Биосенсорное аналитическое устройство для количественной оценки содержания этанола в физиологических жидкостях Российский патент 2025 года по МПК G01N33/487 G01N27/30 G01N33/483 B82Y5/00 

[01] Область техники

[02] Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к биосенсорным аналитическим устройствам (биосенсорам), и может быть использовано для количественной оценки содержания этилового спирта (далее этанола) в физиологических жидкостях, таких как кровь, слюна, моча и пот, неинвазивным способом.

[03] Уровень техники

[04] В медицинской практике наиболее распространенным способом определения текущего уровня содержания этанола в крови является метод газовой хроматографии. Данный метод обладает высокой точностью определения этанола в пробе, однако требуется инвазивный отбор пробы венозной крови. Также к недостаткам данного метода относится его низкая экспрессность.

[05] Для количественной неинвазивной диагностики этанола в организме человека разработаны и сертифицированы большое количество анализаторов (алкотестеров), например: Drager Alcotest 5510 (Drager, Германия), Drivesafe II (Alcohol Countermeasure Systems Corp., Канада), Алкотестер Динго E-010 (Sentech Korea Corp., Корея), однако алкотестеры могут иметь низкую точность измерений содержания этанола, особенно при низком уровне алкоголя в крови или при наличии в дыхании других веществ. Также на снижение точности измерений алкотестера оказывают влияние внешние факторы окружающей среды (температура, влажность), при этом необходима регулярная калибровка таких устройств для поддержания необходимой точности измерений.

[06] Известно устройство для неинвазивной диагностики этанола в поту человека, которое содержит легированный алюминием электрод из оксида никеля (II) и дифференциально импульсный вольтамперометрический детектор [Singh A. et al. Quantifying ethanol in sweat with a wearable Al-doped NiO electrode and data analysis // IEEE Sensors Journal. 2023. V. 23, N. 19, P. 22153-22160]. Диапазон определяемых концентраций этанола данным устройством составляет 50-600 мкМ. Следует отметить, что трансдермальное определение этанола с помощью данного устройства без разбавления анализируемых проб возможно только для здоровых лиц, у которых уровень этанола в поту в нормальном состоянии не превышает 220-650 мкМ, кроме того наличие заболеваний, таких как сахарный диабет 2-го типа, цирроз печени, увеличивают уровень эндогенного этанола [Недугов Г.В. Математическое моделирование кинетики этанола: монография / Г.В. Недугов. - Казань: Бук, 2024. - 300 с.].

[07] Еще одним примером устройства для неинвазивной экспресс-оценки этанола в поту человека является устройство, которое содержит рабочий электрод, поверхность которого покрыта берлинской лазурью, взятой в качестве редокс-активного соединения, ферментом алкогольоксидазой, иммобилизованным в полимер в виде хитозана [Kim J., Sempionatto J.R., Imani S., Hartel M.C., Barfidokht A., Tang G., Campbell A.S., Mercier P.P., Wang J. Simultaneous monitoring of sweat and interstitial fluid using a single wearable biosensor platform // Advanced Science. 2018. V. 5. I. 10. No. 1800880]. Линейный диапазон определяемых концентраций этанола такого устройства составляет до 40 мМ, который не охватывает клинически значимые концентрации для диагностики заболеваний по уровню этанола в поту [Недугов Г.В. Математическое моделирование кинетики этанола: монография / Г.В. Недугов. - Казань: Бук, 2024. - 300 с.].

[08] Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является биосенсорное аналитическое устройство для количественной оценки содержания этанола в физиологических жидкостях, описанное в источнике [Кузнецова Л.С. Биорецепторные системы на основе композитных материалов для контроля качества биотехнологических процессов // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2024», г. Москва, 12-26 апреля 2024 г.]. Устройство содержит графитовый печатный электрод, поверхность которого модифицирована композитным материалом, содержащим полимерную матрицу, включения наноматериала в виде одностенных углеродных нанотрубок и включения фермента алкогольоксидазы, иммобилизованные в полимерную матрицу, при этом полимерная матрица содержит полимер - бычий сывороточный альбумин, модифицированный редокс-активным соединением -нейтральным красным. Указанное устройство позволяет определять содержание этанола в физиологических жидкостях в диапазоне концентраций от 2,3 до 9 мМ. Относительное стандартное отклонение восьми аналитических сигналов, полученных при последовательных измерениях одной и той же концентрации этанола, составляет 2,8%. Время замера одной пробы не превышает 2-х минут. Устройство функционирует без потери активности в течение 7-ми суток. Таким образом, основным недостатком устройства в соответствии с ближайшим аналогом является узкий диапазон определяемых концентраций этанола в физиологических жидкостях, который не охватывает клинически значимые концентрации для диагностики заболеваний по уровню этанола в физиологических жидкостях.

[09] Таким образом, технической проблемой, на решение которой направлено заявленное изобретение, является недостаточно широкий диапазон определяемых концентраций этанола в физиологических жидкостях известными неинвазивными устройствами для количественной оценки содержания этанола.

[010] Раскрытие сущности изобретения

[011] Техническим результатом изобретения является увеличение верхней границы диапазона определяемых концентраций этанола в физиологических жидкостях до 500 мМ при сохранении показателей долговременной стабильности в количестве не менее 7-ми суток, а также длительности единичного измерения в количестве не более 2-х минут.

[012] Указанный технический результат достигается в биосенсорном аналитическом устройстве для количественной оценки содержания этанола в физиологических жидкостях, содержащем рабочий электрод, поверхность которого модифицирована композитным материалом, содержащем полимерную матрицу, включения наноматериала и включения фермента алкогольоксидазы, иммобилизованные в полимерную матрицу, при этом полимерная матрица содержит полимер, модифицированный редокс-активным соединением, в качестве полимера использован хитозан, в качестве редокс-активного соединения использован азур, ковалентно связанный с указанным полимером, а наноматериал представляет собой фуллерен.

[013] В частном случае реализации заявленного устройства:

[014] - используют фуллерен С60;

[015] - в качестве рабочего электрода используют графитовый печатный электрод или инертный металлический электрод.

[016] Верхняя граница определяемых концентраций ферментных биосенсоров определяется (с учетом разбавления в ячейке) значением параметра, аналогичного константе Михаэлиса, получаемого в результате аппроксимации зависимости аналитического сигнала биосенсоров на основе фермента от концентрации определяемого компонента уравнением гиперболы с двумя параметрами [Baronas R. et al. Introduction to Modeling of Biosensors // Mathematical Modeling of Biosensors. - 2021. - C. 1-47], [Tricase A. et al. Water-Based Conductive Ink Formulations for Enzyme-Based Wearable Biosensors // Advanced Sensor Research. - 2024. - T. 3. - №. 3. - С. 2300036]. Компоненты, взятые для формирования заявляемого устройства, приводят к изменению микроокружения фермента алкогольоксидазы, что изменяет сродство фермента к этанолу и приводит к более высокой концентрации субстрата, необходимой для достижения той же каталитической эффективности, чем у свободного фермента, поэтому верхняя граница определяемых концентраций увеличивается [Almulaiky Y. Q., Alkabli J., El-Shishtawy R. M. Sustainable Immobilization of β-Glucosidase onto Silver Ions and AgNPs-Loaded Acrylic Fabric with Enhanced Stability and Reusability // Polymers. - 2023. - T. 15. - №. 22. - C. 4361].

[017] Использование в качестве наноматериала фуллерена вместо одностенных углеродных нанотрубок приводит к увеличению объема электрокаталитического слоя, что также изменяет микрооружение фермента алкогольоксидазы по сравнению с аналогом, влияя на доступность этанола для активного центра указанного фермента алкогольоксидазы и способствует увеличению верхней границы определяемых концентраций.

[018] Использование в полимерной матрице полимера в виде хитозана, кова-лентно связанного с редокс-активным соединением азуром, приводит к изменению константы скорости взаимодействия «фермент редокс-активное соединение», что вызывает конформационные изменения в ферменте алкогольоксидазы и изменяет связывание этанола с алкогольоксидазой и, как следствие, верхнюю границу определяемых концентраций этанола.

[019] Краткое описание чертежей

[020] Изобретение поясняется фигурами, где:

На фигуре 1 схематично показан общий вид заявленного устройства,

На фигуре 2 показан общий вид устройства в разрезе,

На фигуре 3 показан регистрируемый сигнал от заявленного устройства в виде зависимости силы тока (нА) от времени (с),

На фигуре 4 показана градуировочная зависимость заявленного устройства,

На фигуре 5 показан линейный участок градировочной зависимости.

[021] Элементы обозначены на фигурах следующими позициями:

1 - рабочий электрод,

2 - включения наноматериала в виде фуллерена,

3 - включения фермента алкогольоксидазы,

4 - полимерная матрица.

[022] Осуществление изобретения

[023] Заявленное биосенсорное аналитическое устройство включает рабочий электрод (1), поверхность которого модифицирована (покрыта) композитным материалом.

[024] В качестве рабочего электрода (1) может быть использован графитовый печатный электрод или инертный металлический электрод.

[025] Композитный материал содержит полимерную матрицу (4), содержащую полимер в виде хитозана, ковалентно связанный с редокс-активным соединением в виде азура, и размещенные в указанной матрице (4) включения биораспознающего компонента в виде фермента алкогольоксидазы (3) и включения наноматериала (2) в виде фуллерена. Предпочтительно использовать включения фуллерена типа С60.

[026] Ниже представлен пример получения заявленного устройства.

[027] В пробирке смешивают 50 мкл 1%-ного раствора хитозана в 1%-ной уксусной кислоте, 10 мкл 20%-ной суспензии фуллерена С60, 5 мкл насыщенного раствора азура и 20 мкл фермента алкогольоксидазы концентрацией 6,4 Е/мл. Полученную смесь перемешивают в течение 2-х минут, затем к раствору приливают 7,5 мкл 25%-ного глутарового альдегида и встряхивают в течение не более 30 секунд перед нанесением на графитовый печатный электрод (1). Далее 3 мкл полученной смеси наносят на рабочую поверхность графитового печатного электрода (1) и оставляют до полного высыхания.

[028] Принцип работы заявленного устройства для количественной оценки содержания этанола в физиологических жидкостях заключается в следующем.

[029] Для измерений используют потенциостат, ячейку объемом 5 мл, магнитную мешалку и портативный компьютер. Устройство помещают в ячейку, добавляют в нее 5 мл 30 мМ натрий-калий фосфатного буферного раствора (рН 6,8), включают магнитную мешалку и регистрируют фоновый ток в измерительной ячейке. Для регистрации результатов измерения можно использовать потенциостат CS150 (Contest, Китай), подключаемый к рабочему электроду и персональному компьютеру. Затем вводят анализируемую пробу физиологической жидкости, например, слюны, пота, мочи или крови человека. Измерения проводят при комнатной температуре и рабочем потенциале -500 мВ, что связано с окислительно-восстановительными свойствами редокс-активного соединения азура. После каждого измерения промывают измерительную ячейку 30 мМ натрий-калий фосфатным буферным раствором (рН 6,8) в объеме 5 мл.

[030] Сигналом рабочего электрода (1) является зависимость силы тока (нА) от времени (с) (см. фиг. 3). Далее рассчитывают амплитуду изменения силы тока после введения пробы в измерительную ячейку (ответ биосенсора, ΔI, нА). Содержание этанола в пробе определяют с использованием предварительно построенной градуировочной зависимости, показанной на фиг. 4. Содержание этанола в ячейке определяют с использованием уравнения, описывающего линейный участок градуировочной зависимости, показанный на фиг. 5:

[031] у=21х-6,

[032] где х - концентрация этанола в ячейке, ммоль/дм³,

[033] у - ответ биосенсора, нА.

[034] Затем определяют содержание этанола непосредственно в пробе с учетом разбавления. Примеры расчета содержания этанола в образцах крови приведены в таблице 1.

[036] Основные характеристики заявленного устройства для количественной оценки содержания этанола в физиологических жидкостях и устройства согласно ближайшему аналогу приведены в таблице 2.

[038] Таким образом, заявленное устройство для определения этанола в физиологических жидкостях позволяет проводить указанный анализ в широком диапазоне концентраций этанола с увеличенной верхней границей (до 500 мМ) по сравнению с ближайшим аналогом, что позволяет проводить неинвазивный анализ физиологических жидкостей, при этом сохраняются показатели долговременной стабильности в количестве не менее 7-ми суток и длительности единичного измерения в количестве не более 2-х минут.

Настоящее изобретение относится к биосенсорному аналитическому устройству для количественной оценки содержания этанола в физиологических жидкостях, содержащему рабочий электрод (1), поверхность которого модифицирована композитным материалом, содержащим полимерную матрицу (4), включения наноматериала (2) и включения фермента алкогольоксидазы (3), иммобилизованные в полимерную матрицу (4), при этом полимерная матрица (4) содержит полимер, модифицированный редокс-активным соединением, отличающемуся тем, что в качестве полимера использован хитозан, в качестве редокс-активного соединения использован азур, ковалентно связанный с указанным полимером, а наноматериал представляет собой фуллерен. Настоящее изобретение обеспечивает увеличение верхней границы диапазона определяемых концентраций этанола в физиологических жидкостях до 500 мМ при сохранении показателей долговременной стабильности в количестве не менее 7-ми суток, а также длительности единичного измерения в количестве не более 2-х мин. 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл.

1. Биосенсорное аналитическое устройство для количественной оценки содержания этанола в физиологических жидкостях, содержащее рабочий электрод (1), поверхность которого модифицирована композитным материалом, содержащим полимерную матрицу (4), включения наноматериала (2) и включения фермента алкогольоксидазы (3), иммобилизованные в полимерную матрицу (4), при этом полимерная матрица (4) содержит полимер, модифицированный редокс-активным соединением, отличающийся тем, что в качестве полимера использован хитозан, в качестве редокс-активного соединения использован азур, ковалентно связанный с указанным полимером, а наноматериал представляет собой фуллерен.

2. Биосенсорное аналитическое устройство для количественной оценки содержания этанола в физиологических жидкостях по п. 1, отличающееся тем, что используют фуллерен С60.

3. Биосенсорное аналитическое устройство для количественной оценки содержания этанола в физиологических жидкостях по п. 1, отличающееся тем, что в качестве рабочего электрода (1) используют графитовый печатный электрод или инертный металлический электрод.