СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ЛУЧЕВОГО ОРАЛЬНОГО МУКОЗИТА У МЫШЕЙ Российский патент 2025 года по МПК G09B23/28 A61K31/155 A61P1/02 A61P39/00 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к средствам профилактики лучевого мукозита, и может быть использовано для фармакологической защиты здоровых тканей при радиотерапии опухолей, локализованных в области головы-шеи.

В 2022 г. в Российской Федерации выявлено 625 тысяч новых случаев злокачественных новообразований (ЗНО), из которых приблизительно 35 тысяч приходится на ЗНО в области головы-шеи (Каприн А.Д., Старинский В.В., Шахзадова А.О. Состояние онкологической помощи населению России в 2022 году. М.: МНИОИ им. ПА Герцена-филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2023). Лучевая терапия (ЛТ), как изолированно, так и в сочетании с химиотерапией, является одним из основных методов терапии ЗНО данной нозологии. Несмотря на эффективность данного метода, проведение изолированной ЛТ опухолей головы-шеи приводит к развитию острого лучевого орального мукозита различной степени тяжести в 100% случаев, 3-4 степеней по шкале ВОЗ в 85% случаев (Тюляндин С.А., Носов Д.А., Переводчикова Н.И. Минимальные клинические рекомендации Европейского общества медицинской онкологии (ESMO). Медицинский алфавит. 2014. 3(18): 59-65). Развитие данной патологии вынуждает менять режим лучевого воздействия либо прекращать его или назначать дополнительно лечение, что существенно ухудшает эффективность ЛТ. Существующие современные подходы и методы профилактики орального мукозита не отличаются высокой эффективностью, что говорит о необходимости разработки нового средства профилактики данной патологии.

В литературе известны следующие способы профилактики лучевого орального мукозита.

Известен способ профилактики лучевого орального мукозита у мышей линии C57BL/6J, основанный на превентивном внутрибрюшинном введении диметилсульфоксида (ДМСО) в дозе 6 г/кг. (Yang C. et al. "Dimethyl sulfoxide prevents radiation-induced oral mucositis through facilitating DNA double-strand break repair in epithelial stem cells." International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics. 2018. 102(5): 1577-1589). Введение ДМСО в указанной дозе за час до однократного лучевого воздействия рентгеновским излучением в дозе 16,5 Гр на область головы и шеи повышало выживаемость животных при развитии патологии - выживаемость животных в опытной группе составила 100%, в то время как в контрольной группе все животные погибли до 15 суток. Введение ДМСО снижало выраженность повреждения структуры эпидермиса языка, распространённость некротических процессов на слизистой, предотвращало потерю компартмента эпителиальных стволовых клеток и клеток-предшественников.

Однако, недостатком данного способа является высокая доза ДМСО. Применяемая доза ДМСО составляет приблизительно 4/10 ЛД₅₀, что может привести к развитию побочных токсических эффектов (при внутрибрюшинном введении ЛД₅₀ для мышей составляет 14.7 - 17.0 г/кг) (Smith E.R., Zareh H., Mason M.M. The single-and repeated-dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 1967. 141(1): 96-109). Кроме того, внутрибрюшинное применение ДМСО у человека неприемлемо.

Известен способ профилактики лучевого орального мукозита гидрогелевыми препаратами «Колетекс-гель-ДНК» и «Колетексгель-ДНК-Л» у больных раком орофарингеальной зоны (Ткачев С.И., и др. Профилактика и лечение лучевого мукозита полости рта гидрогелевыми препаратами у больных раком орофарингеальной зоны. Вопросы онкологии. 2016. 62(3): 531-535). Ежедневное 3-х разовое нанесение 5 мл препарата «Колетекс-гель-ДНК», начиная с первого сеанса облучения, и «Колетекс-гель-ДНК-Л», начиная со дня проявления первых болевых симптомов, на слизистую полости рта значимо снижает степень тяжести лучевого орального мукозита у пациентов и частоту прерывания курса противоопухолевой терапии, а также нормализует состояние слизистой оболочки полости рта в первые 6 недель после окончания курса лучевой терапии, сокращая длительность пребывания пациента в стационаре.

Недостатком данного способа является необходимость пациентов каждый сеанс облучения, начиная с первого, и на протяжении минимум 3-х недель после окончания курса лучевой терапии трижды в день наносить гидрогелевые препараты «Колетекс-гель-ДНК» и «Колетексгель-ДНК-Л», что может доставлять излишнее неудобство.

Известен способ лечения и предотвращения орального мукозита (RU 2600446 C2), где гелевую композицию, содержащую мелатонин или его соли в концентрации от 2,5% до 5% масс./об. (масса/объем), местно наносят на слизистую оболочку крыс до облучения, сразу после и далее каждые 8 часов в течение 21 дня. При многократном рентгеновском облучении крыс в суммарной очаговой дозе 50 Гр (5×10 Гр) гель плюроника F-127 с 3% или 5% мелатонина, наносимый три раза в сутки на слизистую ротовой полости в объеме 500 мкл за раз снижал окислительный стресс, уровень восстановленного глутатиона GSH, предотвращал повышение активности глутатионпероксидазы, снижал выраженность повреждения слизистой.

Недостатком данного метода является неудобная для пациента схема применения гелевой композиции с мелатонином, которая включает в себя многократное, через каждые 8 часов, нанесение на слизистую в течение 21 суток, а также высокая разовая доза мелатонина - 45 мг при каждом применении.

Известен способ профилактики лучевого орального мукозита модулятором Nrf2 RRx-001 при внутривенном введении дважды в неделю в дозе 4 мг за две недели до начала курса противоопухолевой терапии. RRx-001 при внутривенном введении начиная со второй недели до начала курса противоопухолевой лучевой терапии сокращал продолжительность течения орального мукозита, увеличивал время до проявления первых симптомов и снижал степень тяжести патологии у пациентов, получавших химиолучевую терапию с суммарной очаговой дозой лучевого воздействия 60-72 Гр [Sher D. J. et al. Results of a randomized, open label, multicenter trial assessing the safety, dose and schedule of RRx-001 (R001) in reducing severe oral mucositis (SOM) in patients receiving chemoradiation (CRT) for oral cavity/oropharynx squamous cell carcinoma (OSCC) // International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. - 2020. - Т. 108. - №. 3. - С. 107-108.].

Недостатком данного способа является до конца невыясненный механизм действия RRx-001, потенциально вызывающий выделение активных форм кислорода, в том числе супероксида, что может приводить к усилению негативных проявлений лучевого мукозита.

Прототипом настоящего изобретения является средство амифостин (https://www.rlsnet.ru/active-substance/amifostin-2048). Амифостин (органический тиофосфат) является антиоксидантом и цитопротектором. При внутривенном или подкожном введении после дефосфорилирования щелочной фосфатазой в эндотелиоцитах превращается в свою активную форму - тиол. Поглощается преимущественно нормальными, хорошо васкуляризированными тканями, тем самым являясь селективным цитопротектором. В ряде случаев назначается перед ЛТ ЗНО в области головы-шеи для профилактики развития ксеротомии за 15-30 минут до сеанса лучевой терапии внутривенно в дозе 200 мг/м².

Однако, применение амифостина при внутривенном введении вызывает развитие таких побочных эффектов, как резкая гипотензия, тошнота или рвота, дисгевзия, а также кратковременная потеря сознания. При подкожном введении выраженность этих эффектов снижается, но, в то же время, снижаются его радиопротекторные свойства (Maria O.M., Eliopoulos N., Muanza T. Radiation-induced oral mucositis. Frontiers in oncology. 2017. 7: 89.). Развитие побочных эффектов значительно сокращает возможность применения амифостина в качестве средства профилактики осложнений ЛТ. Из-за противоречивых данных, полученных в 30 исследованиях амифостина с целью профилактики лучевого орального мукозита в различных условиях, группа Многонациональной ассоциации поддерживающей терапии при раке и Международного общества онкологии полости рта (MASCC/ISOO) не дала никаких рекомендаций по его использованию в клинической практике (Lalla R.V., Sonis S.T., Peterson D.E. Management of oral mucositis in patients who have cancer. Dental Clinics of North America. 2008. 52(1): 61-77).

Таким образом, недостатками амифостина являются развитие побочных эффектов при его применении в эффективных дозах, а также противоречивость известных экспериментальных данных о применении амифостина в качестве средства профилактики лучевого орального мукозита.

Задачей изобретения является снижение степени повреждения структуры эпидермиса при β-облучения головы-шеи у мышей.

Техническим результатом заявленного изобретения является то, что за 30 минут до облучения животному превентивно внутрижелудочно вводят разведенное в воде фосфат 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины (соединение Т1082) в дозах 1/15 - 1/10 ЛД₁₀.

Изобретение поясняется подробным описанием, примерами, таблицами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 - гистологическое строение слизистой оболочки языка мыши после однократного β-облучения головы-шеи в дозе 16 Гр.

Фиг. 2 - нарушение структуры эпидермиса языка мыши после однократного β-облучения головы-шеи в дозе 16 Гр.

Фиг. 3 - гистологическое строение слизистой оболочки языка мыши после однократного β-облучения головы-шеи в дозе 16 Гр при превентивном внутрижелудочном (в/ж) введении соединения Т1082 в дозе 150 мг/кг (1/15 ЛД₁₀).

Фиг. 4 - гистологическое строение слизистой оболочки языка мыши после однократного β-облучения головы-шеи в дозе 16 Гр при превентивном в/ж введением соединения Т1082 в дозе 225 мг/кг (1/10 ЛД₁₀).

Способ осуществляют следующим образом.

Мышь в возрасте 2-2,5 месяца с массой тела 20-26 г. подвергают однократному локальному лучевому воздействию β-излучения на область головы-шеи на ускорителе электронов «Novac-11» в дозе 18 Гр, энергия электронов 10 МэВ, диаметр тубуса 4 см, сверху 0,4 см оргстекла. Животному за 30 минут до облучения вводят внутрижелудочно соединение Т1082 в дозе 150-225 мг/кг, что составляет 1/15 ЛД₁₀ - 1/10 ЛД₁₀. Перед введением раствор соединения Т1082 изготавливают на основе воды для инъекций (Дальхимфарм, РФ).

Способ поясняется примерами выполнения.

Пример 1 - Защитный эффект соединения Т1082 на примере теста 30-ти суточной выживаемости при развитии острого лучевого орального мукозита у мышей.

Мыши-самцы F1 (CBAxC57Bl/6j) в возрасте 2-2,5 месяца с массой тела 20-26 г были разделены на две группы: контрольная и опытная группы. Все животные подвергались однократному локальному лучевому воздействию β-излучения на область головы-шеи на ускорителе электронов «Novac-11» в дозе 18 Гр, энергия электронов 10 МэВ, диаметр тубуса 4 см, сверху 0,4 см оргстекла. Животные опытной группы за 30 минут до облучения получали внутрижелудочно (в/ж) соединение Т1082 в дозе 200 мг/кг, что составляет 1/11 ЛД₁₀ для данного метода введения. Раствор соединения Т1082 изготавливали перед введением на основе воды для инъекций (Дальхимфарм, РФ).

Соединение T1082 статистически значимо снижало гибель животных при развитии острого лучевого орального мукозита. В группе животных, получавших соединение, выживаемость к 30 суткам составила 87%, в контрольной группе - 20% (Табл. 1).

Таблица 1.

Влияние соединения Т1082 при превентивном однократном введении в дозе 200 мг/кг в/ж на показатели 30-суточной выживаемости мышей F1 (CBA×C57BL6j) при развитии острого лучевого орального мукозита, вызванного локальным воздействием β-излучения в дозе 18 Гр на область головы-шеи

Доза Т1082 Доля выживших мышей на 30-е сутки, % 0 (контроль облучения) 20% (3/15) 200 мг/кг 87% (13/15) * Примечание: * - статистически достоверное различие (p < 0,05) по критерию Кокса

Высокие показатели выживаемости животных опытной группы в сравнении с контрольной группой свидетельствуют о меньшем поражении здоровых тканей, что проявляется в более мягком течении острого лучевого орального мукозита у животных, получавших до облучения соединение Т1082.

Пример 2 - Влияние соединения Т1082 на степень тяжести орального мукозита.

Мыши-самцы F1 (CBAxC57Bl/6j) в возрасте 2-2,5 месяца с массой тела 18-25 г были разделены на три группы: биологический контроль, контроль облучения и опытная группа. Животные в опытной группе и контроль облучения подвергались однократному локальному лучевому воздействию β-излучения на область головы-шеи на ускорителе электронов «Novac-11» в дозе 18 Гр, энергия электронов 10 МэВ, диаметр тубуса 4 см, сверху 0,4 см оргстекла. Животные опытной группы за 30 минут до облучения получали в/ж соединение Т1082 в дозе 200 мг/кг (1/11 ЛД₁₀.) Раствор Т1082 изготавливали перед введением на основе воды для инъекций (Дальхимфарм, РФ).

На 7, 9 и 11 сутки после лучевого воздействия проводилась оценка тяжести лучевого орального мукозита согласно шкале оценки острых осложнений лучевой терапии Онкологической группы лучевой терапии и Европейской организации по исследованию и лечению рака (RTOG/EORTC).

На 7 сутки после облучения наблюдалась выраженная тенденция к снижению степени тяжести орального мукозита у животных опытной группы в сравнении с контролем облучения. На 9 сутки степень тяжести патологии у животных опытной группы была статистически значимо ниже, чем у животных группы контроль облучения, что сохранялось и на 11 сутки (Табл. 2).

Таблица 2.

Влияние соединения Т1082 при превентивном однократном введении в дозе 200 мг/кг (1/11 ЛД₁₀) в/ж на степень тяжести лучевого орального мукозита у мышей F1 (CBA×C57BL6j) вызванного локальным воздействием β-излучения в дозе 18 Гр на область головы-шеи

Срок наблюдения, сутки Группа Степень мукозита (M±SD) 7 Контроль облучения 2,0 ± 0,5
n = 10 T1082 200 мг/кг 1,6 ± 0,5
n = 10 9 Контроль облучения 3,4 ± 0,5
n = 10 T1082 200 мг/кг 2,6 ± 0,5*
n = 10 11 Контроль облучения 2,7 ± 0,9
n = 10 T1082 200 мг/кг 1,5 ± 1,0*
n = 10 Примечание: * - статистически достоверное различие (p < 0,05) по U-критерию

Пример 3 - Влияние соединения Т1082 на распространенность повреждения слизистой языка.

Мыши-самцы F1 (CBAxC57Bl/6j) в возрасте 2-2,5 месяца с массой тела 18-25 г были разделены на три группы: биологический контроль, контроль облучения и опытная группа. Животные в опытной группе и контроль облучения подвергались однократному локальному лучевому воздействию β-излучения на область головы-шеи на ускорителе электронов «Novac-11» в дозе 18 Гр, энергия электронов 10 МэВ, диаметр тубуса 4 см, сверху 0,4 см оргстекла. Животные опытной группы за 30 минут до облучения получали соединение Т1082 в дозе 200 мг/кг (1/11 ЛД₁₀) в/ж. Раствор Т1082 изготавливали перед введением на основе воды для инъекций (Дальхимфарм, РФ).

На 7, 9 и 11 сутки после облучения выделяли ткани языка, выделенные ткани окрашивали 1% раствором витального красителя толуидиновый синий на основе 10% уксусной кислоты. Далее ткани языка отмывали от красителя в 1% растворе уксусной кислоты, промакивали ватным тампоном, смоченным в 1% растворе уксусной кислоты, до прекращения окрашивания тампона. Темноокрашенные участки языка принимались за поврежденные участки слизистой. Площадь повреждения слизистой языка рассчитывалась относительно общей площади языка в программе IpSquare v5.0 (LProSoft).

Начиная с 7 суток после облучения, площадь повреждения слизистой языка животных опытной группы была статистически значимо ниже, что сохранялось как на 9, так и на 11 сутки после лучевого воздействия (Табл. 3)

Таблица 3.

Влияние соединения Т1082 при превентивном однократном введении в дозе 200 мг/кг (1/11 ЛД₁₀.) в/ж на распространенность повреждения слизистой языку мышей F1 (CBA×C57BL6j) после локального воздействия на область головы-шеи β-излучения в дозе 18 Гр

Срок наблюдения, сутки Группа Относительная площадь, % (M±SD) 7 Контроль облучения 1,9 ± 1,6
n = 10 T1082 200 мг/кг 0,2 ± 0,1*
n = 10 9 Контроль облучения 43,7 ± 15,5
n = 10 T1082 200 мг/кг 18,0 ± 13,4*
n = 10 11 Контроль облучения 15,3 ± 19,5
n = 10 T1082 200 мг/кг 2,5 ± 7,2*
n = 10 Примечание: * - статистически достоверное различие (p < 0,05) по U-критерию

Пример 4 - Оценка защитного эффекта соединения Т1082 в дозах 150 мг/кг в/ж (1/15 ЛД₁₀) и 225 мг/кг в/ж (1/10 ЛД₁₀) на слизистую языка при микроскопическом исследовании при развитии острого лучевого орального мукозита у мышей.

Мыши-самцы F1 (CBAxC57Bl/6j) в возрасте 2-2,5 месяца с массой тела 21-25 г были разделены на четыре группы: биологический контроль, контроль облучения и две опытные группы - «Т1082 150 мг/кг» и «Т1082 225 мг/кг». В каждую группу входило по 5 особей. Животные в опытных группах и контроль облучения подвергались однократному локальному лучевому воздействию β-излучения на область головы-шеи на ускорителе электронов «Novac-11» в дозе 16 Гр, энергия электронов 10МэВ, диаметр тубуса 4 см, сверху 0,4 см оргстекла. Животные опытных групп за 30 минут до облучения получали соединение Т1082 в дозе 150 мг/кг в/ж (1/15 ЛД₁₀) и 225 мг/кг в/ж (1/10 ЛД₁₀) соответственно. Раствор Т1082 изготавливали перед введением на основе воды для инъекций (Дальхимфарм, РФ).

На 7 сутки после лучевого воздействия языки животных выделяли, фиксировали в течение 24 часов в кислой жидкости Буэна. После отмывания от фиксатора в 70% спирте языки разрезали вдоль по средней линии, подвергали стандартной гистологической обработке. Ориентированные фрагменты заключали в парафиновую среду «Гистомикс». Для морфологических исследований срезы толщиной 5 мкм, полученные на микротоме Leica RM2235, после депарафинирования окрашивали гематоксилином и эозином (БиоВитрум). Гистологические срезы изучали под микроскопом AXIO Imager A1 с микрофотосъемкой на цифровую камеру Canon Power Shot A640 при 4 уровнях увеличений объективов: ×5, ×10, ×20 и ×40. Сканированные изображения препаратов с оптическим разрешением не менее 4,000 dpi получали на цифровом сканере «Nikon Super Coolscan 8000 ED».

В группе контроль облучения соединительнотканная строма, мышечная ткань, нервные волокна языка были умеренно отечны. Отмечалась дезинтеграция и полиморфизм клеток базального слоя, частичная или полная деструкция нитевидных сосочков, дезорганизация грибовидных сосочков, на всей протяженности эпидермиса преобладали зернистые клетки (Фиг. 1). У корня языка визуализировались дефекты эпидермиса, его отслойка и образование загибов, утолщение и инфильтрация эпидермиса и соединительнотканной стромы круглоклеточными элементами (Фиг. 2).

При превентивном введении соединения Т1082 в дозе 150 мг/кг отмечалась схожая картина патологических процессов. Вместе с тем, между зонами скудного присутствия базальных клеточных элементов часто визуализировались зоны их гиперплазии с фигурами митоза, появлением шиповатых и увеличения количества зернистых клеток (Фиг. 3). У одного животного отмечалось почти полное восстановление стратификации эпидермиса.

При превентивном введении соединения Т1082 в дозе 225 мг/кг отмечалось менее выраженное повреждение слизистой, восстановление структуры эпидермиса определялось на верхушке спинальной и особенно вентральной поверхностях органа, сопровождающееся почти тотальной гиперплазией базального слоя (Фиг. 4).

Таким образом, результаты микроскопического исследования свидетельствуют о том, что превентивное введение соединения Т1082 уже в дозе 150 мг/кг (1/15 ЛД₁₀) снижало степень повреждения структуры эпидермиса, в связи с чем восстановительные процессы начинались раньше и были больше распространены, чем у животных контроль облучения, обеспечивая высокую восстановительную активность. При введении соединения Т1082 в дозе 225 мг/кг (1/10 ЛД₁₀) наблюдается наиболее выраженное профилактическое действие.

Способ позволяет исключить летальность лабораторных животных во время процедуры, получив при этом полноценную верифицируемую и воспроизводимую модель орального мукозита тяжёлой степени. Изобретение может быть полезно для исследователей в области экспериментальной онкологии и фармакологии, целью которых является разработка эффективных средств профилактики и лечения лучевых реакций здоровых тканей, в частности возникающих вследствие проведения лучевой терапии (ЛТ) злокачественных новообразований (ЗНО) в области головы-шеи.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано при профилактике лучевого орального мукозита у мышей. Способ включает превентивное введение животному внутрижелудочно соединения Т1082, разведенного в воде, в дозе 1/10-1/15 ЛД₁₀, за 30 мин до однократного локального лучевого воздействия β-излучения на область головы и шеи в дозе 18 Гр. Использование изобретения позволяет исключить летальность лабораторных животных во время процедуры, получив при этом полноценную верифицируемую и воспроизводимую модель орального мукозита тяжелой степени. 4 ил., 3 табл., 4 пр.

Способ профилактики лучевого орального мукозита у мышей, характеризующийся тем, что превентивно, за 30 мин до однократного локального лучевого воздействия β-излучения на область головы и шеи в дозе 18 Гр, животному внутрижелудочно вводят соединение Т1082, разведенное в воде, в дозе 1/10-1/15 ЛД₁₀.