СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОГО ДЕФЕКТА ЧЕЛЮСТЕЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2025 года по МПК A61B17/00 B82B1/00 A61N5/67 A61K33/244 A61P1/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано в костно-пластической хирургии дефектов костной ткани челюстей при дентальной имплантации, а также в реконструктивной хирургии пародонта и направленной костной регенерации для восполнения объема костной ткани.

В хирургической стоматологии важной проблемой являются вопросы ускорения регенерации костной ткани и замещения костных дефектов тканью морфогенетически схожей с собственной костью после проведения вмешательств на челюстных костях, связанных с необходимостью восполнения объема костной ткани. Процесс ремоделирования костной ткани характеризуется этапностью течения, сложными механизмами регуляции и зависит от многочисленных факторов. Важное значение в репаративном остеогенезе имеет воздействие на стимуляцию дифференцировки клеточных элементов костной ткани - остеокластов и остеобластов. В последние годы развитие нанотехнологий способствует изучению биоактивных свойств наноматериалов. Уникальные биохимические свойства обнаружены у нанодисперсного диоксида церия (СеО₂). В экспериментальных исследованиях in vitro показано, что данный материал повышает пролиферативную активность клеток, в том числе остеобластов и остеокластов. В исследованиях современных ученых показано, что наноСеО₂ способен выполнять функции энзимов - супероксиддисмутазы (SOD) и каталазы, что определяет его способность к купированию всевозможных патологических процессов, связанных прежде всего с окислительным стрессом. Доказанная высокая кислородная нестехиометрия наноСеО₂, которая определяет возможность к инактивации широкого спектра активных форм кислорода, что способствует снижению воспалительных реакций.

Разработка и создание новых биоинженерных конструкций на основе наноСеО₂ для стимуляции репаративного остеогенеза при различных хирургических вмешательствах с заполнением дефектов костной ткани челюстей является перспективным направлением в развитии биомедицинских нанотехнологий.

Вместе с тем, экспериментальные исследования показали, что низкоинтенсивное лазерное излучение при ремоделировании костной ткани обладает стимулирующим эффектом на остеобласты и пролиферацию остеокластов. Технологии с применением лазерного излучения широко вошли в медицинскую практику и используются практически с момента их открытия во всех областях медицины благодаря уникальным свойствам лазерного света. Развитие лазерных технологий связано с поиском новых параметров излучения, новых длин волн и гармоник излучения для локального воздействия на различные процессы в организме человека. Исследования современных ученых показывают, что под действием лазерного излучения возможно прямое возбуждение синглетного кислорода в тканях без использования фотосенсибилизаторов. Свободный кислород содержится в тканях в небольших количествах, поэтому фотореакции с генерацией активных его форм, приобретают стимулирующую направленность воздействия на объект.

Использование лазерного излучения в наносекундном импульсном режиме доказало свою эффективность, так как фотоны лазерного излучения при этом проникают глубже в ткани при этом не повреждая рядом расположенные важные анатомические структуры, это определяет высокую прецизионность лазерной наносекундной терапии, а также направленность биостимулирующего действия [1,2].

Лазер применялся для ускорения ремоделирования костной ткани челюстей при перемещении зубов (Чобанян А.Г., Базикян Э.А., Чунихин А.А., Чобанян А.Г. Анализ эффективности применения новых лазерных технологий при состояниях, требующих ускорения ремоделирования костной ткани челюстей / Dental Forum. - 2023. - №1. - С. 4-9). Для ускорения регенерации костных дефектов ранее не применялся. Так как ранее было доказано воздействие на ремоделирование, т.е. с одной стороны стимуляция остеобластогенеза, с другой стороны (резорбции) стимуляция остеокластогенеза, мы предположили, что лазерное излучение с длиной волны 1265 нм и определеннными параметрами, указанными ниже будет способствовать стимуляции регенерации в совокупности с наночастицами, которые возможно тоже активируются под действием лазерного излучения.

В патенте РФ №2653480 (опубл. 08.05.2018) описано добавление нанокристаллического диоксида церия в водную суспензию гидроокиси кальция, используемую для заполнения дефектов в костной ткани, которое ускоряет ее регенерацию на ранних сроках (до 1 месяца). Под общей анестезией препаратом, разрешенным для официального применения в ветеринарии, из расчета 10 мг/кг массы тела (внутримышечно), выстригали шерсть, оперативное поле обрабатывали 5% настойкой йода, проводили разрез мягких тканей вдоль края тела нижней челюсти длиной до 2 см. Твердосплавным бором с охлаждением физиологическим раствором трепанировали отверстие диаметром 3÷4 мм, глубиной 3 мм, на первом этапе справа, на следующем этапе - слева. После обработки 3% перекисью водорода и высушивания в сформированное перфорационное отверстие нижней челюсти с одной стороны закладывали суспензию гидроокиси кальция с диоксидом церия и сульфатом бария, с другой стороны - суспензию гидроокиси кальция с сульфатом бария (объемом по 0,03 мл). Раны послойно ушивали. Через определенные сроки кролики выводились из эксперимента (по протоколу), извлекались фрагменты оперированной костной ткани, проводились морфологические (гистологические) исследования.

Недостатком данной методики является применение суспензий для внесения в костный материал. Суспензия находится в жидкой фазе вещества, что не способствует долгому задержанию в полости дефекта и, как следствие, быстрой его диффузии в ткани, т.е. невозможно говорить о пролонгированном действии конструкции на репаративные процессы.

В патент №2793324 описано применение пластической биоинженерной композиции для восполнения объема костной ткани челюстно-лицевой области, включающая смесь гранулированного ксеногенного или синтетического наполнителя с фибриновым сгустком L-PRF с размерами частиц 0.25-1.00 мм и суспензию PRP плазмы пациента с нанодисперсным диоксидом церия в физиологическом растворе в концентрации 10-5 М при соотношении 2:1 при соотношении компонентов композиции наполнитель (г): L-PRF (г): PRP с нанодисперсным диоксидом церия (мл), равном 1:4:2. Применение новой композиции на основе наполнителя различного происхождения с аутоплазмой крови, обогащенной тромбоцитами, позволяет создать в участке ее введения в ткани высокую концентрацию факторов роста, управляющих местными процессами регенерации и иммунокоррекции.

Недостатками данного применения является отсутствие более плотного носителя. PRF-сгустки, насыщенные нанодисперсным диоксидом церия довольно быстро резорбируются в тканях, что также не способствует пролонгированному действию препарата.

Наиболее близким аналогом данного изобретения является способ регенерации костного дефекта (патент РФ №2709723, опубл. 19.12.2019) включающий отслоение слизисто-надкостничного лоскута, подготовку внутренних поверхностей костного ложа с помощью костезамещающего материала до полного прилегания, заполнение дефекта аутоплазмой, обогащенной тромбоцитами и факторами роста, укрытие резорбируемой коллагеновой мембраной, сведение краев ран и ушивание, отличающийся тем, что в качестве костезамещающего материала используют измельченную резорбируемую коллагеновую мембрану Bio-Gide, предварительно соединенную с раствором тромбина 50 Ед/мл до загустевания в количестве 1-5 мас. %, после чего внутреннюю поверхность костного дефекта закрывают полученной смесью путем уплотнения, подготовленную внутреннюю область дефекта заполняют обогащенной тромбоцитами аутоплазмой пациента, содержащей нанодисперсный диоксид церия и Ренопластин, затем внутрь дефекта укладывают обрезанную по форме и размеру резорбируемую коллагеновую мембрану Bio-Gide, обеспечивая ее полное прилегание к аутоплазме, после чего на края костного дефекта укладывают резорбируемую коллагеновую мембрану Bio-Gide пористой поверхностью внутрь, перекрывающую края дефекта на 3-4 мм под слизистую оболочку и сверху дополнительно укладывают вторую резорбируемую коллагеновую мембрану Bio-Gide пористой поверхностью наружу крестообразно для плотной фиксации костного дефекта.

Недостатком данного способа является внесение в полость дефекта аутоплазмы и использование стандартных коллагеновых мембран для удержания материала в полости дефекта. Такое применение коллагеновых мембран может приводить к замедлению процессов регенерации за счет сниженной резорбтивной активности коллагена.

Технической задачей изобретения является оптимизация способа регенерации костной ткани челюстей за счет применения костного графта насыщенного PRP с наноСеО₂ и наносекундного лазерного излучения.

Техническим результатом данного изобретения является повышение пролиферативной активности всех клеточных элементов, в том числе остеобластов, макрофагов, а также эндотелиальных клеток сосудов, что свидетельствует об ускорении процессов регенерации костной ткани в месте дефекта.

Технический результат достигается тем, предложен способ регенерации костного дефекта челюстей, включающий разрез мягких тканей вдоль нижнего края тела нижней челюсти длиной до 2 см, препарирование отверстия в костной ткани челюсти диаметром 4-5 мм и глубиной около 4 мм с использованием бора соответствующего диаметра и охлаждения физиологическим раствором, отличающийся тем, что костные дефекты заполняли костным деминерализованным ксеногенным графтом, обогащенным Platelet-rich plasma с наноСеО₂, с последующим облучением области дефекта диодным лазером, генерирующего импульсное излучение с наносекундной частотой и длиной волны 1265 нм, после чего костные дефекты укрывали коллагеновой мембраной, мягкие ткани ушивали наглухо с помощью биорезрбируемого шовного материала.

Получение деминерализованного костного графта

Ксеногенный деминерализованный костный графт изготавливали по ранее описанной методике [3] из губчатого слоя болынеберцовой кости крупного рогатого скота. После механической фрагментации до необходимых размеров производили биохимическую очистку от белковых и жировых компонентов с использованием протеолитических ферментов, поверхностно-активных веществ и окислителей в условиях вакуума и воздействия ультразвука. Деминерализацию химически очищенного костного графта проводили с помощью соляной кислоты, с последующим погашением кислотной активности путем щелочного титрования. Затем деминерализованный костный графт обрабатывали 4 М солянокислым гуанидином для исключения фоновых значений остеоиндуктивности. Кроме этого, в последующем проводили стабилизацию полученного ксеногенного костного графта путем обработки 0,6% глутаровым альдегидом на фосфатном буфере для оценки возможности регулирования скорости ферментативной резорбции. Полученный костный графт делили с помощью лезвия скальпеля на кусочки приблизительным объемом 125 мм³.

Получение Platelet-rich plasma с наноСеО₂

Кровь отбирали в пробирки, содержащие в качестве антикоагулянта цитрат натрия. Полученную цельную кровь центрифугировали при 300 rpm 10 минут. После первого центрифугирования цельная кровь разделяется на три фракции - верхняя PPP, platelet-poor plasma - обедненная тромбоцитами плазма, средняя - buffy coat, ВС - беловатого цвета, содержащая тромбоциты и лейкоциты, нижняя (RBC, red blood cells) - эритроциты. С использованием пипетки проводи отбор верхней фракции PPP, platelet-poor plasma и средней buffy coat, ВС PRP - плазмы Platelet-rich plasma в объеме 1 мл (1000 мкл) в эппендорфы на 1,5 мл с добавлением в эту же пробирку 0,5 мл (500 мкл) золя диоксида церия в концентрации 0,1 М, стабилизированного низкомолекулярной (средняя молекулярная масса - 8000 г/моль) полиакриловой кислотой по методике, описанной ранее [4], диспергированного предварительно в физиологическом растворе в объеме 1,0 мл в объемном соотношении физиологического раствора и золя наноСеО₂ 9:1. Полученную смесь подвергали высокоскоростному центрифугированию при 2300 грт в течение 10 минут. После центрифугирования верхнюю часть PPP, platelet-poor plasma отбрасывали с использованием пипетки в объеме около 2/3. Оставшуюся 1/3 супернатанта подвергали ресуспензированию с помощью встряхивания пробирки. Готовую смесь, представляющую собой Platelet-rich plasma (PRP) насыщенную наноСеО₂, наносили с использованием пипетки в объеме 0,1 мл (100 мкл) в чашке Петри на кусочки костного графта.

Наносекундный диодный лазер

Для стимуляции процессов репаративного остеогенеза использовали диодный лазер, разработанный исследовательской группой медицинской кибернетики и цифровых биомедицинских нанотехнологий ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова, генерирующего импульсное излучение с наносекундной частотой и длиной волны 1265 нм [1]. Процедуры воздействия лазерным излучением на область регенерации проводили, начиная со второго дня наблюдения с интервалом в 7 дней в течение всего срока наблюдения. При проведении процедуры лазерного воздействия использовали световод диаметром 600 мкм. Устанавливали следующие параметры лазерного излучения -наносекундный импульсный режим работы с частотой излучения 2 Гц при этом время лазерного импульса 200 не и паузы 100 не со средней мощностью 2 Вт. Световод не активировали, устанавливали к области воздействия с соблюдением фокусного расстояния около 2 мм. Лазерное облучение области регенерации проводили с помощью круговых движений в течение 2 мин. Суммарная поглощенная доза лазерного излучения при таких параметрах воздействия составила в среднем 298-325 Дж/см².

Исследования эффективности способа управления репаративными процессами в костной ткани челюстей проводили с помощью экспериментального исследования in vivo. В эксперименте использовали 45 половозрелых самцов кроликов породы «Советская шиншилла» весом 2,5-3,0 кг. Животные были получены из специализированных питомников, в транспортных клетках, соответствующих нормативам. Каждая партия животных сопровождалась ветеринарным свидетельством. Наркоз осуществляли путем введения Ксилазина (4-6 мг/кг) внутримышечно, затем через 20 минут вводили Золетил-100 (5-10 мг/кг). Таким образом, была обеспечена анальгезия и релаксация в течение 30-40 мин. Для облегчения послеоперационного состояния животных, через 30-60 минут после введения Ксилазина, вводили Атипамезол - раствор атипамезола гидрохлорид 5 мг/мл из расчета 0,35 мг/кг внутримышечно. Далее в течение 5 дней животным вводили Катозал (бутафосфан+В12) 0,5 мл/кг подкожно.

В соответствии с дизайном исследования у животных проводили разрез мягких тканей вдоль нижнего края тела нижней челюсти длиной до 2 см, затем проводили препарирование отверстия в костной ткани челюсти диаметром 4-5 мм и глубиной около 4 мм с использованием бора соответствующего диаметра и охлаждения физиологическим раствором. Животные были поделены на 3 (три) группы. В группе А в костный дефект добавляли костный деминерализованный графт, полученный из губчатого слоя болынеберцовой кости крупного рогатого скота. В группе В проводили заполнение дефектов ксеногенным деминерализованным костным матриксом с нанесением PRP (Platelet-rich plasma) плазмы крови с повышенным содержанием тромбоцитов с добавлением нанодисперсного диоксида церия. В группе С костные дефекты заполняли костным деминерализованным ксеногенным графтом, обогащенным Platelet-rich plasma с наноСеО₂, с последующим облучением области дефекта с использованием нового лазерного устройства с длиной волны 1265 нм, генерирующего наносекундные импульсы излучения. Костные дефекты укрывали коллагеновой мембраной, мягкие ткани ушивали наглухо с помощью биорезрбируемого шовного материала.

Всех животных подвергали эвтаназии смертельной внутривенной дозой золетила-100 (50 мг/кг) и выводили из эксперимента на 55 сутки. Проводили морфологический и иммуногистохимический анализ. Морфологический анализ носил описательный характер по следующим признакам: наличие или отсутствие новообразованных костных балок, полнокровия сосудов, остеобластов, участков некроза костной ткани, толщина и восстановительный характер изменений в толще костной ткани. Иммуногистохимический анализ проводили на основе анализа экспрессии антигенов: Ki-67, ядерному белку - маркеру пролиферирующих клеток; сосудисто-эндотелиальному фактору роста (VEGF); CD68, маркеру клеток моноцитарно-макрофагального генеза.

По результатам морфологического исследования для наблюдений группы С характерны наиболее выраженная активность интрамембранозного костеобразования, с образованием остеоида и сети молодых костных баночек, окруженных пролиферирующими остобластами (синяя стрелка), а также и повышенная клеточность фибробластов в межбалочном пространстве, что свойственно нормальному остеогенезу. Склеротические изменения с формированием зрелой волокнистой соединительной ткани умеренно выражены, менее, чем в наблюдениях других групп (Фигура).

Иммуногистохимический анализ показал, что применение костного графта насыщенного PRP с наноСеО₂ и наносекундного лазерного излучения с длиной волны 1265 нм способствует повышению пролиферативной активности всех клеточных элементов, в том числе остеобластов, макрофагов, а также эндотелиальных клеток сосудов, что свидетельствует об ускорении процессов регенерации костной ткани в месте дефекта, образованию новых сосудов с повышением трофики тканей и формированием всех структур костной ткани (табл. 1).

1. Чунихин А.А., Базикян Э.А., Сырникова Н.В., Чобанян А.Г. Сравнительная оценка эффективности генерации синглетного кислорода лазерным наносекундным модулем робототехнического хирургического комплекса в модельных биохимических средах // Российская стоматология -2017, Т. 10(2): 30-35.

2. Янушевич О.О., Маев И.В., Базикян Э.А., Чунихин А.А. Изучение генерации синглетного кислорода в слюне человека in vitro под действием наносекундного импульсного лазерного излучения. Вестник РАМН. 2022; 77(4): 285-290.

3. Зайцев В.В., Есипов Р.С, Олейник Н.В., Лукина Ю.С., Васильев М.Г., Мартынов А.Д., Поважный Д.Б. Остеопластические материалы линии ксенопласт на основе химически стабилизированного ксеногенного деминерализованного матрикса, содержащие рекомбинантные костные морфогенетические белки (доклиническая оценка в модельных исследованиях). / Лечение и профилактика. 2016. №1 (17): 77-83.

4. Иванов В.К., Полежаева О.С, Шапорев А.С., Баранчиков А.Е., Щербаков А.Б., Усатенко А.В. Синтез и исследование термической устойчивости золей нанокристаллического диоксида церия, стабилизированных лимонной и полиакриловой кислотами. Журнал неорганической химии. 2010. Т. 55. №3. С. 368-373.

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и предназначено для использования в костно-пластической хирургии дефектов костной ткани челюстей предетальной имплантации, а также в реконструктивной хирургии пародонта и направленной костной регенерации для восполнения объема костной ткани. Осуществляют разрез мягких тканей вдоль нижнего края тела нижней челюсти длиной до 2 см, препарирование отверстия в костной ткани челюсти диаметром 4-5 мм и глубиной около 4 мм с использованием бора соответствующего диаметра и охлаждения физиологическим раствором. Сформированные костные дефекты заполняют костным деминерализованным ксеногенным графтом, обогащенным Platelet-rich plasma с наноСеО₂, с последующим облучением области дефекта диодным лазером, генерирующим импульсное излучение с наносекундной частотой излучения 2 Гц и длиной волны 1265 нм. При этом лазерное облучение области регенерации осуществляют круговыми движениями в течение 2 мин. Затем костные дефекты укрывают коллагеновой мембраной, а мягкие ткани ушивают наглухо биорезрбируемым шовным материалом. Способ за счет повышения пролиферативной активности всех клеточных элементов, в том числе остеобластов, макрофагов, а также эндотелиальных клеток сосудов, позволяет ускорить процессы регенерации костной ткани в месте дефекта. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ регенерации костного дефекта челюстей, включающий разрез мягких тканей вдоль нижнего края тела нижней челюсти длиной до 2 см, препарирование отверстия в костной ткани челюсти диаметром 4-5 мм и глубиной около 4 мм с использованием бора соответствующего диаметра и охлаждения физиологическим раствором, сформированные костные дефекты заполняют костным деминерализованным ксеногенным графтом, обогащенным Platelet-rich plasma с наноСеО₂, с последующим облучением области дефекта диодным лазером, генерирующим импульсное излучение с наносекундной частотой излучения 2 Гц и длиной волны 1265 нм, при этом лазерное облучение области регенерации осуществляют круговыми движениями в течение 2 мин, затем костные дефекты укрывают коллагеновой мембраной, а мягкие ткани ушивают наглухо биорезрбируемым шовным материалом.