрица (4) - 96,0 мас. %, включения одностенных углеродных нанотрубок (2) - 1,5 мас. %, включения фермента лактатоксидазы (3) - 2,5 мас. %.

[036] Принцип работы заявленной группы изобретений заключается в следующем.

[037] Для измерений используют потенциостат, измерительную кювету объемом, к примеру, 5 мл, магнитную мешалку и портативный компьютер. Заявленное устройство помещают в измерительную кювету, добавляют натрий-калий фосфатный буферный раствор с рН 6-8, включают магнитную мешалку и регистрируют фоновый ток в измерительной кювете. Для регистрации результатов измерения можно использовать потенциостат CS150 (Corrtest, Китай), подключаемый к рабочему электроду и персональному компьютеру. Затем вводят анализируемую пробу физиологической жидкости, которая может представлять собой кровь или пот человека. Измерения проводят при комнатной температуре и рабочем потенциале -550 мВ, что связано с окислительно-восстановительными свойствами редокс-активного соединения, используемого в композиции нейтрального красного. После каждого измерения промывают измерительную кювету фосфатным буферным раствором с рН 6,8 в объеме, равным объему измерительной кюветы.

[038] В примерах 1-3 в качестве рабочего электрода заявленного устройства был использован графитовый печатный электрод. Сигналом графитового печатного электрода (1) является зависимость силы тока (нА) от времени (с) (см. фиг. 3). Далее рассчитывают амплитуду изменения силы тока после введения пробы в измерительную кювету (ответ биосенсора, ΔI, нА). Содержание лактата в пробе определяют с использованием предварительно построенной градуировочной зависимости, показанной на фиг. 4. Расчет проводят следующим образом: содержание лактата в образце определяют с использованием уравнения, описывающего линейный участок градуировочной зависимости, показанной на фиг. 5 (y=8,02+0,36, где х концентрация лактата, ммоль/дм³, у ответ биосенсора, нА). Примеры результатов расчета концентрации лактата в физиологических жидкостях с помощью заявленной группы изобретений в соответствии с вышеприведенными примерами 1-3 приведены в таблице 1.

[040] Основные характеристики заявленного устройства для количественной оценки содержания лактата в физиологических жидкостях и устройства согласно ближайшему аналогу показаны в таблице 2.

[042] Таким образом, заявленные композиционный материал и устройство для количественной оценки содержания лактата в физиологических жидкостях позволяют определить содержание лактата повышенной концентрации (до 57 мМ) с длительностью одного измерения не более 2-х минут, что обеспечивает проведение неинвазивного экспресс-анализа количественной оценки содержания лактата в физиологических жидкостях без разбавления.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и медицины. Раскрыт композиционный материал для устройства для количественной оценки содержания лактата в физиологических жидкостях, содержащий полимерную матрицу (4), включения наноматериала и включения фермента лактатоксидазы (3), иммобилизованные в полимерную матрицу (4), при этом полимерная матрица (4) содержит полимер, модифицированный редокс-активным соединением. В качестве полимера использован бычий сывороточный альбумин, в качестве редокс-активного соединения использован нейтральный красный, ковалентно связанный с указанным полимером, а наноматериал представляет собой одностенные углеродные нанотрубки (2). Также раскрыто устройство для количественной оценки содержания лактата в физиологических жидкостях. Группа изобретений обеспечивает увеличение верхней границы диапазона определяемых концентраций лактата в физиологических жидкостях до 57 мМ, а также сокращение времени, затрачиваемого на проведение единичного измерения. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Композиционный материал для устройства для количественной оценки содержания лактата в физиологических жидкостях, содержащий полимерную матрицу (4), включения наноматериала и включения фермента лактатоксидазы (3), иммобилизованные в полимерную матрицу (4), при этом полимерная матрица (4) содержит полимер, модифицированный редокс-активным соединением, отличающийся тем, что в качестве полимера использован бычий сывороточный альбумин, в качестве редокс-активного соединения использован нейтральный красный, ковалентно связанный с указанным полимером, а наноматериал представляет собой одностенные углеродные нанотрубки (2).

2. Устройство для количественной оценки содержания лактата в физиологических жидкостях, содержащее рабочий электрод (1), поверхность которого покрыта композиционным материалом, содержащим полимерную матрицу (4), включения наноматериала и включения фермента лактатоксидазы (3), иммобилизованные в полимерную матрицу (4), при этом полимерная матрица (4) содержит полимер, модифицированный редокс-активным соединением, отличающееся тем, что в качестве полимера использован бычий сывороточный альбумин, в качестве редокс-активного соединения использован нейтральный красный, ковалентно связанный с указанным полимером, а наноматериал представляет собой одностенные углеродные нанотрубки (2).

3. Устройство для количественной оценки содержания лактата в физиологических жидкостях по п.2, отличающееся тем, что в качестве рабочего электрода (1) используют графитовый печатный электрод или инертный металлический электрод.