СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИТОСУБСТАНЦИИ С АДАПТОГЕННОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2025 года по МПК A61K36/79 B01D11/02 A61K127/00 A61K135/00 A61P39/06 

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности и направлено на разработку и применение фармацевтических субстанций с адаптогенной и антиоксидантной активностью.

Растущий спрос на натуральные лекарственные препараты приводит к истощению природных запасов, поэтому введение лекарственных растений в культуру, особенно ценных, редких, исчезающих видов, а также рациональное использование сырья особенно актуально [Hamilton А.С. Medicinal plants, conservation and livelihoods. Biodivers Conserv. 2004; 13: 1477-517]. Подход к использованию в фармации культивируемых ценных лекарственных растений имеет ряд главных преимуществ, основным из которых является достаточная сырьевая база [Орловская Т.В. Фармакогностическое исследование некоторых культивируемых растений с целью расширения их использования в фармации: автореф. дис. доктора фарм. наук: Орловская Т.В. - Пятигорск, 2011: 50]. Расширение ассортимента лекарственных средств адаптогенного действия и на сегодняшний день остается актуальным, решение данного вопроса достигается путем использования новых видов лекарственных растений или использование других морфологических групп сырья, ранее не используемых.

Из лимонника китайского получают препараты «Лимонника семян настойка», «Лимонника плодов настойка» общетонизирующего действия (МКБ-10), входящие в Государственный реестр лекарственных средств России (2024 г.) [Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://grls.pharm-portal.ru. Дата доступа: 06.07.2024].

Известна «Лимонника семян настойка» (ФС.3.4.0029.22) из семян дикорастущей лианы с содержанием суммы лигнанов в пересчете на схизандрин не менее 0,3%, получаемая методом мацерации на 95% этиловом спирте [https://pharmacopoeiaTegmed.ra/pharmacopoeia/izdanie-14/1/1-1/statisticheskaya-obrabotka-rezultatov-khimicheskogo-eksperimenta/?ysclid=lua6jxinli93 9937061 [Электронный ресурс] (дата обращения: 08.07.24)].

Наиболее близким аналогом изобретения является способ получения средства «Настойка лимонника китайского», заключающийся в том, что семена лимонника китайского экстрагируют 70-90%) этиловым спиртом сначала при комнатной температуре, а затем при нагревании в интервале температур 65-70°С, то есть применяется экстракция в трех экстракторах. Способ обеспечивает получение настойки с содержанием суммы лигнанов в препарате в пересчете на γ-схизандрин 2,12% [патент RU 2368388, 2009].

Недостатком аналогов является использование семян в качестве лекарственного сырья и нерегулярность плодоношения дикорастущего лимонника, которая может сказываться на урожайности. Лимонник китайский является японо-маньчжурским эндемиком с восточноазиатским типом ареала [Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Семейство Magnoliaceae - Juglandaceae, Ulmaceae, Moraceae, Cannabaceae, Urticaceae / Отв. ред. А.Л. Буданцев. - Спб.; М.: Товарищество научных изданий КМК. 2008; 2: 421]. В условиях культивирования лианы в умеренном климате, в силу погодных условий, плоды (семена) не всегда вызревают. Но при этом лиана обладает природной жизнестойкостью и высокой побегообразовательной способностью [Билалова Р.А. Опыт интродукции Schisandra chinensis на Южном Урале / Вестник РУДН. Серия: Агрономика и животноводство. 2022; 17 (4): 448-454].

Единой задачей изобретения является получение новых лекарственных фармацевтических субстанций из листьев и побегов Schisandra chinensis (Turcz.) Baill., расширение арсенала средств, обладающих адаптогенной и антиоксидантной активностью.

Единый технический результат при использовании изобретения - получение фитосубстанции с адаптогенным и антиоксидантным действием в виде сухого экстракта.

Предлагаемый способ получения фитосубстанции с адаптогенной и антиоксидантной активностью (вариант 1) осуществляется следующим образом. Листья лимонника китайского - S. chinensis (Turcz.) Baill. измельчают до частиц размером 3,0 мм, используемое соотношение сырья к экстрагенту 1:30, для намачивания листья заливают спиртом этиловым 70% в объеме, равном массе сырья, и оставляют на 5 ч в закрытой емкости. Затем сырье загружают в перколятор, плотно утрамбовывают, заливают тем же экстрагентом до «зеркала» и настаивают 24 ч. Далее проводят перколяцию со скоростью 1/24 части рабочего объема в час. Полученные перколяты собирают отдельно: первую порцию (концентрированную) получают из перколятора, вторую порцию - до полного истощения сырья, которую упаривают под вакуумом при Т 50-60°С, разряжение 600-650 мм рт. ст.до получения рассчитанного объема. Извлечения объединяют, сгущают, очищают спиртом этиловым 95%. Очищенную вытяжку дальше сгущают под вакуумом и досушивают в сушильном шкафу при Т не более 60°С до влажности не более 5,0%.

Предлагаемый способ получения фитосубстанции с адаптогенной и антиоксидантной активностью (вариант 2) осуществляется следующим образом. Побеги лимонника китайского - S. chinensis (Turcz.) Baill. измельчают до частиц размером 5,0 мм, используемое соотношение сырья к экстрагенту 1:20, для намачивания побеги заливают спиртом этиловым 70% в объеме, равном массе сырья, и оставляют на 5 ч в закрытой емкости. Затем сырье загружают в перколятор, плотно утрамбовывают, заливают тем же экстрагентом до «зеркала» и настаивают 48 ч. Далее проводят перколяцию со скоростью 1/24 части рабочего объема в час. Полученные перколяты собирают отдельно: первую порцию (концентрированную) получают из перколятора, вторую порцию - до полного истощения сырья, которую упаривают под вакуумом при Т 50-60°С, разряжение 600-650 мм рт. ст.до получения рассчитанного объема. Извлечения объединяют, сгущают, очищают спиртом этиловым 95%. Очищенную вытяжку дальше сгущают под вакуумом и досушивают в сушильном шкафу при Т не более 60°С до влажности не более 5,0%.

Экспериментальные исследования показали, что наибольший выход экстрактивных веществ наблюдался из извлечений на спирте этиловом 70% при следующих условиях: для листьев S. chinensis (Turcz.) Baill. - при соотношении сырья к экстрагенту 1:30 с измельченностью 3,0 мм; для побегов S. chinensis (Turcz.) Baill. - при соотношении сырья к экстрагенту 1:20 с измельченностью 5,0 мм. Из использованных традиционных методов экстракции оказалось, что полнота экстрагирования наблюдалась при использовании метода перколяции. Для этого навеску растительного сырья с точной массой измельчали до размера частиц 3,0 мм для листьев (соотношение сырья и экстрагента 1:30) или 5,0 мм для побегов (соотношение сырья и экстрагента 1:20), заливали 70% спиртом этиловым в объеме, равном массе сырья, и оставляли на 5 ч (этап смачивания сырья). Затем сырье загружали в перколятор, плотно утрамбовывали и заливали тем же экстрагентом до «зеркала». Экстрагирование БАВ в листьях проводили в течение 24 часов и 48 часов в побегах. Далее проводили перколяцию со скоростью 1/24 части рабочего объема в час. Полученные перколяты собирали отдельно: первую порцию (концентрированную) получают из перколятора, вторую порцию - до полного истощения сырья, которую упаривали под вакуумом (Т 50-60°С, разряжение 600-650 мм рт. ст.) до получения рассчитанного объема. Извлечения объединяли, сгущали, очищали спиртом этиловым 95%. Очищенную вытяжку дальше сгущали и досушивали в сушильном шкафу при Т не более 60°С до влажности не более 5,0%) [Чуешов В.И., Чернов Н.Е, Хохлова Л.Н., Богуславская Л.И., Пашнев П.Д., Ляпунова О.А. и др. Промышленная технология лекарств. - X.: МТК-Книга; Издательство НФАУ. 2002; 2: 716].

Предлагаемое изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Листья S. chinensis (Turcz.) Baill. массой 100,0 измельчают до 3,0 мм, используемое соотношение сырья к экстрагенту 1:30, заливают спиртом этиловым 70% в объеме примерно 100 мл и оставляют на 5 ч для намачивания сырья в закрытой емкости. Затем сырье загружают в перколятор, плотно утрамбовывают, заливают тем же экстрагентом до «зеркала» и настаивают 24 ч. Далее проводят перколяцию со скоростью 1/24 части рабочего объема в час. Полученные перколяты собирают отдельно: первую порцию (концентрированную) получают из перколятора, вторую порцию - до полного истощения сырья, которую упаривают под вакуумом: Т 50°С, разряжение 600 мм рт. ст.При объединении перколятов получаемый объем равен 3000 мл. Далее извлечение сгущают, очищают спиртом этиловым 95%. Очищенную вытяжку дальше сгущают под вакуумом и досушивают в сушильном шкафу при Т не более 60°С до влажности не более 5,0%).

Пример 2. Побеги S. chinensis (Turcz.) Baill. массой 100,0 измельчают до 5,0 мм, используемое соотношение сырья к экстрагенту 1:20, заливают спиртом этиловым 70%) в объеме примерно 100 мл и оставляют на 5 ч для намачивания сырья в закрытой емкости. Затем сырье загружают в перколятор, плотно утрамбовывают, заливают тем же экстрагентом до «зеркала» и настаивают 48 ч. Далее проводят перколяцию со скоростью 1/24 части рабочего объема в час. Полученные перколяты собирают отдельно: первую порцию (концентрированную) получают из перколятора, вторую порцию - до полного истощения сырья, которую упаривают под вакуумом: Т 60°С, разряжение 650 мм рт. ст. При объединении перколятов получаемый объем равен 2000 мл. Далее извлечение сгущают, очищают спиртом этиловым 95%. Очищенную вытяжку дальше сгущают под вакуумом и досушивают в сушильном шкафу при Т не более 60°С до влажности не более 5,0%.

Полученные фитосубстанции: сухие экстракты листьев и побегов S. chinensis (Turcz.) Baill. представляли собой порошкообразные сыпучие массы темно-коричневого цвета со специфическим запахом, горьковатого вкуса. Сухие экстракты листьев, побегов S. chinensis (Turcz.) Baill. хорошо растворимы в воде, спирте этиловом, образуя мутные растворы, и не растворимы в органических растворителях. Влажность сухих экстрактов из листьев и побегов S. chinensis составила 3,67±0,06% и 4,63±0,11% соответственно (не более 5,0%).

Полученные результаты количественного содержания маркерных компонентов в сухих экстрактах листьев и побегов S. chinensis составило соответственно: флавоноидов в пересчете на рутин 6,22%±0,14%) и 8,96%)±0,21%(должно быть не менее 6,0%) и 8,0% соответственно), лигнанов в пересчете на схизандрин А - 5,40±0,11% и 15,56%±0,32% (должно быть не менее 5,0% и 15,0%) соответственно), сапонинов в пересчете на β-эсцин - 19,37%±0,57% и 15,43%±0,40% (должно быть не менее 19,0% и 15,0% соответственно).

Известно применение «Лимонника семян настойка», как стимулирующего средства, влияющего на ЦНС, сердечно-сосудистую и дыхательную систему, повышающего артериальное давление, умственную и физическую работоспособность. Показания к применению: психическое и физическое перенапряжение, реконвалесценция после соматических и инфекционных заболеваний, для повышения работоспособности организма, в комплексной терапии при астеническом синдроме [Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://grls.pharm-portal.ru. Дата доступа: 06.07.2024. 2) Зилфикаров И.Н. Природные лекарственные препараты: химический состав и стандартизация. Справочное и научно-практическое издание. - М: Изд-во «СЛОН ПО». 2021: 712]. «Лимонника плодов настойка» обладает гепатопротективными, иммуномодулирующими, гипогликемическими, антиаллергическими, стрессрегуляторными свойствами, также повышает гемопоэз и устойчивость организма к интоксикациям, в том числе алкогольным [Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Дополнения к 1 тому / Отв. ред. А. Л. Буданцев. - СПб.; М: Товарищество научных изданий КМК. 2018: 409].

В научно-медицинской и патентной литературе сведений об известности получения фитосубстанций из листьев и побегов S. chinensis (Turcz.) Baill. (Turcz.) Baill. (Turcz.) Baill. и о применении их в качестве средств с адаптогенной и антиоксидантной активностью не обнаружено. Полученные сухие экстракты, используемые в ниже перечисленных методиках определения биологической активности, растворяли в воде очищенной для получения водных растворов в соотношении 1:30 для сухих экстрактов из листьев и 1:20 - из побегов.

Адаптогенное действие фитосубстанций листьев и побегов S. chinensis исследовали на белых мышах-самцах (n=56, m 18,0-25,0 г) в 2 системах воспроизведения. В 1 системе воспроизводили нормобарическую гипоксию с гиперкапнией, при которой лабораторных животных помещали в емкости (V=250 см³) и регистрировали резервное время в условиях гипоксии. После эксперимента животных декапитировали, извлекали головной мозг и немедленно проводили биохимические исследования. Антиоксидантный статус в гомогенатах определяли путем измерения уровня малонового диальдегида (нмоль/г сырой ткани) и каталазы (мкат/г сырой ткани).

Во 2 системе оценивании физическую работоспособность по продолжительности плавания мышей с грузом (~ 7% от массы) на 15-й день эксперимента до полного утомления (погружение животного под воду и отказ от плавания). После плавания мышей обсушивали и через час повторяли эксперимент. Для снижения влияния стресса, мышейпредварительно приучали к воде: плавание без груза в течение 1 мин (3 раза, с интервалом 3 дня, Т воды 26-28°С).

Для исследования использовали 3 группы животных: 1 - опытная группа, которую поили водным раствором сухих экстрактов листьев и побегов лимонника; 2 - группа сравнения, которую поили водным раствором предварительно деалкоголизированного «Лимонника семян настойка», включенного в государственный реестр лекарственных средств; 3 -контрольная группа, которую поили дистиллированной водой. Водные растворы экстрактов вводили перорально в течение 14 дней мышам-самцам по 3 капли. Объем водных растворов экстрактов был рассчитан, исходя из рекомендуемой суточной дозы для взрослого человека (m=70 кг - 30 капель 3 раза в день: 30 капель*3=90 капель/сутки, на массу в 1 кг приходится примерно 1,3 капель/кг. Суточная доза для мышей (m=20,0 г) равна 0,026 капель. Для возможности и удобства дозирования водный раствор сухих экстрактов разводили в 100 раз. Следовательно, мышам весом 20,0 г вводили 3 капли.

По полученным результатам, в условиях нормобарической гипоксии экстракты листьев S. chinensis увеличивали продолжительность жизни мышей в 2,4 раза (р<0,044108), экстракты побегов S. chinensis - в 2,5 раза (р<0,040745) относительно группы контроля. Опытные группы практически не уступали по активности препарату сравнения (р<0,0134 относительно контроля). Исследования антиоксидантного статуса в опытных группах показали, что уровень малонового диальдегида выше, чем у контроля, что, вероятно, объясняется большей продолжительностью жизни в условиях гипоксии. Увеличение деструктивных изменений в клетках приводит к повышению активности ферментов антиоксидантной защиты. Так, можно наблюдать, что уровень каталазы у животных опытной группы и препарата сравнения выше, чем в контрольной группе. В то же время, опытная группа из экстрактов листьев показала практически такие же результаты, что и группа препарата сравнения, а группа из экстрактов побегов - больше (таблица 1).

Тест на исследование физической выносливости показал, что при повторном плавании с нагрузкой, продолжительность плавания увеличилась во всех группах: в препарате сравнения и в опытных группах практически в 2 раза относительно времени первого плавания, а в группе контроля - в 1,2 раза (таблица 2).

Антиоксидантную активность (АОА) фитосубстанций устанавливали хемилюминесцентным методом in vitro. В качестве препарата сравнения использовали 0,05% раствор аскорбиновой кислоты и отвар плодов шиповника (1:10). Водные извлечения (0,01-1 мл) вносили в модельные системы, в которых формировалось образование активных форм кислорода (АФК) и протекали реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ).

1 модельная система состояла из фосфатного буфера с раствором цитрата натрия и люминола (рН 7,5), в которую вводили в качестве инициатора процесса окисления 1 мл 50 мМ раствор сернокислого железа. Регистрацию свечения проводили в течение 5 минут.

2 модельная система включала липопротеиновые комплексы, приготовленные из куриного желтка, гомогенизированного с фосфатным буфером (1:5). Инициатором процесса окисления также являлся 50 мМ раствор сернокислого железа.

Контролем служили модельные системы без добавления исследуемых извлечений. Регистрацию свечения проводили на приборе «ХЛМ-003». АОА оценивали по снижению интенсивности свечения (таблица 3).

Выявлено, что водные извлечения фитосубстанций обладают выраженной АОА и влияют как на образование АФК, так и на процесс ПОЛ.

Таким образом, использование изобретения обеспечивает:

1. Полученные фитосубстанции из листьев и побегов лимонника китайского адаптогенного действия за счет повышения физической выносливости, антигипоксического и антиоксидантного действия позволяют расширить ассортимент лекарственных средств растительного происхождения на Российском фармацевтическом рынке.

2. Предложенные фитосубстанции (сухие экстракты) из листьев и побегов лимонника, полученные методом перколяции со спиртом этиловым 70%, позволяют извлечь комплекс веществ фенольной (флавоноиды и лигнаны) и тритерпеновой природы.

3. Фармацевтические субстанции могут выпускаться в промышленных условиях на фармацевтических предприятиях как самостоятельные лекарственные средства, также могут быть использованы для получения других лекарственных форм.

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к способам получения фитосубстанции в виде сухого экстракта с адаптогенной и антиоксидантной активностью. Способ получения фитосубстанции в виде сухого экстракта с адаптогенной и антиоксидантной активностью, включающий экстракцию измельченного сырья лимонника китайского 70% этиловым спиртом, при этом в качестве сырья используют листья лимонника, которые измельчают до частиц размером 3,0 мм, экстракцию проводят при соотношении сырья и экстрагента 1:30 методом перколяции, затем полученное извлечение очищают спиртом этиловым 95%, очищенную вытяжку сгущают под вакуумом и досушивают до влажности не более 5,0%. Способ получения фитосубстанции в виде сухого экстракта с адаптогенной и антиоксидантной активностью, включающий экстракцию измельченного сырья лимонника китайского 70% этиловым спиртом, при этом в качестве сырья используют побеги лимонника, которые измельчают до частиц размером 5,0 мм, экстракцию проводят при соотношении сырья и экстрагента 1:20 методом перколяции, затем полученное извлечение очищают спиртом этиловым 95%, очищенную вытяжку сгущают под вакуумом и досушивают до влажности не более 5,0%. Вышеописанные способы обеспечивают получение фитосубстанции с адаптогенным и антиоксидантным действием в виде сухого экстракта. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

1. Способ получения фитосубстанции в виде сухого экстракта с адаптогенной и антиоксидантной активностью, включающий экстракцию измельченного сырья лимонника китайского 70% этиловым спиртом, отличающийся тем, что в качестве сырья используют листья лимонника, которые измельчают до частиц размером 3,0 мм, экстракцию проводят при соотношении сырья и экстрагента 1:30 методом перколяции, затем полученное извлечение очищают спиртом этиловым 95%, очищенную вытяжку сгущают под вакуумом и досушивают до влажности не более 5,0%.

2. Способ получения фитосубстанции в виде сухого экстракта с адаптогенной и антиоксидантной активностью, включающий экстракцию измельченного сырья лимонника китайского 70% этиловым спиртом, отличающийся тем, что в качестве сырья используют побеги лимонника, которые измельчают до частиц размером 5,0 мм, экстракцию проводят при соотношении сырья и экстрагента 1:20 методом перколяции, затем полученное извлечение очищают спиртом этиловым 95%, очищенную вытяжку сгущают под вакуумом и досушивают до влажности не более 5,0%.