СПОСОБ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОГО ЦИСТИТА И ФИБРОЗА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ Российский патент 2025 года по МПК A61K31/155 A61P13/10 

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологической урологии и радиационной онкологии, и представляет собой способ профилактики лучевых циститов и фиброза мочевого пузыря, развивающихся на фоне радиотерапии злокачественных опухолей, локализованных в области малого таза.

По данным медицинской статистики, около 20-25% злокачественных новообразований человека имеют локализацию в области малого таза. Так, в Российской Федерации в 2021 году было выявлено 580000 новых случаев злокачественных новообразований, из которых 134147 приходится на опухоли органов малого таза (Состояние онкологической помощи населению России в 2021 году / под ред. Каприна А.Д., Старинского В.В., Шахзадовой А.О. − М.: МНИОИ им. П. А. Герцена − филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2022. − 239 с).

Одним из наиболее эффективных способов лечения злокачественных новообразований в области малого таза является лучевая терапия. Вместе с тем, радиотерапия опухолей такой локализации достаточно часто сопровождается развитием острых и отдаленных осложнений, обусловленных лучевым поражением нормальных, немалигнизированных тканей мочевыводящих путей и толстого кишечника. По данным литературы, развитие лучевых циститов и проктитов отмечается у 30% онкологических больных, получавших лучевую терапию на область малого таза (Сычева И.В. Лечение лучевых повреждений органов малого таза после лучевой терапии рака предстательной железы. Сибирский онкологический журнал. 2018; 17(3): 64–71). Такие осложнения радиотерапии, особенно их отдаленные стадии, с трудом поддаются консервативному лечению, и способны не только приводить к инвалидизации, но и могут представлять прямую угрозу жизни больных, а существующие подходы к профилактике развития данных осложнений несовершенны. В этой связи, проблема разработки новых способов профилактики лучевых токсических реакций со стороны органов малого таза является в настоящее время актуальной для всех стран мира.

В научной и патентной литературе на сегодняшний день описано значительное число способов системного и местного лечения лучевых циститов. Системные методы лечения направлены на замену или усиление поврежденного полисахаридного слоя мочевого пузыря, уменьшение хрупкости его кровеносных сосудов и противодействие развитию фиброза.

Так, известно применение химически стабильного хлоринового матрикса TCDO/WF10 для снижения степени гематурии при лучевом цистите (Denton S., Clarke N. W., Maher E. J. Non-surgical interventions for late radiation cystitis in patients who have received radical radiotherapy to the pelvis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2002; 3: CD001773).

Недостатком этого способа является то, что препараты TCDO/WF10 нередко вызывают тошноту, головную боль и преходящую анемию, и в настоящее время еще не лицензированы для лечения лучевого цистита.

Известно позитивное влияние конъюгированного эстрогена на сосуды мочевого пузыря и течение гематурии при лучевом цистите (Liu Y. K., Harty J. I., Steinbock G. S. et al. Treatment of radiation or cyclophosphamide induced hemorrhagic cystitis using conjugated estrogen. Journal of Urology. 1990; 144(1): 41-3).

Однако, недостатком способа является отсутствие для конъюгированного эстрогена лицензии для лечения лучевого цистита.

Известен достаточно эффективный способ системного лечения лучевого цистита - гипербарическая оксигенация (Oscarsson N., Müller B., Rosén A. et al. Radiation-induced cystitis treated with hyperbaric oxygen therapy (RICH-ART): a randomised, controlled, phase 2-3 trial. Lancet Oncol. 2019; 20(11): 1602-14). Усиленная оксигенация тканей поврежденного мочевого пузыря стимулирует заживление дефектов в подслизистом слое и реваскуляризацию стенок мочевого пузыря.

Недостатком такого метода лечения является высокая стоимость, трудоемкость и побочный эффект. Стойкий терапевтический эффект достигается только после 35-40 двухчасовых сеансов. И при этом у 30-40% пациентов развивается оталгия.

Известны способы местного, внутрипузырного лечения лучевого цистита, обладающих анальгезирующей, антисептической, противовоспалительной, регенераторной и фибринолитической направленностью; RU 2537031 C2, 27.12.2014 и RU 2730450 C1, 08.24.2020 – в них описаны способы местного лечения циститов различной этиологии, в том числе, и лучевых циститов, гелями «Колагель» и гидрогелевыми салфетками «Колетекс» под контролем лабораторных показателей мочи.

В ряде работ показана польза внутрипузырных инъекций ботулинического токсина А (Chuang Y.C., Kim D. K., Chiang P.H., et al. Bladder botulinum toxin A injection can benefit patients with radiation and chemical cystitis. BJU International. 2008; 102(6): 704-6) и дендритно-клеточной вакцины, полученной с использованием антигенов культуры HeLa (RU 2645957 C1, 10.04.2017). У пациентов с лучевым циститом при этом отмечается увеличение емкости мочевого пузыря и снижение частоты мочеиспусканий. В настоящее время ботулинический токсин А рекомендован в ряде стран для лечения гиперактивного мочевого пузыря.

Позитивный эффект на реваскуляризацию и регенерацию слизистых мочевого пузыря и фибринолитическое действие при лучевом цистите оказывает внутрипузырное введение гелей, содержащих супероксиддисмутазу (Жариков А.А., Пасов В.В., Паршин В.С. Новый подход в лечении местных лучевых повреждений мочевого пузыря: внутритазовые блокады и ультразвуковая навигация. Радиация и риск. 2019; 28(3): 107-18), полидезоксирибонуклеотиды (Bonfili P., Franzese P., Marampon F. et al. Intravesical instillations with polydeoxyribonucleotides reduce symptoms of radiation induced cystitis in patients treated with radiotherapy for pelvic cancer: a pilot study. Supportive Care in Cancer. 2014; 22(5): 1155-9), экстракты плаценты (Micic S., Genbacev O. Post-irradiation cystitis improved by instillation of early placental extract in saline. European Urology. 1988; 14(4): 291-3), гиалуроновую кислоту (Shao Y., Lu G.L., Shen Z.J. Comparison of intravesical hyaluronic acid instillation and hyperbaric oxygen in the treatment of radiation-induced hemorrhagic cystitis. BJU International. 2012; 109(5): 691-4) и хондроитина сульфат (Hazewinkel M.H., Stalpers L.J.A., Dijkgraaf M.G., et al. Prophylactic vesical instillations with 0.2% chondroitin sulfate may reduce symptoms of acute radiation cystitis in patients undergoing radiotherapy for gynecological malignancies. International Urogynecology Journal. 2011; 22(6): 725-30).

Общими недостатками всех описанных способов местного лечения лучевого цистита является ограниченная терапевтическая эффективность и необходимость длительных инсталляций или инъекций терапевтических средств, что может привести к механическим повреждениям слизистых уретры и мочевого пузыря, и бактериальному обсеменению. В крайних случаях, может развиться стеноз уретры или формирование ложных мочевыводящих ходов, с необходимостью пластической хирургической коррекции.

Если подходы к лечению острых и поздних лучевых циститов достаточно активно развиваются, и некоторых из них уже доступны в клинической практике, то возможности фармакологической профилактики лучевых циститов в настоящее время остаются крайне ограниченными. Известно единственное лекарственное средство такого действия, допущенное к применению для человека, - аминоалкилтиоловый радиопротектор амифостин. Этот препарат с 2004 года ограничено применяется в радиационной онкологии для профилактики осложнений радиотерапии опухолей головы и шеи, абдоминальной области и малого таза (King M., Joseph S., Albert A., et al. Use of amifostine for cytoprotection during radiation therapy: a review. Oncology. 2020; 98(2): 61-80).

Недостатком амифостина является низкая переносимость и достаточно высокая токсичность для человека. Острые негативные эффекты амифостина развиваются в 30-40% случаев, и, как правило, требуют незамедлительной коррекции и отказа от дальнейшего применения препарата (Brunton L., Hilat-Dandan R. Goodman and Gilman manual of pharmacology and therapeutics, second edition. – McGraw Hill / Medical, 2013. – 1216 p).

Известно средство 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины фосфат, соединение Т1082 со структурной формулой (I):

(I),

обладающее радиозащитной эффективностью (RU 2733883 C2; 07.10.2020). Данное соединение Т1082 взято за прототип. Ранее установлена способность 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины фосфата при пероральном введении в безопасных дозах выраженно снижать кожную токсичность фракционированной радиотерапии (Filimonova M., Saburova A., Shevchenko L., et al. 1-isobutanoil-2-isopropylisothiourea phosphate, T1082: a safe and effective prevention of radiotherapy complications in oncology. Int. J. Mol. Sci. 2022; 23(5): 2697).

Однако исследований возможностей этого соединения и в профилактике острых и отдаленных лучевых циститов не проводилось.

В этой связи, разработка новых безопасных и эффективных способов профилактики лучевых токсических эффектов со стороны органов малого таза, и, в частности, со стороны мочевого пузыря, является высоко актуальной.

Техническим решением изобретения является создание способа фармакологической профилактики радиационно-индуцированного цистита и фиброза мочевого пузыря, отличающегося безопасностью и низкими рисками негативных эффектов.

Техническим результатом изобретения является обеспечение клинически и морфологически выраженной профилактики раннего (острого) и позднего (хронического) лучевого цистита и фиброза мочевого пузыря безопасным способом с низкими рисками негативных, токсических эффектов: путем неинвазивного перорального введения фармакологического средства в относительно безопасных дозах.

Технический результат достигается тем, что 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины фосфата вводят превентивно, за 30 минут до облучения, в дозах:

- для мышей и крыс внутрижелудочно – 150-225 мг/кг;

- для человека перорально, с учетом площади поверхности тела – 11-18 мг/кг. При этом доза действующего вещества составляет – 1/15-1/10 ЛД₁₀. Пероральный приём твердых лекарственных форм, содержащих 400-500 мг действующего вещества, пациент осуществляет в виде 2-3 капсул/таблеток.

Изобретение поясняется подробным описанием, тремя примерами с достижением заявленного технического результата и 11 иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 – Гистологическое строение мочевого пузыря мыши на 11 сутки после локального воздействия β-облучения в дозе 25 Гр.

Фиг. 2 – Гистологическое строение мочевого пузыря мыши на 11 сутки после локального воздействия β-облучения: в дозе 25 Гр + Т1082 в/ж в дозе 150 мг/кг за 30 минут до облучения: а) увеличение х200; б) увеличение х400.

Фиг. 3 – Гистологическое строение мочевого пузыря мыши на 11 сутки после локального воздействия β-облучения в дозе 25 Гр + Т1082 в/ж в дозе 225 мг/кг за 30 минут до облучения.

Фиг. 4 – Гистологическое строение мочевого пузыря мыши на 38 сутки после локального воздействия β-облучения в дозе 25 Гр за 30 минут до облучения: а) увеличение х200; б) увеличение х400.

Фиг. 5 – Гистологическое строение мочевого пузыря мыши на 38 сутки после локального воздействия β-облучения в дозе 25 Гр + Т1082 в/ж в дозе 150 мг/кг за 30 минут до облучения.

Фиг. 6 – Гистологическое строение мочевого пузыря мыши на 38 сутки после локального воздействия β-облучения в дозе 25 Гр + Т1082 в/ж в дозе 225 мг/кг за 30 минутдо облучения.

Фиг. 7 – Гистологическое строение мочевого пузыря крысы на 41 сутки после однократного локального воздействия β-облучения в дозе 25 Гр.

Фиг. 8 – Гистологическое строение мочевого пузыря крысы на 41 сутки после однократного локального воздействия β-облучения в дозе 25 Гр + Т1082 в/ж в дозе 220 мг/кг за 30 минут до облучения.

Фиг. 9 – Динамика урометрических показателей у мышей экспериментальных групп: а) среднее число мочеиспусканий за 4 часа; б) средний объем мочеиспусканий за 4 часа; в) общий объем мочевыделения за 4 часа. Светлые символы и кривые 1 – показатели облученного контроля (мышей, не получавших введение Т1082); темные символы и кривые 2 – показатели Т1082-леченных облученных мышей (получавших перед облучениями введение Т1082); пунктирными прямыми 3 обозначены интервалы (M±SD) показателей здоровых мышей. Графические отклонения соответствуют SD. Символом # отмечены достоверные различия показателей облученного контроля и Т1082-леченных мышей по U-критерию Манна-Уитни (А – p = 0,00376; p = 0,00552; p = 0,01389; Б – p = 0,00614; p = 0,02672).

Фиг. 10 – Макроскопический вид (увеличение ×20) мочевых пузырей в растянутом состоянии у здоровых животных: а, г) у мышей облученного контроля; б, д) у Т1082-леченных облученных; в, е) у мышей в конце 4-й и 12-й недели после лучевого воздействия (пояснения приведены в тексте).

Фиг. 11 – Гистологическая картина стенки мочевых пузырей у здоровых животных: а, г, ж) у мышей облученного контроля; б, д, з) у Т1082-леченных облученных мышей; в, е, и) в конце 4-й и 12-й недели после лучевого воздействия. Окраска гематоксилином-эозином (H&E) и по Ван Гизону; увеличение ×200.

Способ осуществляют следующим образом.

Мышам, превентивно, за 30 минут до облучения, внутрижелудочно (в/ж) вводят 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины фосфата в следующих дозах:

- для мышей и крыс – 150-225 мг/кг;

- для человека – 11-18 мг/кг, с учетом площади поверхности тела.

При этом доза действующего вещества составляет – 1/15-1/10 ЛД₁₀.

Примеры осуществления способа.

Пример 1.

Профилактическое действие соединения Т1082 в дозах 150 и 225 мг/кг в отношении раннего и позднего лучевого цистита у мышей при однократном внутрижелудочном превентивном введении.

Объектом исследования были выбраны самцы мышей линии F1(CBAxC57Bl/6j), n=42. Методом рандомизации животные были распределены на следующие группы:

1 группа – однократное локальное воздействие β-облучения в дозе 25 Гр, n=14;

2 группа – Т1082 150 мг/кг на основе воды для инъекций за 25-40 минут перед облучением, в/ж + однократное локальное воздействие β-облучения в дозе 25 Гр, n=14;

3 группа – Т1082 225 мг/кг на основе воды для инъекций за 25-40 минут перед облучением, в/ж + однократное локальное воздействие β-облучения в дозе 25 Гр, n=14.

Однократное локальное облучение малого таза проводили на медицинском мобильном линейном ускорителе электронов NOVAC 11 в дозе 25 Гр, энергия электронов 10 МэВ.

Гистологический анализ мочевых пузырей мышей на 11 сутки после однократного локального лучевого воздействия β-облучения в дозе 25 Гр показал, что через 11 суток после облучения наблюдались выраженные изменения в эпителиальной выстилке слизистой оболочки органов. Эпителий был истончен, базальный слой был представлен единичными клетками с узкими гиперхромными ядрами и незначительным объемом цитоплазмы. Ядра многих грушевидных клеток пикнотичны, цитоплазма лишена органелл. Клетки покровного слоя (замыкающие) на некоторых участках слизистой оболочки отсутствовали или находились в стадии десквамации. Подслизистая основа истончена, содержала небольшое количество коллагеновых волокон и клеток соединительной ткани, в основном фиброцитов. Количество сосудов микроциркуляции существенно уменьшено. Сосуды венозного типа полнокровны, клетки эндотелия гиперхромны, выбухали в просвет сосуда. В артериях кровь не обнаруживалась. Мышечная оболочка была отечна, миофибриллярный аппарат гладкомышечных клеток в миоцитарных комплексах был дезорганизован (Фиг.1).

Гистологический анализ мочевых пузырей мышей на 11 сутки после однократного лучевого воздействия β-облучения в дозе 25 Гр + Т1082 в/ж в дозе 150 мг/кг за 30 минут до облучения показал, что слизистая оболочка органов находилась в более сохранном состоянии (Фиг.2). В базальном слое эпителия были видны редко расположенные клетки с сохраненными ядрами. В цитоплазме грушевидных клеток просматривались волокнистые структуры. Покровные клетки в отдельных участках слизистой подвергались десквамации, но их гистологическое строение соответствовало норме: в ядрах хорошо обнаруживались крупные гранулы гетерохроматина, цитоплазма была мелкогранулярной (Фиг.2 а). В подслизистой основе располагались волокна соединительной ткани и умеренное количество фибробластов. В эндотелии не обнаруживалось признаков деструкции. Миофибриллярный аппарат, как на продольных, так и поперечно срезанных миоцитарных комплексах упорядочен и заполняет всю цитоплазму гладкомышечных клеток (Фиг.2 б).

Гистологический анализ мочевых пузырей мышей на 11 сутки после однократного лучевого воздействия β-облучения в дозе 25 Гр + Т1082 в/ж в дозе 225 мг/кг за 30 минут до облучения показал, что стенки органов находились в компактном состоянии. В слизистой оболочке просматривались хаотично расположенные базальные клетки. Отмечалась хорошая сохранность эпителия (слизистой оболочки), в частности покровных клеток (Фиг.3). В подслизистой основе и мышечной оболочке отек был слабо выражен.

Гистологический анализ мочевых пузырей мышей на 38 сутки после однократного локального лучевого воздействия β-облучения в дозе 25 Гр показал, что цитоархитектоника стенок органов не была изменена, а структура стенок имела складчатый вид. Переходный эпителий на протяжении слизистой имел неравномерную толщину. Клетки базального слоя распределены неравномерно, в некоторых участках слизистой оболочки отсутствуют. В отдельных грушевидных клетках ядра гиперхромны, но в целом цитоплазматические структуры просматривалась (Фиг.4 а), Замыкающие клетки с гомогенной зернистой цитоплазмой и мелкими гиперхромными ядрами не всегда видны. Подслизистая оболочка содержит оксифильные коллагеновые волокна и фиброциты. Венозные сосуды подслизистой основы полнокровны. Отмечен случай присутствия лимфоцитарного инфильтрата в периваскулярном пространстве венозного сосуда. Строма между миоцитарными комплексами отечна (Фиг.4 б). Миофибриллярный аппарат отдельных гладкомышечных клеток дезорганизован.

Гистологический анализ мочевых пузырей мышей на 38 сутки после однократного локального лучевого воздействия β-облучения в дозе 25 Гр+Т1082 в/ж в дозе 150 мг/кг за 30 минут до облучения показал, что переходный эпителий слизистых оболочек содержал хорошо визуализируемые упорядоченно расположенные клетки базального слоя и несколько рядов грушевидных клеток Замыкающие клетки также были сохранены. В подслизистой основе тонким слоем располагались слабо оксифильные коллагеновые волокна. Среди клеточных элементов соединительной ткани преобладали фибробласты. Подслизистая оболочка была умеренно полнокровна (Фиг.5), сохранялся небольшой отек стромы. В мышечной оболочке цитоплазма мышечных клеток оксифильна.

Гистологический анализ мочевых пузырей мышей на 38 сутки после однократного локального лучевого воздействия β-облучения в дозе 25 Гр + Т1082 в/ж в дозе 225 мг/кг за 30 минут до облучения показал, что слизистая оболочка органов формировала складки, покрытые переходным эпителием, содержащим все клеточные слои. Подслизистая основа была незначительной толщины, умеренно васкуляризирована, со слабо оксифильными коллагеновыми волокнами и небольшим количеством соединительнотканных клеток (Фиг.6), мышечная оболочка практически не отекла.

Пример 2.

Профилактическое действие соединения Т1082 в дозе 220 мг/кг в отношении лучевого цистита, вызванного однократным либо фракционированным β-облучением у крыс при внутрижелудочном превентивном введении.

Исследования проводились на самцах крыс Wistar. Однократное локальное облучение малого таза проводилось на медицинском мобильном линейном ускорителе электронов NOVAC 11 в дозе 25 Гр, энергия электронов 10 МэВ. Фракционированное локальное облучение малого таза проводилось в течении 5 фракций по 6 Гр каждая, суммарная очаговая доза 30 Гр. В зависимости от веса животные были распределены на следующие группы:

1 группа – однократное локальное воздействие β-облучения в дозе 25 Гр, n=2;

2 группа – Т1082 220 мг/кг на основе воды для инъекций за 25-40 минут перед облучением в/ж + однократное локальное воздействие β-облучения в дозе 25 Гр, n=2;

3 группа – локальное фракционированное воздействие β-облучения в течение 5 фракций в суммарной дозе 30 Гр, n=3;

4 группа – Т1082 220 мг/кг на основе воды для инъекций за 25-40 минут перед облучением в/ж + локальное фракционированное воздействие β-облучения в течение 5 фракций в суммарной дозе 30 Гр, n=3.

Гистологическое исследование мочевых пузырей крыс на 41 сутки после локального однократного воздействия β-облучения в дозе 25 Гр показало, что, несмотря на то, что стенка органов не была растянута, а имела складчатый характер, эпителиальная выстилка слизистой оболочки чаще всего состояла из 2 слоев клеток, а в отдельных участках в ней определялся только слой базальных клеток, которые располагались хаотично. Их ядра гиперхромны и цитоплазма вакуолизирована. Митотически делящиеся клетки не были выявлены. Отмечалась десквамация поверхностного слоя (замыкающих клеток) в эпителиальной выстилке, полнокровие венозных сосудов в подслизистой оболочке и наличие круглоклеточного инфильтрата в периваскулярных пространствах. Ядра эндотелия сосудов гиперхромны, эндотелиальные клетки расположены редко. Миоцитарные комплексы немногочисленны, разделены широкими прослойками соединительной ткани с небольшим количеством клеточных элементов фибробластического ряда (Фиг.7). Мезотелий серозной оболочки представлен уплощенными, редко расположенными клетками с гиперхромными ядрами. Подлежащая соединительная ткань уплотнена, содержала крупные оксифильные коллагеновые волокна.

Гистологическое исследование мочевых пузырей крыс на 41 сутки после локального однократного воздействия β-облучения в дозе 25 Гр + Т1082 в дозе 220 мг/кг в/ж показало, что стенки органов были небольшой толщины, слизистая оболочка складчатая, тонкая, (несмотря на то, что стенка мочевого пузыря не растянута) содержала 2-3 слоя эпителиальных клеток. При этом, клетки базального слоя не всегда просматривались отчетливо. Замыкающие клетки визуализировались, хотя они сохранены не на всем протяжении слизистой, имели значительно меньший объем цитоплазмы и мелкие ядра. Местами был сохранен незначительный отек подслизистой основы, полнокровие сосудов в этих оболочках носит умеренный характер. Визуально количество миоцитарных комплексов было уменьшенным. Пространства между ними, как и у облученных животных, не получавших лечения, заполнены прослойками соединительной ткани. хотя в несколько меньшем объеме (Фиг.8). Расположение миофибриллярного аппарата в гладкомышечных миоцитах в отдельных миоцитарных комплексах носило несколько более упорядоченный характер.

Пример 3.

Профилактическое действие соединения Т1082 в дозе 220 мг/кг внутрижелудочно в отношении функционального состояния мочевого пузыря мышей, при фракционированном β-облучении.

Исследование проведено на 50 самках мышей линии C57Bl/6j (возраст – 4-5 недель, масса – 19-23 г), МП которых отличается высокой радиочувствительностью (Zwaans B.M.M., Wegner K.A., Bartolone S.N., et al. Radiation cystitis modeling: A comparative study of bladder fibrosis radiosensitivity in C57BL/6, C3H, and BALB/c mice. Physiol Reports. 2020; 8(4): e14377). Мыши были распределены в 3 экспериментальные группы: контрольную (10 особей) и две опытные (по 20 особей). Мыши контрольной группы далее не получали каких-либо воздействий и в исследовании служили здоровым контролем. Мышам обеих опытных групп в течение первых 5-ти суток эксперимента ежедневно, через каждые 24 часа, проводили локальное воздействие на область МП β-излучением с энергией 4 МэВ в дозе 6 Гр. При этом, мышам первой опытной группы за 30 минут до каждой фракции облучения с помощью стального изогнутого желудочного зонда 20 G × 38 мм с оливой 2,25 мм (ГК Виварий, Россия) внутрижелудочно (в/ж) вводили в качестве плацебо 0,9% асептический раствор хлорида натрия (Дальхимфарм, Россия) в объеме 10,0 мл/кг. А мышам второй опытной группы за 30 минут до каждой фракции облучения таким же способом вводили 2,2% раствор 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины фосфата (соединение Т1082) в объеме 10,0 мл/кг, что обеспечивало дозу 220 мг/кг, составляющую 1/10 ЛД₁₀ для таких животных при таком способе введения (Filimonova M., Saburova A., Shevchenko L., et al. 1-isobutanoil-2-isopropylisothiourea phosphate, T1082: a safe and effective prevention of radiotherapy complications in oncology. Int. J. Mol. Sci. 2022; 23(5): 2697). Растворы Т1082 для введения изготавливали на основе воды для инъекций (Дальхимфарм, Россия).

Облучение МП мышей проводили на медицинском ускорителе электронов Novac-11 (Sordina IORT Technologies, Италия). Для этого каждое животное фиксировали на текстолитовой пластине в горизонтальном вентрально-дорсальном положении. Исходный пучок электронов с энергией 4 МэВ корректировали свинцовым коллиматором до диаметра 8 мм, и выставляли его ось на проекцию МП мыши с помощью светового указателя. По данным дозиметрии при такой энергии электронов и геометрии облучения более 80% энергии излучения поглощалось в области МП мышей (на первых 5 мм пробега в тканях), а лучевая нагрузка на подлежащий толстый кишечник была низкой.

Динамику развития индуцированного лучевого цистита у мышей опытных групп и фармакологические эффекты соединения Т1082 изучали в течение 12 недель после окончания облучения, используя физиологические, морфологические и гистологические методы. Физиологические исследования включали еженедельный контроль массы тела мышей и урометрическую оценку функций МП. Для этого в звукоизолированном помещении, при отсутствии освещения, мышей помещали на 4 часа в индивидуальные контейнеры с сетчатым дном, под которым была размещена pH-чувствительная бумага. Выделение животным мочи вызывало образование на индикаторной бумаге цветового пятна, площадь которого определяется объемом мочевыделения. По прошествии 4 часов, листы индикаторной бумаги сканировали, и с помощью программных средств измеряли число пятен (число мочевыделений), их площадь, и по калибровочным кривым оценивали объем каждого мочевыделения и общий объем выделенной мочи.

Морфологические и гистологические исследования проводили в конце 4-й и 12-й недели наблюдения. Для этого выводили из опыта с помощью CO₂-эвтанайзера AWTech (АВТех, Россия) по 5 мышей контрольной группы и по 10 мышей опытных групп, и извлекали МП. Далее по два МП здоровых мышей и по три МП мышей опытных групп использовали для макроскопических морфологических исследований, а остальные МП здоровых и облученных мышей использовали для гистологических исследований.

При макроскопических исследованиях из органов шприцом удаляли остаточную мочу и растягивали их путем внутрипузырного введения 0,1 мл 10% раствора формалина. После чего при увеличении ×10-20 изучали макроскопическое состояние органов с фотофиксацией на цифровую камеру Canon Power Shot A640 (Canon, Япония). Органы для гистологических исследований фиксировали 24 часа в нейтральном забуференном формалине, и после стандартной проводки заключали в парафиновую среду Гистомикс Экстра (БиоВитрум, Россия). Срезы толщиной 5 мкм, полученные на микротоме Leica RM2235 (Leica Biosystems Nussloch GmbH, Германия) после депарафинирования окрашивали гематоксилином и эозином, и по Ван Гизону (БиоВитрум, Россия). Гистологические срезы изучали под микроскопом AXIO Imager A1 (Carl Zeiss AG, Германия) с микрофотосъемкой на цифровую камеру.

Результаты клинических наблюдений состояния облученных мышей и динамика их веса свидетельствовали, что использованный способ локального облучения позволил избежать развития системных лучевых нарушений: отсутствовала характерная для лучевой болезни потеря веса, и в течение 3 последующих месяцев отсутствовали случаи гибели животных. В то же время, несмотря на внешнее благополучие мышей, примененное локальное воздействие на МП β-излучением в дозе 30 Гр привело к развитию выраженного лучевого цистита.

Развитие лучевого цистита и его проявления у облученных мышей, не получавших Т1082, в данном исследовании протекали в описанной динамике. По данным урометрии, острый цистит и нарушения функций МП у этих мышей развивались уже через 1 неделю после облучения (Фиг.9 а, б, в), и проявлялись гиперактивностью органа: отмечалось достоверное повышение частоты мочеиспусканий с пониженными объемами мочи. К 3-й неделе проявления этих нарушений регрессировали (фаза мнимого благополучия), но вновь начинали нарастать в сроки, характерные для начала развития позднего лучевого цистита и фиброза МП – на 7-8 неделе после облучения.

Развитие выраженного острого и позднего лучевого цистита у облученных мышей, не получавших Т1082, подтверждали данные морфологических и гистологических исследований. При макроскопическом осмотре наполненных МП этих животных через 4 недели после облучения визуализировалась неравномерность толщины стенки органа, наличие бессосудистых областей и множественных точечных кровоизлияний (Фиг. 10 б). И гистологическая картина этих органов на этом сроке соответствовала острому лучевому циститу. У всех животных этой группы наблюдалось значительное истончение уротелия с обширными участками его полной десквамации без признаков регенерации (Фиг.11 б). В собственной пластинке слизистой оболочки визуализировалось существенное снижение сосудов микроциркуляции и прослеживались признаки острого воспаления: значительный отек с выраженной диффузной лимфоцитарно-плазмоцитарной инфильтрацией. Мышечная оболочка отечна, миофибриллярный аппарат гладкомышечных клеток дезорганизован.

При макроскопическом осмотре наполненных МП облученных мышей, не получавших Т1082, через 12 недель после облучения наблюдалось выраженное утолщение стенок, значительная деформация и слабая васкуляризация органов (Фиг. 10 д). И гистологическая картина соответствовала хроническому лучевому циститу с активным субслизисто-стромальным фиброзом. В слизистой оболочке МП животных этой группы наблюдалась уротелиальная атрофия: истонченный, местами слущенный уротелий с дефицитом базальных и зонтичных клеток, и признаками железистой метаплазии (Фиг. 11 д). Собственная пластинка слизистой утолщена, с зонами гиповаскуляризации, умеренной лимфоцитарно-плазмоцитарной воспалительной инфильтрацией и высоким содержанием клеток фибробластического ряда. В подслизистой оболочке, строме мышечной оболочки и стенках единичных кровеносных сосудов визуализируются (особенно, при окраске по Ван Гизону) разрастания волокнистого компонента – преимущественно, компактизация коллагеновых волокон (субслизисто-мышечный фиброз) (Фиг. 11 з).

В данном исследовании соединение Т1082 при внутрижелудочном введении животным в безопасной дозе 220 мг/кг (1/10 ЛД₁₀) перед фракциями облучения выраженно ограничивало клинические и патоморфологические последствия лучевого воздействия на МП мышей. При урометрических исследованиях у Т1082-защищённых мышей не наблюдалось изменений мочевыделительных функций, характерных для острого и позднего лучевого цистита (Фиг.9 а, б, в). У этих мышей в течение всего периода наблюдения все функциональные показатели соответствовали уровням здоровых, необлученных животных.

Через 4 недели после облучения МП Т1082-защищённых мышей при макроскопическом исследовании были без особенностей и практически не отличались от здоровых органов (Фиг. 10 а, в). При гистологическом исследовании МП Т1082-защищённых мышей на этом сроке патологические последствия лучевой альтерации проявлялись существенно слабее, чем у облученного контроля. У всех животных в слизистой оболочке наблюдалась полная сохранность уротелия с ограниченными участками регенераторной гиперплазии (Фиг. 11 в). В подслизистой оболочке визуализировались неизмененные сосуды, а диффузная лимфоцитарно-плазмоцитарная воспалительная инфильтрация отмечалась в ограниченных локусах и имела слабый характер. Мышечная оболочка оставалась без изменений.

Через 12 недель после облучения у МП Т1082-защищённых мышей также не выявлялось каких-либо макроскопических изменений (Фиг. 10 г, е). И по данным гистологических исследований у этих животных эпителиальный слой слизистой оболочки МП был полностью сохранным, местами с признаками регенераторной гиперплазии (Фиг. 11 е, и). При этом проявления субслизисто-мышечного фиброза стромального компонента носили слабый, очаговый характер, представленный единичными пучками коллагеновых и эластических волокон.

Заключение.

Результаты сравнительных урометрических, морфологических и гистологических исследований свидетельствуют, что гипофракционированное локальное воздействие на мочевой пузырь мышей β-излучения с энергией 4 МэВ в суммарной дозе 30 Гр (5 фракций по 6 Гр через 24 часа) сопровождалось развитием у животных выраженного острого (на сроке 4 недели, Фиг.11 а, б, в) и хронического лучевого цистита и фиброза мочевого пузыря (на сроке 12 недель, Фиг.11 г, д, е, ж, з, и).

При этом действие соединения Т1082 при в/ж введении мышам в дозе 220 мг/кг за 30 минут перед каждой фракцией облучения эффективно противодействовало лучевому повреждению тканей мочевого пузыря и развитию лучевого цистита, что проявлялось выраженным уменьшением степени и диапазона функциональных нарушений и ключевых патоморфологических изменений, характерных для раннего (острого) и позднего (хронического) лучевого цистита и фиброза мочевого пузыря.

Доказательство достижения технического результата.

Представленные ранее данные свидетельствуют, что предложенный в настоящем изобретении способ (превентивное в/ж введение Т1082 в дозах 150-225 мг/кг) обеспечивает в исследованиях на животных выраженное профилактическое действие в отношении системных лучевых синдромов и локальных лучевых повреждений. Т1082 эффективно (ФИД – 1,7-1,9) защищает костный мозг и кишечный эпителий, противодействуя развитию острой лучевой болезни (Filimonova M., Saburova A., Shevchenko L., et al. 1-isobutanoil-2-isopropylisothiourea phosphate, T1082: a safe and effective prevention of radiotherapy complications in oncology. Int. J. Mol. Sci. 2022; 23(5): 2697).

В исследовании, результаты которого отражены в примерах 1-3, Т1082 (в предложенном способе) обеспечивает эффективную профилактику раннего (острого) и позднего (хронического) лучевого цистита и фиброза мочевого пузыря у мышей и крыс при однократном и фракционированном облучении. При этом выраженность наблюдаемых клинико-морфологических эффектов Т1082 в отношении лучевого цистита имеют такой же уровень и характер, как и у эффектов амифостина при радиотерапии рака прямой кишки и рака простаты (Liu T., Liu Y., He S., et al. Use of radiation with or without WR-2721 in advanced rectal cancer. Cancer. 1992; 69(11): 2820-5; Dziuk T., Senzer N. Feasibility of amifostine administration in conjunction with high-dose rate brachytherapy. Semin. Oncol. 2003; 30(6 Suppl 18): 49-57) и на моделях геморрагического цистита, индуцированных ифосфамидом и акролеином (Batista C.K., Mota J.M., Souza M.L., et al. Amifostine and glutathione prevent ifosfamide- and acrolein-induced hemorrhagic cystitis. Cancer Chemother. Pharmacol. 2007; 59(1): 71-7).

Предложенный в данном изобретении способ фармакологической профилактики лучевых циститов не имеет рисков негативных, токсических эффектов, характерных для известных способов.

Первое позитивное отличие предложенного способа – неинвазивное, пероральное (внутрижелудочное) введение действующего вещества. Такой атравматичный путь введения более приемлем и имеет очевидные преимущества, особенно, в случае кратного или многократного применения при фракционированной лучевой терапии (число сеансов облучения может достигать 60-70).

Вторым, наиболее важным позитивным отличием предложенного способа является применение безопасных, нетоксичных доз действующего вещества. Согласно данным токсикометрии, соединение Т1082 по ГОСТ 12.1.007-76 относится к третьему классу токсичности и опасности (вещества умеренно опасные) и к четвертому классу токсичности (малотоксично) по классификации Hodge и Sterner: при однократном в/ж введении параметры острой токсичности Т1082 для мышей ЛД₁₀, ЛД₁₆ и ЛД₅₀ составляют 2290, 2364 и 2638 мг/кг (Filimonova M., Saburova A., Shevchenko L., et al. 1-isobutanoil-2-isopropylisothiourea phosphate, T1082: a safe and effective prevention of radiotherapy complications in oncology. Int. J. Mol. Sci. 2022; 23(5): 2697). Дозы соединения Т1082, используемые в предложенном способе для мышей и крыс 150-225 мг/кг, являются оптимальными радиозащитными дозами для этих животных, обеспечивающими максимально выраженный защитный эффект (уровня ED_84-98).

Соединение Т1082 при однократном и многократном в/ж введении в дозах 150-225 мг/кг легко переносится, не вызывает интоксикации и каких-либо изменений в общем состоянии, двигательной и поведенческой активности животных, и не оказывает местного раздражающего и повреждающего действия на органы ЖКТ.

Следует отметить, что предложенный способ является также приемлемым для фармацевтической реализации. В случае применения этого способа профилактики для человека рекомендуемые дозы соединения Т1082 для перорального приема составляют 11-18 мг/кг (экстраполяция доз с учетом площади поверхности тела (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2012. 944 с)). И в этом случае все манипуляции сводятся к пероральному приему пациентом 2-3 твердых лекарственных форм (капсулы, таблетки), содержащих 400-500 мг действующего вещества.

Совокупность изложенных данных свидетельствует, что предложенный способ профилактики лучевых циститов является эффективной и существенно более безопасной альтернативой известным способам, и способен значительно расширить возможности профилактики осложнений радиотерапии опухолей малого таза.

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к способу фармакологической профилактики радиационно-индуцированного цистита и фиброза мочевого пузыря. Способ фармакологической профилактики радиационно-индуцированного цистита и фиброза мочевого пузыря, включающий превентивное введение 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины фосфата за 30 минут до облучения в дозах для мышей и крыс внутрижелудочно 150-225 мг/кг. Изобретение позволяет обеспечить клинически и морфологически выраженную профилактику раннего и позднего лучевого цистита и фиброза мочевого пузыря безопасным способом с низкими рисками негативных эффектов. 1 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 пр.

1. Способ фармакологической профилактики радиационно-индуцированного цистита и фиброза мочевого пузыря, включающий превентивное введение 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины фосфата за 30 минут до облучения в дозах для мышей и крыс внутрижелудочно - 150-225 мг/кг.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что доза действующего вещества - 1/15-1/10 ЛД₁₀.