Способ получения липосомальной лекарственной формы ацетилцистеина Российский патент 2025 года по МПК A61K9/127 A61K31/198 

Изобретение относится к области фармакологии и медицины, а именно к новому виду лекарственной формы ацетилцистеина, который применяется в качестве растворов для ингаляций и растворов для инъекций с целью лечения бронхо-легочных заболеваний.

Ацетилцистеин является муколитическим, отхаркивающим, и детоксицирующим средством, а также антиоксидантом. Применяется данный препарат при инфекционных заболеваниях верхних и нижних дыхательных путей, сопровождающихся повышенной вязкостью мокроты. Широко исследуется применение ацетилцистеина для лечения и профилактики отравлений. Ведутся исследования терапевтического эффекта при шизофрении, биполярном расстройстве, обсессивно-компульсивном расстройстве, синдроме приобретенного иммунного дефицита (СПИД), синдроме поликистозных яичников и других состояниях [Zuin R., Palamidese A., Negrin R. High–dose N–acetylcysteine in patients with exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease // Clin Drug Investig. 2005. № 25 (6). Р. 401–408; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Diseases (GOLD). Global strategy for diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease. NHLBI/WHO workshop report. Last updated 2009. www.goldcopd.org].

В настоящее время ацетилцистеин коммерчески доступен в различных лекарственных формах, таких как: сироп, гранулы, шипучие таблетки и раствор. Для ингаляционного введения он доступен в виде раствора для ингаляции и, следовательно, требует небулайзера. Однако использование этого ингаляционного устройства является длительным процессом и требует регулярного обслуживания для предотвращения микробного загрязнения. Эти недостатки открывают перспективу для разработки инновационных формул для доставки лекарств в легкие для ацетилцистеина.

Из уровня техники известен способ получения фармацевтической композиции, содержащей инозит, выполненной в виде мягкой капсулы или капсулы из мягкого геля, состоящей из оболочки на основе желатина и наполнения, состоящего из инозитола или его изомера и наполнителей или инозитола или его изомера, наполнителей и по меньшей мере одного дополнительного активного компонента, выбранного из группы, состоящей из фолиевой кислоты, полифенолов какао, генистеина, L-аргинина, витамина E, селена, N ацетилцистеина и мелатонина, где указанное наполнение находится в твердой, жидкой или полужидкой форме (EA 026746, МПК A61K 9/48, опубл. 31.05.2017).

Недостатком указанного способа является содержание в фармацевтической композиции компонентов, способных вызывать нежелательные побочные эффекты, такие как аллергические реакции или проблемы с желудочно-кишечным трактом. Также слабая биоусвояемость некоторых ингредиентов в составе наполнителя может привести к тому, что они не будут полностью поглощаться организмом. Кроме того, данная лекарственная форма может вводится только перорально, что снижает перечень органов-мишеней.

Оригинальным решением является фармацевтическая композиция для перорального применения, содержащая N- ацетилцистеин с маскированным вкусом. Ее структура характеризуется наличием множества частиц с покрытием, включающих в себя ядро и покрытие, где ядро состоит из N- ацетилцистеина, а покрытие содержит триглицерид (RU 2667637, МПК A61K 9/50, A61K 31/198, A61K 47/14, опубл. 21.09.2018).

Недостатком данного способа является слишком большой размер частиц (350-500 мкм), которые нельзя вводить внутривенно и ингаляционно.

Наиболее близким к предлагаемому решению является применение лекарственной формы на основе липосом, представляющих собой полые структуры, состоящие из дилипидного слоя фосфолипидов. Размер липосом варьируется от 20 нм до 50 мкм. Они имеют гидрофильную полярную головку и длинные гидрофобные углеводородные цепи. При добавлении полярного растворителя образуются мембраны, образующие полярный бислой.

Липосомальная лекарственная форма может обеспечивать более длительное действие препарата, увеличивая время полувыведения из организма ацетилцистеина. Это позволит уменьшить количество используемого лекарственного препарата и повысить его эффективность [Almeida B, Nag OK, Rogers KE, Delehanty JB. Recent Progress in Bioconjugation Strategies for Liposome-Mediated Drug Delivery. Molecules. 2020 Dec 1;25(23):5672. doi: 10.3390/molecules25235672].

Исследователи показали эффективное применение липосомального сухого порошка N-ацетилцистеина (SD-NAC-Lip) разработанный для легочного введения. Липосомы были приготовлены методом обратнофазного испарения и высушены распылением с использованием лактозы (10%, м/м) в качестве адъюванта сушки. Сухой порошок липосомального N-ацетилцистеина продемонстрировал более высокую антиоксидантную активность, чем неинкапсулированное лекарство в растворе или сухой порошок, содержащий неинкапсулированный NAC [Ourique, A.F. Redispersible liposomal-N-acetylcysteine powder for pulmonary administration: Development, in vitro characterization and antioxidant activity / A.F. Ourique, P.d.S. Chaves, G.D. Souto et al // Eur J Pharm Sci. – 2014. – №65. – PP. 174-182. DOI: 10.1016/j.ejps.2014.09.017].

Преимуществом предлагаемого способа перед приведенным аналогом является то, что используется более простая и стабильная технология, не требующая дополнительного перерастворения перед использованием. Кроме того, он может использоваться не только в качестве аэрозоля, но и для внутривенного введения. Состав предлагаемого способа близок к составу легочного сурфактанта, обеспечивающего снижение альвеолярного поверхностного натяжения, облегчение дыхания, предотвращая спад дыхательных путей, обеспечивая их проходимость и защищая от инфекций и патологических факторов окружающей среды [Han S, Mallampalli RK. The Role of Surfactant in Lung Disease and Host Defense against Pulmonary Infections. Ann Am Thorac Soc. 2015 May;12(5):765-74. doi: 10.1513/AnnalsATS.201411-507FR. PMID: 25742123; PMCID: PMC4418337].

Технический результат заключается в уменьшении количества используемого лекарственного препарата ацетилцистеина, повышении эффективности его применения за счет новой формы доставки лекарственного препарата, обладающей меньшей токсичностью по сравнению с пустыми липосомами, которая может быть введена в организм разными способами (внутривенно, внутрибрюшинно и ингаляционно), обеспечивающей более длительное его действие благодаря увеличенному времени полувыведения из организма ацетилцистеина, что позволяет увеличить выживаемость пациентов с острым респираторным дистресс-синдромом и уменьшить степень поражения легких.

Сущность изобретения заключается в том, что способ получения липосомальной лекарственной формы ацетилцистеина включает получение липосомальной лекарственной формы путем смешивания лецитина и холестерина, их растворение при помощи хлороформа, высушивание до образования липидной пленки и полного исчезновения хлороформа, дальнейшей гидратации раствором ацетицистеина в растворе 0,9% хлорида натрия, гомогенизации получившейся дисперсиии, ее очищения методом диализа и последующей оценки количественного содержания ацетилцистеина, при этом, состав лекарственной формы ацетилцистеина, находящийся как внутри липосом, так и внелипосомально будет следующим, мас. %:

лецитин 6 холестерин 0,06 ацетилцистеин внутрилипосомальный 1,37 ацетилцистеин внелипосомальный 8,63 хлорид натрия 0,83 вода деионизованная 83,11

Способ получения лекарственной липосомальной формы ацетилцистеина осуществляется следующим образом.

Для получения липосомальной лекарственной формы ацетилцистеина требуется следующее соотношение компонентов, мас. %: лецитин – 2-6, холестерин – 0,02-0,06, ацетилцистеин – 8-10, хлорид натрия – 0,0005-0,001, вода деионизованная – 85-90.

Базовый состав липосомальной формы ацетилцистеина и оптимальное количество компонентов, мас. %:

лецитин 6 холестерин 0,06 ацетилцистеин 10 хлорид натрия 0,83 вода деионизованная 83,11

Точную навеску лецитина (300 мг) и холестерина (3 мг) помещают в круглодонную колбу объемом 1 литр. Затем добавляют хлороформ до полного растворения лецитина и холестерина. Органический растворитель упаривают под вакуумом при температуре 50 °С, постепенно увеличивая количество оборотов с 50 об/мин до 210 об/мин. Высушивание проводят до образования липидной пленки и полного удаления хлороформа. После чего ее гидратируют раствором ацетилцистеина 100 мг/мл в 0,9% растворе хлорида натрия общим объёмом 5 мл. Образовавшуюся дисперсию мультиламеллярных везикул гомогенизировали с помощью газового экструдера AE001 Antos Nanotech (Китай) с использованием поликарбонатных фильтров с диаметром пор 400 нм под давлением сверхчистого азота 10 МПа.

Для измерения размера липосом используют наносайзер – NANO-flex. Примерно 1 мл раствора липосом помещают в пробирку Eppendorf и проводят анализ. Определение размеров проводится автоматически с помощью программы Microtrac Flex 11.0.0.2.

Полученные липосомы имеют размер 100±15 нм, что оптимально как для использования путем ингаляции, так и для внутривенного и внутрибрюшинного введения.

Очистку липосомальной дисперсии проводят методом диализа. В диализный стакан устанавливают мембрана с диаметром пор 12-14 кДа, после чего в него помещают 5 мл раствора липосом и доводят его объем до 50 мл. Далее стакан устанавливают на магнитную мешалку. В стакане с помощью баллона с азотом создают повышенное давление в 0,3 МПа. Диализ проводят в течение 24 часов до образования в стакане густого раствора липосом объемом 5 мл. Полученный диализат используют для определения эффективности включения действующего вещества в липосомы.

Количественное определение содержания ацетилцистеина в липосомах определяют спектрофотометрическим методом. При взаимодействии ацетилцистеина с железом (III) и 1,10-фенантролином образуется комплексное соединение, имеющее ярко-оранжевую окраску. Максимум поглощения данной системы находится в области 510 нм.

Далее проводят спектрофотомерию с использованием раствора сравнения (холостой опыт без ацетилцистеина). Концентрацию определяют по градуировочному графику, построенному по растворам стандартных образцов.

Эффективность включения ацетилцистеина в липосомы равна 13,7325%±0,392%. Таким образом, концентрация ацетилцистеина в липосомах составляет 100 мг/мл, при этом концентрация внутрилипосомального ацетилцистеина составляет 13,7 мг/мл, а внелипосомального 86,3 мг/мл.

Состав лекарственной формы ацетилцистеина, находящейся как внутри липосом, так и внелипосомально будет следующим, мас. %:

лецитин 6 холестерин 0,06 ацетилцистеин внутрилипосомальный 1,37 ацетилцистеин внелипосомальный 8,63 хлорид натрия 0,83 вода деионизованная 83,11

Изучение цитотоксичности липосомальной лекарственной формы ацетилцистеина методом МТТ-теста на клеточной культуре L929 представлено ниже.

Изучение цитотоксичности производят по стандартной методике на культуре клеток фибробластов мыши L929. Фибробласты мыши культивируют на среде DMEM c 10% эмбриональной телячьей сыворотки в стандартных условиях: атмосфера 5% СО₂, при температуре 37 °С и влажности 5% в инкубаторе.

Для эксперимента в экспоненциальную фазу роста клетки рассеивают в объеме 100 мкл среды DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки в 96-луночный планшет. Клетки инкубируют 24 часа, затем добавляют лекарственную липосомальную форму ацетилцистеина (100 мкл, с последовательным двукратным разбавлением). Также для сравнения изучают токсичность пустых липосом в эквивалентных разведениях. В качестве пассивного контроля используют 100 мкл 0,15 М раствор хлорида натрия и раствор холостых липосом без ацетилцистеина. Итоговый объем раствора в лунках составляет 200 мкл. Время экспозиции с исследуемыми препаратами составляет 24 часа.

После указанного выше интервала времени инкубации среду заменяют на свежую и добавляют 30 мкл раствора МТТ (концентрация 5 мг/мл). После чего клетки инкубируют в течение 3 часов в стандартных условиях инкубатора, затем среду аспирируют, и в лунки добавляют 150 мкл 100% ДМСО (использованный в данном случае для лизирования клеток). Далее планшеты помещают в шейкер на 20 минут для полного растворения образовавшегося формазана. Для оценки оптической плотности используют мультимодальный ридер Thermo Scientific Varioskan LUX при длине волны 492 нм против референсной 620 нм. Клеточную жизнеспособность определяют как соотношение оптической плотности образца к оптической плотности контроля, выражаемое в процентах.

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что липосомальная лекарственная форма ацетилцистеина не превосходит по токсичности пустые липосомы, а в ряде случаев и обладают меньшей токсичностью.

По сравнению с известными решениями заявленное изобретение позволяет уменьшить количество лекарственного препарата ацетилцистеина, повысить эффективность его применения за счет новой формы доставки лекарственного препарата, обладающей меньшей токсичностью по сравнению с пустыми липосомами, которая может быть введена в организм разными способами (внутривенно, внутрибрюшинно и ингаляционно), обсеспечивающей более длительное его действие благодаря увеличенному времени полувыведения из организма ацетилцистеина, что позволяет увеличить выживаемость пациентов с острым респираторным дистресс-синдромом и уменьшить степень поражения легких.

Изобретение относится к области фармакологии и медицины, а именно к новому виду лекарственной формы ацетилцистеина, который применяется в качестве растворов для ингаляций и растворов для инъекций с целью лечения бронхолегочных заболеваний. Способ получения липосомальной лекарственной формы ацетилцистеина заключается в получении липосомальной лекарственной формы путем смешивания лецитина и холестерина, их растворения при помощи хлороформа, высушивания до образования липидной пленки и полного исчезновения хлороформа, дальнейшей гидратации раствором ацетилцистеина в растворе 0,9% хлорида натрия, гомогенизации получившейся дисперсии, ее очищения методом диализа и последующей оценки количественного содержания ацетилцистеина, при этом состав лекарственной формы ацетилцистеина, находящийся как внутри липосом, так и внелипосомально, мас. %: лецитин 6, холестерин 0,06, ацетилцистеин внутрилипосомальный 1,37, ацетилцистеин внелипосомальный 8,63, хлорид натрия 0,83, вода деионизованная 83,11. Заявленное изобретение позволяет уменьшить количество лекарственного препарата ацетилцистеина, повысить эффективность его применения за счет новой формы доставки лекарственного препарата, обладающей меньшей токсичностью по сравнению с пустыми липосомами, которая может быть введена в организм разными способами (внутривенно, внутрибрюшинно и ингаляционно), обеспечивающей более длительное его действие благодаря увеличенному времени полувыведения из организма ацетилцистеина, что позволяет увеличить выживаемость пациентов с острым респираторным дистресс-синдромом и уменьшить степень поражения легких.

Способ получения липосомальной лекарственной формы ацетилцистеина заключается в получении липосомальной лекарственной формы путем смешивания лецитина и холестерина, их растворения при помощи хлороформа, высушивания до образования липидной пленки и полного исчезновения хлороформа, дальнейшей гидратации раствором ацетилцистеина в растворе 0,9% хлорида натрия, гомогенизации получившейся дисперсии, ее очищения методом диализа и последующей оценки количественного содержания ацетилцистеина, при этом состав лекарственной формы ацетилцистеина, находящийся как внутри липосом, так и внелипосомально, будет следующим, мас. %:

лецитин 6 холестерин 0,06 ацетилцистеин внутрилипосомальный 1,37 ацетилцистеин внелипосомальный 8,63 хлорид натрия 0,83 вода деионизованная 83,11