МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО С ФУНКЦИЯМИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ И КОНТРОЛЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ АФЛАТОКСИНОМ И ЕГО ПРОДУЦИРОВАНИЯ АФЛАТОКСИГЕННЫМ ШТАММОМ И СПОСОБСТВОВАНИЯ УВЕЛИЧЕНИЮ УРОЖАЙНОСТИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Настоящая заявка является продолжением заявки согласно РСТ № PCT/CN2022/131943, поданной 15 ноября 2022 г., которая испрашивает преимущество приоритета по заявке на патент Китая №202111344662.7, поданной 15 ноября 2021 г. Все содержание каждой из вышеупомянутых заявок на патенты включено в данный документ посредством ссылки и является частью данного описания.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к области технической микробиологии, и в частности относится к микробиологическому средству с функциями предотвращения и контроля загрязнения афлатоксином и его продуцирования афлатоксигенным штаммом и способствования увеличению урожайности сельскохозяйственных культур, а также к его применению.

Описание известного уровня техники

[0002] Афлатоксины (AFT) являются наиболее токсичными микотоксинами, которые до сих пор загрязняют сельскохозяйственные продукты, характеризуются острой и хронической токсичностью и могут вызывать рак, характеризоваться тератогенностью и вызывать мутагенез. Афлатоксины образуются в основном в подходящих условиях после заражения растений-хозяев грибами рода Aspergillus, такими как Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus. К распространенным соединениям относятся афлатоксин B₁ (AFB₁), афлатоксин B₂ (AFB₂), афлатоксин G₁ (AFG₁) и афлатоксин G₂ (AFG₂). Афлатоксин B₁ является самым токсичным и самым канцерогенным. Его токсичность в 10 раз выше, чем у цианистого калия, и в 68 раз выше, чем у белого мышьяка, а его канцерогенность в 10000 раз выше, чем у гексахлорциклогексана, и при этом афлатоксин B₁ включен в перечень канцерогенов I класса Международного агентства по изучению рака (IARC) Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), и в стране и за рубежом случалось много смертей от отравления людей и животных, вызванных избытком афлатоксина. Афлатоксины также являются загрязняющими веществами, которые загрязняют большинство типов продуктов питания и сельскохозяйственных продуктов, и согласно статистике поисковых данных Web of Science за последние 5 лет афлатоксины загрязняют более 110 типов продуктов питания и сырьевых материалов, занимая первое место среди загрязняющих веществ, при этом сельскохозяйственные продукты, такие как сорта арахиса, наиболее подвержены загрязнению. Загрязнение афлатоксинами может происходить на протяжении всего процесса полевого производства, сбора урожая, хранения и транспортировки арахиса. Создание технологии предотвращения и контроля загрязнения арахиса афлатоксином в поле может обеспечить снижение заражения Aspergillus flavus и загрязнения афлатоксином из источника, что имеет большое значение для обеспечения качества и безопасности сельскохозяйственных продуктов, таких как арахис, в Китае и способствования экологическому и высококачественному развитию отрасли.

[0003] Биологический контроль с применением антагонистических микроорганизмов обладает такими преимуществами, как отсутствие снижения качества сельскохозяйственных продуктов, безопасность и высокая эффективность, а также экологическая приемлемость, и является эффективным способом экологического контроля Aspergillus flavus и загрязнения афлатоксином. Однако применение и способствование биологическому контролю на сельскохозяйственных угодьях ограничено вследствие экологической адаптивности штаммов, а также вследствие неподходящих препаратов или неспособности эффективно выполнять роль биологического контроля. В Китае было проведено большое количество исследований по скринингу штаммов для биологического контроля Aspergillus flavus. Штаммы бактерий, дрожжей и плесневых грибов с эффектами устойчивости к бактериям или деградации афлатоксинов были идентифицированы в лабораторных экспериментах или в полевых условиях, однако в настоящее время отсутствует продукт, который можно было бы широко продвигать и применять в производстве со значительными эффектами снижения количества бактерий и загрязнения токсинами. Для предотвращения и контроля загрязнения афлатоксином в таких странах, как Соединенные Штаты Америки и Аргентина, споры Aspergillus flavus, не продуцирующие токсины, инокулируют на семена ячменя и зерна риса для внесения в поле, при этом они конкурируют за подавление роста и размножения продуцирующего токсин Aspergillus flavus с достижением цели биологического контроля. Однако этот способ является затратным, затруднительным в эксплуатации и сложным для внедрения, поэтому существует острая необходимость в препарате для биологического контроля, который обладает высокой эффективностью, прост в хранении и внесении, не только может эффективно предотвращать и контролировать загрязнение афлатоксином, но также оказывает стимулирующий эффект на увеличение урожайности культур.

[0004] Целью настоящего изобретения является разработка и применение микробиологического средства с учетом недостатков предшествующего уровня техники, при этом путем антагонизации роста Aspergillus flavus, улучшения структур популяций микроорганизмов в ризосферах арахиса и оптимизации микроэкологической среды не только может быть снижена численность афлатоксигенного штамма, такого как штамм Aspergillus flavus, и вероятность заражения им в почве от источника и эффективно обеспечен контроль загрязнения арахиса афлатоксинами, но также может быть увеличено число корневых клубеньков, повышена устойчивость культур, и может быть улучшена степень наполненности бобов и урожайность. Микробиологическое средство по настоящему изобретению имеет большое значение для улучшения качества и уровня безопасности сельскохозяйственных продуктов, таких как сорта арахиса, обеспечения увеличения урожайности и эффективности культур, сокращения применения удобрений на сельскохозяйственных угодьях, улучшения экологической среды и т.п.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] Учитывая недостатки предшествующего уровня техники, техническая проблема, решаемая настоящим изобретением, заключается в обеспечении микробиологического средства с функциями предотвращения и контроля загрязнения афлатоксином и его продуцирования афлатоксигенным штаммом и способствовании увеличению урожайности сельскохозяйственных культур, а также в его применении. Микробиологическое средство применяется на стадии посева в поле культур, таких как сорта арахиса, что может эффективно снизить численность продуцирующего токсин штамма, такого как штамм Aspergillus flavus, и вероятность заражения им в почве из источника, снизить риск загрязнения сортов арахиса афлатоксинами после получения, улучшить качество и уровень безопасности сортов арахиса и, в то же время, способствовать росту сельскохозяйственной культуры, повысить устойчивость, улучшить степень наполненности бобов и урожайность, при этом микробиологическое средство обладает значительными экономическими, социальными и экологическими преимуществами.

[0006] Для решения вышеупомянутых технических проблем в настоящем изобретении представлены следующие технические решения.

[0007] Представлено микробиологическое средство с функциями предотвращения и контроля загрязнения афлатоксином и его продуцирования афлатоксигенным штаммом и обеспечения повышения урожайности культур, составленное из 5 микроорганизмов, включая Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus laterosporu, Bacillus mucilaginosus Krassilnikov, Enterobacter ludwigii и Myroides odoratimimus, путем раздельного ферментативного культивирования, концентрирования и смешивания.

[0008] При этом Bacillus amyloliquefaciens представляет собой штамм Bacillus amyloliquefaciens BA-HZ54 с номером доступа в CCTCC № M 20211295, который был депонирован 20 октября 2021 г. в Китайском центре коллекции типовых культур (сокращенно CCTCC) Уханьского университета, Ухань, Китай, и назван по классификации как Bacillus amyloliquefaciens BA-HZ54.

[0009] Brevibacillus laterosporu представляет собой штамм Brevibacillus laterosporu BL-TS08 с номером доступа в CCTCC № M 20211296, который был депонирован 20 октября 2021 г. в Китайском центре коллекции типовых культур (сокращенно CCTCC) Уханьского университета, Ухань, Китай, и назван по классификации как Brevibacillus laterosporu BL-TS08.

[0010] Bacillus mucilaginosus Krassilnikov представляет собой штамм Bacillus mucilaginosus Krassilnikov BM-TS05 с номером доступа в CCTCC № M 20211297, который был депонирован 20 октября 2021 г. в Китайском центре коллекции типовых культур (сокращенно CCTCC) Уханьского университета, Ухань, Китай, и назван по классификации как Bacillus mucilaginosus Krassilnikov BM-TS05.

[0011] При этом Enterobacter ludwigii представляет собой штамм Enterobacter ludwigii BG10-1 с номером доступа в CCTCC № M 2016014, который депонирован 7 января 2016 г. в Китайском центре коллекции типовых культур Уханьского университета (CN 201610155898.9).

[0012] Кроме того, Myroides odoratimimus представляет собой Myroides odoratimimus 3J2MO с номером доступа в CCTCC № M 2017329 (CN 201811409668.6), который был депонирован 13 июня 2017 г. в Китайском центре коллекции типовых культур Уханьского университета.

[0013] Предпочтительно в микробиологическом средстве число живых бактерий Bacillus amyloliquefaciens составляет 2 × 10⁹ КОЕ/г или больше, число живых бактерий Brevibacillus laterosporu составляет 2 × 10⁹ КОЕ/г или больше, число живых бактерий Bacillus mucilaginosus Krassilnikov составляет 1 × 10¹⁰ КОЕ/г или больше, число живых бактерий Enterobacter ludwigii составляет 1 × 10¹⁰ КОЕ/г или больше, и число живых бактерий Myroides odoratimimus составляет 2 × 10⁹ КОЕ/г или больше.

[0014] Вышеуказанные штаммы микроорганизмов выделяются из бобов арахиса и ризосферы в основных регионах производства арахиса в Китае и могут эффективно антагонизировать рост Aspergillus flavus и подавлять продуцирование афлатоксина посредством присущего антагонизма согласно тесту in vivo на антибактериальное действие и снижение уровня токсинов и контрольному тесту в полевых условиях.

[0015] Дополнительно микробиологическое средство в соответствии с настоящим изобретением представляет собой средство в виде гранулы, порошка или водного раствора, предпочтительно гранулы, содержащее живые бактерии в высокой концентрации.

[0016] Согласно вышеуказанному решению носитель в форме частиц микробиологического средства по настоящему изобретению содержит гуминовую кислоту, тапиоковую муку и бентонитовое связующее вещество. Сырьевые материалы присутствуют в носителе в форме частиц в соотношении приблизительно 8,5:10:0,5. Сырьевые материалы равномерно перемешивают, гранулируют и высушивают для последующего применения.

[0017] Согласно вышеуказанному решению микробиологическое средство по настоящему изобретению получают путем соединения концентрированных растворов бактериальных штаммов с носителем в форме частиц. В частности, концентрированные образцы бактерий, полученные центрифугированием ферментационных бульонов штаммов, растворяют в соответствующем количестве воды для равномерного распыления и адсорбции на носителе.

[0018] Представлено применение микробиологического средства в поле для предотвращения и контроля загрязнения афлатоксином и его продуцирования афлатоксигенным штаммом и способствования увеличению урожайности сельскохозяйственных культур.

[0019] Согласно вышеуказанному решению конкретный способ применения заключается в следующем: микробиологическое средство распыляют на почву или вносят в ризосферы сельскохозяйственных культур перед посевом или в период роста. Микробиологическое средство вносится отдельно или в смеси с основным удобрением, подлежащим искусственному внесению путем разбрасывания/внесению в лунки или механическому распределению по почве при внесении на стадии посева; и микробиологическое средство вносят отдельно или смешивают с почвой для распределения по корням сельскохозяйственных культур при внесении в период роста.

[0020] Согласно вышеуказанному решению сельскохозяйственная культура предусматривает арахис и т.п.

[0021] Согласно вышеуказанному решению время внесения предпочтительно приходится на стадию посева или цветения и стадию образования гинофоров, и норма внесения составляет 2-4 кг/му.

[0022] Полезные эффекты настоящего изобретения заключаются в следующем.

[0023] 1. Микробиологическое средство по настоящему изобретению может обеспечивать улучшение структуры популяций микроорганизмов в почве, оптимизирование микроэкологической среды, значительное подавление роста и размножения продуцирующего токсины штамма, такого как штамм Aspergillus flavus, в почве, снижение риска загрязнения афлатоксином сортов арахиса, улучшение качества и уровня безопасности продукта, а также имеет значительные социальные преимущества.

[0024] 2. Микробиологическое средство по настоящему изобретению может обеспечивать уменьшение количества болезней сельскохозяйственных культур, увеличение числа бобов на растение, увеличить наполненность зерна и урожайность и имеет значительные экономические преимущества.

[0025] 3. Микробиологическое средство по настоящему изобретению может способствовать увеличению числа корневых клубеньков у сельскохозяйственных культур, способствовать росту сельскохозяйственных культур и повышению их урожайности и качества.

[0026] 4. Микробиологическое средство по настоящему изобретению может быть внесено отдельно или внесено с удобрением на стадии посева, является удобным в хранении и применении, характеризуется простой внесения и небольшой нормой внесения на му (всего 2-4 кг/му).

[0027] 5. Микробиологическое средство по настоящему изобретению не только позволяет избежать загрязнения окружающей среды и энергетических потерь, вызванных чрезмерным внесением химических удобрений, но также способствует повышению плодородия почвы и улучшению экологической среды сельскохозяйственных угодий, характеризуется значительными экологическими преимуществами и имеет большое значение для сокращения применения удобрений, пиковых выбросов углекислого газа и углеродной нейтральности. Микробиологическое средство характеризуется небольшой нормой внесения и простой применения, является удобным в хранении и характеризуется простой внесения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0028] Фиг. 1. Микробиологическое средство для предотвращения и контроля загрязнения афлатоксином и его продуцирования афлатоксигенным штаммом и способствования увеличению урожайности сельскохозяйственных культур.

[0029] Фиг. 2. Сравнение устойчивости к болезням у контрольных сортов арахиса и сортов арахиса, обработанных микробиологическим средством.

[0030] Фиг. 3. Эффект обработки микробиологическим средством на способствование увеличению урожайности арахиса.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0031] Пример 1. Получение микробиологического средства с эффектами, заключающимися в предотвращении и контроле загрязнения афлатоксином и его продуцирования штаммом, продуцирующим токсины, и способствовании увеличению урожайности сельскохозяйственных культур

[0032] 1. Идентификация штаммов

[0033] Микробные штаммы, предусмотренные в настоящем изобретении, получали из бобов арахиса и ризосфер в Таншане, Хэбэй и Хэчжоу, Гуанси путем традиционного выделения и очистки бактерий и молекулярной идентификации последовательности 16S rDNA. При этом Bacillus amyloliquefaciens BA-HZ54 с номером доступа в CCTCC № M 20211295, Brevibacillus laterosporu BL-TS08 с номером доступа в CCTCC № M 20211296 и Bacillus mucilaginosus Krassilnikov BM-TS05 с номером доступа в CCTCC № M 20211297 были депонированы 20 октября 2021 г. в Китайском центре коллекции типовых культур (сокращенно CCTCC) Уханьского университета. Enterobacter ludwigii BG10-1 был депонирован 7 января 2016 г. в Китайском центре коллекции типовых культур Уханьского университета (CN 105586300 B) с номером доступа в CCTCC № M 2016014. Myroides odoratimimus 3J2MO был депонирован 13 июня 2017 г. в Китайском центре коллекции типовых культур Уханьского университета с номером доступа в CCTCC № M 2017329 (CN 201811409668.6).

[0034] 2. Получение микробиологического средства

[0035] 1) Осуществление микробиологической ферментации. Активированные Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus laterosporu, Bacillus mucilaginosus Krassilnikov, Enterobacter ludwigii и Myroides odoratimimus по отдельности инокулировали в жидкую среду (содержащую 3,5-4,0% кукурузной муки, 1,5-2,0% пептона, 0,4-0,5% K₂HPO₄ + KH₂PO₄ (1:1) и 1 л воды, имеющую pH 7,0-7,2 и стерилизованную при 121°C в течение 20 мин) в асептических условиях и проводили культивирование со встряхиванием в конической колбе при 180 об/мин при 37°C в течение 24 ч. Затем культивированные штаммы по отдельности инокулировали в ферментационный резервуар объемом 300 л при норме инокуляции 1% для осуществления ферментации. Ферментационное культивирование проводили при температуре 30-37°C, рН 7,0-7,2 и скорости перемешивания 180-220 об/мин и ферментацию прекращали, когда количество бактерий достигало 1 × 10¹⁰ КОЕ/мл.

[0036] 2) Получение носителя в форме частиц для микробиологического средства. Носитель в форме частиц состоит из гуминовой кислоты, тапиоковой муки и бентонитового связующего вещества. Сырьевые материалы присутствовали в носителе в форме частиц в соотношении 8,5:10:0,5. Сырьевые материалы равномерно перемешивали, гранулировали с помощью гранулятора и высушивали для последующего применения.

[0037] 3) Получение продукта, представляющего собой микробиологическое средство. Придерживаясь необходимого для получения 1 кг микробиологического удобрения соотношения ферментационных бульонов, предусматривающего 200 мл Bacillus amyloliquefaciens + 200 мл Brevibacillus laterosporu + 1 л Bacillus mucilaginosus Krassilnikov + 1 л Enterobacter ludwigii + 1 л Myroides odoratimimus, образцы бактерий, полученные центрифугированием ферментационных бульонов пяти штаммов с определенными объемами, растворяли в соответствующем количестве воды с получением смешанной бактериальной суспензии, которую затем распыляли на носитель в смесителе (массовое соотношение бактериальной суспензии и носителя составляло 1:10), осуществляли высушивание при низкой температуре (≤ 60°C) с получением микробиологического средства (см. фиг. 1) и микробиологическое средство упаковывали с получением готового продукта, представляющего собой микробиологическое средство. В разработанном микробиологическом средстве число живых бактерий Bacillus amyloliquefaciens составляет 2 × 10⁹ КОЕ/г или больше, число живых бактерий Brevibacillus laterosporu составляет 2 × 10⁹ КОЕ/г или больше, число живых бактерий Bacillus mucilaginosus Krassilnikov составляет 1 × 10¹⁰ КОЕ/г или больше, число живых бактерий Enterobacter ludwigii составляет 1 × 10¹⁰ КОЕ/г или больше, и число живых бактерий Myroides odoratimimus составляет 2 × 10⁹ КОЕ/г или больше.

[0038] Пример 2. Применение микробиологического средства для обеспечения снижения численности продуцирующего токсин штамма, такого как Aspergillus flavus, в полях

[0039] 1) Схема полевых испытаний в отношении арахиса

[0040] Полевое демонстрационное применение продукта, представляющего собой микробиологическое средство, осуществляли в основных районах производства арахиса в Хэнани, Шаньдуне, Хубэе и т.п. Китая, при этом используемая для испытания площадь составляла 50 му в каждом опытном участке, были предусмотрены контрольная группа и группа обработки, и между группой обработки и контрольной группой была предусмотрена изоляционная зона.

[0041] Контрольная группа: площадь составляла 25 му, разновидность представляла собой местную основную разновидность, использовали местный традиционный метод посева и традиционные полевые работы, такие как прополка, контроль вредителей и контроль интенсивности роста.

[0042] Группа обработки: площадь, разновидность, метод посева и техника полевых работ были такими же, как и в контрольной группе, и, исходя из этого, продукт, представляющий собой микробиологическое средство, равномерно смешивали с основным удобрением при норме внесения 2 кг/му с обеспечением равномерного распределения по почве с удобрением механическим или ручным способом на стадии посева арахиса.

[0043] 2) Сбор почвенных образцов в поле

[0044] В период сбора арахиса три почвенных образца ризосферы корней арахиса и три почвенных образца ризосферы бобов арахиса случайным образом отбирали на расстоянии 5-10 см от контрольного участка и участка обработки и для каждого образца отбирали 5 подобразцов путем пятиточечного отбора образцов. 5 подобразцов смешивали в один образец, 1 кг/образец, и после уменьшения образцов делением на четыре части тестировали численность продуцирующих токсин штаммов, таких как штамм Aspergillus flavus, в почве.

[0045] 3) Выявление численности продуцирующего токсин штамма, такого как штамм Aspergillus flavus, в почве

[0046] Aspergillus flavus выделяли из почв, на которых произрастает арахис, в контрольной группе и группе обработки, очищали и идентифицировали с применением морфологических и молекулярно-биологических способов идентификации Aspergillus flavus (подробнее см. метод, опубликованный в главе 2 «Research on the Distribution, Virulence and Infection of Aspergillus flavus in Typical Peanut Production Areas in China», магистерской работы Китайской академии сельскохозяйственных наук, автором которой является Zhang Xing). Выявляли продуцирующий токсин штамм Aspergillus flavus. Выявление численности продуцирующего токсин штамма, такого как штамм Aspergillus flavus, в почве представлено в таблице 1. В общей сложности 59 штаммов Aspergillus flavus выделяли и идентифицировали из образцов на контрольном участке, и диапазон распределения колоний Aspergillus flavus составлял 134-1742 КОЕ/г при среднем значении, составляющем 790 КОЕ/г, и в общей сложности 18 штаммов Aspergillus flavus выделяли и идентифицировали из почвенных образцов на участке обработки, и диапазон распределения колоний Aspergillus flavus составлял 67-603 КОЕ/г при среднем значении, составляющем 243 КОЕ/г. Степень подавления микробиологическим средством численности Aspergillus flavus в почве составляла от 43,28% до 83,33% со средней степенью подавления, составляющей 62,88%. Показано, что микробиологическое средство по настоящему изобретению способно значительно подавлять численность продуцирующего токсин штамма, такого как штамм Aspergillus flavus, в поле.

[0047] Таблица 1. Эффект обработки микробиологическим средством на численность продуцирующего токсин штамма в почве

[0048] Пример 3. Эффект применения микробиологического средства в отношении предотвращения и контроля загрязнения афлатоксином

[0049] Схема полевых испытаний была такой же, как и в примере 2.

[0050] 1) Сбор и обработка образцов арахиса

[0051] Образцы бобов арахиса случайным образом собирали с контрольного участка и участка обработки во время сбора урожая арахиса и высушивали на солнце. Образцы уменьшали делением на четыре части, а затем измельчали. По 1,0 г образцов взвешивали для определения содержания афлатоксинов. Кроме того, случайным образом отбирали контрольные и обработанные образцы (по меньшей мере 3 повторности) в иллюстративных опытных участках и определяли содержание афлатоксинов после культивирования, обеспечивающего продуцирование токсина.

[0052] 2) Культивирование продуцирующего токсин арахиса и определение содержания афлатоксинов

[0053] Образцы порошка арахиса взвешивали в чашках Петри по 3 биологических повторности на обработку, помещали образцы в термостатический инкубатор и инкубировали непрерывно в темноте в течение 3,5 дня при 28±1°C и относительной влажности, составляющей 90%. После высушивания в сушильном шкафу с постоянной температурой (110°C, 1 ч) 1,0 г образца порошка арахиса после охлаждения взвешивали в центрифужной пробирке, добавляли 5 мл 70% раствора метанола (содержащего 4% NaCl), проводили вихревое и равномерное перемешивание, полученную смесь встряхивали на шейкере в течение 2 ч, центрифугировали при 4500 об/мин, пропускали через иммуноаффинную колонку и органическую фильтрующую мембрану и выявляли содержание афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Общее количество афлатоксинов (AFT) представляет собой сумму вышеуказанных 4 афлатоксинов.

[0054] Условия HPLC: применяли хроматографическую колонку C18 (4,6 мм × 150 мм, 5 мкм) с температурой колонки, составляющей 35°C; применяли подвижную фазу метанол:вода (об.:об. = 45:55), скорость потока 0,8 мл/мин; применяли способ постколоночной фотохимической дериватизации с применением фотохимического дериватизатора 254 нм; применяли флуоресцентный детектор (длина волны возбуждения 360 нм, длина волны испускания 440 нм), вводимый объем составлял 10 мкл, и время определения составляло 22 мин.

[0055] Афлатоксин (95,7 мкг/кг) выявляли в одном образце контрольной группы, в то время как в арахисе группы обработки афлатоксин не выявляли во время сбора урожая. Сравнение содержания афлатоксина в образцах из двух опытных участков в условиях культивирования, обеспечивающего продуцирование токсина, представлено в таблице 2. Как видно из таблицы 2, среднее содержание афлатоксина на контрольном участке составляло 6,93 мкг/кг и 11,76 мкг/кг соответственно, и среднее содержание афлатоксина в сортах арахиса на участке обработки составляло 1,24 мкг/кг и 3,47 мкг/кг соответственно. Эффект обработки микробиологическим средством в отношении контроля содержания афлатоксина в сортах арахиса составлял 70% или больше.

[0056] Таблица 2. Эффект обработки микробиологическим средством в отношении контроля афлатоксина в сортах арахиса в условиях культивирования, обеспечивающего продуцирование токсина

[0057] Пример 4. Применение микробиологического средства для увеличения урожайности арахиса

[0058] Схема полевых испытаний была такой же, как и в примере 2.

[0059] Биологические и экономические признаки, такие как цвет листьев, устойчивость, наполненность бобов, вес 100 бобов и урожайность на му, на контрольных и обработанных участках соответственно, изучали на опытных участках и показательных областях, таких как Хэнань, Шаньдун, Хэбэй и Хубэй.

[0060] Также исследовали и определяли нодуляцию. По сравнению с контрольной группой корневая система сортов арахиса, обработанного микробиологическим средством, была более развитой и росла более интенсивно, а старение замедлялось; число корневых клубеньков значительно увеличилось и увеличилось в 30 раз или больше, а суммарная активность нитрогеназы увеличилась более чем в 50 раз, что указывает на то, что микробиологическое средство по настоящему изобретению может эффективно способствовать нодуляции и фиксации азота в корнях арахиса.

[0061] Обнаружили, что по сравнению с контрольным участком, сила роста арахиса была выше, листья были более плотными и зелеными, и устойчивость к проявляющейся в пятнистости листьев болезни и т. п. была повышена на участке, обработанном микробиологическим средством (фиг. 2). Результаты определения урожайности в 2020 г. (фиг. 3): урожайность сортов арахиса на му в каждом опытном участке увеличилась на 5-25 кг со степенью увеличения урожайности, составляющей 1,2-10,0%, и средняя урожайность на му увеличилась на 15,2 кг со средней степенью увеличения урожайности, составляющей 5,59%; урожайность сортов арахиса на му в каждом опытном участке увеличилась на 6,67-43 кг в 2021 г. со степенью увеличения урожайности, составляющей от 2,2% до 25,0%, и средняя урожайность на му увеличилась на 37,88 кг со средней степенью увеличения урожайности, составляющей 13,69%.

[0062] Результаты определения экономических признаков на иллюстративных опытных участках приведены в таблице 3, по сравнению с контрольной группой число бобов на растение и вес 100 бобов сортов арахиса, обработанного микробиологическим средством, увеличились на 27,6% и 10,94% соответственно, а также обеспечивалась наполненность бобов арахиса, и степень наполненности бобов увеличивалась на 7,45% со способствованием, тем самым, увеличению урожайности арахиса.

[0063] Результаты показывают, что обработка микробиологическим средством оказывает эффекты, заключающиеся в повышении устойчивости арахиса к болезням, увеличении числа бобов арахиса на растение, обеспечении наполненности зерна, а также увеличения веса бобов арахиса на растение, веса 100 бобов и урожайности арахиса.

[0064] Таблица 3. Эффект обработки микробиологическим средством в отношении обеспечения увеличения урожайности арахиса

[0065] Микробиологическое средство, разработанное путем смешивания Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus laterosporu, Bacillus mucilaginosus Krassilnikov, Enterobacter ludwigii и Myroides odoratimimus, в соответствии с настоящим изобретением, характеризуется эффектами предотвращения и контроля загрязнения афлатоксином и его продуцирования афлатоксигенным штаммом в отношении сортов арахиса и способствования увеличению урожайности арахиса. После полевого внесения микробиологического средства численность продуцирующего токсин штамма, такого как штамм Aspergillus flavus, в поле может быть эффективно снижена, риск загрязнения сортов арахиса афлатоксинами может быть снижен, качество и уровень безопасности сортов арахиса могут быть улучшены, и может быть обеспечено образование бобов арахиса, может быть улучшена наполненность зерна и урожайность, а также получены значительные социальные, экономические и экологические выгоды, что имеет большое значение для улучшения качества и эффективности производства арахиса и способствования экологическому и высококачественному развитию, а также имеет перспективы широкого применения.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой микробиологическое средство, составленное из 5 микроорганизмов, включая Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus laterosporu, Bacillus mucilaginosus Krassilnikov, Enterobacter ludwigii и Myroides odoratimimus, путем раздельного ферментационного культивирования, концентрирования и смешивания. Микробиологическое средство применяется на стадии посева в поле культур, таких как сорта арахиса, что может эффективно снизить численность продуцирующего токсин штамма, такого как штамм Aspergillus flavus, и вероятность заражения им в почве из источника, снизить риск загрязнения сортов арахиса афлатоксинами после получения, улучшить качество и уровень безопасности сортов арахиса и в то же время способствовать росту сельскохозяйственной культуры, повысить устойчивость, улучшить степень наполненности бобов и урожайность, при этом микробиологическое средство обладает значительными экономическими, социальными и экологическими преимуществами. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.

1. Микробиологическое средство с функциями предотвращения и контроля загрязнения афлатоксином и его продуцирования афлатоксигенным штаммом и способствования увеличению урожайности сельскохозяйственных культур, составленное из 5 микроорганизмов, включая Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus laterosporu, Bacillus mucilaginosus Krassilnikov, Enterobacter ludwigii и Myroides odoratimimus, путем раздельного ферментационного культивирования, концентрирования и смешивания; где Bacillus amyloliquefaciens представляет собой штамм Bacillus amyloliquefaciens BA-HZ54 с номером доступа в CCTCC № M 20211295; Brevibacillus laterosporu представляет собой штамм Brevibacillus laterosporu BL-TS08 с номером доступа в CCTCC № M 20211296; Bacillus mucilaginosus Krassilnikov представляет собой штамм Bacillus mucilaginosus Krassilnikov BM-TS05 с номером доступа в CCTCC № M 20211297; Enterobacter ludwigii представляет собой штамм Enterobacter ludwigii BG10-1 с номером доступа в CCTCC № M 2016014; и Myroides odoratimimus представляет собой штамм Myroides odoratimimus 3J2MO с номером доступа в CCTCC № M 2017329; при этом в микробиологическом средстве число живых бактерий Bacillus amyloliquefaciens составляет 2 × 10⁹ КОЕ/г, число живых бактерий Brevibacillus laterosporu составляет 2 × 10⁹ КОЕ/г, число живых бактерий Bacillus mucilaginosus Krassilnikov составляет 1 × 10¹⁰ КОЕ/г, число живых бактерий Enterobacter ludwigii составляет 1 × 10¹⁰ КОЕ/г, и число живых бактерий Myroides odoratimimus составляет 2 × 10⁹ КОЕ/г.

2. Микробиологическое средство по п. 1, где микробиологическое средство представляет собой средство в виде гранулы, порошка или водного раствора, содержащее живые бактерии.

3. Микробиологическое средство по п. 2, где носитель в форме частиц микробиологического средства содержит гуминовую кислоту, тапиоковую муку и бентонитовое связующее вещество и где микробиологическое средство получено путем составления концентрированных растворов бактериальных штаммов с носителем в форме частиц.

4. Применение микробиологического средства по п. 1 в поле для предотвращения и контроля загрязнения афлатоксином и его продуцирования афлатоксигенным штаммом и способствования увеличению урожайности сельскохозяйственных культур.

5. Применение по п. 4, где микробиологическое средство распыляется на почву или вносится в ризосферы сельскохозяйственных культур перед посевом или в период роста.

6. Применение по п. 4, где время внесения предпочтительно приходится на стадию посева или цветения и стадию образования гинофоров и норма внесения составляет 2-4 кг/му.

7. Применение по п. 4, где сельскохозяйственные культуры предусматривают сорта арахиса.