Тканебиоинженерная конструкция для восполнения объема костной ткани челюстных костей Российский патент 2023 года по МПК A61K35/28 A61K6/75 A61K33/24 C12N5/775 B82B1/00 B82Y5/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано в хирургии для восстановления костнопластических дефектов костной ткани челюстей при дентальной имплантации, а также в реконструктивной хирургии пародонта.

Дефекты костной ткани могут возникать после стоматологических оперативных вмешательств и их осложнений, а также в результате хронических деструктивных процессов. В ряде случаев заболевания или пороки развития приводят к стойкой потере костной ткани в связи с развитием различных в патофизиологическом отношении патологических процессов.

Значительная атрофия костной ткани затрудняет лечение с использованием съемных протезов, ухудшается эстетический эффект при протезировании несъемными ортопедическими конструкциями. Зачастую становится невозможной стоматологическая реабилитация пациентов с применением дентальных имплантатов в виду недостаточного объема костной ткани. Обеспечение достаточного объема альвеолярной части челюстей перед имплантацией является основной задачей реконструктивных вмешательств с целью нормализации функционального состояния жевательного аппарата. Хирургическое лечение дефицита и дефектов костной ткани направлено на восстановление утраченных тканей в их оригинальной гистоархитектонике и функции. В настоящее время в широкой клинической практике распространены имплантационные материалы для направленной костной регенерации.

Эффективность восстановления костной ткани в таком случае при хирургическом лечении главным образом зависит от свойств имплантационных материалов, которыми замещается дефект.

В реконструктивной хирургии чаще всего используют методику аутотрансплантации костной ткани.

Однако этот метод имеет ряд ограничений, особенно при замещении дефектов костной ткани большого объема. Использование аутотрансплантатов, искусственных костнопластических материалов, факторов роста, тромбоцитарных концентратов не всегда дают хорошие результаты в клинической практике.

Зачастую полученный объем костной ткани недостаточен, требуется повторное хирургическое вмешательство, отмечается травматичность оперативного вмешательства. Таким образом, разработка эффективных средств и методов костной пластики, и создание оптимальных условий репаративного остеогенеза является актуальной проблемой хирургической стоматологии.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (далее ММСК) активно изучаются в течение последних десятилетий, являются оптимальной клеточной популяцией для создания тканеинженерных конструкций. Аутогенные клетки не вступают в конфликт с собственной иммунной системой, не вызывают аллергических реакций. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из биоптата десны, под воздействием индукционных факторов могут дифференцироваться в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях.

Несмотря на многообразие остеопластических материалов различного содержания и свойств, на сегодняшний день среди них нельзя выделить «идеального» для использования в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.

Различия эффектов остеопластических материалов обусловлены разными свойствами минералов, а также коллагенов различных типов. Однако большинство материалов не обладают прогнозируемыми и достаточно выраженными остеопластическими свойствами, особенно у пациентов со слабым репаративным остеогенезом, в силу наследственных или приобретенных качеств и в результате воздействия болезнетворных факторов.

По результатам проведенного информационного поиска были отобраны для последующего анализа следующие патенты.

Известны материалы для имплантации в ткани на основе резорбируемых и нерезорбируемых остеоиндуктивных веществ, которые могут быть минерального или биологического происхождения. Так, известна имплантация в поднадкостничную область материалов на основе коллагена, содержащего костный порошок гидроксиаппатитов, трикальций-фосфатов с применением лекарственных средств гликозамингликанов (РФ №2159101).

Известен биосовместимый костнозамещающий материал, имеющий сквозные поры 0,7-100 мкм и общую пористость 50-85%, на основе реакционно-твердеющей смеси порошков биологического гидроксиапатита с размерами частиц не более 40 мкм и фосфата магния с размером частиц не более 40 мкм, содержащей 2-амино-5-гуанидиновалериановую кислоту, и затворяющей жидкости, содержащей раствор хитозана в янтарной кислоте и водный раствор альгината натрия, и отверждаемый непосредственно перед применением с помощью отвердителя хлорида кальция. (РФ №2494721).

Известен биотрансплантат, выбранный для лечения дегенеративных и травматических заболеваний костной ткани челюстно-лицевой области, характеризующийся тем, что содержит аутологичные или донорские мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) из костного мозга или жировой ткани взрослых доноров, которые распределены в фибриновом сгустке в концентрации 5-7 млн клеток в 1 мл, представляющем собой полимеризованную обогащенную тромбоцитами плазму крови пациента, и матрицу-носитель (в виде крошки, стружки), имеющую в основе своей структуры коллаген-минеральный комплекс, идентичный по составу натуральному костному материалу (РФ №2380105).

Недостатком этого биотрансплантата является недостаточная эффективность восстановления костной ткани, а также существует риск инфицирования прионами и возникновения иммунного ответа у пациента из-за использования эмбриональной телячьей сыворотки в составе культуральной среды.

Известна тканеинженерная конструкция для восполнения объема костной ткани челюстно-лицевой области, выбранная в качестве прототипа, включающая донорские мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки на носителе, в качестве которого используют гранулы октакальций фосфата размером 150-200 мкм с размером пор 1-5 мкм, на поверхности которых инкубированы мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, полученные из биоптата десны пациента и культивированные на среде водного золя нанокристаллического диоксида церия, стабилизированного ионами цитрата в концентрации (10-4)-(10-9)М, при этом концентрация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток составляет 2×10⁷ клеток на 1 г носителя (РФ №2729365).

Техническим результатом является повышение эффективности лечения пациентов хирургического профиля путем совершенствования костнопластических операций за счет применения новых тканеинженерных конструкций.

Технический результат достигается при использовании предлагаемой тканеинженерной конструкции для восполнения объема костной ткани челюстно-лицевой области, включающей донорские мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, полученные из биоптата десны пациента и инкубированные на поверхности носителя в концентрации 2×10⁷ клеток на 1 см³ носителя. При этом, в качестве носителя которого используют матрицы-носители наногидроксиаппатита, с размером пор 20-100 нм, синтезированные из порошка яичной скорлупы и нанодисперсного диоксида церия, с соотношением в кристаллической решетке ионов кальция и катионов диоксида церия 4:1.

Получение конструкции.

1 этап - получение матриц носителей - нанодисперсного гидроксиаппатита, насыщенного нанодисперсным диоксидом церия

Хорошо очищенную яичную скорлупу промывали, затем обжигали в вакуумной печи при температуре 900°С. После обжига образовывался порошок - оксид кальция, который перемалывали дополнительно в шаровой мельнице до получения частиц с размером 2-5 нм. Полученный порошок смешивали с нанодисперсным диоксидом церия, заранее подготовлыннй с размером частиц 2-5 нм, в объемном соотношении 1:0,2 в шаровой мельнице в течение 1 ч. Затем полученную смесь подогревали до 100°С и смешивали с дистиллированной водой и оставляли до полного остывания.

Полученный гидроксид кальция с нанодисперсным диоксидом церия при комнатной температуре титровали раствором ортофосфорной кислоты H₃PO₄ (1,2 М)

В процессе получения гидроксиаппатита, насыщенного нанодисперсным диоксидом церия, контролировали рН реакции для поддержания в диапазоне от 7,5 до 8,5 с целью соблюдения оптимальных условий синтеза для того, чтобы конструкция не распалась. Затем полученный порошок высушивали в вакуумной сушилке при температуре 400°С в течение 1 ч. Сам процесс синтеза нанодисперсного гидроксиаппатита, насыщенного нанодисперсным диоксидом церия, не требует специальных условий и дополнительных ингибиторов.

Полученный порошок в объеме 50 мг смешивали с дистиллированной водой в концентрации 1:0,4 (20 мл) с помощью центрифугирования на малых оборотах при 300 об/мин в течение 5 мин. Полученную суспензию в платиновой чашке размером 10×10×10 мм помещали в вакуумную печь с постепенным нагреванием до 1200°С, на 50°С повышая температуру каждый час в течение 14 часов и еще 2 часа на максимальной температуре, затем постепенно охлаждали в печи. Весь процесс занимал 24 часа. Добивались плотного спекания материала с размером пор 20-100 нм и соотношения в кристаллической решетке ионов кальция и катионов диоксида церия в соотношении 4:1.

В качестве носителя используют полученные матрицы размером 10×10×10 мм синтезированного наногидроксиаппатита с размером пор 20-100 нм с соотношением в кристаллической решетке ионов кальция и катионов диоксида церия в соотношении 4:1.

II этап - получение ММСК

Возможность использования в составе тканеинженерной конструкции выделенных аутогенных мультипатентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), заранее выделенных из биоптата десны и культивированных по следующей методике. Иссечение биоптата прикрепленной слизистой полости рта под местным обезболиванием (Sol.Ultracaini 1,7 ml DC Forte). Иссеченный фрагмент слизистой 2*2 мм был помещен в транспортировочную среду и направлен в лабораторию для клеточного процессинга. Культивирование аутологичных ММСК слизистой оболочки полости рта осуществляли следующим образом.

Биоптат десны помещали в стандартную ростовую среду для транспортировки с последующим культивированием из него клеточной популяции. Затем проводили инкубацию при +4°С не менее 8 часов. В качестве культуральной среды использовали водный золь нанокристаллического диоксида церия, стабилизированного ионами цитрата в концентрациях (10-4)-(10-9) М. Затем проведена экспансия клеток по методике культивирования ММСК в культуральной среде на основе водного золя нанокристаллического диоксида церия, стабилизированного ионами цитрата в концентрациях (10-4)-(10-9) М при 37°С и 5% СО₂ в инкубаторе СО₂ с принудительной конвекцией AWTech LCI(ABTex - Россия). При достижении монослоем 70-80% конфлуэнтности клетки двукратно отмывали стерильным раствором фосфатно-солевого буфера, сняли с поверхности флаконов 0,05% раствором трипсина-ЭДТА (инкубация в течение 2-3 минут), активность трипсина блокировали добавлением 3-5 мл отмывочной среды. Открепившиеся ММСК были собраны в стерильные пробирки, центрифугированы и пересеяны с плотностью около 10⁴ клеток на см². Далее ММСК культивировали до достижения необходимого количества, но не более 4 пассажей. Добивались концентрации клеток 2×10⁷ на 1 мл среды. Полученные растворы ММСК в культуральной среде в виде золя собирали в пробирки объемом 2 мл.

III этап - Заселение клеток на носитель - новую композицию на основе нанодисперсного гидроксиаппатита и нанодисперсного диоксида церия.

Носители кубической формы размером около 10×10×10 мм стерилизовали с использованием -облучения в медицинском стерилизаторе ЭЛС-900 в дозе 15кГр и промывали физиологическим раствором. Клеточную суспензию ММСК с концентрацией 2×10⁷ клеток на 1 мл среды, наносили по 1 мл на 1 см³ образца носителя и инкубировали в течение 1 часа для инициации прикрепления клеток к носителям, затем добавляли культуральную среду-водный золь нанокристаллического диоксида церия, стабилизированного ионами цитрата в концентрациях (10-4)-(10-9) М в объеме 100 мкл. Клетки на носителях инкубировали, меняя ростовую среду каждые 2 суток в течение 12 суток в инкубаторе СО² с принудительной конвекцией AWTech LCI (АВТех - Россия) при 37°С и 5% CO₂.

Заселение ММСК на биоконструкцию усиливало их дифференцировку в остеобласты за счет направленного потенцирования нанодисперсного диоксида церия, входящего в конструкцию. Кроме того, минимальный диаметр пор конструкции от 20 нм до 100 нм способствовал более прочному закреплению ММСК на поверхности биоконструкции.

Биологические испытания, подтверждающие пригодность средства для восстановления костно-пластических дефектов костной ткани челюстей.

Исследование предложенного материала проводили in vivo на кроликах породы «Советская шиншилла». Под общим наркозом путем введения Ксилазина (4-6 мг/кг) внутримышечно и Золетила-100 (5-10 мг/кг), для обеспечения анальгезии и релаксации в течение 30-40 мин, проводили разрез мягких тканей вдоль нижнего края тела нижней челюсти длиной до 2 см, затем проводили препарирование отверстия в костной ткани челюсти диаметром 4-5 мм и глубиной около 4 мм с использованием бора соответствующего диаметра и охлаждения физиологическим раствором. В соответствии с дизайном исследования у животных проводили препарирование челюстных костей с двух сторон челюсти. Слева (сторона эксперимента) в сформированный костный дефект укладывали новую биокомпозицию, справа (сторона сравнения) дефект заполняли ксеногенным остеопластическим материалом (например, Osteobiol Gen-OS).

Позитивные результаты иммуногистохимической реакции учитывали при наличии двух негативных контролей: на специфичность реакции и отсутствие активной эндогенной пероксидазы и одного внутреннего позитивного на специфичность реакции.

На 60 сутки после проведения оперативного вмешательства проводили иммуногистохимические исследования.

Матриксные металлопротеиназы (ММР) относятся к семейству цинковых металлопротеиназ, функция которых связана с обменом соединительнотканного матрикса в т.ч. в костной ткани, в норме и при патологии. Активность ММР регулируется как неспецифическими ингибиторами α2-макроглобулинами, так и специфическими ингибиторами - тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (TIMP).

Доказана эффективность применения предлагаемой тканеинженерной конструкции, (фиг. 1а и 1б). Гистотопограмма поперечного сечения челюсти кролика на 60 сутки эксперимента (а) внесение в сформированный костный дефект ксеногенного остеопластического материала - слабая экспрессия ММР-9; (б) внесение в дефект новой биокомпозиции на основе нанодисперсного диоксида церия и ММСК - слабая экспрессия TIMP-1 (гематоксилин Майера, Zeiss, ×120). В таблице 1 представлена экспрессия ММР-9 и TIMP-1 (М±σ) в очагах внесения в сформированный костный дефект ксеногенного остеопластического материала (а) и новой биокомпозиции на основе нанодисперсного диоксида церия и ММСК (б) на 60 сутки эксперимента.

Использование исследуемой тканеинженерной конструкции ускоряет процесс остеорепарации и способствует послеоперационной реабилитации пациентов при следующих вмешательствах: увеличения объема костной ткани по ширине и высоте; синус-лифтинг; консервация лунок после удаления; заполнение костных дефектов при цистэктомии.

Заявляемая тканеинженерная конструкция рекомендована к клиническому применению при реконструктивных хирургических вмешательствах.

Использование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, полученных из биоптата десны пациента, представляется более удобным ввиду доступности тканевого источника и минимальной инвазивности забора биоптата.

Применение предлагаемой тканеинженерной конструкции позволяет снизить послеоперационные осложнения, сократить сроки реабилитации пациента в послеоперационном периоде.

Преимущества заявленного изобретения заключаются в использовании нанодисперсного гидроксиапатита с нанодисперсным диоксидом церия с улучшенными морфологическими характеристиками и в значительном повышении его биологической активности.

Использование заявленной тканеинженерной конструкции для восполнения объема костной ткани челюстных костей, с использованием аутогенных мультипатентных мезенхимальных стромальных клеток, заранее выделенных из биоптата десны, культивированных в среде на основе водного золя нанокристаллического диоксида церия, стабилизированного ионами цитрата в концентрациях (10-4)-(10-9) М при 37°С и 5% СО₂ для дифференцировки в остеогенном направлении и осажденных на носителе, имеющем пористую структуру с использованием гидроксиаппатита, полученного из яичной скорлупы (биогенного источника кальция). Метод был усовершенствован авторами для получения нанодисперсного гидроксиаппатита с нанодисперсным диоксидом в качестве носителя с заселением на него ММСК с концентрацией 2×10⁷ клеток на 1 см³ носителя.

Использование исследуемой биоконструкции способствует ускорению регенерации за счет стимуляции остеобластогенеза, неоваскуляризации, что свидетельствует о стимуляции полноценных процессов регенерации костной ткани, морфологически идентичной нативной кости челюстей.

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано в хирургии для восстановления костно-пластических дефектов костной ткани челюстей при дентальной имплантации, а также в реконструктивной хирургии пародонта. Предлагается тканеинженерная конструкция для восполнения объема костной ткани челюстно-лицевой области, включающая донорские мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, полученные из биоптата десны пациента, и инкубированные на поверхности носителя, согласно изобретению концентрация клеток составляет 2×10⁷ на 1 см³ носителя, при этом в качестве носителя используют матрицы-носители наногидроксиаппатита, с размером пор 20-100 нм, синтезированного из порошка яичной скорлупы и нанодисперсного диоксида церия с соотношением в кристаллической решетке ионов кальция и катионов диоксида церия 4:1. Вышеописанная тканеинженерная конструкция ускоряет процесс остеорепарации, что способствует послеоперационной реабилитации пациентов при следующих вмешательствах. 2 ил., 1 табл.

Тканеинженерная конструкция для восполнения объема костной ткани челюстно-лицевой области, включающая донорские мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, полученные из биоптата десны пациента, и инкубированные на поверхности носителя, отличающаяся тем, что концентрация клеток составляет 2×10⁷ на 1 см³ носителя, при этом в качестве носителя используют матрицы-носители наногидроксиаппатита, с размером пор 20-100 нм, синтезированного из порошка яичной скорлупы и нанодисперсного диоксида церия с соотношением в кристаллической решетке ионов кальция и катионов диоксида церия 4:1.