ВАРИАНТ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, ИМЕЮЩИЙ УЛУЧШЕННУЮ СПОСОБНОСТЬ К ПРОДУКЦИИ L-ЛИЗИНА, И СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ L-ЛИЗИНА ПОСРЕДСТВОМ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК C12N15/11 C12N9/00 C12N15/77 C12P13/08 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие относится к мутантному штамму Corynebacterium glutamicum, имеющему повышенную продуктивность в отношении L-лизина, и к способу продуцирования L-лизина с его применением.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

L-лизин представляет собой незаменимую аминокислоту, которая не синтезируется в человеческом или животном организме. L-лизин должен поставляться извне, и он обычно продуцируется посредством ферментации с использованием микроорганизмов, таких как бактерии или дрожжи. Продукция L-лизина может осуществляться с использованием встречающихся в природе штаммов дикого типа или мутантных штаммов, полученных модифицированием штаммов дикого типа для того, чтобы они имели повышенную продуктивность в отношении L-лизина. В последние годы для того, чтобы улучшить эффективность продукции L-лизина, разработали разные рекомбинантные штаммы или мутантные штаммы, имеющие превосходную продуктивность в отношении L-лизина, и способы продуцирования L-лизина с их использованием посредством применения технологии генной инженерии к таким микроорганизмам, как Escherichia coli и Corynebacterium, которые широко используются для продукции L-аминокислот и других полезных веществ.

Согласно корейским патентам №10-0838038 и 10-2139806 продуктивность в отношении L-лизина может быть усилена посредством увеличения экспрессии генов, кодирующих белки, включающие ферменты, связанные с продукцией L-лизина, посредством модификации нуклеотидных последовательностей генов или аминокислотных последовательностей белков, или удаления не являющихся необходимыми генов. Кроме того, в публикации корейского патента №10-2020-0026881 раскрыт способ, посредством которого существующий промотор гена, кодирующего фермент, участвующий в продукции L-лизина, заменяется на промотор, имеющий сильную активность, для того, чтобы увеличивать экспрессию данного гена.

Как описано выше, разработали разные способы увеличения продуктивности в отношении L-лизина, но существуют десятки типов белков, таких как ферменты, транскрипционные факторы и транспортные белки, которые прямо или опосредованно участвуют в продукции L-лизина. Следовательно, все еще необходимо проводить обширные исследования по тому, приводят ли или нет изменения активностей данных белков к увеличению продуктивности в отношении L-лизина.

Документы предшествующего уровня техники

Патентные документы

Корейский патент №10-0838038

Корейский патент №10-2139806

Публикация корейской патентной заявки №10-2020-0026881

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

Целью настоящего раскрытия является предложение мутантного штамма Corynebacterium glutamicum, имеющего повышенную продуктивность в отношении L-лизина.

Другой целью настоящего раскрытия является предложение способа продуцирования L-лизина с использованием данного мутантного штамма.

Техническое решение

Авторы настоящего изобретения провели исследования для разработки нового мутантного штамма, имеющего повышенную продуктивность в отношении L-лизина с использованием штамма Corynebacterium glutamicum и, в результате, обнаружили, что продукция L-лизина увеличивается при замене нуклеотидной последовательности в конкретных положениях в промоторе гена рус, кодирующего пируваткарбоксилазу, участвующую в поставке предшественника лизина - оксалоацетата в пути биосинтеза L-лизина, тогда как продукция побочных продуктов, образующихся из пирувата, снижается, посредством этого осуществляя настоящее раскрытие.

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложен мутантный штамм Corynebacterium glutamicum, имеющий повышенную продуктивность в отношении L-лизина из-за повышенной активности пируваткарбоксилазы.

Термин «пируваткарбоксилаза» в том виде, как он здесь используется, относится к ферменту, который катализирует реакцию, которая продуцирует предшественник лизина -оксалоацетат (ОАА) посредством индуцирования карбоксилирования пирувата в пути биосинтеза L-лизина.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия пируваткарбоксилаза может происходить из штамма вида Corynebacterium. В частности, штамм вида Corynebacterium может представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium callunae, Corynebacterium suranareeae, Corynebacterium lubricantis, Corynebacterium doosanense, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium uterequi, Corynebacterium stationis, Corynebacterium pacaense, Corynebacterium singulare, Corynebacterium humireducens, Corynebacterium marinum, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium freiburgense, Corynebacterium striatum, Corynebacterium canis, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium renale, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium caspium, Corynebacterium testudinoris, Cory neb acaterium pseudopelargi или Corynebacterium flavescens, но не ограничивается ими.

Термин «повышенная активность» в том виде, как он здесь используется, означает то, что экспрессия гена, кодирующего такой белок, как целевой фермент, транскрипционный фактор или транспортный белок, вновь вводится или увеличивается таким образом, что уровень экспрессии данного гена увеличивается по сравнению с уровнем экспрессии у штамма дикого типа или штамма перед модификацией. Термин «повышенная активность» также включает случай, при котором активность самого белка увеличивается по сравнению с активностью данного белка родительского микроорганизма посредством замены, вставки, делеции или их комбинации одного или более чем одного нуклеотида кодирующего гена; случай, при котором общая ферментативная активность в клетке выше, чем ферментативная активность в штамме дикого типа или штамме перед модификацией из-за повышенной экспрессии или трансляции гена, кодирующего данный белок; и их комбинации.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия повышенная активность пируваткарбоксилазы может достигаться посредством сайт-направленного мутагенеза в промоторе гена, кодирующего пируваткарбоксилазу.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия промотор гена, кодирующего пируваткарбоксилазу, может быть представлен нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.

Термин «промотор» в том виде, как он здесь используется, относится к специфической области ДНК, которая регулирует транскрипцию гена, включая сайт связывания РНК-полимеразы, которая инициирует транскрипцию мРНК целевого гена. В общем, промотор находится выше сайта начала транскрипции. У прокариот промотор определяется как область около сайта начала транскрипции, с которым связывается РНК-полимераза, и он обычно состоит из двух коротких последовательностей в областях от -10 и -35 выше сайта начала транскрипции. В настоящем раскрытии мутация в промоторе означает осуществление модификации промотора так, чтобы он имел более высокую активность, чем промотор дикого типа, и экспрессия гена, расположенного ниже сайта начала транскрипции, может увеличиваться посредством индуцирования мутации в промоторной области, расположенной выше сайта начала транскрипции.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия повышенная активность пируваткарбоксилазы может достигаться заменой по меньшей мере одного нуклеотида в области, расположенной между положениями от -90 до -30 (ниже называется область от -90 до -30) выше от сайта начала транскрипции в последовательности промотора гена, кодирующего пируваткарбоксилазу.

Более конкретно, в настоящем раскрытии мутация в промоторе может представлять собой замену по меньшей мере одного нуклеотида в области от -90 до -30, предпочтительно замену 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 смежных или несмежных нуклеотидов в области от -90 до -30, области от -80 до -40, области от -75 до -45, области от -55 до -40 или области от -75 to -60.

Согласно одному примеру настоящего раскрытия мутантный штамм Corynebacterium glutamicum, имеющий новую последовательность промотора гена рус, был получен заменой нуклеотидной последовательности ggggttacgatac области от -73 до -61 на tgtggtatgatgg, и заменой нуклеотидной последовательности gtgactgctatcac области от -51 до -38 на acagctgctactgt в последовательности промотора гена рус, кодирующего пируваткарбоксилазу, штамма Corynebacterium glutamicum. Данный мутантный штамм Corynebacterium glutamicum может содержать мутировавший промотор гена рус, который представлен нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2.

Кроме того, согласно одному примеру настоящего раскрытия мутантный штамм Corynebacterium glutamicum, имеющий новую последовательность промотора гена рус, был получен заменой нуклеотидной последовательности ggggttacgatac области от -73 до -61 на tgttgtatgattg и заменой нуклеотидной последовательности gtgactgctatcac области от -51 до -38 на actgctgctactac в последовательности промотора гена рус, кодирующего пируваткарбоксилазу, штамма Corynebacterium glutamicum. Данный мутантный штамм Corynebacterium glutamicum может содержать мутировавший промотор гена рус, который представлен нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3.

Термин «повышенная продуктивность» в том виде, как он здесь используется, означает, что продуктивность мутантного штамма в отношении L-лизина увеличивается по сравнению с продуктивностью родительского штамма. Родительский штамм относится к штамму дикого типа или мутантному штамму, который подлежит мутации, и включает штамм, который непосредственно мутирован или трансформирован рекомбинантным вектором, или тому подобное. В настоящем раскрытии родительский штамм может представлять собой штамм Corynebacterium glutamicum дикого типа или штамм, мутировавший из данного штамма дикого типа.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия родительский штамм может представлять собой мутантный штамм, имеющий мутации в последовательностях генов (например, генов lysC, zwf и hom), которые участвуют в продукции лизина. В частности, родительский штамм может представлять собой штамм Corynebacterium glutamicum (далее именуемый «штамм DS1 Corynebacterium glutamicum»), депонированный в Корейский центр культивирования микроорганизмов 2 апреля 2021 г. с номером доступа КССМ12969Р.

Мутантный штамм Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию, имеющий повышенную продуктивность в отношении L-лизина, может содержать вышеописанную мутировавшую последовательность промотора гена, кодирующего пируваткарбоксилазу.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия данный мутантный штамм может содержать любую из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 2 и 3, в качестве последовательности промотора гена, кодирующего пируваткарбоксилазу.

Согласно одному примеру, поскольку данный мутантный штамм содержит мутации в промоторе гена рус, кодирующего пируваткарбоксилазу, он может демонстрировать повышенную продуктивность в отношении L-лизина по сравнению с родительским штаммом. В частности, данный мутантный штамм может демонстрировать увеличения продукции L-лизина 3% или более, в частности, от 3% до 40%, более конкретно, от 4 до 30% по сравнению с родительским штаммом, и, таким образом, продуцирует от 65 до 75 г, предпочтительно от 65 до 70 г L-лизина на литр культуральной среды данного штамма.

Мутантный штамм Corynebacterium glutamicum по одному воплощению настоящего раскрытия может быть получен посредством рекомбинантного вектора, содержащего вариант, образующийся в результате замены части последовательности промотора гена, кодирующего пируваткарбоксилазу, у родительского штамма.

Термин «часть последовательности промотора» в том виде, как он здесь используется, означает не всю нуклеотидную последовательность или последовательность полинуклеотида промотора и может представлять собой от 1 до 300, предпочтительно от 1 до 100, более предпочтительно от 1 до 50 нуклеотидов, но не ограничиваясь ими.

Термин «вариант» в том виде, как он здесь используется, относится к варианту промотора, образующемуся в результате замены по меньшей мере одного нуклеотида в области от -90 до -30 в последовательности промотора гена, кодирующего пируваткарбоксилазу, который участвует в биосинтезе L-лизина.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия вариант, имеющий замену tgtggtatgatgg нуклеотидной последовательности области от -73 до -61 и acagctgctactgt для нуклеотидной последовательности области от -51 до -38 в последовательности промотора гена, кодирующего пируваткарбоксилазу, может иметь нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, и вариант, имеющий замену tgttgtatgattg для нуклеотидной последовательности области от -73 до -61 и actgctgctactac для нуклеотидной последовательности области от -51 до -38 в последовательности промотора гена, кодирующего пируваткарбоксилазу, может иметь нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.

Термин «вектор» в том виде, как он здесь используется, относится к экспрессионному вектору, способному экспрессировать интересующий белок в подходящей клетке-хозяине, и он означает генетическую конструкцию, которая содержит существенные контрольные элементы, связанные функциональным образом таким образом, что экспрессируется вставленный ген. Термин «связанный функциональным образом» в том виде, как он здесь используется, означает то, что ген, подлежащий экспрессии, и его регуляторная последовательность функционально связаны друг с другом способом, делающим возможной экспрессию гена. Термин «регуляторные элементы» включают промотор для инициации транскрипции, любую последовательность оператора для осуществления контроля транскрипции, последовательность, кодирующуюподходящий сайт связывания рибосомы с мРНК, и последовательность для осуществления контроля терминации транскрипции и трансляции. Примеры данного вектора включают плазмидные векторы, космидные векторы, бактериофаговые векторы и вирусные векторы, но не ограничиваются ими.

«Рекомбинантный вектор», который используется в настоящем раскрытии, может быть трансформирован в подходящую клетку-хозяина и затем может реплицироваться независимо от генома данной клетки-хозяина или может быть интегрирован в сам геном. В данном случае «подходящая клетка-хозяин» может содержать репликатор, который представляет собой конкретную нуклеотидную последовательность, которая обеспечивает репликацию вектора в подходящей клетке-хозяине, и от которой начинается репликация.

Трансформацию можно проводить с использованием подходящей методики введения вектора, выбранной, в зависимости от клетки-хозяина, таким образом, что целевой ген может экспрессироваться в данной клетке-хозяине. Например, введение вектора может осуществляться электропорацией, тепловым шоком, осаждением с фосфатом кальция (CaPO₄), осаждением с хлоридом кальция (CaCl₂), микроинъекцией, способом с полиэтиленгликолем (PEG), способом с DEAE-декстраном, способом с катионными липосомами, способом с ацетатом лития-DMSO (диметилсульфоксид) или их комбинацией. Для трансформированного гена не важно, вставлен ли данный ген в хромосому клетки-хозяина или локализуется вне хромосомы, при условии, что данный ген может экспрессироваться в клетке-хозяине.

Данная клетка-хозяин может включать клетку, трансфицированную, трансформированную или инфицированную рекомбинантным вектором или полинуклеотидом по настоящему раскрытию in vivo или in vitro. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантный вектор по настоящему раскрытию, может представлять собой рекомбинантную клетку-хозяина, рекомбинантную клетку или рекомбинантный микроорганизм.

Кроме того, рекомбинантный вектор по настоящему раскрытию может содержать селективный маркер. Селективный маркер можно использовать для отбора трансформанта (клетки-хозяина), полученного трансформацией данным вектором. Поскольку в среде, обработанной селективным маркером, могут выживать только клетки, экспрессирующие данный селективный маркер, селективный маркер может отбирать трансформированные клетки. Репрезентативные примеры селективного маркера включают канамицин, стрептомицин и хлорамфеникол, но не ограничиваются ими.

Гены, вставленные в рекомбинантный вектор для трансформации по настоящему раскрытию, могут быть введены в клетку-хозяина, такого как микроорганизм вида Corynebacterium, посредством кроссинговера на основе гомологичной рекомбинации.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия клетка-хозяин может представлять собой штамм вида Corynebacterium, например, штамм Corynebacterium glutamicum.

Согласно другому аспекту настоящего раскрытия предложен способ продуцирования L-лизина, включающий стадии а) культивирования мутантного штамма Corynebacterium glutamicum в среде; и б) выделения L-лизина из данного мутантного штамма или среды, в которой культивировался данный мутантный штамм.

Культивирование может осуществляться с использованием подходящей среды и культуральных условий, известных в данной области, и любой специалист в данной области может легко корректировать и применять данную среду и культуральные условия. В частности, данная среда может представлять собой жидкую среду, но не ограничивается ей. Примеры способа культивирования включают периодическое культивирование, непрерывное культивирование, культивирование с подпиткой или их комбинацию, но не ограничиваются ими.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия данная среда должна удовлетворять требованиям конкретного штамма правильным образом, и она может быть подходящим образом модифицирована специалистом в данной области. Относительно культуральной среды для штамма вида Corynebacterium может быть сделана ссылка на известный документ (Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981), но не ограничиваясь им.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия данная среда может содержать разные источники углерода, источники азота и компоненты-микроэлементы. Примеры источников углерода, которые можно использовать, включают сахариды и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; жиры и масла, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Данные вещества можно использовать индивидуально или в смеси, но не ограничиваясь ими. Примеры источников азота, которые можно использовать, включают соединения, содержащие органический азот, такие как пептон, дрожжевойэкстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевый жмых и мочевину или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Данные источники азота также можно использовать индивидуально или в смеси, но не ограничиваясь ими. Примеры источников фосфора, которые можно использовать, включают калия дигидрофосфат или дикалия гидрофосфат, или соответствующие натрийсодержащие соли, но не ограничиваются ими. Кроме того, культуральная среда может содержать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа, которые требуются для роста, но не ограничиваясь ими. Кроме того, культуральная среда может содержать незаменимые ростовые вещества, такие как аминокислоты и витамины. Кроме того, в данную культуральную среду могут быть добавлены подходящие предшественники. Среду или индивидуальные компоненты можно добавлять в культуральную среду во время культивирования подходящим способом периодически или непрерывно, но не ограничиваясь ими.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия рН культуральной среды можно корректировать добавлением в культуральную среду микроорганизма таких соединений, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота подходящим способом во время культивирования. Кроме того, во время культивирования пенообразование можно подавлять с использованием пеногасителя, такого как сложный полигликолевый эфир жирной кислоты. Кроме того, для поддержания культуральной среды в аэробном состоянии в данную культуральную среду можно инъецировать кислород или кислородсодержащий газ (например, воздух). Температура данной культуральной среды обычно может составлять от 20°С до 45°С, например, от 25°С до 40°С.Культивирование можно продолжать, пока не продуцируется желательное количество полезного вещества. Например, время культивирования может составлять от 10 часов до 160 часов.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия на стадии выделения L-лизина из культивируемого мутантного штамма или среды, в которой культивировали данный мутантный штамм, продуцированный L-лизин может быть отобран или выделен из культуральной среды с использованием подходящего способа, известного в данной области, в зависимости от способа культивирования. Примеры данного способа включают центрифугирование, фильтрование, экстракцию, распыление, сушку, упаривание, осаждение, кристаллизацию, электрофорез, фракционное растворение (например, осаждение сульфатом аммония), хроматографию (например, ионообменная, аффинная, гидрофобная и гель-фильтрация), но не ограничиваются ими.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия стадию выделения L-лизина можно осуществлять центрифугированием культуральной среды на низкой скорости для удаления биомассы и отделения полученного супернатанта посредством ионообменной хроматографии.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия стадия выделения L-лизина может включать способ очистки L-лизина.

Полезные эффекты

Мутантный штамм Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию может улучшать продукционный выход L-лизина посредством увеличения или усиления экспрессии гена, кодирующего пируваткарбоксилазу, по сравнению с родительским штаммом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 показана структура вектора pCGI(Pm1-pyc'), содержащего промотор, полученный заменой нуклеотидной последовательности области от -73 до -61 на tgtggtatgatgg и заменой нуклеотидной последовательности области от -51 до -38 на acagctgctactgt в последовательности промотора гена, кодирующего пируваткарбоксилазу, согласно одному примеру настоящего раскрытия.

На ФИГ. 2 показана структура вектора pCGI(Pm2-pyc'), содержащего промотор, полученный заменой нуклеотидной последовательности области от -73 до -61 на tgttgtatgattg и заменой нуклеотидной последовательности области от -51 до -38 на actgctgctactac в последовательности промотора гена, кодирующего пируваткарбоксилазу, согласно одному примеру настоящего раскрытия.

Способ осуществления данного изобретения

Далее настоящее раскрытие будет описано более подробно. Однако данное описание приводится лишь в качестве примера для того, чтобы помочь пониманию настоящего раскрытия, и объем настоящего раскрытия не ограничивается данным иллюстративным описанием.

Пример 1. Конструирование мутантного штамма Corynebacterium glutamicum Для конструирования мутантного штамма Corynebacterium glutamicum, имеющего повышенную активность пируваткарбоксилазы, осуществляли случайный мутагенез с использованием штамма DS1 Corynebacterium glutamicum.

1-1. Мутагенез

Штамм DS1 Corynebacterium glutamicum инокулировали в колбу, содержащую 50 мл бульона СМ для посевной культуры (содержащего, на дистиллированную воду, 5 г глюкозы, 2,5 г NaCl, 5,0 г дрожжевого экстракта, 1,0 г мочевины, 10,0 г полипептона и 5,0 г говяжьего экстракта, рН 6,8), и добавляли в него мутаген N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) до конечной концентрации 300 мкг/мл, с последующим культивированием при 30°С со встряхиванием при 200 об./мин в течение 20 часов. Затем культуру центрифугировали при 12000 об./мин в течение 10 минут для удаления супернатанта, и остающиеся клетки один раз промывали физиологическим раствором и дополнительно три раза промывали фосфатным буфером. Затем клетки суспендировали в 5 мл фосфатного буфера, высаживали на твердую среду для посевной культуры (дополнительно содержащую 15 г/л агара, помимо жидкой среды для посевной культуры), культивировали при 30°С в течение 30 часов и выделяли 100 колоний.

1-2. Отбор мутантных штаммов, имеющих повышенную продуктивность в отношении L-лизина и конструирование библиотек мутантов

5% каждых 100 выделенных колоний инокулировали в колбу, содержащую 10 мл жидкой среды для продукции лизина, показанной в Таблице 1 ниже, и культивировали со встряхиванием при 200 об./мин при 30°С в течение 30 часов. Каждую из культур измеряли на поглощение при ОП 610 нм, и продукцию L-лизина сравнивали между культурами. В результате отобрали 10 колоний, продуцирующих 75,0 г/л или более L-лизина. Кроме того, проводили секвенирование для идентификации положений мутаций в промоторе гена рус.

Пример 2. Модификация промотора рус

2-1. Модификация промотора: введение мутации

Синтезировали 30 последовательностей-кандидатов, причем каждая имеет вплоть до 15 модификаций нуклеотидов, включая положения мутаций в промоторе рус, которые были идентифицированы в Примере 1, посредством способа, описанного в Sambrook, J. et al. (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, volume 2, 13.36-13.39, и каждую последовательность промотора рус Corynebacterium glutamicum АТСС13032 (см. SEQ ID NO: 1) и синтезированные области промотора рус клонировали в вектор pSK1-CAT, который представляет собой вектор с репортером -хлорамфениколацетилтрансферазой (CAT). Ориентацию во время клонирования ДНК и присутствует ли мутация во время клонирования ДНК проверяли посредством секвенирования ДНК. Библиотеки мутантов, сконструированные, как описано выше, называли от pSK1-pyc1 до pSK1-рус30. Наконец, каждую из библиотек мутантов трансформировали в Corynebacterium glutamicum АТСС13032, и проводили сравнительную проверку активностей промотора.

2-2. Трансдукция структуры pSK1-CAT в Corynebacterium glutamicum АТСС13032

Получали компетентные клетки для того, чтобы трансформировать Corynebacterium glutamicum АТСС13032 каждой из сконструированных pSK-pyc1 - pSK-рус30, идентифицированных посредством секвенирования. 10 мл культивируемой Corynebacterium glutamicum АТСС13032 инокулировали и культивировали в 100 мл среды BHIS (бульон с сердечным экстрактом дополненный) при 30°С в течение ночи и затем инокулировали в 100 мл бульона СМ для достижения ОП 600 (оптическая плотность при длине волны 600 нм) 0,3 и культивировали при 18°С при 120 об./мин в течение примерно 28 часов пока ОП 600 не достигала 0,8. Данную культуру центрифугировали при 6000 об./мин при 4°С в течение 10 мин, и клетки отбирали, суспендировали в 20 мл 10%-ного раствора глицерина и затем центрифугировали. Данный процесс повторяли три раза. Отобранные клетки ресуспендировали в 10%-ном растворе глицерина, и в каждую Е-пробирку распределяли 100 мкл клеточной суспензии и хранили в морозильной камере глубокой заморозки при -70°С до применения. 1 мкг ДНК добавляли к 100 мкл компетентных клеток Corynebacterium glutamicum АТСС13032, которые затем добавляли в охлажденную кювету для электропорации, и проводили электропорацию с использованием MicroPulser (Bio-Rad). Сразу после подачи импульсов к клеткамдобавляли 1 мл бульона СМ, предварительно нагретого при 46°С. Затем клетки отбирали, выдерживали на льду в течение 2 минут и затем инкубировали в инкубаторе при 30°С при 180 об./мин. Затем 100 мкл клеток высаживали на чашку с агаром BHIS, дополненным канамицином (50 мкг/мл), и затем культивировали в инкубаторе при 30°С.

2-3. Анализ CAT

Анализ хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) вариантов промоторной области рус проводили с использованием способа Shaw (Shaw et al., 1991, Biochemistry. 30(44): 10806). Вкратце, каждый из трансформированных штаммов Corynebacterium glutamicum культивировали в бульоне СМ, дополненном канамицином (50 мкг/мл), отбирали клетки и выделяли из клеток лизаты белка. Добавляли 5 мкг каждого белка и проводили реакцию с 0,1 М буфера Tris-HCl (рН 7,8), 0,4 мг/мл 5,5’-дитиобис-2-нитробензойной кислоты (DTNB; Sigma D8130), 0,1 мМ ацетил-КоА (Sigma А2056) и 0,1 мМ хлорамфеникола при комнатной температуре в течение 15 минут и затем измеряли поглощение при ОП 412 нм. Посредством этого отбирали два варианта (pSK-рус3 и pSK-pyc23), демонстрирующих наибольшее увеличение активности CAT по сравнению с последовательностью промотора рус Corynebacterium glutamicum дикого типа.

pSK-рус3 содержал замену нуклеотидной последовательности области от -73 до -61 на tgtggtatgatgg и замену нуклеотидной последовательности области от -51 до -38 на acagctgctactgt в последовательности промотора выше инициирующего кодона гена, кодирующего пируваткарбоксилазу, и pSK-pyc23 содержал замену нуклеотидной последовательности области от -73 до -61 на tgttgtatgattg и замену нуклеотидной последовательности области от -51 до -38 на actgctgctactac в последовательности промотора. Затем провели эксперимент для подтверждения увеличения продуктивности в отношении L-лизина посредством мутации в промоторе гена рус с использованием штамма DS1 Corynebacterium glutamicum.

Пример 3. Конструирование мутантного штамма Corynebacterium glutamicum

Для конструирования мутантного штамма Corynebacterium glutamicum, имеющего повышенную активность пируваткарбоксилазы, использовали штамм DS1 Corynebacterium glutamicum и DH5αЕ. coli (HIT Competent cells™, кат. №RH618).

Штамм DS1 Corynebacterium glutamicum культивировали в среде СМ-бульон (рН 6,8) (содержащей, на литр дистиллированной воды, 5 г глюкозы, 2,5 г NaCl, 5,0 г дрожжевого экстракта, 1,0 г мочевины, 10,0 г полипептона и 5,0 г говяжьего экстракта) при температуре 30°С.

DH5α E.coli культивировали в среде LB (Лурия-Бертани) (содержащей, на литр дистиллированной воды, 10,0 г триптона, 10,0 г NaCl и 5,0 г дрожжевого экстракта) при температуре 37°С.

Использованые канамицин и стрептомицин приобретали у Sigma, а секвенирование ДНК проводилось Macrogen.

3-1. Конструирование рекомбинантного вектора

Для того, чтобы увеличить продуктивность данного штамма в отношении лизина посредством усиления поставки предшественника лизина - оксалоацетата в данный штамм, вводили усиление пируваткарбоксилазы. В способе, используемом в данном Примере, в промоторе гена рус индуцировали специфические мутации для того, чтобы увеличить экспрессию гена рус, кодирующего пируваткарбоксилазу. Для замены в промоторе гена рус нуклеотидной последовательности ggggttacgatac области от -73 до -61 на tgtggtatgatgg и замены нуклеотидной последовательности gtgactgctatcac области от -51 до -38 на acagctgctactgt в промоторе гена рус конструировали праймеры, включающие мутантные последовательности. С использованием данных праймеров посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция) амплифицировали область из 735 п. н. левого плеча и 730 п. н. правого плеча относительно мутировавшей области промотора гена рус на геноме мутантного штамма DS1 Corynebacterium glutamicum, отобранного в Примере 1. ПЦР-продукты лигировали друг с другом посредством ПЦР с перекрывающимися праймерами и затем клонировали в рекомбинантный вектор pCGI (см. Kim et al., Journal of Microbiological Methods 84 (2011), 128-130). Полученную в результате плазмиду называли pCGI(Pml-pyc') (см. ФИГ. 1). Для конструирования данной плазмиды для амплификации каждого фрагмента ДНК использовали праймеры для амплификации варианта 1 промотора рус и праймеры для амплификации вектора pCGI, показанные в Таблице 2 ниже.

В частности, ПЦР проводили от геномной ДНК штамма DS1 Corynebacterium glutamicum с использованием соответствующих праймеров при следующих условиях.

От 25 до 30 циклов ПЦР проводили в присутствии 1 единицы смеси ДНК-полимеразы pfu-X (Solgent) с использованием термоциклера (ТР600, TAKARA BIO Inc., Япония), реакционного раствора, содержащего 100 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ) и 1 пМ олигонуклеотида, и используя 10 нг хромосомной ДНК мутантного штамма DS1 Corynebacterium glutamicum (идентифицированного в Примере 1) или вектора pCGI в качестве матрицы. ПЦР проводили за 25-30 циклов, причем каждый состоял из (1) денатурации при 94°С в течение 30 секунд, (2) отжига при 58°С в течение 30 секунд и (3) элонгации при 72°С в течение 1-2 минут (время полимеризации 2 минуты на 1 т.п.н.).

Фрагменты гена, полученные, как описано выше, клонировали в вектор pCGI посредством самосборочного клонирования. Данный вектор трансформировали в Е. coli DH5α, которую затем сеяли штрихами на чашку с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл канамицина, и культивировали при 37°С в течение 24 часов. Образованные наконец колонии выделяли и проверяли, точно ли присутствовали данные вставки в векторе, и затем данный вектор выделяли и использовали для рекомбинации штамма DS1 Corynebacterium glutamicum.

Во время генетической манипуляции использовали Taq полимеразу Ex (Takara) и полимеразу Pfu (Solgent) в качестве ферментов для ПЦР-амплификации, и разные использованные рестрикционные ферменты и ДНК-модифицирующие ферменты приобретали у NEB. Данные полимеразы и ферменты использовали согласно поставленным буферу и протоколам.

3-2. Конструирование мутантного штамма

Штамм DS5 конструировали с использованием вектора pCGI(Pml-pyc'). Данный вектор получали в конечной концентрации 1 мкг/мл или выше, и вводили в штамм DS1 Corynebacterium glutamicum посредством электропорации (см. Tauch et al, FEMS Microbiology letters 123 (1994) 343-347), таким образом, индуцируя первичную рекомбинацию. В это время подвергнутый электропорации штамм высаживали на чашку с СМ-агаром, содержащим 20 мкг/мкл канамицина, выделяли колонии, и затем анализировали посредством ПЦР и секвенирования, правильно ли данный вектор был вставлен в индуцированное положение в геноме. Для того, чтобы индукцировать вторичную рекомбинацию выделенного штамма, выделенный штамм инокулировали на жидкую среду с СМ-агаром, содержащим стрептомицин, культивировали в течение ночи или дольше, затем высаживали на среду с агаром, содержащую стрептомицин в такой же концентрации, и выделяли колонии. Проверяли, имеют ли конечные выделенные колонии устойчивость к канамицину, и затем анализировали были ли введены мутации в промотор гена рус в штаммах, не имеющих устойчивости к антибиотику, посредством секвенирования (см. Schafer et al., Gene 145 (1994) 69-73). Наконец, получали мутантный штамм (DS5) Corynebacterium glutamicum, имеющий мутации, введенные в промотор гена рус.

Пример 4. Конструирование мутантного штамма Corynebacterium glutamicum

Мутантный штамм Corynebacterium glutamicum конструировали таким же способом, как и в Примере 3, за исключением того, что проводили замену нуклеотидной последовательности ggggttacgatac области от -73 до -61 на tgttgtatgattg и замену нуклеотидной последовательности gtgactgctatcac области от -51 до -38 на actgctgctactac в промоторе гена рус.

В данном Примере для конструирования плазмиды для амплификации каждого фрагмента гена использовали праймеры для амплификации варианта-2 промотора рус и праймеры для амплификации вектора pCGI, показанные в Таблице 3 ниже, и сконструированный плазмидный вектор pCGI(Pm2-pyc') (см. FIG. 2) Наконец, получали мутантный штамм Corynebacterium glutamicum (DS5-1), имеющий введенный в него мутантный ген рус.

Экспериментальный пример 1. Сравнение продуктивности в отношении L-лизина между мутантными штаммами и родительским штаммом

Продуктивность в отношении L-лизина сравнивали между родительским штаммом - штаммом DS1 Corynebacterium glutamicum и продуцирующими лизин мутантными штаммами штаммами DS5 и DS5-1, сконструированными в Примерах 3 и 4.

Каждый из штаммов инокулировали в 100 мл колбу, содержащую 10 мл лизиновой среды, имеющей состав, показанный в Таблице 1 выше, и затем культивировали со встряхиванием при 180 об./мин при 30°С в течение 28 часов. После завершения культивирования для анализа лизина продукцию L-лизина измеряли посредством ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) (Shimazu, Япония), и результаты измерения показаны в Таблице 4 ниже.

Как показано в Таблице 4 выше, подтвердили то, что у мутантных штаммов DS5 и DS5-1 Corynebacterium glutamicum, в которых специфические положения (область от -73до -61 и область от -51 до -38) в последовательности промотора гена рус были заменены оптимальными нуклеотидными последовательностями для усиления поставки предшественника лизина - оксалоацетата, продуктивности в отношении L-лизина мутантных штаммов DS5 и DS5-1 увеличивались примерно на 8,3% и 4,7%, соответственно, по сравнению с продуктивностью родительского штамма DS1 Corynebacterium glutamicum. Из данных результатов можно видеть, что повышенная экспрессия гена рус увеличивала продуктивность в отношении L-лизина мутантного штамма посредством усиления поставки предшественника лизина.

Вплоть до этого момента настоящее раскрытие было описано со ссылкой на его воплощения. Обычным специалистам в области, к которой относится настоящее раскрытие, будет понятно то, что настоящее раскрытие можно осуществлять в модифицированных формах без отступления от важных характеристик настоящего раскрытия. Следовательно, раскрытые воплощения следует рассматривать с иллюстративной точки зрения, а не с ограничивающей точки зрения. Объем настоящего раскрытия определяется формулой изобретения, а не приведенным выше описанием, и все различия в пределах эквивалентного ей объема следует истолковывать как включенные в настоящее раскрытие.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> ВАРИАНТ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, ИМЕЮЩИЙ УЛУЧШЕННУЮ СПОСОБНОСТЬ К ПРОДУКЦИИ L-ЛИЗИНА, И СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ L-ЛИЗИНА С ЕГО ПРИМЕНЕНИЕМ

<130> OPA23237

<150> KR 10-2021-0056581

<151> 2021-04-30

<150> KR 10-2021-0066965

<151> 2021-05-25

<160> 15

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 247

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Последовательность промотора гена pyс

<400> 1

aaatgcgtta aacttggcca aatgtggcaa cctttgcaag gtgaaaaact ggggcggggt 60

tagatcctgg ggggtttatt tcattcactt tggcttgaag tcgtgcaggt caggggagtg 120

ttgcccgaaa acattgagag gaaaacaaaa accgatgttt gattggggga atcgggggtt 180

acgatactag gacgcagtga ctgctatcac ccttggcggt ctcttgttga aaggaataat 240

tactcta 247

<210> 2

<211> 247

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Мутантная последовательность промотора гена pyс

<400> 2

aaatgcgtta aacttggcca aatgtggcaa cctttgcaag gtgaaaaact ggggcggggt 60

tagatcctgg ggggtttatt tcattcactt tggcttgaag tcgtgcaggt caggggagtg 120

ttgcccgaaa acattgagag gaaaacaaaa accgatgttt gattggggga atcgtgtggt 180

atgatggtag gacgcaacag ctgctactgt ccttggcggt ctcttgttga aaggaataat 240

tactcta 247

<210> 3

<211> 247

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Мутантная последовательность промотора гена pyс

<400> 3

aaatgcgtta aacttggcca aatgtggcaa cctttgcaag gtgaaaaact ggggcggggt 60

tagatcctgg ggggtttatt tcattcactt tggcttgaag tcgtgcaggt caggggagtg 120

ttgcccgaaa acattgagag gaaaacaaaa accgatgttt gattggggga atcgtgttgt 180

atgattgtag gacgcaactg ctgctactac ccttggcggt ctcttgttga aaggaataat 240

tactcta 247

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pycP-F1

<400> 4

catgtatcac gcactcggtg aaggcgtgag ccc 33

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pycP-R1

<400> 5

gaccgccaag gacagtagca gctgttgcgt cctaccatca taccacacga ttccc 55

<210> 6

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pycP-F2

<400> 6

gggaatcgtg tggtatgatg gtaggacgca acagctgcta ctgtccttgg cggtc 55

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pycP-R2

<400> 7

aacttctcca gtgtgatcgc caaggatctg cac 33

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pycP-F3

<400> 8

tgattacgcc catgtatcac gcactcggtg 30

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pycP-R3

<400> 9

gtgtgatcgc caaggatctg cacttc 26

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCGI-F1

<400> 10

actggccgtc gttttacaac 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCGI-R1

<400> 11

ggcgtaatca tggtcatagc 20

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCGI(pyc)-F2

<400> 12

tggagaagtt actggccgtc gttttacaac 30

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCGI-R2

<400> 13

tggtcatagc tgtttcctgt g 21

<210> 14

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pycP-R4

<400> 14

gaccgccaag ggtagtagca gcagttgcgt cctacaatca tacaacacga ttccc 55

<210> 15

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pycP-F4

<400> 15

gggaatcgtg ttgtatgatt gtaggacgca actgctgcta ctacccttgg cggtc 55

<---

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к промотору, мутантному микроорганизму Corynebacterium glutamicum, продуцирующему L-лизин и содержащему указанный промотор, и способу продуцирования L-лизина с использованием указанного мутантного микроорганизма. Изобретение обеспечивает продуцирование L-лизина с улучшенным выходом. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 4 пр.

1. Промотор, в котором в промоторной последовательности SEQ ID NO: 1 гена, кодирующего пируваткарбоксилазу, нуклеотидная последовательность в области от -73 до -61 заменена с ggggttacgatac на tgtggtatgatgg и нуклеотидная последовательность в области от -51 до -38 заменена с gtgactgctatcac на acagctgctactgt.

2. Мутантный микроорганизм Corynebacterium glutamicum, продуцирующий L-лизин, в котором в промоторной последовательности SEQ ID NO: 1 гена, кодирующего пируваткарбоксилазу, нуклеотидная последовательность в области от -73 до -61 заменена с ggggttacgatac на tgtggtatgatgg и нуклеотидная последовательность в области от -51 до -38 заменена с gtgactgctatcac на acagctgctactgt.

3. Мутантный микроорганизм Corynebacterium glutamicum по п. 2, где данный микроорганизм содержит нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2.

4. Способ продуцирования L-лизина, включающий следующие стадии:

а) культивирование микроорганизма по п. 2 в среде и

б) выделение L-лизина из данного микроорганизма или среды, в которой культивируется данный микроорганизм.