Способ оценки эффективности применения лекарственного препарата «Лаеннек» на фармакологической модели неалкогольной жировой болезни печени с перегрузкой железом у экспериментальных животных.
Изобретение относится к медицине, а именно оценки эффективности применения препарата «Лаеннек» у экспериментальных животных на модели перегрузки печени железом у крыс при влиянии избыточного потребления пальмового масла и фруктозы
Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) - заболевание, характеризующаяся повышенным содержанием жирового компонента ткани, и выражающиеся двумя патоморфологическими видами: неалкогольный стеатоз (жировой гепатоз) и неалкогольный стеатогепатит.В 30% случаев НАЖБП сочетается с перегрузкой железом, что проявляется развитием гемосидероза: накоплением мелкодисперсных оксидов железа в печени и в других органах. Гемосидероз отягощает НАЖБП посредством активации про-оксидантных, про-воспалительных и про-тромботических процессов, способствующих формированию ферроптоза гепатоцитов, неалкогольного стеатогепатита и цирроза печени (Торшин И.Ю., Громова О.А., Богачева Т.Е. Систематический анализ взаимосвязей между неалкогольной жировой болезнью печени и перегрузкой тканей железом: перспективные направления применения полипептидной терапии. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2023; (10): 139-152).
Для лечения перегрузки железом при НАЖБП не указано специальных средств коррекции. В работе представлена разработанная нами и патоморфологически подтвержденная модель НАЖБП с перегрузкой железом с полиорганной патологией у крыс, вызванная одновременным приемом избытка жиров (пальмовое масло), углеводов (фруктоза) и неорганического железа (сульфат железа) в течение 12 дней. На данной фармакологической модели была изучена эффективность и безопасность использования стандартизированного гидролизата плаценты человека «Лаеннек» (пр-во Japan Bioproducts, Япония).
Обладающие потенциалом средства для лечения НАЖБП и профилактики неалкогольного стеатогепатита являются стандартизированные гидролизаты плаценты человека (ГПЧ). В настоящее время, ГПЧ производятся и исследуются посредством современных протеомных технологий, т.к. представляют собой перспективное средство для регенерации тканей и органов, в т.ч. с высоким содержанием митохондрий (печени, почек, мозга, миокарда). Экспериментальные и клинические исследования ГПЧ подтвердили высокую эффективность и безопасность для терапии НАЖБП и ее осложнений (Торшин И.Ю., Громова О.А., Тихонова О.В., Чучалин А.Г. О молекулярных механизмах воздействия пептидов стандартизированного гидролизата плаценты на функционирование митохондрий. Терапевтический архив. 2023;95(12):1141-1148). В частности, в разработанной нами ранее модели НАЖБП, основанной на хроническом приеме твердых фракций рафинированного пальмового масла, применение ГПЧ «Лаеннек» достоверно снижало уровни биомаркеров дисфункции печени, возрастающие при воспроизведении модели (билирубин, общий белок, АЛТ, ACT). Гепатопротекторный эффект ГПЧ был подтвержден результатами гистологических и биохимических исследований, указывающими на снижение выраженности и распространенности жировой дистрофии печени (Патент на изобретение №2811886; Богачева Т.Е., Калачева А.Г., Громова О.А., Торшин И.Ю., Гришина Т.Р., Демидов В.И. Изучение эффективности препарата Лаеннек при повреждении печени пальмовым маслом у крыс.Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2023;(4):23-31).
Перспективное использование ГПЧ при терапии НАЖБП с перегрузкой железом является наличие в составе стандартизированных ГПЧ пептидов, способствующих нормализации обмена железа (в т.ч. предотвращения перегрузки железом). Например, в ГПЧ «Лаеннек» найдены 19 пептидов, вовлеченных в регулировку гомеостаза железа: (1) хелаторы ионов железа (пептиды PAGAPQV, VCTNLG, ALHAQY, NEGLPV, VTLDGG), (2) гормоно-подобные пептиды геморфин, спинорфин (VVYPWTE), (3) пептиды-ингибиторы специфических таргетных белков гамма-секретазы (MVGSVV), протеазы фурин (SLEHEP), FKBP1A (GAGLPL, LPLLVQ), CUL1 и SKP1 (NLTVLSLP), пептиды-активаторы ретиноидного рецептора RXRA (SLLQLTG, LELDSSD), пептиды-ингибиторы растворимого белка гемохроматоза HFE2 (VYPFGE, VAALNS). Идентифицированные пептиды способствуют устранению перегрузки тканей железом посредством регуляции уровней гепцидина и ферритина (основных защитных механизмов от перегрузки тканей железом) и, также, посредством противовоспалительного действия (Громова О.А., Торшин И.Ю., Максимов В.А., Чучалин А.Г., 3 года В.Г., Громов А.Н., Тихонова О.В. Пептиды в составе препарата Лаеннек, способствующие устранению гиперферритинемии и перегрузки железом. ФАРМАКОЭКОНОМИКА. Современная фармакоэкономика и фармакоэпидемиология. 2020; 13(4):413-425).
Технический результат заключается в том, что на гистологической подтвержденной модели НАЖБП с полиорганной патологией у крыс, вызванная сочетанными приемом избытка жиров (пальмовое масло), углеводов (фруктоза) и неорганического железа (сульфат железа) доказана эффективность применения стандартизированного гидролизата плаценты человека (ГПЧ) «Лаеннек». Применение Лаеннека в дозе 0,6 мл/кг массы в сутки, внутримышечно, в течение 4 недель приводило к нормализации перечисленных показателей полиорганной патологии: к достоверному снижению ферритина, ACT, АЛТ, лейкоцитов, тромбоцитов и к достоверному повышению общего белка, креатинина и СКФ. Гистологический анализ показал, что ГПЧ Лаеннек способствует выведению железа из печени, одновременно препятствуя повреждениям почек, головного мозга и миокарда в предлагаемой модели НАЖБП с перегрузкой железом. Таким образом, применение стандартизированного ГПЧ эффективно и безопасно в терапии экспериментальной НАЖБП с перегрузкой железом. Материалы и методы.
Эксперимент по изучению эффективности ГПЧ Лаеннек при неалкогольной жировой болезни печени с перегрузкой железом был проведен на 24 белых крысах-самцах массой 300-400 г. Животные были разделены на 3 группы: первая группа (n=6) - интактный контроль (на нормальной диете и питье в виде чистой питьевой воды).; во второй (n=12) и в третьей (n=6) группах животных воспроизводилась модель перегрузки печени железом в условиях добавления в диету насыщенных жиров и фруктозы - особям внутрибрюшинно вводили железо сернокислое (II) 7-водное (хч) в дозе 50 мг/кг массы в сутки (АО «ЛенРеактив», паспорт №070051-81), одновременно в рацион питания добавляли твердую фракцию пальмового масла (CandleM, Индонезия) в дозировке 30 г/кг/сут., раствор фруктозы из расчета 1 г/кг/сутки (ООО «Компания «Сладкий мир», ТУ 10.86.10-027-72315488-2019. партия 210723) перорально в виде питьевого режима в течение 12 дней. На 13 день исследования животных первой и второй групп, из каждой по (n=6) наркотизировали, проводили забор крови для биохимического исследования и секционного материала (печени, почек, мозг, сердце) для патогистологического исследования.
После воспроизведения модели в группах 2-3 (т.е. начиная с 13 дня от начала эксперимента) животные переводились на стандартную диету и обычный питьевой режим.
С 13 дня исследования в третьей группе (n=6) крыс вводили препарат ГПЧ «Лаеннек» (регистрационный номер №013851/01, Джапан Био Продактс Ко., Япония) в дозе 0,6 мл/кг массы в сутки, в/м, в течение 4 недель. На 41-ый день исследования животных второй и третьей групп наркотизировали, проводили забор крови для биохимического исследования и секционного материала (печени, почек, мозг, сердце) для патогистологического исследования.
Животные содержались в стандартных условиях в соответствии с правилами, утвержденным санитарным врачом РФ от 29.08.2014 №51 об утверждении СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)». Животные содержались в поликарбонатных клетках, группами одного пола (самцы), на подстилке; клетки покрыты стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением. В качестве подстилки использовались опилки.
Корм для содержания лабораторных животных ЛБК-120, приготовленный по ГОСТ Р50258-92, давался ad libitum («по желанию») в кормовое углубление стальной решетчатой крышки клетки. Данные о составе и качестве корма от производителя хранились в документации лаборатории и в файле исследования. Животным давалась вода, соответствующая ГОСТ Р51232-98 «Вода питьевая. Общие требования к организации и методам контроля качества». Вода в стандартных поилках со стальными крышками-носиками, давалась ad libitum («по желанию»).
Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды (18-26°С и относительной влажности воздуха 30-70%). В комнатах содержания животных поддерживался 12-ти часовой цикл освещения. Контроль условий окружающей среды осуществлялся измерителем комбинированным Testo фирмы Testo AG (Германия) и фиксироваться в соответствующем журнале. Для акклиматизации лабораторные животные до начала исследования содержались 5 дней при одиночном содержании в клетках. Во время этого периода у животных ежедневно контролировалось клиническое состояние путем визуального осмотра. Животные с обнаруженными в ходе осмотра отклонениями не были включены в экспериментальные группы.
При начале эксперимента животные были распределены по группам 1-3 так, чтобы индивидуальное значение массы тела не отклонялось от среднего по группе значения массы тела более чем на 20% (в пределах одного пола). Взвешивание осуществлялось на электронных весах для взвешивания крыс/мышей (пр-во Cas Corporation, Россия). Наблюдения за животными проводились ежедневно; фиксировались общее состояние, аппетит, особенности поведения, интенсивность и характер двигательной активности, частота и глубина дыхательных движений, состояние волосяного и кожного покрова, положение хвоста, количество и консистенция фекальных масс.
В крови определялись биохимические показатели: ферритин, насыщение трансферрина, железо сыворотки, ретикулоциты (%), ретикулоциты (абс), фракция ретикулоцитов (%), лейкоциты (абс), эритроциты (абс) гемоглобин, гематокрит (%), объем эритроцита, гемоглобин эритроцита, содержание гемоглобина в эритроците тромбоциты (абс), индекс mentzer, индекс sirdah, фолаты сыворотки, белок сыворотки, аспартатаминотрансфераза (ACT), аланинаминотрансфераза (АЛТ), креатинин сыворотки, скорость клубочковой фильтрации (СКФ), билирубин общий/прямой, витамины В9 и В12 в сыворотке крови. Лейкоциты, эритроциты, гемоглобин, гематокрит, средний объем эритроцита, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средн. конц. гемоглобина в эритроците, тромбоциты, ретикулоциты определялись проточной цитофлуориметрией (цитофлуоритметр ВС-6200, Mindray, Китай). Остальные биохимические показатели определялись на универсальном анализаторе крови Cobas 6000 (пр-во Roche Diagnostics, Швейцария) с использованием различных подходов. Ферритин и трансферрин определялись иммунотурбидиметрией; железо сыворотки, общий белок, билирубин общий и прямой - колориметрией; ACT и АЛТ - УФ кинетическим тестом, креатинин сыворотки и СКФ - «кинетическим» методом Яффе; витамин В12 - иммунохемилюминесценцией, витамин В9 (фолаты) - твердофазным хемилюминесцентным иммуноферментным анализом.
Патогистологическое исследование секционного материала. На 13, 41 сутки от начала эксперимента животные выводились путем достижения наркозной смерти с использованием препарата Золетил. Материал для гистологического исследования получали в ходе аутопсии экспериментальных животных. Посредством краниотомии головной мозг извлекался целиком и фиксировался в 10% растворе нейтрального формалина, через 1 сутки с помощью фронтальных разрезов выделялась зона прецентральной извилины переднего мозга, мозжечок, ствол головного мозга. После эвисцерации сердце, печень и почки фиксировались в 10% растворе нейтрального формалина, через 1 сутки органы препарировались, выделались фрагменты миокарда левого желудочка, правой и левой доли печени, кортикальные отделы правой и левой почек, которые повторно фиксировались. После вторичной фиксации и промывки материала проводка (обезвоживание) тканей головного мозга, печени и почек осуществлялась с помощью 99% изопропилового спирта. В дальнейшем кусочки заливались парафином и изготовленные на санном микротоме «Microm» гистологические срезы толщиной 5-6 мкм окрашивались гематоксилином и эозином. Дубликаты срезов с помощью набора реактивов компании «Биовитрум» окрашены по Перльсу для выявления в тканях трехвалентного железа, результатом проведенной реакции должно быть образование окрашенной в синий цвет соли - берлинской лазури (4Fe3+3K4Fe(CN)6=Fe4 (Fe(CN)6)3+12К+). Оценка патологических изменений органов крыс при моделировании вторичного гемохроматоза и стеатоза печени учитывала степень расстройства кровообращения, наличие и локализацию берлинской лазури, особенности ответной воспалительной реакции, структурные изменения паренхиматозных элементов. Микрофотографии получены с помощью исследовательского микроскопа «Micros» МС-200 и цифровой окулярной камеры DCM 900.
В результате исследования было установлено, что применение ГПЧ Лаенненк при воспроизведение модели НАЖБП с перегрузкой железом, приводит к комплексным и взаимосвязанным изменениям сразу нескольких биохимических показателей крови. Для полноценного описания результатов были использованы метрические карты показателей (параметров) исследования и профиль-диаграммы нормализованных значений всех исследованных показателей. Метрические карты показателей (параметров) исследования представляют собой отображение всего комплекса взаимодействий параметров, спроецированных на плоскость диаграммы. Каждая точка метрической диаграммы соответствует одному показателю исследования (например, уровням железа сыворотки) в определенный день исследования в определенной группе. Соответственно, метрическая диаграмма позволяет оценивать (1) степень взаимодействия показателей (чем больше коррелируют два показателя/параметра, тем ближе соответствующие точки на диаграмме), (2) динамику изменения параметров (т.к. значение одного и того же показателя в разные моменты времени, в общем случае, соответствует двум разным точкам), (3) различия между группами (значение одного показателя для разных групп соответствует двум разным точкам).
Из приведенной метрической диаграммы (рис. 1), отражающей согласованные изменения биохимических показателей при воспроизведении модели НАЖБП с перегрузкой железом (точками голубоватого цвета обозначены параметры в группе интактных животных, оранжевого цвета - параметры при воспроизведении модели, данные на день 41) очевидно, что при воспроизведении модели характерно движение точек слева направо (соответствует усилению полиорганной патологии: возрастание уровней лейкоцитов, тромбоцитов, ACT, АЛТ, нарушения индексов Сирдаха, Ментцера и др.) и сверху вниз (противоположно действию терапии: нарушения уровней эритроцитов, гемоглобина, возрастание железа сыворотки и др.). Таким образом, воспроизведение модели соответствует усилению патофизиологических процессов в различных системах органов.
Профиль-диаграммы нормализованных значений всех исследованных показателей позволяют (1) целостно описывать динамику и различия между группами, (2) формировать и оценивать интегральные оценки (баллы) состояния групп животных в различные моменты времени. Как известно, значения различных биомедицинских показателей могут лежать в разных диапазонах (0-1, 50-500 и т.д.), поэтому не всегда могут быть представлены на одной диаграмме.
Анализ нормализованных профиль-диаграмм значений биохимических показателей (красная штрих-пунктирная линия описывает профиль изменений в целом по всем показателям. 1 - Ферритин, мкг/л; 2 - Коэффициент насыщения трансферрина железом, %; 3 - Железо сыворотки, мкмоль/л; 4 - Ретикулоциты, %; 5 - Ретикулоциты, *10^9/л; 6 -Фракция ретикулоцитов, %; 7 - Лейкоциты, *10^9/л; 8 - Эритроциты, *10^12/л; 9 -Гемоглобин, г/л; 10 - Гематокрит, %; 11 - Средний объем эритроцита, fL; 12 - Средн. сод. гемоглобина в эр-те, пг; 13 - Средн. конц. гемоглобина в эр-те, г/л; 14 - Тромбоциты, * 10^9/л; 15 - Индекс Mentzer; 16 - Индекс Sirdah; 17 - фолаты, нмоль/л; 18 - Белок общий в сыворотке, г/л; 19 - ACT, Ед/л; 20 - АЛТ, ед./л; 21 - Креатинин сыв., мкмоль/л; 22 - СКФ; 23 - Билирубин общий, мкмоль/л; 24 - Билирубин прямой, мкмоль/л; 25 - Витамин В12, пг/мл; 26 - Купферовские клетки, в цитоплазме кот. содержится берлинская лазурь) (рис. 2) в группе 2 указывает на резкое возрастание ферритина (показатель 1), резкое падение показателей 8-11 (эритроциты, гемоглобин, гематокрит, средний объем эритроцита), возрастание показателей 12-17 (среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглобина в эритроците, тромбоциты, индексы Ментцера и Сирдаха, фолаты), падение белка в сыворотке и др.
Патоморфологическое подтверждения результатов биохимических исследований при воспроизведении модели НАЖБП с перегрузкой железом.
Во всех наблюдениях группы интактных контролей (группа 1), микроскопическая картина ткани печени соответствовала норме (рис. 3. Увеличение на всех слайдах ×480. Окраска реакцией Перльса (А), гематоксилином и эозином (Б-Д). А) Структура неизмененной печеночной дольки с трабекулярным уложением гепатоцитов. Б) Единичные лимфоциты в строме портального тракта на фоне равномерной перфузии всех отделов печеночной дольки. В) Почечный клубочек имеет просвет капсулы и свободный мезангиум, клетки эпителия проксимальных и дистальных извитых канальцев с гомогенной окраской цитоплазмы. Г) Пирамидные нейроны привычной конфигурации с равномерным распределением глыбок Ниссля в цитоплазме. Д) Сократительные волокна равномерной окраски и толщины, видны анизотропные диски).
В пределах отдельно взятой печеночной дольки при сохранении гистоархитектоники гепатоциты имели привычную конфигурацию и равномерную окраску с равномерным распределением ультраструктур в цитоплазме без образования берлинской лазури (рис. 3А), наблюдалась равномерная перфузия синусоидов как в центральной и в перипортальной зонах, в строме портальных трактов присутствовали единичные лимфоциты (рис. 3Б). Исследование корковой зоны почек показало привычное строение клубочков с нормальным уровнем перфузии кровью, свободным мезангиальным пространством. Нефроциты в пределах извитых проксимальных и дистальных канальцев не имели повреждений (рис. 3В). Головной мозг крыс контрольной группы имел нормальный уровень перфузии без признаков агрегации эритроцитов в капиллярах и отека нервной ткани. Нейроны имели привычную форму и размеры с четкими контурами ядер. В цитоплазме пирамидных нейронов коры полушарий переднего мозга глыбки Ниссля имели равномерное распределение (рис. 3Г). В миокарде левого желудочка наблюдались ориентированные сократительные волокна с сохраненной поперечной исчерченностью (рис. 3Д).
Во второй группе (рис. 4. Окраска гематоксилином и эозином - слайды Б, Д, Е, Ж; окраска реакцией Перльса - слайды А, В, Г. Слайды Б, В, Г - увеличение ×480, слайды А, Д, Е, Ж-увеличение х1200. А) Внутри и внеклеточное отложение глыбок берлинской лазури на периферии печеночной дольки. Б) Мелкокапельное ожирение гепатоцитов центра печеночной дольки. В) Цитоплазма звездчатых ретикулоэндотелиоцитов (купферовских клеток) насыщена берлинской лазурью. Г) Очаговое скопление берлинской лазури в капсуле печени. Д) Крупнокапельное ожирение гепатоцитов центра печеночной дольки. Е) Воспалительно-клеточная инфильтрация стромы портального тракта. Ж) В составе инфильтрата Т-лимфоциты (А), эозинофилы (Б)) через 12 дней введения сульфата железа, пальмового масла и раствора фруктозы в печени наблюдалось накопление железосодержащих соединений в пространстве Диссе, цитоплазме гепатоцитов и купферовских клеток перипортальной зоны печеночных долек (рис. 4А). В центральных отделах печеночной дольки гепатоциты содержали мелкие капли липидов (рис. 4Б). Через 41 день от начала эксперимента железосодержащий субстрат в печени перераспределился и активно накапливался в цитоплазме купферовских клеток (рис. 4 В) и между соединительнотканными волокнами капсулы печени (рис. 4Г), причем большинство гепатоцитов были свободны от берлинской лазури. Наблюдалось прогрессирование жировой дистрофии гепатоцитов с образованием крупных вакуолей с липидами в их цитоплазме (рис. 4Д). В большинстве наблюдений строма портальных трактов имела воспалительно-клеточный инфильтрат, состоящий преимущественно из Т-лимфоцитов и эозинофилов (рис. 4Е,Ж). Гистологическая картина соответствовала умеренной выраженности воспалительной реакции как ко дню 13, так и ко дню 41 после воспроизведения модели. Исследование гистологических срезов кортикальной зоны почек (рис. 5. Окраска гематоксилином и эозином - слайд Б; окраска реакцией Перльса - слайды А, В, Г. Слайды Б, В - увеличение ×480, слайды А, Г - увеличение ×1200. А) Зерна берлинской лазури в цитоплазме эпителия проксимальных извитых канальцев. Б) Эозинофильные массы в просветах дистальных отелов канальцев. В) Окрашивание в синий цвет (на железо) содержимого дистальных извитых канальцев. Г) Цитоплазма нефроцитов дистальных канальцев насыщена железосодержащими продуктами (А), мелкие зерна берлинской лазури в цитоплазме эпителия проксимальных извитых канальцев (Б)) на 12 день проведения эксперимента показало накопление мелких «зерен железа» в цитоплазме нефроцитов проксимальных извитых канальцев, которое носило диффузно-очаговый характер (рис. 5А). В 2-х наблюдениях просветы дистальных извитых канальцев были обтурированы эозинофильными массами из нерастворимых углеводов и липидов, что свидетельствовало о нарушении гломерулярного фильтра (рис. 5Б). К 41-ому дню эксперимента наблюдалась активная экскреция железосодержащих соединений, что подтверждается прокрашиванием в синий цвет мочи в просветах дистальных отделов извитых канальцев (рис. 5В). При этом, нефроциты дистальных канальцев, учитывая их реабсорционную компетентность, стали активно накапливать «зерна железа» в цитоплазме; нефроциты проксимальных канальцев сохраняли в цитоплазме единичные зерна берлинской лазури (рис. 5Г). При исследовании головного мозга (рис. 6. Окраска гематоксилином и эозином - слайд А; окраска реакцией Перльса - слайды Б, В, Г. Слайд А - увеличение ×480, слайды Б, В, Г - увеличение ×1200. А) Периваскулярный и перицеллюлярный отек нервной ткани (А), пирамидный нейрон без структурных изменений (Б). Б) Очаговое отложение железосодержащих продуктов в периваскулярном пространстве. В) Накопление железосодержащих гранул в цитоплазме астроцита. Г) Накопление железосодержащих гранул кардиомиоцитами в периваскулярной зоне миокарда левого желудочка) к 13-му дню эксперимента на фоне умеренно выраженного периваскуляного и перицеллюлярного отека нервной ткани (рис. 6А) наблюдалось очаговое накопление железосодержащих веществ в периваскулярном пространстве (рис. 6Б). Структурных нарушений нейронов не обнаружено. К 41-ому дню от начала эксперимента в нервной ткани полушарий большого мозга и мозжечка сохранялись одиночные очаги с глыбками берлинской лазури, кроме того отмечалась активность астроцитов, в цитоплазме которых располагались мелкие гранулы железосодержащих продуктов (рис. 6В). Исследование сердца экспериментальных животных показало сохранность паренхиматозных и стромально-сосудистых элементов миокарда (13-ый и 41-ый дни). Минимальные изменения обнаружены лишь в 2-ух наблюдениях в виде мелкоочагового отложения гранул берлинской лазури в цитоплазме кардиомиоцитов (рис. 6Г).
Таким образом, при воспроизведении модели неалкогольной жировой болезни печени с перегрузкой железом у экспериментальных животных установлены структурные изменения печени, почек, головного мозга и миокарда на микроскопическом уровне, характерные для полиорганной патологии. В печени наблюдалось накопление железосодержащих продуктов (гемосидерина) в цитоплазме гепатоцитов и в пространстве Диссе перипортальной зоны печеночной дольки. Выявлена макрофагальная активность звездчатых ретикулоэндотелиоцитов (купферовских клеток) с тенденцией к нарастанию уровня фагоцитоза железосодержащих продуктов к 41-му дню эксперимента. Жировая дистрофия гепатоцитов (как главный морфологический критерий стеатоза) носила диффузно-очаговый характер с локализацией в центрах печеночных долек и выражалась мелкокапельным ожирением гепатоцитов на 13 -ый день эксперимента, с крупнокапельным ожирением к 41 дню. Наличие в строме портальных трактов воспалительно-клеточного инфильтрата с участием эозинофилов свидетельствует о развитии реактивного (медикаментозного) гепатита. После воспроизведения модели (день 13) в почках установлена инфильтрация железосодержащих продуктов в цитоплазму нефроцитов на всем протяжении канальцев, без существенных расстройств кровотока и воспалительной реакции. К 41-ому дню эксперимента отмечена экскреция и реабсорбция железа, что привело к перегрузке железосодержащими продуктами нефроцитов проксимальных и дистальных извитых канальцев. В головном мозге и в миокарде содержание «зерен железа» оказалось минимальным и наблюдалось в виде фокальных очагов скопления мелких глыбок берлинской лазури при отсутствии морфологических признаков какого-либо токсического воздействия на паренхиматозные элементы этих органов. Возможные причины минимального эффекта на мозг включают малые сроки после воспроизведения модели и фильтрующую роль гемоэнцефалического барьера В случае миокарда, минимальной количество отложений железа связанно, скорее всего, спостоянной двигательной активностью данного органа и с высоким количеством митохондрий в кардиомиоцитах (что ускоряет цикл детоксикации клеток). Применения препарата «Лаеннек» на модели неалкогольной жировой болезни печени с перегрузкой железом у экспериментальных животных.
Применение ГПЧ соответствует движению точек, соответствующих биохимических показателям исследования, справа налево (снижение полиорганной патологии: нормализация ACT, АЛТ, ферритина, железа сыворотки крови, нормализация уровней билирубина и др.) и снизу вверх (положительный эффект терапии: снижение абнормально повышенных уровней лейкоцитов, нормализация уровней витамина В12, белка сыворотки и др. (рис. 7. Метрическая диаграмма согласованной динамики показателей при терапии Лаеннеком модели НАЖБП с перегрузкой железом. Оранжевым цветом обозначены точки, соответствующие показателям в группе воспроизведения модели на день 41, красным - точки в группе, получавшей лечение ГПЧ Лаеннек, день 41). Таким образом, лечение НАЖБП с перегрузкой железом посредством ГПЧ приводило к нормализации не только стандартных показателей, обычно используемых при оценки динамки лечения НАЖБП (уровни ACT, АЛТ, билирубина), но и многих других биохимических показателей, характеризующих функцию различных органов.
Нормализованные профили значений биохимических показателей при применении ГПЧ Лаеннек на 41 день представлены на профиль-диаграмме (рис. 8). Для Лаеннека характерно, прежде всего, снижение значений показателей 1-12 (показатели обмена железа: ферритин, коэффициент насыщения трансферрина железом,железо сыворотки и показатели общего анализа крови: ретикулоциты, эритроциты и др.), нормализация (снижение) ACT, АЛТ (показатели 19, 20).
Анализ нормализованных профилей биохимических показателей (рис. 2, 8) позволяет получить более целостную картину отличий в эффектах исследованных подходов к терапии перегрузки железом, чем использование каких-либо отдельных показателей (ACT/АЛТ, уровней железа в крови и др.). Мы разделили эти профили на три сегмента: показатели обмена железа, показатели общего анализа крови, биохимические показатели полиорганной дисфункции. Показатели обмена железа
Анализ показателей обмена железа (рис. 9А) указал на формирование перегрузки железом при воспроизведении модели с последующей нормализацией уровней железа в крови. Показателей обмена железа - ферритин, коэффициент насыщения трансферрина железом, железо сыворотки резко повышались при воспроизведении модели: значения ферритина возрастали от 211±47 мкг/л у интактных контролен до 238±13 мкг/л (модель, д.13, Р0.0001) и, далее, до 266±14 мкг/л (модель, день 41, Р0.0002). Значения коэффициента насыщения трансферрина железом возрастали от 59±8% (интактные) до 90±15% (д.13, Р0.0001) и 85±27% (день 41, Р0.0002). Уровни железа в сыворотке крови увеличивались от 35±5 мкмоль/л (интактные) до 57±10 мкмоль/л на дни 13 и 41 (Р0.00015). Терапия ГПЧ Лаеннек приводила к достоверному снижению ферритина на день 41 (до 151±24 мкг/л, Р0.00001), коэффициента насыщения трансферрина железом (Лаеннек: 32±7%, Р0.00005) и железа в сыворотке крови (Лаеннек: 25±5 мкмоль/л, Р0.0001).
Показатели общего анализа крови
Изменения показателей общего анализа крови (рис. 9Б) позволило оценить эффекты ГПЧ Лаеннек на состояние кроветворения. Основным показателем обмена железа и кроветворения является уровень гемоглобина в крови, от которого зависят следующие показатели: средний объем эритроцита, среднее количество гемоглобина в эритроците и средняя концентрация гемоглобина в эритроците. При воспроизведении модели отмечается достоверно падение общего числа эритроцитов в крови (интактные 9.7±0.9 10^12 кл/л, модель д. 13 8.5±1.3 10^12 кл/л, Р=0.022, день 41: 8.2±1.5 10^12 кл/л). Это может быть связано с тем, что перегрузка железом стимулирует гибель эритроцитов и/или сокращает жизненный цикл эритроцитов. Применение Лаеннека приводило к достоверному снижению среднего объема эритроцита (интактные 54.7±1.5 фл, модель, дни 13/41 - 52±6 фл); 47±5 фл, Р=0.025,) на фоне снижения среднего количества гемоглобина в эритроците в сторону интервала нормы (интактные 288±32 г/л, модель, д. 13/41 - 311±7 г/л„ 301±18 г/л, Р=0.005). Лаеннек не оказывал достоверного влияния на общее количество эритроцитов (Р>0.075).
На ускорение жизненного цикла эритроцитов (что подразумевает, в частности, активацию процессов кроветворения) в условиях перегрузки железом указывает и резкое возрастание уровней ретикулоцитов при воспроизведении модели. Все три показателя, характеризующие различные аспекты содержания ретикулоцитов в крови (% ретикулоцитов, содержание ретикулоцитов, 10^9 кл/л, фракция ретикулоцитов) достоверно возрастали при воспроизведении модели (рис. 2). Напомним, что ретикулоциты - это молодые эритроциты, образующиеся в костном мозге, клетки-предшественники эритроцитов. Содержание ретикулоцитов в крови отражает состояние системы кроветворения (прежде всего, эритропоэза).
Воспроизведение модели привело к достоверному повышению процента ретикулоцитов (интактные 4.2±0.7%, модель,д.13 6.3±1.0%, Р=0.00116), общего количества ретикулоцитов (интактные 229±62 10^9 кл/л, модель,д.13 435±118 10 л9 кл/л, Р=0.0145), фракции ретикулоцитов (интактные 44.4±6.1%, модель,д.13 55.6±7.0%, Р=0.0075) с небольшим и статистически недостоверным снижением всех трех показателей ко дню 41 (Р>0.08). ГПЧ Лаеннек стимулировал снижение общего количества ретикулоцитов и фракции ретикулоцитов в сторону диапазона нормы. На день 41 Лаеннек достоверно способствовал нормализации общего количества ретикулоцитов (216±53 10^9 кл/л, Р=0.00013) и фракции ретикулоцитов (49.6±12, Р=0.049). Биохимические показатели полиорганной дисфункции
Анализ других биохимических показателей (рис. 9 В), связанных с характеризацией полиорганной дисфункции: воспаление и тромбообразование, функция почек, функция печени.
Воспаление и тромбообразование. Одним из основных признаков полиорганной дисфункции является возрастание провоспалительных и протромботических реакций организма. В настоящем исследовании этому соответствует достоверное повышение уровней лейкоцитов (воспаление) и тромбоцитов (коагуляция/аггрегация крови) при воспроизведении модели НАЖБП с перегрузкой железом. Терапевтические вмешательства, наоборот, способствовали снижению и лейкоцитов, и тромбоцитов.
Уровни лейкоцитов у интактных животных составили 4.9±1.6 10^9 кл/л, а при воспроизведении модели повышались, в среднем, на +1.9 10^9 кл/л ко дню 13 (6.5±1.3 10^9 кл/л, Р=0.023) с трендом к повышению ко дню 41 (7,1±0.9 10^9 кл/л, Р=0.068). Применение Лаеннека приводило, фактически, к возвращению уровней лейкоцитов в диапазон нормы (4.8±2.9 10^9 кл/л, Р=0.04).
Уровни тромбоцитов составили 511.8±123.7 10^9 кл/л в группе интактных животных и возрастали до 862.9±158.3 10^9 кл/л (Р=0.00083) на день 13 после воспроизведения модели, с недостоверным снижением ко дню 41 (822.3±52.6 10^9 кл/л, Р>0.1). Применение ГПЧ Лаеннек способствовало выраженной нормализации уровней тромбоцитов над. 41 (641.0±93.4 10^9 кл/л, Р=0.00157).
Функция почек. Креатинин в сыворотке крови и скорость клубочковой фильтрации (СКФ) являются показателями функционирования почек. При воспроизведении модели уровни креатинина и СКФ достоверно снижались ко дню 13 без существенной динамики ко дню 41, что указывает на формирование поражения почек при перегрузке железом на фоне перегрузки липидного и углеводного метаболизма. Исследованные терапевтические вмешательства способствовали восстановлению функции почек (в соответствии с изменениями креатинина и СКФ).
Креатинин сыворотки крови падал от 36.8±1.4 мкмоль/л у интактных животных до 24.6±2.4 мкмоль/л в модели на день 13 (Р<0.00002), без изменений ко дню 41 (24.4±1.7 мкмоль/л). ГПЧ Лаеннек способствовал восстановлению уровней креатинина в сторону диапазона нормы на д. 41 (28.8±1.8 мкмоль/л, Р=0.00025).
СКФ у интактных животных составила 171±6 мл/мин/1,73 м^2, а при воспроизведении модели падала до 144.5±14.4 мл/мин/1,73 м^2 на день 13 (Р=0.0012), с частичным улучшением ко д. 41 (156.2±8.1 мл/мин/ 1,73 м^2, Р=0.043). Лаеннек практически полностью восстанавливал СКФ до исходного уровня у интактных животных над. 41 (171.6±6.6 мл/мин/1,73 м^2, Р=0.0012).
Функция печени. Уровни общего белка в сыворотке крови, аспартатаминотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (АЛТ), билирубина (общего, прямого), витаминов В9 (фолатов) и витамина В12 (цианкобаламина) являются биомаркерами функциями печени. При этом, при повреждении паренхимы печени уровни ACT/АЛТ, билирубина, и витамина В12 и фолатов, как правило, повышаются (вследствие цитолиза гепатоцитов с выходом наружу содержимого клеток), а уровни общего белка -падают (вследствие ухудшения биосинтетической функции печени).
При воспроизведении настоящей модели уровни ACT, АЛТ, фолатов действительно возрастали, а уровни общего белка - падали. Однако, отмечено необычная динамика уровней билирубина (падение общего и прямого билирубина) и падение уровней витамина В12. В целом, исследованные терапевтические вмешательства способствовали восстановлению значений этих показателей в сторону диапазона значений, характерных для интактных животных (рис. 8).
Ферменты ACT и АЛТ в наибольших концентрациях представлены в гепатоцитах, кардиомиоцитах, мышцах. В норме уровни/активность АСТ/АЛТ в крови относительно низки, а при повреждении тканей печени эти ферменты высвобождаются в кровь. Повышение АСТ/АЛТ - характерная особенность НАЖБП, а снижение АСТ/АЛТ в сторону диапазона нормы характеризует эффективность терапии НАЖБП.
Так, уровни ACT составили 117.1±28.4 Ед/л у интактных животных. При воспроизведении модели в группах 2-3 отмечено более чем двухкратное повышение ACT до 301.6±28.9 Ед/л (Р0.000001) на день 13, без изменений ко дню 41 (303.5±32.4 Ед/л). ГПЧ Лаеннек способствовал достоверному снижению ACT на день 41 (168.8±53.5 Ед/л, Р=0.00027).
Уровни АЛТ так же повысились: по сравнению с интактными (24.9±4.3 Ед/л) воспроизведение модели приводило к достоверному повышению АЛТ на д. 13 (56.6±10,2 Ед/л, Р=0.00015), без изменений ко дню 41 (60.6±6.4 Ед/л). Лаеннек (38.5±8.1 Ед/л, Р=0.00002) способствовал нормализации АЛТ.
Изменения уровней АСТ/АЛТ в группах 2-3 находились в соответствии с изменениями уровней общего белка в сыворотке крови (которые, как отмечено выше, являются биомаркером биосинтетической функции печени). Воспроизведение модели приводило к снижению уровней общего белка надень 13 (интактные 59.0±5.1 г/л, модель 47.4±6.1 г/л, Р=0.0022), без изменений ко дню 41 (48.3±4.9 г/л). ГПЧ положительно сказывался на биосинтетической функции печени, способствуя восстановлению уровней общего белка на день 41 (57.6±4.1 г/л, Р=0.0013).
Витамин В9 (фолаты) - водорастворимый витамин, необходимый для синтеза и метилирования ДНК, аминокислот глицина и метионина. При воспроизведении модели уровни фолатов в крови показали тренд к повышению ко дню 13 (64.4±5.9 нмоль/л, Р=0.078) по сравнению с интактными (54.5±15.3 нмоль/л). Динамика повышения уровней фолатов достигла статистической значимости ко дню 41 (69.7±3.8 нмоль/л, Р=0.044). Измерение уровней фолатов в крови обычно используется для диагностики дефицита фолатов, возникающего вследствие (1) недостаточного поступления с пищей (в т.ч. при употреблении пищи, прошедшей термическую обработку), (2) снижения усвоения фолатов в кишечнике, (3) приема препаратов, нарушающих всасывание/метаболизм фолатов (эстрогены, НПВП, цитостатические препараты и др.). Причины повышения уровня фолатов включают прием специальных фолат-содержащих препаратов или цитолиз гепатоцитов. Также, повышение фолатов при воспроизведении модели может носить компенсаторный характер: ведь фолаты важны для деления клеток, в т.ч. для восстановления пула гепатоцитов и эритроцитов. Ко дню 41 Лаеннек способствовал нормализации уровней фолатов в сторону нормы (62.7±4.9 нмоль/л, Р=0.0072). Интегральная оценка изменений состояния животных при воспроизведении модели и при различных подходах к терапии
Анализ метрических диаграмм показал, что при воспроизведении модели неалкогольной жировой болезни печени с перегрузкой железом у экспериментальных животных, равно как и при применении исследованных подходов к терапии происходят согласованные изменения сразу многих показателей состояния здоровья. Поэтому представляется целесообразным введение определенных интегральных индикаторов общего состояния экспериментальных животных, которые бы учитывали все достоверные изменения исследованных показателей.
Для введения таких интегральных (балльных) шкал, во-первых, вычисляются эмпирические функции распределения (э.ф.р.) каждого из исследованных показателей. Во-вторых, значения показателей в их естественных единицах измерения (например, ммоль/л) заменяются на значения э.ф.р. в безразмерных единицах в диапазоне значений [0...1], как это делалось с профилями нормализованных значений (см. выше).
В-третьих, определяются знаки позитивных и негативных изменений показателей. Для этого, сравнивается значение показателя в интактной группе и значение того же показателя при воспроизведении модели заболевания. Принимается, что изменения всех показателей при воспроизведении модели соответствуют активации патофизиологических процессов и, соответственно, носят негативный характер. Тогда отрицательный знак разности значений "значение (интактные)-значение(модель)" соответствует возрастанию показателя при воспроизведении модели, а положительный знак разности - уменьшению показателя при воспроизведении модели. Например, уровни ACT и АЛТ возрастают, поэтому им соответствует отрицательное значение знака разности значений. Соответственно, чем выше значение АСТ/АЛТ относительно интактных контролей, тем выше тяжесть патологии.
В-четвертых, производится домножение значения э.ф.р. показателя (в среднем по группе или для индивиуального животного) на знак изменения показателя и суммирование общего балла по всем показателям. Например, знак изменения показателя отрицательный для АСТ/АЛТ и положительный, скажем, для количества эритроцитов -ведь падение числа эритроцитов при воспроизведении модели патологично и соответствует формированию анемических состояний. В результате, после суммирования по всем показателям, получается суммарное значение интегрального балла оценки состояния животного или группы животных. Более отрицательные значения такой суммы баллов соответствуют патологическим состояниям, более положительные физиологическим.
Результаты расчетов интегральной балльной оценки наглядно показывают различия между группами (рис. 10. Положительные значения соответствуют нормофизиологическим состояниям, отрицательные - патофизиологическим состояниям). Так, для группы интактных животных значения интегрального балла были положительны и составили +2.98±1.54. Воспроизведение модели НАЖБП с перегрузкой железом приводило к резкому снижению значения балла (-8.13±1.37) на день 13, с незначительной положительной динамикой ко дню 41 (-7.7±0.76). ГПЧ Лаеннек приводил к достоверному повышению интегрального балла оценки ко дню 41: - до -3.31±2.3, указывают на высокую общую эффективность терапии ГПЧ Лаеннек в данной модели полиорганной патологии с перегрузкой железом.
Гистологический анализ эффектов ГПЧ Лаеннек (рис. 11. Окраска гематоксилином и эозином - слайды В, Ж; окраска реакцией Перльса - слайды А, Б, Г, Д, Е. Слайды А, Б, В, Г, Е, Ж - увеличение ×480, слайд Д - увеличение ×1200. А) В зоне портального тракта идет активное накопление макрофагами (купферовскими клетками и гистиоцитами) железосодержащих продуктов (метка «А»), мелкие гранулы берлинской лазури в пространствах Диссе (метка «Б»). Б) В перипортальной зоне цитоплазма купферовских клеток содержит незначительное количество железосодержащих продуктов. В) Умеренно выраженная воспалительно-клеточная инфильтрация стромы портального тракта на фоне сохраненной гемоперфузии печеночной дольки. Г) Мелкие гранулы берлинской лазури в цитоплазме нефроцитов дистальных извитых канальцев (метка «А»), нефроциты проксимальных извитых канальцев свободны от железосодержащих продуктов (метка «Б»). Д) Мелкие гранулы берлинской лазури в цитоплазме нефроцитов дистальных извитых канальцев (метка «А»), нефроциты проксимальных извитых канальцев свободны от железосодержащих продуктов (метка «Б»). Е) Перицеллюлярный отек нервной ткани. Пирамидные нейроны без структурных нарушений. Ж) Сократительные волокна миокарда левого желудочка сохраняют поперечную исчерченность на фоне удовлетворительной гемоперфузии).
На момент завершения эксперимента (41 день) печень лабораторных животных сохранила нормальный уровень гемоперфузии; жировая дистрофия гепатоцитов (в виде мелкокапельного ожирения единичных гепатоцитов центральной зоны печеночных долек) наблюдалась лишь у 2-х из 6 животных. Реакция Перльса показала, что во всех случаях (с разной степенью интенсивности: 2 наблюдения - выраженная реакция, 4 наблюдения -слабовыраженная реакция) железосодержащие продукты накапливались в цитоплазме купферовских клеток, гистиоцитах стромы портальных трактов и капсулы печени (рис. 11А, Б). При этом сами гепатоциты оказались свободными от окраски на гемосидерин. Уровень выраженности воспалительного инфильтрата стромы портальных трактов также оказался не одинаковым (3 случая - умеренно выраженная инфильтрация, 3 - случая слабо выраженная), в состав инфильтрата в основном входили Т-лимфоциты и эозинофилы (рис. 11В).
Исследование почек показало, что во всех случаях наблюдений при сохранении нормального уровня перфузии почечной ткани железосодержащие продукты накапливались в цитоплазме нефроцитов дистальных извитых канальцев в виде мелких гранул берлинской лазури (рис. 11Г Д). В головном мозге наблюдался слабо выраженный перицеллюлярный отек нервной ткани, реакция Перльса во всех наблюдениях не позволила выявить присутствие железосодержащих соединений (рис. 11Е). У всех крыс, получавших терапию Лаеннеком, миокард не имел структурных нарушений (рис. 11Ж).
При применении Лаеннека наблюдался гистологически выраженный гепатопротекторный эффект (отсутствие жировой дистрофии гепатоцитов, возросшая макрофагальная активность купферовских клеток и снижение выраженности воспалительно-клеточной инфильтрации) на фоне снижения уровня накопления гемосидерина почками: в просветах дистальных канальцев отсутствовала железопозитивная реакция (что, вероятно, связано с ускорением экскреции отложений железа).
Таким образом, на гистологической подтвержденной модели НАЖБП с полиорганной патологией у крыс, вызванная сочетанными приемом избытка жиров (пальмовое масло), углеводов (фруктоза) и неорганического железа (сульфат железа) доказана эффективность применения стандартизированного гидролизата плаценты человека (ГПЧ) «Лаеннек Применение Лаеннека приводило к нормализации перечисленных показателей полиорганной патологии: к достоверному снижению ферритина, ACT, АЛТ, лейкоцитов, тромбоцитов и к достоверному повышению общего белка, креатинина и СКФ. Гистологический анализ показал, что ГПЧ Лаеннек способствует выведению железа из печени, одновременно препятствуя повреждениям почек, головного мозга и миокарда в предлагаемой модели НАЖБП с перегрузкой железом. Таким образом, применение стандартизированного ГПЧ эффективно и безопасно в терапии экспериментальной НАЖБП с перегрузкой железом.
Примеры оценки эффективности применения лекарственного препарата «Лаеннек» на фармакологической модели неалкогольной жировой болезни печени с перегрузкой железом у экспериментальных животных. Группа 1 (Контроль) Крыса №1.1.
До исследования масса крысы 1.1 составила 330 гр., белый окрас, гладкую блестящую шерсть, чистый кожный покров. Крыса активная, потребление корма и воды - не ниже установленных норм кормления. На протяжении всех дней исследования наблюдался нормальный мышечный тонус и двигательная активность, чистая сухая шерсть. Измеренные значения биохимических и показателей общего анализа крови: ретикулоциты (%) - 4,1; ретикулоциты (*10Л9/л) - 272,9; фракция незрелых ретикулоцитов (%) - 46,4; лейкоциты (*10^9/л) - 3,52; эритроциты (*10^12/л) - 9,21; гемоглобин (г/л) - 145; гематокрит (%) - 48,1; средний объем эритроцита (fl) - 53,2; средн. сод. гемоглобина в эр-те (пг) - 16,7; средн. конц. гемоглобина в эр-те (г/л) - 301; тромбоциты (*10^9/л) - 410; индекс mentzer - 5,67; индекс sirdah- (-0,5); витамин Ь9 (фолиевая кислота) -(нмоль/л) - 64,1; витамин в12 (цианокобаламин) - (пг/мл) -315; белок общий в сыворотке (г/л) - 60,8; аспартатаминотрансфераза (ACT) - (Ед/л) -128,3; аланинаминотрансфераза (АЛТ) (Ед/л) - 19,8; креатинин в сыворотке (мкмоль/л) -35; скорость клубочковой фильтрации (мл/мин/1,73 м^2) - 175; ферритин (мкг/л) - 221,3; трансферрин (г/л)<0,1; коэффициент насыщения трансферрина железом (%) - 989,8; железо в сыворотке (мкмоль/л) - 30,87; билирубин общий (мкмоль/л)- 5,88; билирубин прямой (мкмоль/л)- 1,33.
При патогистологическом исследовании у крысы 1.1 микроскопическая картина ткани печени соответствовала норме. В пределах отдельно взятой печеночной дольки при сохранении гистоархитектоники гепатоциты имели привычную конфигурацию и равномерную окраску с равномерным распределением ультраструктур в цитоплазме без образования берлинской лазури (рис. 12а). Исследование корковой зоны почек показало привычное строение клубочков с нормальным уровнем перфузии кровью, свободным мезангиальным пространством, (рис. 13а). В головном мозге отмечается нормальный уровень перфузии без признаков агрегации эритроцитов в капиллярах и отека нервной ткани (рис. 14а). В миокарде левого желудочка наблюдались ориентированные сократительные волокна с сохраненной поперечной исчерченностью (рис. 15а).
Примеры гистологической картины ткани печени в контрольной группе (рис. 12). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Структура неизмененной печеночной дольки с трабекулярным уложением гепатоцитов. Реакция Перльса б) Крыса №2.1. Равномерная перфузия всех отделов печеночной дольки. Окраска гематоксилином и эозином, б) Крыса №3.1. Единичные лимфоциты в строме портального тракта. Окраска гематоксилином и эозином.
Примеры гистологической картины ткани почек в контрольной группе (рис. 13). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Почечный клубочек имеет просвет капсулы и свободный мезангиум. б) Крыса №2.1. Клетки эпителия проксимальных и дистальных извитых канальцев с гомогенной окраской цитоплазмы. Окраска гематоксилином и эозином, в) Крыса №3.1. Корковая зона почек с нормальным уровнем перфузии кровью. Окраска гематоксилином и эозином.
Примеры гистологической картины ткани головного мозга в контрольной группе (рис. 14). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Нормальный уровень перфузии без признаков агрегации эритроцитов в капиллярах и отека нервной ткани, б) Крыса №2.1. Нейроны привычной формы и размером с четкими контурами ядер. Окраска гематоксилином и эозином, в) Крыса №3.1. Пирамидные нейроны привычной конфигурации с равномерным распределением глыбок Ниссля в цитоплазме. Окраска гематоксилином и эозином.
Примеры гистологической картины ткани миокарда в контрольной группе (рис. 15). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Ориентированные сократительные волокна с сохраненной поперечной исчерченностью в миокарде левого желудочка. Окраска гематоксилином и эозином, б) Крыса №2.1. Сократительные волокна равномерной окраски и толщины, видны анизотропные диски, в) Крыса №3.1. Сократительные волокна с сохраненной поперечной исчерченностью. Окраска гематоксилином и эозином. Крыса №2.1.
В исследование крыса 2.1 имела массу 368 гр., шерсть была чистая, блестящая, кожный покров без внешних признаков заболеваний. Крыса активная, потребление корма - в норме. На протяжении всех дней исследования наблюдался нормальный мышечный тонус и двигательной активности.
Измеренные значения биохимических и показателей общего анализа крови: ретикулоциты (%) - 3,9; ретикулоциты (*10Л9/л) - 209; фракция незрелых ретикулоцитов (%) - 37; лейкоциты (*10^9/л) - 3,64; эритроциты (*10^12/л) - 9,23; гемоглобин (г/л) - 149; гематокрит (%) - 49,4; средний объем эритроцита (fl) - 53,4; средн. сод. гемоглобина в эр-те (пг) - 15,8; средн. конц. гемоглобина в эр-те (г/л) - 301; тромбоциты (*10^9/л) - 514; индекс mentzer - 5,65; индекс sirdah- (-1,41); витамин В9 (фолиевая кислота) -(нмоль/л) - 40,3; витамин В12 (цианокобаламин) -(пг/мл) -312; белок общий в сыворотке (г/л) - 60,5; аспартатаминотрансфераза (ACT) -(Ед/л) - 126,8; аланинаминотрансфераза (АЛТ) (Ед/л) - 20,1; креатинин в сыворотке (мкмоль/л) - 35; скорость клубочковой фильтрации (мл/мин/1,73 м^2) - 165,2; ферритин (мкг/л) - 198,7; трансферрин (г/л)<0,1; коэффициент насыщения трансферрина железом (%) - 1020,3; железо в сыворотке (мкмоль/л) - 35,22; билирубин общий (мкмоль/л)- 5,12; билирубин прямой (мкмоль/л)- 1,01;
При патогистологическом исследовании у крысы 2.1 микроскопическая картина ткани печени соответствовала норме. В пределах отдельно взятой печеночной дольки наблюдалась равномерная перфузия синусоидов как в центральной и в перипортальной зонах (рис. 126). Нефроциты в пределах извитых проксимальных и дистальных канальцев не имели повреждений (рис. 136). При патогистологическом исследовании нейроны имели привычную форму и размеры с четкими контурами ядер, (рис. 146). Клетки миокарда имели нормальное строение, сократительные волокна с сохраненной поперечной исчерченностью (рис. 156).
Примеры гистологической картины ткани печени в контрольной группе (Рис. 12). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Структура неизмененной печеночной дольки с трабекулярным уложением гепатоцитов. Реакция Перльса б) Крыса №2.1. Равномерная перфузия всех отделов печеночной дольки. Окраска гематоксилином и эозином, б) Крыса №3.1. Единичные лимфоциты в строме портального тракта. Окраска гематоксилином и эозином.
Примеры гистологической картины ткани почек в контрольной группе (Рис. 13). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Почечный клубочек имеет просвет капсулы и свободный мезангиум. б) Крыса №2.1. Клетки эпителия проксимальных и дистальных извитых канальцев с гомогенной окраской цитоплазмы. Окраска гематоксилином и эозином, в) Крыса №3.1. Корковая зона почек с нормальным уровнем перфузии кровью. Окраска гематоксилином и эозином.
Примеры гистологической картины ткани головного мозга в контрольной группе (рис. 14). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Нормальный уровень перфузии без признаков агрегации эритроцитов в капиллярах и отека нервной ткани, б) Крыса №2.1. Нейроны привычной формы и размером с четкими контурами ядер. Окраска гематоксилином и эозином, в) Крыса №3.1. Пирамидные нейроны привычной конфигурации с равномерным распределением глыбок Ниссля в цитоплазме. Окраска гематоксилином и эозином.
Примеры гистологической картины ткани миокарда в контрольной группе (рис. 15). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Ориентированные сократительные волокна с сохраненной поперечной исчерченностью в миокарде левого желудочка. Окраска гематоксилином и эозином. 6) Крыса №2.1. Сократительные волокна равномерной окраски и толщины, видны анизотропные диски, в) Крыса №3.1. Сократительные волокна с сохраненной поперечной исчерченностью. Окраска гематоксилином и эозином. Крыса №3.1.
В эксперименте крыса 3.1 имела массу 396 гр., чистую, гладкую шерсть. Животное подвижное, неагрессивное, потребление корма и воды - не ниже установленных норм кормления. На протяжении всех дней исследования наблюдался нормальный мышечный тонус, признаков агрессии не отмечалось.
Измеренные значения биохимических и показателей общего анализа крови: ретикулоциты (%) - 3,9; ретикулоциты (*10Л9/л) - 229; фракция незрелых ретикулоцитов (%) - 38; лейкоциты (*10^9/л) - 4,2; эритроциты (*10^12/л) - 9,43; гемоглобин (г/л) - 143; гематокрит (%) - 45; средний объем эритроцита (fl) - 55,5; средн. сод. гемоглобина в эр-те (пг) - 16; средн. конц. гемоглобина в эр-те (г/л) - 297; тромбоциты (*10^9/л) - 424; индекс mentzer - 5,75; индекс sirdah- (-1,42);
витамин В9 (фолиевая кислота) -(нмоль/л) - 56,9; витамин В12 (цианокобаламин) -(пг/мл) -215; белок общий в сыворотке (г/л) - 60,7; аспартатаминотрансфераза (ACT) -(Ед/л) - 127,5; аланинаминотрансфераза (АЛТ) (Ед/л) - 21,1; креатинин в сыворотке (мкмоль/л) - 37; скорость клубочковой фильтрации (мл/мин/1,73 м^2) - 164,3; ферритин (мкг/л) - 168,5; трансферрин (г/л)<0,1; коэффициент насыщения трансферрина железом (%) - 1090,1; железо в сыворотке (мкмоль/л) - 37,39; билирубин общий (мкмоль/л)- 5,67; билирубин прямой (мкмоль/л)-1,38;
При патогистологическом исследовании у крысы 3.1 микроскопическая картина ткани печени соответствовала норме. Структура гепатоцитов не изменена, распределение ультраструктур в цитоплазме без образования берлинской лазури, в строме портальных трактов присутствовали единичные лимфоциты (рис. 12в). Исследование корковой зоны почек показало типичное строение клубочков с нормальным уровнем перфузии кровью (рис. 13в). В цитоплазме пирамидных нейронов коры полушарий переднего мозга глыбки Ниссля имели равномерное распределение (рис. 14в). В миокарде левого желудочка сократительные волокна с сохраненной поперечной исчерченностью (рис. 15в).
Примеры гистологической картины ткани печени в контрольной группе (рис. 12). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Структура неизмененной печеночной дольки с трабекулярным уложением гепатоцитов. Реакция Перльса б) Крыса №2.1. Равномерная перфузия всех отделов печеночной дольки. Окраска гематоксилином и эозином, б) Крыса №3.1. Единичные лимфоциты в строме портального тракта. Окраска гематоксилином и эозином.
Примеры гистологической картины ткани почек в контрольной группе (рис. 13). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Почечный клубочек имеет просвет капсулы и свободный мезангиум. б) Крыса №2.1. Клетки эпителия проксимальных и дистальных извитых канальцев с гомогенной окраской цитоплазмы. Окраска гематоксилином и эозином, в) Крыса №3.1. Корковая зона почек с нормальным уровнем перфузии кровью. Окраска гематоксилином и эозином.
Примеры гистологической картины ткани головного мозга в контрольной группе (рис. 14). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Нормальный уровень перфузии без признаков агрегации эритроцитов в капиллярах и отека нервной ткани, б) Крыса №2.1. Нейроны привычной формы и размером с четкими контурами ядер. Окраска гематоксилином и эозином, в) Крыса №3.1. Пирамидные нейроны привычной конфигурации с равномерным распределением глыбок Ниссля в цитоплазме. Окраска гематоксилином и эозином.
Примеры гистологической картины ткани миокарда в контрольной группе (рис. 15). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Ориентированные сократительные волокна с сохраненной поперечной исчерченностью в миокарде левого желудочка. Окраска гематоксилином и эозином, б) Крыса №2.1. Сократительные волокна равномерной окраски и толщины, видны анизотропные диски, в) Крыса №3.1. Сократительные волокна с сохраненной поперечной исчерченностью. Окраска гематоксилином и эозином. Группа 2 Крыса №1.2.
В начале эксперимента крыса 1.2 имела массу 380 гр, белый окрас, гладкую блестящую шерсть, чистый кожный покров. Крыса активная, неагрессивная, потребление корма - не ниже установленных норм кормления. С 3 дня исследования наблюдались признаки полиурии (влажная шерсть, факт частой смены опилок-наполнителя), дегидратации (сухость кожи, слизистой глаз, ее тусклость) и снижение двигательной активности, мышечного тонуса. Крыса стала более агрессивной.
Измеренные значения биохимических и показателей общего анализа крови: ретикулоциты (%) - 5,3; ретикулоциты (*10^9/л) - 482,9; фракция незрелых ретикулоцитов (%) - 45,8; лейкоциты (*10^9/л) - 7,58; эритроциты (*10^12/л) - 7,32; гемоглобин (г/л) - 102; гематокрит (%) - 32,4; средний объем эритроцита (fl) - 52,3; средн. сод. гемоглобина в эр-те (пг) - 17,2; средн. конц. гемоглобина в эр-те (г/л) - 315; тромбоциты (*10^9/л) - 761; индекс mentzer - 8,12; индекс sirdah- (14,38); витамин В9 (фолиевая кислота) -(нмоль/л) - 64,8; витамин В12 (цианокобаламин) -(пг/мл) -196; белок общий в сыворотке (г/л) - 48,3; аспартатаминотрансфераза (ACT) -(Ед/л) - 315; аланинаминотрансфераза (АЛТ) (Ед/л) - 47; креатинин в сыворотке (мкмоль/л) - 22; скорость клубочковой фильтрации (мл/мин/1,73 м^2) - 164,13; ферритин (мкг/л) - 268; трансферрин (г/л)<0,1; коэффициент насыщения трансферрина железом (%) - 2577,4; железо в сыворотке (мкмоль/л) - 64,76; билирубин общий (мкмоль/л)- 2,14; билирубин прямой (мкмоль/л)- 0,9; При патогистологическом исследовании у крысы 1.2 через 12 дней введения сульфата железа, пальмового масла и раствора фруктозы в печени наблюдалось накопление железосодержащих соединений в пространстве Диссе, цитоплазме гепатоцитов и купферовских клеток перипортальной зоны печеночных долек (рис. 16а). В центральных отделах печеночной дольки гепатоциты содержали мелкие капли липидов (рис. 166) Исследование гистологических срезов кортикальной зоны почек показало накопление мелких зерен «железа» в цитоплазме нефроцитов проксимальных извитых канальцев, которое носило диффузно-очаговый характер (рис. 17а). Просветы дистальных извитых канальцев были обтурированы эозинофильными массами из нерастворимых углеводов и липидов, что свидетельствовало о нарушении гломерулярного фильтра (рис. 17б). При исследовании головного мозга на фоне умеренно выраженного периваскуляного и перицеллюлярного отека нервной ткани (рис. 18а) наблюдалось очаговое накопление железосодержащих веществ в периваскулярном пространстве (рис. 18б). Структурных нарушений нейронов не обнаружено. Исследование сердца показало сохранность паренхиматозных и стромально-сосудистых элементов миокарда, (рис. 19а).
Примеры гистологической картины ткани печени в группе модели перегрузки печени железом у крыс в условиях избыточного потребления пальмового масла и фруктозы (рис. 16). Крыса №1.1. а) Внутри и внеклеточное отложение глыбок берлинской лазури на периферии печеночной дольки. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. 6) Мелкокапельное ожирение гепатоцитов центра печеночной дольки. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 480. Крыса №2.1. в) Цитоплазма звездчатых ретикулоэндотелиоцитов (купферовских клеток) насыщена берлинской лазурью. Реакция Перльса. Увеличение × 480. г) Очаговое скопление берлинской лазури в капсуле печени. Реакция Перльса. Увеличение × 480. д) Крыса №3.1. Крупнокапельное ожирение гепатоцитов центра печеночной дольки. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 1200. е) Воспалительно-клеточная инфильтрация стромы портального тракта. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 1200. ж) В составе инфильтрата Т-лимфоциты (А), эозинофилы (Б). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 1200.
Примеры гистологической картины ткани почек в группе модели перегрузки печени железом у крыс в условиях избыточного потребления пальмового масла и фруктозы (рис. 17). Крыса №1.1. а) Зерна берлинской лазури в цитоплазме эпителия проксимальных извитых канальцев. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. б) Эозинофильные массы в просветах дистальных отелов канальцев. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 480. в) Крыса №2.1. Окрашивание в синий цвет содержимого дистальных извитых канальцев. Реакция Перльса. Увеличение × 480. г) Крыса №3.1. Цитоплазма нефроцитов дистальных канальцев насыщена железосодержащими продуктами (А), мелкие зерна берлинской лазури в цитоплазме эпителия проксимальных извитых канальцев (Б). Реакция Перльса. Увеличение × 1200.
Примеры гистологической картины ткани головного мозга в группе модели перегрузки печени железом у крыс в условиях избыточного потребления пальмового масла и фруктозы (рис. 18). Крыса №1.1. а) Периваскулярный и перицеллюлярный отек нервной ткани (А), пирамидный нейрон без структурных изменений (Б). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 480. б) Очаговое отложение железосодержащих продуктов в периваскулярном пространстве. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. в) Крыса №2.1. Накопление железосодержащих гранул в цитоплазме астроцита. Реакция Перльса. Увеличение ×1200. г) Крыса №3.1. Очаговое отложение железосодержащих продуктов в периваскулярном пространстве. Реакция Перльса. Увеличение × 1200.
Примеры гистологической картины ткани миокарда в группе модели перегрузки печени железом у крыс в условиях избыточного потребления пальмового масла и фруктозы (рис. 19). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Сохранность паренхиматозных и стромально-сосудистых элементов миокарда. б) Крыса №2.1. Накопление железосодержащих гранул кардиомиоцитами в периваскулярной зоне миокарда левого желудочка. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. в) Крыса №3.1. Накопление железосодержащих гранул кардиомиоцитами в периваскулярной зоне миокарда левого желудочка. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. Крыса №2.2.
Масса крысы 320 гр, шерсть чистая, кожный покров без внешних признаков заболеваний. Крыса активная, потребление корма - не ниже установленных норм кормления. С 3 дня исследования крыса стала меньше потреблять корм, больше пить раствор с фруктозой. Шерсть у животного выглядит «взъерошенной», понизилась двигательная активность. Отмечаются признаки полиурии.
Измеренные значения биохимических и показателей общего анализа крови: ретикулоциты (%) - 5,9; ретикулоциты (*10^9/л) - 525,3; фракция незрелых ретикулоцитов (%) - 59,9; лейкоциты (*10^9/л) - 5,92; эритроциты (*10^12/л) - 8,98; гемоглобин (г/л) - 147; гематокрит (%) - 47,9; средний объем эритроцита (fl) - 53,3; средн. сод. гемоглобина в эр-те (пг) - 17,3; средн. конц. гемоглобина в эр-те (г/л) - 307; тромбоциты (*10^9/л) - 1004; индекс mentzer - 5,94; индекс sirdah- (0,22); витамин В9 (фолиевая кислота) -(нмоль/л) - 63,2; витамин В12 (цианокобаламин) -(пг/мл) -187; белок общий в сыворотке (г/л) - 64,3; аспартатаминотрансфераза (ACT) -(Ед/л) - 318,5; аланинаминотрансфераза (АЛТ) (Ед/л) - 63,7; креатинин в сыворотке (мкмоль/л) - 25; скорость клубочковой фильтрации (мл/мин/1,73 м^2) - 156,58; ферритин (мкг/л) - 252,5; трансферрин (г/л)<0,1; коэффициент насыщения трансферрина железом (%) - 2602,2; железо в сыворотке (мкмоль/л) - 66,12; билирубин общий (мкмоль/л)-1,1633; билирубин прямой (мкмоль/л)- 0,8;
При патогистологическом исследовании у крысы 2.2 железосодержащий субстрат в печени перераспределился и активно накапливался в цитоплазме купферовских клеток (рис. 16в) и между соединительнотканными волокнами капсулы печени (рис. 17 г), при этом большинство гепатоцитов были свободны от берлинской лазури. Наблюдалась активная экскреция железосодржащих соединений, что подтверждается прокрашиванием в синий цвет мочи в просветах дистальных отделов извитых канальцев (рис. 17в). В нервной ткани полушарий большого мозга и мозжечка сохранялись одиночные очаги с глыбками берлинской лазури, кроме того отмечалась активность астроцитов, в цитоплазме которых располагались мелкие гранулы железосодержащих продуктов (рис. 18в). Минимальные изменения обнаружены в виде мелкоочагового отложения гранул берлинской лазури в цитоплазме кардиомиоцитов (рис. 196).
Примеры гистологической картины ткани печени в группе модели перегрузки печени железом у крыс в условиях избыточного потребления пальмового масла и фруктозы (рис. 16). Крыса №1.1. а) Внутри и внеклеточное отложение глыбок берлинской лазури на периферии печеночной дольки. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. 6) Мелкокапельное ожирение гепатоцитов центра печеночной дольки. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 480. Крыса №2.1. в) Цитоплазма звездчатых ретикулоэндотелиоцитов (купферовских клеток) насыщена берлинской лазурью. Реакция Перльса. Увеличение × 480. г) Очаговое скопление берлинской лазури в капсуле печени. Реакция Перльса. Увеличение × 480. д) Крыса №3.1. Крупнокапельное ожирение гепатоцитов центра печеночной дольки. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 1200. е) Воспалительно-клеточная инфильтрация стромы портального тракта. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 1200. ж) В составе инфильтрата Т-лимфоциты (А), эозинофилы (Б). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 1200.
Примеры гистологической картины ткани почек в группе модели перегрузки печени железом у крыс в условиях избыточного потребления пальмового масла и фруктозы (рис. 17). Крыса №1.1. а) Зерна берлинской лазури в цитоплазме эпителия проксимальных извитых канальцев. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. б) Эозинофильные массы в просветах дистальных отелов канальцев. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 480. в) Крыса №2.1. Окрашивание в синий цвет содержимого дистальных извитых канальцев. Реакция Перльса. Увеличение × 480. г) Крыса №3.1. Цитоплазма нефроцитов дистальных канальцев насыщена железосодержащими продуктами (А), мелкие зерна берлинской лазури в цитоплазме эпителия проксимальных извитых канальцев (Б). Реакция Перльса. Увеличение × 1200.
Примеры гистологической картины ткани головного мозга в группе модели перегрузки печени железом у крыс в условиях избыточного потребления пальмового масла и фруктозы (рис. 18). Крыса №1.1. а) Периваскулярный и перицеллюлярный отек нервной ткани (А), пирамидный нейрон без структурных изменений (Б). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 480. б) Очаговое отложение железосодержащих продуктов в периваскулярном пространстве. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. в) Крыса №2.1. Накопление железосодержащих гранул в цитоплазме астроцита. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. г) Крыса №3.1. Очаговое отложение железосодержащих продуктов в периваскулярном пространстве. Реакция Перльса. Увеличение × 1200.
Примеры гистологической картины ткани миокарда в группе модели перегрузки печени железом у крыс в условиях избыточного потребления пальмового масла и фруктозы (рис. 19). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Сохранность паренхиматозных и стромально-сосудистых элементов миокарда. б) Крыса №2.1. Накопление железосодержащих гранул кардиомиоцитами в периваскулярной зоне миокарда левого желудочка. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. в) Крыса №3.1. Накопление железосодержащих гранул кардиомиоцитами в периваскулярной зоне миокарда левого желудочка. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. Крыса №3.2.
Масса крысы 377 гр., шерсть чистая, кожный покров без внешних признаков заболеваний. Крыса активная, потребление корма - не ниже установленных норм кормления. Шерсть влажная и «взъерошенная». Крыса много пьет раствор с фруктозой. На 10 день исследования у крысы на левом боку отмечается выдранный клочек шерсти. Измеренные значения биохимических и показателей общего анализа крови: ретикулоциты (%) - 5,4; ретикулоциты (*10^9/л) - 457,1; фракция незрелых ретикулоцитов (%) - 62,8; лейкоциты (*10^9/л) - 6,97; эритроциты (*10^12/л) - 8,48; гемоглобин (г/л) - 137; гематокрит (%) - 47,1; средний объем эритроцита (fl) - 52,5; средн. сод. гемоглобина в эрте (пг) - 17,2; средн. конц. гемоглобина в эр-те (г/л) - 311,1; тромбоциты (*10^9/л) - 752; индекс mentzer - 6,54; индекс sirdah- (5,92);
витамин В9 (фолиевая кислота) -(нмоль/л) - 66,1; витамин В12 (цианокобаламин) -(пг/мл) -195; белок общий в сыворотке (г/л) - 47,5; аспартатаминотрансфераза (ACT) -(Ед/л) - 320,8; аланинаминотрансфераза (АЛТ) (Ед/л) - 49,7; креатинин в сыворотке (мкмоль/л) - 22; скорость клубочковой фильтрации (мл/мин/1,73 м^2) - 162,51; ферритин (мкг/л) - 236,3; трансферрин (г/л)<0,1; коэффициент насыщения трансферрина железом (%) - 970,5; железо в сыворотке (мкмоль/л) - 49,36; билирубин общий (мкмоль/л)- 3,13; билирубин прямой (мкмоль/л)- 0,81;
При патогистологическом исследовании у животного 3.2 наблюдалось прогрессирование жировой дистрофии гепатоцитов с образованием крупных вакуолей с липидами в их цитоплазме (рис. 16д). Строма портальных трактов имела воспалительно-клеточный инфильтрат, состоящий преимущественно из Т-лимфоцитов и эозинофилов (16е), (16ж), выраженность воспалительной реакции была умеренной. Нефроциты дистальных канальцев, учитывая их реабсорционную компетентность, стали активно накапливать «железо» в своей цитоплазме, нефроциты проксимальных канальцев сохраняли в цитоплазме единичные зерна берлинской лазури (рис. 17 г). В нервной ткани полушарий большого мозга и мозжечка сохранялись очаговые отложения железрсодержащих продуктов в периваскулярном пространстве (рис. 18 г). Исследование сердца экспериментальных животных показало сохранность паренхиматозных и стромально-сосудистых элементов миокарда. Минимальные изменения обнаружены в виде мелкоочагового отложения гранул берлинской лазури в цитоплазме кардиомиоцитов (рис. 19в).
Примеры гистологической картины ткани печени в группе модели перегрузки печени железом у крыс в условиях избыточного потребления пальмового масла и фруктозы (рис. 16). Крыса №1.1. а) Внутри и внеклеточное отложение глыбок берлинской лазури на периферии печеночной дольки. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. б) Мелкокапельное ожирение гепатоцитов центра печеночной дольки. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 480. Крыса №2.1. в) Цитоплазма звездчатых ретикулоэндотелиоцитов (купферовских клеток) насыщена берлинской лазурью. Реакция Перльса. Увеличение × 480. г) Очаговое скопление берлинской лазури в капсуле печени. Реакция Перльса. Увеличение × 480. д) Крыса №3.1. Крупнокапельное ожирение гепатоцитов центра печеночной дольки. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 1200. е) Воспалительно-клеточная инфильтрация стромы портального тракта. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 1200. ж). В составе инфильтрата Т-лимфоциты (А), эозинофилы (Б). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 1200.
Примеры гистологической картины ткани почек в группе модели перегрузки печени железом у крыс в условиях избыточного потребления пальмового масла и фруктозы (рис. 17). Крыса №1.1. а) Зерна берлинской лазури в цитоплазме эпителия проксимальных извитых канальцев. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. б) Эозинофильные массы в просветах дистальных отелов канальцев. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 480. в) Крыса №2.1. Окрашивание в синий цвет содержимого дистальных извитых канальцев. Реакция Перльса. Увеличение × 480. г) Крыса №3.1. Цитоплазма нефроцитов дистальных канальцев насыщена железосодержащими продуктами (А), мелкие зерна берлинской лазури в цитоплазме эпителия проксимальных извитых канальцев (Б). Реакция Перльса. Увеличение × 1200.
Примеры гистологической картины ткани головного мозга в группе модели перегрузки печени железом у крыс в условиях избыточного потребления пальмового масла и фруктозы (рис. 18). Крыса №1.1. а) Периваскулярный и перицеллюлярный отек нервной ткани (А), пирамидный нейрон без структурных изменений (Б). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 480. б) Очаговое отложение железосодержащих продуктов в периваскулярном пространстве. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. в) Крыса №2.1. Накопление железосодержащих гранул в цитоплазме астроцита. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. г) Крыса №3.1. Очаговое отложение железосодержащих продуктов в периваскулярном пространстве. Реакция Перльса. Увеличение × 1200.
Примеры гистологической картины ткани миокарда в группе модели перегрузки печени железом у крыс в условиях избыточного потребления пальмового масла и фруктозы (рис. 19). Увеличение ×480. а) крыса №1.1. Сохранность паренхиматозных и стромально-сосудистых элементов миокарда. б) Крыса №2.1. Накопление железосодержащих гранул кардиомиоцитами в периваскулярной зоне миокарда левого желудочка. Реакция Перльса. Увеличение × 1200. в) Крыса №3.1. Накопление железосодержащих гранул кардиомиоцитами в периваскулярной зоне миокарда левого желудочка. Реакция Перльса. Увеличение × 1200.
Группа 3.
Крыса №1.3.
Масса крысы 334 гр. На 15 день исследования у животного отмечалось повышение двигательной активности, нормализация мышечного тонуса. Шерсть белая, чистая, сухая. На протяжении всего эксперимента потребление корма и воды - не ниже установленных норм кормления. Признаков полиурии не отмечалось. Измеренные значения биохимических и показателей общего анализа крови: ретикулоциты (%) - 4,4; ретикулоциты (*10^9/л) - 267,8; фракция незрелых ретикулоцитов (%) - 59,3; лейкоциты (*10^9/л) - 2,04; эритроциты (*10^12/л) - 8,31; гемоглобин (г/л) - 144; гематокрит (%) - 27,7; средний объем эритроцита (fl) - 50,1; средн. сод. гемоглобина в эр-те (пг) - 15,8; средн. конц. гемоглобина в эр-те (г/л) - 303; тромбоциты (*10^9/л) - 661; индекс mentzer - 9,81; индекс sirdah- (25,59); витамин В9 (фолиевая кислота) - (нмоль/л) - 57,9; витамин В12 (цианокобаламин) - (пг/мл) -132; белок общий в сыворотке (г/л) -59,7; аспартатаминотрансфераза (ACT) - (Ед/л) - 225,5; аланинаминотрансфераза (АЛТ) (Ед/л) - 46,0; креатинин в сыворотке (мкмоль/л) - 28; скорость клубочковой фильтрации (мл/мин/1,73 м^2) - 172,8; ферритин (мкг/л) - 151,8; трансферрин (г/л)<0,1; коэффициент насыщения трансферрина железом (%) - 593,8; железо в сыворотке (мкмоль/л) - 25,92; билирубин общий (мкмоль/л)- 2,727; билирубин прямой (мкмоль/л)- 0,0762; При патогистологическом исследовании на момент завершения эксперимента (41 день) у животного 1.3 печень сохранила нормальный уровень гемоперфузии, жировая дистрофия гепатоцитов не наблюдалась. Реакция Перльса показала (слабовыраженная реакция), что железосодержащие продукты накапливались в цитоплазме купферовских клеток, гистиоцитах стромы портальных трактов и капсулы печени (рис. 11 АБ). При этом сами гепатоциты оказались свободными от «железа». Уровень выраженности воспалительного инфильтрата стромы портальных трактов оценивался как слабо выраженный, в состав инфильтрата в основном входили Т-лимфоциты и эозинофилы (рис. 11 В). Исследование почек показало, что при сохранении нормального уровня перфузии почечной ткани железосодержащие продукты накапливались в цитоплазме нефроцитов дистальных извитых канальцев в виде мелких гранул берлинской лазури (рис. 11Г Д). В головном мозге наблюдался слабо выраженный перицеллюлярный отек нервной ткани, реакция Перльса не позволила выявить присутствие железосодержащих соединений (рис. 11Е). У крысы 1.3 структурных нарушений миокарда не определялось (рис. 11Ж). Крыса №2.3.
Масса крысы 311 гр. На четвертой неделе исследования шерсть чистая, кожный покров без внешних признаков заболеваний. Крыса активная, хорошо шла на контакт.Потребление корма и воды - не ниже установленных норм кормления. Измеренные значения биохимических и показателей общего анализа крови: ретикулоциты (%) - 3,5; ретикулоциты (*10^9/л) - 259,2; фракция незрелых ретикулоцитов (%) - 60,9; лейкоциты (*10Л9/л) - 4,17; эритроциты (*10^12/л) - 8,49; гемоглобин (г/л) - 121; гематокрит (%) - 37,9; средний объем эритроцита (fl) - 50,6; средн. сод. гемоглобина в эр-те (пг) - 17,1; средн. конц. гемоглобина в эр-те (г/л) - 301; тромбоциты (*10^9/л) - 730; индекс mentzer - 6,76; индекс sirdah- (6,81); витамин В9 (фолиевая кислота) - (нмоль/л) -65,5 витамин В12 (цианокобаламин) - (пг/мл) -182; белок общий в сыворотке (г/л) - 54,7; аспартатаминотрансфераза (ACT) - (Ед/л) - 130; аланинаминотрансфераза (АЛТ) (Ед/л) - 46,2; креатинин в сыворотке (мкмоль/л) - 28; скорость клубочковой фильтрации (мл/мин/1,73 м^2) - 176,6; ферритин (мкг/л) - 166,5; трансферрин (г/л)<0,1; коэффициент насыщения трансферрина железом (%) - 1045,1; железо в сыворотке (мкмоль/л) - 29,26; билирубин общий (мкмоль/л)- 2,19; билирубин прямой (мкмоль/л)- 0,0951; При патогистологическом исследовании печени у крысы 2.3 наблюдается слабо выраженная воспалительно-клеточная инфильтрация стромы портального тракта на фоне сохраненной гемоперфузии печеночной дольки и отсутствия жировой дистрофии гепатоцитов. В перипортальной зоне цитоплазма купферовских клеток содержит незначительное количество железосодержащих продуктов, (рис. 20 а,б,в). Определяются мелкие гранулы берлинской лазури в цитоплазме нефроцитов дистальных извитых канальцев (рис. 20 г, д), нефроциты проксимальных извитых канальцев свободны от железосодержащих продуктов (Б). В головном мозге отсутствуют железосодержащие соединения, наблюдался слабо выраженный перицеллюлярный отек нервной ткани (рис. 20 е). У крысы 2.3 структурных нарушений миокарда не определялось (рис. 20 ж). Крыса №3.3.
В эксперименте крыса 3.3 имела массу 320 гр, белый окрас, гладкую сухую шерсть, чистый кожный покров. Крыса активная, потребление корма - не ниже установленных норм кормления.
Измеренные значения биохимических и показателей общего анализа крови: ретикулоциты (%) - 3,7; ретикулоциты (*10^9/л) - 196,6; фракция незрелых ретикулоцитов (%) - 39,1; лейкоциты (*10^9/л) - 3,25; эритроциты (*10^12/л) - 8,2; гемоглобин (г/л) - 127; гематокрит (%) - 40,5; средний объем эритроцита (fl) - 52,9; средн. сод. гемоглобина в эр-те (пг) - 17,5; средн. конц. гемоглобина в эр-те (г/л) - 295; тромбоциты (*10^9/л) - 597; индекс mentzer - 6,24; индекс sirdah- (7,02); витамин В9 (фолиевая кислота) - (нмоль/л) -54,1; витамин В12 (цианокобаламин) - (пг/мл) -201; белок общий в сыворотке (г/л) - 54,7; аспартатаминотрансфераза (ACT) - (Ед/л) - 167,3; аланинаминотрансфераза (АЛТ) (Ед/л) - 40,2; креатинин в сыворотке (мкмоль/л) - 29; скорость клубочковой фильтрации (мл/мин/1,73 м^2) - 164,3; ферритин (мкг/л) - 175,2; трансферрин (г/л)<0,1; коэффициент насыщения трансферрина железом (%) - 798,3; железо в сыворотке (мкмоль/л) - 30,5; билирубин общий (мкмоль/л)- 1,735; билирубин прямой (мкмоль/л)- 0,0689; При патогистологическом исследовании на момент завершения эксперимента (41 день) у животного 3.3 печень сохранила нормальный уровень гемоперфузии, отмечается жировая дистрофия гепатоцитов в виде мелкокапельного ожирения единичных гепатоцитов центральной зоны печеночных долек. По реакции Перльса железосодержащие продукты накапливались в цитоплазме купферовских клеток, гистиоцитах стромы портальных трактов и капсулы печени (рис. 216, г), однако сами гепатоциты оказались свободными от «железа». Воспалительная инфильтрация стромы портальных трактов была умеренно выраженной, в состав инфильтрата в основном входили Т-лимфоциты и эозинофилы (рис. 21 а)
Исследование почек показало, что при сохранении нормального уровня перфузии почечной ткани железосодержащие продукты накапливались в цитоплазме нефроцитов дистальных извитых канальцев в виде мелких гранул берлинской лазури (рис. 21в). В головном мозге наблюдался слабо выраженный перицеллюлярный отек нервной ткани, реакция Перльса не позволила выявить присутствие железосодержащих соединений (рис. 21д). У крысы 33 структурных нарушений миокарда не определялось (рис. 21е).
Таким образом, на гистологической подтвержденной модели НАЖБП с полиорганной патологией у крыс, вызванная сочетанными приемом избытка жиров (пальмовое масло), углеводов (фруктоза) и неорганического железа (сульфат железа) доказана эффективность применения стандартизированного гидролизата плаценты человека (ГПЧ) «Лаеннек». Применение Лаеннека в дозе 0,6 мл/кг массы в сутки, внутримышечно, в течение 4 недель приводило к нормализации перечисленных показателей полиорганной патологии: к достоверному снижению ферритина, ACT, АЛТ, лейкоцитов, тромбоцитов и к достоверному повышению общего белка, креатинина и СКФ. Гистологический анализ показал, что ГПЧ Лаеннек способствует выведению железа из печени, одновременно препятствуя повреждениям почек, головного мозга и миокарда в предлагаемой модели НАЖБП с перегрузкой железом. Таким образом, применение стандартизированного ГПЧ эффективно и безопасно в терапии экспериментальной НАЖБП с перегрузкой железом.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ лечения стеатогепатоза у экспериментальных животных | 2023 |
|
RU2811886C1 |
| СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПОЛИОРГАННОЙ ПАТОЛОГИИ У КРЫС | 2011 |
|
RU2453002C1 |
| СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ КАДМИЯ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ | 2009 |
|
RU2410763C1 |
| СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ СИСТЕМНОГО ФИБРОЗА | 2008 |
|
RU2371778C1 |
| СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ОРГАНИЗМА К ВРЕДНОМУ ДЕЙСТВИЮ ТОКСИЧЕСКОЙ КОМБИНАЦИИ, ЗАГРЯЗНЯЮЩЕЙ ВОЗДУХ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ И ОКРУЖАЮЩУЮ АТМОСФЕРУ В СВЯЗИ С ДЕЯТЕЛЬНОСТЬЮ ПРОИЗВОДСТВА ЧЕРНОВОЙ МЕДИ | 2021 |
|
RU2784169C1 |
| СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПРИ МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ | 2016 |
|
RU2631596C1 |
| Гепатопротекторное действие низкомолекулярного миметика NGF | 2022 |
|
RU2790828C1 |
| СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ГЕМОХРОМАТОЗОМ ПУТЕМ ЦИТАФЕРЕЗА | 1996 |
|
RU2146543C1 |
| СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОСТЕОМИЕЛИТА | 2015 |
|
RU2604124C1 |
| Способ моделирования неалкогольной жировой болезни печени при помощи диеты, насыщенной фруктозой | 2019 |
|
RU2728418C1 |
Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, экспериментальной медицине, и может быть использовано для оценки эффективности применения лекарственного препарата Лаеннек на фармакологической модели неалкогольной жировой болезни печени с перегрузкой железом у экспериментальных животных – крыс. Осуществляют внутрибрюшинное введение железа сернокислого (II) 7-водного (хч) в дозе 50 мг/кг/сут, в условиях перорального избыточного потребления твердой фракции пальмового масла в дозировке 30 г/кг/сут и раствора фруктозы из расчета 1 г/кг/сут в течение 12 дней. Затем вводят препарат Лаеннек в дозе 0,6 мл/кг массы в сутки, внутримышечно, в течение 4 недель. Затем проводят биохимический и общий анализ крови. При показателях: ферритине от 127 до 175 мкг/л, коэффициенте насыщения трансферрина железом от 25 до 39% и железа в сыворотке крови от 20 до 30 мкмоль/л, ACT от 115,3 до 222,3 Ед/л, АЛТ от 30,4 до 46,6 Ед/л, лейкоцитов от 1,9×109 до 7,7×109 кл/л, тромбоцитов от 547,6×109 до 734,4х109 кл/л, общего белка от 53,5 до 61,7 г/л, креатинина от 27 до 30,6 мкмоль/л и СКФ от 165 до 178,2 мл/мин/1,73 м2 оценивают терапию препаратом Лаенннек, как эффективную. Способ обеспечивает возможность доказательства эффективности применения стандартизированного гидролизата плаценты человека лекарственного препарата Лаеннек за счет оценки эффективности применения Лаеннек на гистологической подтвержденной модели неалкогольной жировой болезни печени с полиорганной патологией у крыс, вызванной сочетанными приемом избытка жиров - пальмового масла, углеводов - фруктозы и неорганического железа - сульфата железа, с использованием доказательств в виде изменения клинических, биохимических, показателей общего анализа крови и гистологических маркеров. 21 ил., 9 пр.
Способ оценки эффективности применения лекарственного препарата Лаеннек на фармакологической модели неалкогольной жировой болезни печени с перегрузкой железом у экспериментальных животных – крыс, включающий внутрибрюшинное введение железа сернокислого (II) 7-водного (хч) в дозе 50 мг/кг/сут, в условиях перорального избыточного потребления твердой фракции пальмового масла в дозировке 30 г/кг/сут и раствора фруктозы из расчета 1 г/кг/сут в течение 12 дней, затем вводят препарат Лаеннек в дозе 0,6 мл/кг массы в сутки, внутримышечно, в течение 4 недель, затем проводят биохимический и общий анализ крови, и при показателях: ферритине от 127 до 175 мкг/л, коэффициенте насыщения трансферрина железом от 25 до 39% и железа в сыворотке крови от 20 до 30 мкмоль/л, ACT от 115,3 до 222,3 Ед/л, АЛТ от 30,4 до 46,6 Ед/л, лейкоцитов от 1,9×109 до 7,7×109 кл/л, тромбоцитов от 547,6×109 до 734,4х109 кл/л, общего белка от 53,5 до 61,7 г/л, креатинина от 27 до 30,6 мкмоль/л и СКФ от 165 до 178,2 мл/мин/1,73 м2 оценивают терапию препаратом Лаенннек, как эффективную.
| Назаренко О.А | |||
| и др | |||
| Коррекция Лаеннеком хронической перегрузки железом печени, почек и головного мозга | |||
| Фармакокинетика и Фармакодинамика | |||
| Автомобиль-сани, движущиеся на полозьях посредством устанавливающихся по высоте колес с шинами | 1924 |
|
SU2017A1 |
| КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО КАПЕЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ НА ОСНОВЕ ОЧИЩЕННОГО ГИДРОЛИЗАТА ПЛАЦЕНТЫ (ВАРИАНТЫ) | 2007 |
|
RU2356561C1 |
| Способ лечения стеатогепатоза у экспериментальных животных | 2023 |
|
RU2811886C1 |
| СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОГО ГЕПАТИТА В ИЛИ С ТЯЖЕЛОГО ТЕЧЕНИЯ | 2015 |
|
RU2599037C1 |
| SHIMOKOBE H | |||
| et al | |||
| Human placental extract treatment for non-alcoholic steatohepatitis non-responsive to | |||
