ВОДОДИСПЕРГИРУЕМЫЙ СОСТАВ ДЛЯ ДОСТАВКИ ГРИБОВ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ БИОКОНТРОЛЯ, СНИЖАЮЩИЙ СОДЕРЖАНИЕ АФЛАТОКСИНА Российский патент 2013 года по МПК C12N1/14 A01N63/04 

Область техники

Настоящее изобретение относится к вододиспергируемому гранулированному составу, осуществляющему биоконтроль, предназначенному для снижения загрязненности афлатоксином продовольствия и кормов для животных, в частности, кукурузы, а также к способам приготовления такого состава. Вододиспергируемый гранулированный состав содержит агент, предназначенный для биоконтроля, заключенный в гранулированную матрицу, образующую дисперсию при добавлении воды. Агент, предназначенный для биоконтроля, представляют собой нетоксикогенные и неафлатоксигенные штаммы Aspergillus flavus, способные ингибировать образование колоний афлатоксинпродуцирующих грибов, и кроме того, способные подавлять продуцирование афлатоксина токсикогенными грибами. Вододиспергируемый гранулированный состав согласно изобретению обладает высокой стабильностью при хранении и в полевых условиях.

Область техники

Многие грибы продуцируют вторичные метаболиты, не являющиеся необходимыми для их роста и размножения. Если эти метаболиты токсичны для человека или животного, то их классифицируют как микотоксины. Различают четыре наиболее важных рода грибов, продуцирующих микотоксины, включая: Aspergillus, Fusarium, Penicillium и Alternaria (Council for Agricultural Science and Technology [CAST]. 2003. Task Force Report 139, Ames, IA). Эти грибы продуцируют микотоксины, которые могут неблагоприятно влиять на качество и доставку продовольствия и кормов, включая кукурузу, семена хлопчатника, зерна хлебных злаков, арахис и лесные орехи.

Суммарный размер ущерба, наносимого микотоксинами, в пищевой промышленности и животноводстве США и Канады оценивают в пять миллиардов ежегодно; при этом наибольшие опасения вызывает афлатоксин - класс микотоксинов, продуцируемых штаммами Aspergillus spp. (Robbens and Cardwell. 2005. In: Aflatoxin and Food Safety, Abbas, H.K. (Ed.), CRC Press, Boca Raton, FL, pp.1-12). Двумя основными типами микотоксинов, преобладающими в качестве загрязнителей продовольствия и кормов, являются продуцируемые A.Flavus микотоксины - афлатоксины В1 и В2 (Payne, G.S. 1992. Critical Rev. Plant Sci. 10: 423-440). Полагают, что афлатоксин Bi (AFB₁) является самым сильным и распространенным микотоксином (International Agency for Research on Cancer-World Health Organization [IRAC-WHO]. 1993. В: IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Lyon, France, pp.56, 467-488). Случаи загрязнения чаще всего связывают с A.flavus (Diener et al. 1987. Ann. Rev. Phytopath. 25: 249-270). Этот гриб способен расти в широком интервале температур, а именно 10°С-43°С, и широком интервале активности воды (0.82-0.998) (Food and Agriculture Organization of the United Nations/ International Atomic Energy Agency [FAO/IAEA]. 2001. In: FAO Food and Nutrition Paper, FAO, Rome, Italy, pp.73, 75-93). Тем не менее, засушливая погода, механическое повреждение или наличие сельскохозяйственных вредителей обычно усиливают загрязненность кукурузы афлатоксином в предуборочный период.

В настоящее время максимальный допустимый уровень содержания афлатоксина в человеческой пище и корме для животных составляет 20 мкг/кг (CAST, supra; van Egmond and Jonker. 2004. J.Toxicol. - Toxin Rev. 23: 273-293). Несмотря на то что избежать присутствия микотоксинов в сельскохозяйственном сырье невозможно, уровень загрязнения можно контролировать с применением определенных агротехнические приемов. Предложено несколько вариантов предуборочной стратегии различной степени успешности, регулирующей загрязнение афлатоксином (Betran and Isakeit. 2004. Agron. J. 96: 565-570). Перспективной стратегией контроля является биологический контроль с использованием нетоксикогенного A.flavus (Domer, J.W. 2004. J.Toxicol. - Toxin Rev. 23: 425-450). Brown et al. (1991. J.Food Protect. 54: 623-626) показали, что уровни содержания афлатоксина можно снизить путем прямой скарификации початков кукурузы и инъекции нетоксикогенного штамма A.Flavus. В противовес прямой, механистической стратегии Brown et al., возникла стратегия непрямой доставки в почву, получившая большее распространение. Почвенный инокулят, как правило, представляет собой активный, нетоксикогенный штамм А.flavus, который первоначально культивируют на зернах хлебных злаков. Эти зерна служат питательной средой обеспечивающей пролиферацию штамма А.Flavus, предназначенного для биоконтроля, и их применяют для обработки почвы под намеченными зерновыми культурами. Находясь на зернах, нетоксикогенный штамм образует множество спор, распространяемых ветром и водой, и конкурирует с эндемическими афлатоксикогенными штаммами за ресурсы, что в целом приводит к снижению уровня содержания афлатоксина. Данная стратегия обработки почвы успешно применялась при выращивании арахиса (Domer et al. 1992. J. Food Protect. 55: 888-892), хлопчатника (Cotty, P.J.1994. Phytopath. S4: 1270-1277) и кукурузы (Domer et al. 1999. J. Food Protection 62: 650-656). Аналогичную стратегию с применением инокулята, вносимого в почву, использовали при производстве кукурузы в дельте Миссисипи (Abbas et al. 2006. Biocontrol Sci. Tech. 16: 437-449). Исследование процесса производства кукурузы в дельте Миссисипи выявило К49 - нетоксикогенный штамм A. flavus, который способствовал значительному снижению уровня загрязнения афлатоксином в течение четырех лет полевых испытаний и проявил высокую способность к колонизации.

Несмотря на успех вышеописанных стратегий, существуют препятствия, ограничивающие их практическое применение в коммерческом сельскохозяйственном производстве. Вследствие этого, сохраняется необходимость в разработке подходов, предполагающих прямую воздушную доставку, позволяющих добиться эффективного снижения уровня загрязнения кукурузы афлатоксином в предуборочный период и уменьшить зависимость применения от оптимальных условий окружающей среды.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторами настоящего изобретения разработана композиция, представляющая собой вододиспергируемый гранулированный состав, включающий агенты биоконтроля, пригодный для применения в качестве распыляемой конидиальной суспензии, предназначенной для предотвращения загрязнения афлатоксином продовольствия и кормов, а также способ приготовления вододиспергируемого гранулированного состава.

Таким образом, в соответствии с вышесказанным задачей настоящего изобретения является обеспечение вододиспергируемого гранулированного состава, содержащего изолированные неафлатоксикогенные и нетоксикогенные штаммы А. Flavus, способные функционировать в качестве агентов биоконтроля и ингибировать пролиферацию грибов, продуцирующих афлатоксин, предотвращая таким образом загрязнение афлатоксином продовольствия и кормов. Согласно предпочтительным примерам реализации предложен нетоксикогенный штамм, обозначенный как К49.

Кроме того, другой задачей настоящего изобретения является обеспечение такого состава на основе агентов биоконтроля, в котором указанные агенты сохраняли бы жизнеспособность, при высокой степени стабильности состава при хранении, а также в полевых условиях.

Другой задачей изобретения является приготовление продуктов для биоконтроля, которые являются чистыми, удобными в обращении и обладающими относительно низкой фитотоксичностью для сельскохозяйственных культур.

Еще одной задачей изобретения является включение агентов биоконтроля в составы, пригодные для применения в традиционных сельскохозяйственных распылителях.

Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из дальнейшего описания.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Автораами настоящего изобретения разработан способ приготовления вододиспергируемого гранулированного состава, содержащего агент биоконтроля - нетоксикогенный штамм A. flavus. Сравнивали эффект инокуляции почвы нетоксикогенным штаммом К49, входящим и не входящим в состав композиции, с целью определения влияния на способность к колонизации и уровень содержания афлатоксина в полевой кукурузе. Указанное сравнение проводили с целью оценкистратегии прямой доставки для снижения уровня загрязнения афлатоксином кукурузы в предуборочный период. Аналогичные степени колонизации и снижения уровня афлатоксина обнаружены при сравнении эффекта, полученного в результате распыления конидий, входящих и не входящих в состав композиции. Значение обнаруженных данных состоит в том, что они демонстрируют возможность разработки продукта биологического контроля при использовании традиционных технологий нанесения, с целью уменьшения загрязнения кукурузы афлатоксином. Отличный результат, характеризующий уменьшение уровня содержания афлатоксина, и очевидная приживаемость штамма, предназначенного для биоконтроля, подтверждает гипотезу о том, что наиболее эффективным способом снижения уровня загрязнения кукурузы афлатоксином, является непосредственное нанесение агента биоконтроля на чувствительные к афлатоксину или репродуктивные органы кукурузы.

Способ, заключающийся в добавлении высококонкурентных, нетоксикогенных штаммов A. Flaws в почву, применяли традиционным способом; в результате получали снижение концентрации токсинов в сельскохозяйственных культурах, благодаря тому, что биологическая конкуренция нетоксикогенных штаммов Aspergillus с микрофлорой почвы предотвращала накопление штаммов, продуцирующих токсины, обычно появляющихся во время поздних сезонных засух. В ходе конкурентного замещения токсикогенные штаммы грибов, населяющих почву в природных условиях, замещались нетоксикогенными и неафлатоксигенными штаммами, добавленными в почву. Поэтому все зерновые культуры, подвергшиеся поздней сезонной засухе, оказывались пораженными преобладающими биоконкурентными штаммами, не способными продуцировать токсины.

Тем не менее, применение зерновых инокулянтов для регулирования содержания афлатоксина в кукурузе связано со следующими недостатками: 1) применение твердой матрицы может быть затруднительным при коммерческом использовании в случае, когда зерновые находятся на поздних стадиях онтогенеза, 2) некоторые биотические, абиотические и погодные факторы могут ограничить или остановить рассеивание конидий от гранулированных источников к органам кукурузы, доступным для воздушной доставки 3) спорообразование, протекающее на обработанных зернах в поле может вызвать проблемы, связанные со здоровьем и безопасностью. В итоге успех стратегии биологического контроля зависит от динамики биологической конкуренции между различными штаммами A. flavus. Конидии К49, включенные и не включенные в состав композиции, наносили на репродуктивные ткани кукурузы и сравнивали их воздействие на снижение содержания афлатоксина в кукурузе. При прямом распылении на початки кукурузы включенные и не включенные в состав композиции конидии оказались высокоэффективным средством, способствующим снижению уровня загрязненности кукурузы афлатоксином. Несмотря на то, что материал, включенный в состав композиции, приготовляли и хранили в течение одиннадцати месяцев, не было отмечено разницы в эффективности между материалом, включенным в состав композиции, и материалом, состоящим из свежесобранных конидий, не включенных в состав композиции. Поскольку применение свежевыработанных агентов биоконтроля является трудно выполнимым условием с коммерческой точки зрения, стабильная композиция, способная эффективно доставлять агенты биоконтроля, представляет собой важный и коммерчески целесообразный продукт, позволяющий регулировать уровень содержания афлатоксина в кукурузе и других зерновых культурах, подверженных загрязнению микотоксином. Концентрации применяемого материала также различны. В данном исследовании материал, включенный в композицию, применяют в количестве 9 кг/га; в то время как зерновые почвенные инокулянты традиционно применяют в количестве от 20 до 200 кг/га (Abbas et al. 2006; Cotty; Domer et al. 1998; supra). Дальнейшая оптимизация описанного здесь состава, а также способа распыления может в дальнейшем способствовать снижению количества состава, вносимого на единицу площади, для регулирования содержания афлатоксина в кукурузе.

Способ согласно изобретению применим для любого сельскохозяйственного сырья, выращиваемого для потребления человеком и/или в качестве корма для животных и/или поврежденного токсинами грибов, для которого прямое нанесение на органы-мишени растения, такого как, например, кукуруза, хлопчатник, лесной орех и маслина, оказывает благоприятное воздействие.

В соответствии с задачами настоящего изобретения термин «препарат грибов» или «сельскохозяйственная композиция, преджназначенная для биоконтроля, содержащая грибы» относится к микробному препарату, в котором микробысодержат, по существу состоят, или представляют собой нетоксикогенные или неафлатоксикогенные штаммы Aspergillus. Препараты грибов могут содержать один или более нетоксикогенных или неафлатоксикогенных штаммов Aspergillus. «Нетоксикогенный штамм Aspergillus)) включает любой штамм, который не продуцирует токсин афлатоксин и циклопиазоновую кислоту (СРА). «Неафлатоксикогенный штамм Aspergillus» включает любой штамм, который не продуцирует токсин афлатоксин, однако продолжает продуцировать циклопиазоновую кислоту (СРА). Сельскохозяйственная композиция, предназначенная для биоконтроля, содержащая грибы, в соответствии с задачами настоящего изобретения, включает нетоксикогенный штамм (или штаммы) грибов, или Неафлатоксикогенный штамм (или штаммы) грибов, заключенный в приемлемые сельскохозяйственные носители, которые могут представлять собой любые носители, к которым можно прикреплять грибы и которые не являются вредными для грибов или зерна, которое обрабатывают композицией. Пример нетоксикогенного штамма включает A. flavus K49. Грибы, особо полезные при применении согласно настоящему изобретению, представлены штаммами с идентификационными характеристиками нетоксикогенного A. flavus K49, обозначенного как NRRL 30797. Этими характеристиками являются неспособность к продуцированию токсина афлатоксина и СРА, а также способность к биологической конкуренции при внесении в почву, на которой выращивают сельскохозяйственные сырьевые культуры. Пример неафлатоксикогенного штамма включает A. flavus CT3. Кроме того, грибы, особо полезные при применении согласно настоящему изобретению, представлены штаммами с идентификационными характеристиками неафлатоксикогенного штамма A. flavus CT3, обозначенного как NRRL 30798. Этими характеристиками являются неспособность к продуцированию афлатоксина, а также способность к биологической конкуренции при внесении в почву, на которой выращивают сельскохозяйственные сырьевые культуры.

Когда нетоксикогенные и неафлатоксикогенные штаммы Aspergillus культивируют как единичные штаммы на гранулированных пищевых источниках, таких как, например, пшеница, рис, рожь и т.д., то эти пищевые источники при полной колонизации содержат приблизительно 10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) грибов на грамм массы пищевого источника. Для упомянутых пищевых источников инокулированные зерна инкубировали приблизительно при 35°С. После 24 ч роста инокулированную пшеницу встряхивали вручную и инкубировали в течение 24 ч дополнительно, далее гомогенизировали встряхивая вручную. Колонизацию штаммом инокулянта подтвердили определением концентрации афлатоксина в инокулянтах. Инокулированный продукт можно хранить приблизительно при 5°С в течение приблизительно 2 месяцев и более, если содержание воды в высушенном продукте ниже критического.

Нетоксикогенные и неафлатоксикогенные штаммы Aspergillus наносят на растения в количестве, эффективном для снижения уровней содержания токсинов в сельскохозяйственном сырье. Термин «снижение уровня содержания токсина» в настоящем описании относится к снижению количества токсина по сравнению с количеством токсина в сельскохозяйственном сырье, ожидаемом в том случае, когда сельскохозяйственное сырье не обрабатывали способами согласно настоящему изобретению. Для специалиста в данной области очевидно, что для подобных сравнений можно применять все точные методы измерения и сравнения уровней содержания токсина.

Термины «в эффективном количестве», «в количестве, эффективном», «эффективное количество» относятся к такому введенному количеству препарата грибов, при котором эффект от его применения проявляется в снижении загрязнения токсином сельскохозяйственного сырья.

ПРИМЕРЫ

После общего описания изобретения для лучшего его понимания представлены отдельные конкретные примеры, включенные исключительно для иллюстрации и не ограничивающие настоящего изобретения, объем которого определен формулой изобретения.

ПРИМЕР 1

Штаммы Aspergillus flavus

Нетоксикогенный штамм A. flavus K49 (NRRL 30797) и афлатоксикогенный штамм F3W4 (NRRL 30796) сохраняли на силикагеле при 4°С, перед началом исследования проверили соответствующие фенотипические признаки штаммов, профили афлатоксина, формирование склероциев, морфологию колоний и формирование конидий (Abbas et al. 2006. Biocontrol Science and Technology 16: 437-449).

ПРИМЕР 2

Материалы состава и вододиспергируемый гранулированный препарат

В качестве носителя при приготовлении вододиспергируемого гранулированного состава (WG) использовали кальцинированную коалиновую глину со средним размером частиц меньше 1 микрона. В дополнение к трегалозе в качестве связующего вещества применили натрий карбоксиметилцеллюлозу. Трегалозу использовали в качестве многофункционального компонента состава. Этот дисахарид включили в состав в качестве осмопротектора, адгезива или клеящего вещества, функционирующего после нанесения, и потенциального источника питательных элементов для К49. В частности, композиция сухих ингредиентов в составе содержала:

76-90% Satintone 5HB в качестве носителя, 1-4% Nilyn XL 90 в качестве связующего вещества и 5-20% трегалозы в качестве осмопротектора, адгезива или клеящего вещества, функционирующего после нанесения, и потенциального источника питательных элементов для К.49. Сухие ингредиенты смешивали до визуальной гомогенности в смесителе с большими сдвиговыми усилиями перед перемешиванием в приблизительно 510 мл 0,1% (вес/об) пептоном растворе, содержащим 5% от общего количества сухой трегалозы и конидий К.49 при 4×10⁸ КОЕ/г влажной смеси на 500 г сухих ингредиентов. Конидии собрали из агаровых чашек с мальц-экстрактом с добавлением малых аликвот 0,1% пептонного раствора. Таким образом, конидии оказывались заключенными в гранулы, изготовленные из состава. Контрольные гранулы, не содержащие конидий A. flavus, готовили и обработали вышеописанным способом.

Глины, отличные от кальцинированной каолиновой глины, можно использовать в составах согласно изобретению, т.е. в составах можно использовать любые глины с соответствующим размером частиц, т.е. размером частиц, сравнимым с размером организма, достаточно малым, чтобы не вызывать засорения системы распыления. Таким образом, возможно использование других кремнеземных глин и смесей глин, таких как, например, бентонит, каолинит и смектиты, включая монтмориллонит и бейделлит.

Вышеупомянутые смеси готовили отдельно при помощи тарельчатого гранулятора (LCI Corp) с матрицей 1.2 мм или 2.0 мм, высушивали под вакуумом до активности воды, составляющей приблизительно 0,30. Гранулы размером 2,0 мм и 1,2 мм обозначены как Продукт 1 и Продукт 2. соответственно. Гранулы хранили при 4°С в течение ~330 дней; в течение указанного периода выживаемость пропагул A. Flavus периодически измеряли, высевая на полуселективную среду. По три параллельных пробы гомогенизировали в водном агаре (0,2% масс./об.) возвратно-поступательным встряхиванием (30 мин, 100 ударов/мин), серийно разбавляли и высевали на модифицированную среду с бенгальским розовым (MDRB; Horn and Domer. 1998. Mycologia 90: 767-776).

Анализ гранулированного состава, включающего конидии, проведенный сразу после сушки, выявил >3×10⁸ КОЕ/г.Отметили сравнительно высокий уровень выживаемости A. flavus штамма К49, на что указывает отсутствие потерь жизнеспособности штамма в течение 11 месяцев хранения К49, включенного в композицию, при 4°С (Таблица 1). После двух лет хранения количество жизнеспособных пропагул грибов сократилось лишь на 50%.

Гранулы состава содержат заключенный в них агент биоконтроля, в данном случае, конидии К49. При контакте с водой (как в Примере 5) или другим водным раствором гранулы образуют дисперсию или разрушаются с высвобождением агента биоконтроля, который приобретает способность функционировать как агент биоконтроля.

Таблица 1 Выживаемость A.flavus штамма К49 в вододиспергируемых гранулах.   Продукт 1 (2.0 мм WG) Продукт 2 (1.2 мм WG)   Колониеобразующие единицы A.flavus 1 г После сушки 3.12±0.35×10⁸ 3.70±0.10×10⁸ Хранение при 4°С в течение 20 дней 2.57±0.15×10⁸ 2.95±0.34×10⁸ Хранение при 4°С в течение 330 дней 3.90±0.36×⁸ 3.18±0.21×10⁸ Хранение при 4°С в течение 745 дней 1.66±0.44×10⁸ 1.49±0.20×10⁸ Представленные данные являются средними величинами по трем пробам ± стандартное отклонение.

ПРИМЕР 3

Конидии и твердый препарат для инокуляции

Для производства инокулята конидий, не включенных в композицию, исходные культуры высевали на 40 чашек с картофельно-декстрозным агаром (КДА) и инкубировали в течение 5-7 дней при 28°С, при 12 часовом световом режиме (165 мкмоль/м²/с¹) и 12-часовом темновом режиме. Конидии и мицелий снимали с чашки при помощи водного Твин-20 (0,2% масс./об.). Вегетативные грибные структуры отделяли от суспензии конидий фильтрованием через два слоя марли. Плотность конидий измеряли при помощи гемоцитометра; конечную концентрацию довели до величины 4.1×10⁶ конидий/мл.

Для инокуляции почвы использовали пшеницу в качестве носителя инокулята, как описано в литературе (Abbas et al. 2006, supra). Зерна пшеницы замочили в воде на ночь, высушили и поместили в автоклав в полипропиленовых мешках (1 кг/мешок с 250 мл воды) на 1 час при 121°С. Первичным инокулятом A. flavus являлись 5-дневные культуры КДА - по секции площадью 3 см² на мешок, которые инкубировали при температуре 35°С. Через 48 часов при 35°С пшеница оказалась полностью колонизированной. Затем этот продукт гомогенизировали путем ручного встряхивания и хранили при 4°С до применения в полевых испытаниях.

ПРИМЕР 4

Полевое исследование колонизации с применением техники «Pin Bar» Метод инокуляции с применением техники «pin bar» (Windham et al. 2003. J.Toxicol. - Toxin Rev. 22: 313-325) использовали для сравнения степени колонизации кукурузы, инокулированной суспензией конидий К49, не включенных в композицию, и кукурузы, инокулированной WG гранулированньш составом, включающим К49 в 2005 году в ходе полевых испытаний, проведенных в Стоунвилле и Элизабет, штат Миссисипи. В Стоунвилле исследования проводили на гибриде кукурузы, резистентном к глифосфату (Garst 8270 rr), а в исследованиях в Элизибет участвовал гибрид, экспрессирующий ген эндотоксина Bacillus thuringiensis (Agrigold A6333 bt). Кукурузные початки инокулировали через 25 дней после 50% выметывания пестичных столбиков (развития зубовидных зерен). Кукурузные початки (100 на одну обработку) инокулировали по отдельности суспензией включенных, либо не включенных в композицию конидий (5×10⁶ конидий/мл), в фазе выметывания пестичных столбиков у 50% растений при помощи техники «pin bar» (три 100 мм ряда из 12 швейных игл, закрепленных на деревянном блоке, кончик каждой иглы выступает на 6 мм). Иглы окунали в суспензии конидий и погружали в початок. Через различные временные интервалы после «pin bar» инокуляции собирали по десять инокулированных початков, обработанных одинаковым образом; общее количество початков в инокулированной зоне и количество инфицированных початков определили путем подсчета и визуальной оценки роста грибов на отдельных початках.

Аналогичный итоговый уровень колонизации початков кукурузы штаммом К49, введенным в виде конидий, включенных или не включенных в состав композиции, наблюдали в 2005 году на двух участках при исследовании с «pin bar» инокуляцией (Таблица 2). Начальная скорость колонизации кукурузных початков штаммом К49, наблюдаемая на участках, расположенных в Стоунвилле (не-ВТ гибрид) была более высокой по сравнению со скоростью на участках, расположенных в Элизабет (ВТ гибрид). При исследованиях в Стоунвилле инокуляцию проводили на 10 дней раньше, чем в Элизабет, и, возможно, на скорость колонизации повлияли погодные условия. Случаи колонизации A.flavus на контрольных неинокулированных участках в Стоунвилле наблюдали чаще, чем в Элизабет. Эта разница, возможно, вызвана применением ВТ гибрида (на участках, расположенных в Элизабет), снижающего частоту поражения кукурузным мотыльком European comborer (Dowd, В.W. 2003. J.Toxicology-Toxin Review 22: 327-350). На участке в районе Элизабет наблюдали ускоренную колонизацию кукурузных зерен на початках, инокулированных Продуктом 1, по сравнению с колонизацией на початках, инокулированных конидиями, не включенными в композицию, через 5 и 7 дней после инокуляции; в то же время, в районе Стоунвилля оба состава способствовали усиленной колонизации по сравнению с колонизацией при инокуляции конидиями, не включенными в композицию, через 7 дней после инокуляции. Усиленную колонизацию штаммом К49 наблюдали при применении Продукта 1 по сравнению с Продуктом 2 в районе Стоунвилля через 5 дней и в районе Элизабет через 9 дней после инокуляции. Не было отмечено негативного воздействия состава и того же состава после хранения (в течение 20 дней) на колонизацию конидиями К49; на раннем этапе исследования в определенные моменты отмечали более активную колонизацию конидиями К49, включенными в композицию, по сравнению с конидиями, не включенными в композицию. На основании этих предварительных результатов для применения в полевых испытаниях второго года эксперимента выбрали Продукт 1 (диаметр гранул WG 2,0 мм).

Таблица 2 Колонизация кукурузных зерен после инкубации К49, нанесенными в составе вододиспергируемых гранул, или в виде свободных конидий в двух районах.   Инфицированные зерна (%)   День 2 День 5 День 7 День 9 День 12 День 14 Элизабет (ВТ)*             Контроль 0 0 с 0.8 с 2.1 b 5.0 b 7.5 b Продукт 1 0 54.1 а 85.7 а 100.0 а 100.0 а 98.1 а Продукт 2 0 51.1 а 73.1 а 97.2 а 100.0 а 98.1 а Свободные конидии 0 34.4 b 67.6 b 100.0 а 100.0 а 92.0 а LSD МЗР (Pr>0.05)   16.2 10.0 4.5 8.2 10.8 Стоунвилль (RR)^#             Контроль 0.0 b 0.9 с 5.1 с 9.4 b 6.9 b 23.9 b Продукт 1 0.6 b 80.1 а 98.7 а 93.8 а 98.5 а 99.2 а Продукт 2 0.0 b 37.5 b 98.9 а 94.5 а 96.7 а 93.6 а Свободные конидии 17.2 a 69.7 а 85.7 b 91.1 а 96.0 а 96.6 а     14.55 12.0 8.9 5.2 14.3

Представлен средний результат по трем образцам, собираемым каждый день. Величины с одинаковыми буквенными индексами не различаются существенно при уровне доверительной вероятности 95%. ВТ=гибрид, содержащий ВТ конструкцию, RR=модифицированный гибрид, резистентный к глифосфату.

ПРИМЕР 5

Полевой эксперимент по регулированию содержания афлатоксина и внедрению штаммов

В 2006 году в районе Стоунвилля, штат Миссисипи, провели полевое исследование с целью оценки эффективности нанесения атоксикогенного штамма К49 - агента биоконтроля на листья растения для снижения заражения афлатоксикогенными изолятами A.flavus и загрязнения афлатоксином. Кукурузу (ОК C69-70RR) высевали 14 апреля 2006 г. в илисто-глинистую почву (Dundee) в Стоунвилле, штат Миссисипи. Использовали экспериментальную планировку рандомизированного общего участка для 6 видов обработки, воспроизведенных в 3 блоках. Каждый экспериментальный блок состоял из трех рядов длиной 9,36 м (1,06 м шириной) с одним обработанным рядом (в центре от 25 до 30 растений) и двумя необработанными буферными рядами. Виды обработки включали: 1) контроль - отсутствие обработки; 2) внесение почвенного инокулята - пшеницы, инокулированной афлатоксигенным А. flavus штамм F3W4 (20 кг/га); 3) внесение почвенного инокулята - пшеницы, инокулированной составом, включающем К49; 4) внесение почвенного инокулята - пшеницы, инокулированной обоими штаммами F3W4 и К49; 5) обработка суспензией экструдированных гранул, включающих К49; и 6) обработка распыленной суспензией свежесобранных конидий К49.

26 июня (на ранней стадии выметывания пестичных столбиков), пшеничным инокулянтом афлатоксигенного штамма F3W4 и атоксигенного штамма К49 обработали соответсвующие участки в количестве 20 кг/га. 30 июня (на стадии выметывания пестичных столбиков у 50% растений), при помощи ручного опрыскивателя распылили инокулянты (обработка способами 5 и 6). Раствор для распыления включал 56 г продукта, содержащего состав, суспендированного в 4 литрах 0,2% масс./об. Твин 20, количество раствора для обработки составило ~600 мл на участок. Проводили опрыскивание верхней трети растения, мишенью являлись початки. На стадии физиологической зрелости (17 августа) все початки с растений, находящихся в 6 м от центра обработанного ряда, собрали вручную, высушили, обмолотили и размололи.

Подсчет плотности пропагул Aspergillus и оценку характеристик изолята провели при помощи селективной среды. Размолотые образцы зерна гомогенизировали в 0,2% масс./об. водном агаре, разбавили сериями и высеяли на MDRB агар. Колониеобразующие единицы (КОЕ) подсчитали через 5 дней инкубации. Тридцать колоний с участка перенесли на CD-PDA (PDA с 0.3% β-циклодекстрина) и инкубировали в течение 5 дней при непрерывном затемнении при 28°С, и провели оценку продуцирования афлатоксина по пигментации колоний и изменению цвета после воздействия паров аммиака (Abbas etal. 2004. Canad. J.Microbiol. 50: 193-199).

Все полевые данные, результаты исследования колонизации, выделения токсина и фенотипа Aspergillus, а также загрязнения афлатоксином анализированли при помощи PROC GLM Системы Статистического Анализа (SAS. 2001. SAS® Proprietary Software Release 8.2, Windows version 5.1.2600. SAS Institute Inc. Cary, NC). Разделение средних проводили по критерию наименьшей значимой разности (критерию Фишера).

Количество КОЕ A. flavus, выделенных из размолотого зерна варьировалось от log 5.4 до 6.3 пропагул/г зерна, при максимальном уровне выделения из зерна, обработанного распылительным раствором конидий К49, не включенных в композицию (Таблица 3). Данный уровень колонизации намного выше, по сравнению с уровнем, выявленным при подсчете пропагул A. flavus, обнаруженных на кукурузе в предыдущих исследованиях (Abbas et al. 2006, supra), где количество выделенных колоний варьировалось от 3.4 до 4.4 log КОЕ/г зерна. Минимальную долю (от 4 до 6%) афлатоксикогенных изолятов обнаружили при применении распыляемого штамма К49, входящего и не входящего в состав композиции (Таблица 3). При всех других способах обработки наблюдали аналогичные уровни афлатоксикогенных изолятов (от 50 до 71%), на которые существенно не влияла инокуляция почвы как нетоксикогенным штаммом К49, так и токсикогенным штаммом F3W4.

Таблица 3 Выделение изолятов A. flavus из кукурузы при различной инокуляционной обработке. Обработка A. flavus (log₁₀ KOE/r) Токсикогенные изоляты (%) Без инокуляции 5.5 be 69 а К49 пшеничный инокулянт 5.7 b 52 а F3W4 пшеничный инокулянт 5.7 b 71 а F3W4+К49 пшеничный инокулянт 5.6 bc 50 а F3W4 пшеничный инокулянт +К49 состав для распыления, включающий конидии 5.4 с 4 b F3W4 пшеничный инокулянт +К49 свободные конидии (не входящие в состав композиции) 6.3 а 6 b       M3PLSD(Pr>0.05 level) 0.2 42 Представлены средние величины по трем опытам. Величины с одинаковыми буквенными индексами не различаются существенно при уровне доверительной вероятности 95%.

По средним результатам подсчетов КОЕ и частоте регистрации двух фенотипов определили соотношения атоксикогенные:токсикогенные, составившее 24:1, 15:1 и 1:1 для распылительного раствора, содержащего композицию; распылительного раствора, не содержащего композиции и всех остальных способов обработки, соответственно. Проведенные ранее исследования показали, что колонизацию штаммом К49 кукурузных початков можно усилить инокуляцией почвы (Abbas et al. 2006, supra); тем не менее, этот результат не подтвердился в данном исследовании (Таблица 3). Возможное объяснение этих различий состоит в том, что в данном исследовании почвенный инокулят К49 применяли на стадии выметывания пестичных столбиков у 50% растений, в то время как в предыдущем исследовании инокулят применяли на стадии V6 онотогенеза. При исследованиях на хлопчатнике Cony (supra) выявлено, что 67% выделенных из коробочек хлопчатника A. flavus находились в той же группе вегетативной совместимости, что и нетоксикогенный штамм, введенный в виде почвенного инокулянта; по сравнению с 46% при введении распыляемого инокулянта; и 25% на необработанных контрольных участках. Это указывает на то, что при полевых испытаниях в штате Аризона при нанесении конидий распылением наблюдали меньшую степень внедрения биоконтролирующего штамма.

Низкий уровень выделения афлатоксикогенного A.flavus из кукурузы, прошедшей обработку распылением конидий К49, включенного или не включенного в композицию, указывает на очевидное внедрение, колонизацию и конкурентное замещение токсикогенного Aspergillus внедренным нетоксикогенным штаммом К49 при прямом его нанесении на репродуктивные структуры кукурузы.

ПРИМЕР 6

Определение афлатоксина и выделение Aspergillus

Концентрацию афлатоксина определяли количественно при помощи коммерческих наборов ELISA (Neogen Corp, Lansing MI) согласно Abbas et al. (2002, 2006, supra). Приготовили три параллельных навески измельченного зерна (20 г); каждую экстрагировали 100 мл метанола (70%) в течение 30 мин на высокоскоростном встряхивателе с возвратно-поступательным движением, очистили центрифугированием (10 мин, 8000×g) и проанализировали метанольные экстракты при помощи ELISA. Предел обнаружения афлатоксина в данном исследовании составил 5 нг/г суммарного афлатоксина.

В этих полевых испытаниях наблюдали сравнительно высокий уровень загрязнения афлатоксином, вызванный естественным заражением на контрольных необработанных участках и на контрольных участках, где почва была инокулирована зернами пшеницы, зараженной афлатоксикогенным F3W4. Соответственно, содержание афлатоксина составило 428 и 635 мкг/кг с большим разбросом результатов по образцам для этих двух контрольных участков (Таблица 4). Тем не менее, там, где инокуляцию почвы атоксикогенным К49 проводили внесением зараженных зерен на участки, которые либо не были обработаны, либо одновременно обработаны почвенным инокулятом F3W4, содержание афлатоксина существенно снизилось (Р<0.05) до 44 и 223 мкг/кг, соответственно. Здесь внесение в почву К49 с F3W4 привело к существенному снижению среднего уровня содержания афлатоксина (~400 мкг/кг) в кукурузе по сравнению с уровнем его содержания в кукурузе, инокулированной одним только F3W4. Тем не менее, уровень содержания афлатоксина в кукурузе, инокулированной зараженным штаммами К49 с F3W4 зерном, существенно не отличался от аналогичного уровня в кукурузе с необработанных контрольных участков.

Таблица 4 Содержание афлатоксина в кукурузе, обработанной с применением различных способов инокуляции Обработка Концентрация афлатоксина (мкг/кг) Без инокулянта 428 ab К49 инокулянт (пшеница) 44 с F3W4 инокулянт (пшеница) 635 а F3W4+К49 инокулянт (пшеница) 223 be F3W4 инокулянт (пшеница) +К49 распыленный состав 18 с F3W4 инокулянт (пшеница) +К49 свободные конидии (не входящие в состав композиции) 21 с   МЗР (LSD) (Pr>0.05 level) 287 Представлены средние величины по трем опытам, величины с одинаковыми буквенными индексами не различаются существенно при уровне доверительной вероятности 95%.

В предыдущих исследованиях, где К49 вносили в почву, загрязнение кукурузы афлатоксином снизилось на 58-76% по сравнению с необработанными участками, на которых в изобилии присутствовал природный афлатоксин (Abbas et al. 2006, supra). При инокуляции почвы афлатоксикогенным изолятом F3W4, одновременная инокуляция штаммом К49 на пшенице позволяла снизить загрязнение на 74-95% по сравнению с концентрациями афлатоксина на участках, где почву инокулировали одним лишь F3W4. В других исследованиях содержание афлатоксина снизилось на 66 и 87% в течение двух лет последовательно на кукурузных участках, обработанных одинаковыми смесями риса, колонизированного двумя различными неафлатоксикогенными видами Aspergillus, по сравнению с содержанием афлатоксина на необработанных участках (Domer et al. 1999, supra). Процентное снижение содержания афлатоксина составило 90 и 65%; наши результаты согласуются с результатами ранее проведенных исследований. В то время как внесение в почву К49 привело к существенному снижению загрязнения афлатоксином, концентрации афлатоксина все еще превышали предельные нормы в продукции, предназначенной для применения в качестве продовольственного сырья или кормов для животных.

Обработка кукурузы распылением суспензией конидий К49, включенных или не включенных в композицию, на участках, где почва была инфицирована афлатоксикогенным F3W4, привела к снижению средней концентрации афлатоксина на ~615 мкг/кг. В частности, прямое нанесение конидий К49, включенных или не включенных в композицию, на репродуктивные структуры кукурузы, выращиваемой на участках с внесенным в почву F3W4, существенно (Р<0.05) снижало уровень содержания афлатоксина до 18 и 21 мкг/кг, соответственно, по сравнению с уровнем содержания афлатоксина 635 мкг/кг, обнаруженным на контрольном участке, где в почву внесли только F3W4. Таким образом, снижение средней концентрации афлатоксина более чем на 97% связывали с инокуляцией распылением К49, против 65% снижения при непрямой инокуляции внесением в почву К49. В опыте с хлопчатником внесение зерен снизило загрязнение афлатоксином на 75%, в то же время при нанесении неафлатоксикогенного штамма распылением на репродуктивные ткани не было отмечено никакого эффекта (Cotty, supra). Однако упомянутые исследования на хлопчатнике проводили в штате Аризона, где факторы окружающей среды (низкая относительная влажность и высокие температуры) могли затруднить приживаемость инокулянта при воздушном распылении.

Из-за анатомических различий между кукурузой и хлопчатником или арахисом, инокуляция почвы может оказаться не самой эффективной стратегией биоконтроля для кукурузы. Несмотря на широкое применение и явную эффективность твердых инокулянтов при выращивании хлопчатника и арахиса, данную стратегию регулирования содержания афлатоксина в кукурузе не приняли в коммерческих масштабах. Разницу результатов эксперимента при обработке почвы и распылении можно объяснить различием способа применения. Плодоносящие структуры арахиса расположены под поверхностью почвы, следовательно, внесение инокулянта в почву направлено на область заражения. Кроме того, репродуктивные структуры хлопчатника распределены от третьего до двенадцатого узла и находятся сравнительно близко к поверхности почвы. Напротив, кукуруза является быстрорастущим растением, сравнительно высокие экземпляры, продуцируют чувствительные репродуктивные структуры, находящиеся на высоте более двух метров от поверхности почвы. Для колонизации и последующего замещения природных афлатоксикогенных штаммов на кукурузе, возможно, требуется высокий уровень содержания инокулята с соответствующим универсальным механизмом переноса вносимых в почву агентов биоконтроля для внедрения и приживаемости на участках-мишенях, доступных для воздушного распыления, т.е., на кукурузных початках. В то же время, в случае прямого распыления, данное условие перестает быть необходимым, как показывает данное исследование. Еще одним преимуществом прямого распыления состава, содержащего К49, является коммерческое преимущество - наличие готового доступного стабильного состава, содержащего жизнеспособные конидии К49.

Все публикации и патенты, упомянутые в данной заявке, включены в заявку посредством ссылки, что равносильно включению каждой отдельной публикации и патента отдельно и индивидуально посредством ссылки.

Вышеизложенное описание и отдельные репрезентативные примеры реализации и детали настоящего изобретения представлены для иллюстрации и описания изобретения. Они не являются исчерпывающими и не ограничивают настоящего изобретения описанными формами. Для специалистов в данной области очевидно, что в рамках настоящего изобретения возможны модификации и вариации.

Изобретение относится к вододиспергируемому гранулированному составу, предназначенному для биоконтроля, способу его получения и способу снижения загрязнения продовольствия и кормов афлатоксином с использованием указанного состава. Состав содержит агент, предназначенный для биоконтроля, для снижения уровня загрязнения продовольствия и кормов афлатоксином, связующий агент, агент, обладающий осмопротекторными и адгезивными свойствами, носитель и источник питательных элементов для агента, предназначенного для биоконтроля. Изобретение обеспечивает снижение уровня загрязнения продовольствия и кормов афлатоксином в сырье более чем на 97%. 3 н. и 26 з.п. ф-лы, 4 табл., 6 пр.

1. Вододиспергируемый гранулированный состав, предназначенный для биоконтроля, содержащий: (1) агент, предназначенный для биоконтроля, для снижения уровня загрязнения продовольствия и кормов афлатоксином; (2) связующий агент; (3) агент, обладающий осмопротекторными и адгезивными свойствами; (4) носитель и (5) источник питательных элементов для агента, предназначенного для биоконтроля, в котором агент, предназначенный для биоконтроля, присутствует в виде суспензии, при этом содержание агента, обладающего осмопротекторными и адгезивными свойствами, составляет приблизительно 5-20% сухой массы всего состава, при этом указанные агенты и источник питательных элементов присутствуют в указанном составе в виде смеси, и при этом указанный агент, предназначенный для биоконтроля, включен в указанную смесь и при диспергировании в воде высвобождается с возможностью осуществления своей функции.

2. Состав по п.1, где указанный агент, предназначенный для биоконтроля, представляет собой эффективное количество препарата конидий нетоксикогенного или неафлатоксикогенного штамма Aspergillus.

3. Состав по п.2, где указанный штамм Aspergillus выбран из группы, содержащей: Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus sojae, и их смеси.

4. Состав по п.3, где указанный нетоксикогенный штамм Aspergillus представляет собой штамм К49 Aspergillus flavus.

5. Состав по п.1, где указанный связующий агент представляет собой натрий карбоксиметилцеллюлозу.

6. Состав по п.5, где указанный состав содержит приблизительно 0,4% натрий карбоксиметилцеллюлозы.

7. Состав по п.1, где указанный, агент, обладающий осмопротекторными и адгезивными свойствами, представляет собой трегалозу.

8. Состав по п.7, где указанный состав содержит приблизительно 20% трегалозы.

9. Состав по п.1, где указанный носитель представляет собой глину с размером частиц, сравнимым с размерами конидий, достаточно малым для того, чтобы не вызвать засорения системы распыления.

10. Состав по п.9, где указанный носитель представляет собой кремнеземную глину или смесь глин.

11. Состав по п.10, где указанная кремнеземная глина или смесь глин представляет собой кальцинированный каолин, бентонит, каолинит или смектит.

12. Состав по п.11, где указанный носитель представляет собой кальцинированную каолиновую глину.

13. Состав по п.12, где указанный состав содержит приблизительно 75-90% кальцинированной каолиновой глины.

14. Состав по п.11, где указанный смектит представляет собой монтмориллонит или бейделлит.

15. Состав по п.1, где указанный источник питательных элементов представляет собой трегалозу.

16. Состав по п.1, где указанный состав представляет собой дисперсию, пригодную для распыления, способную оставаться в виде суспензии при минимальном взбалтывании/перемешивании.

17. Состав по п.16, где указанная дисперсия, пригодная для распыления, является водным раствором.

18. Способ приготовления вододиспергируемого гранулированного состава, предназначенного для биоконтроля, включающего агент, предназначенный для биоконтроля, по п.1, включающий стадии:
(a) смешивание сухих ингредиентов, включая натрий карбоксиметилцеллюлозу, трегалозу и кремнеземную глину или смесь глин до визуально гомогенного состояния;
(b) суспендирование эффективного количества конидий Aspergillus нетоксикогенных или неафлатоксикогенных, в пептонном растворе, содержащем трегалозу или другие известные осмопротекторы/питательные вещества, для приготовления раствора, содержащего конидии; и
(c) смешивание сухих ингредиентов с раствором, содержащим конидии, для приготовления вододиспергируемого гранулированного состава, предназначенного для биоконтроля, кремнеземная глина или смесь глин представляет носитель и
(d) вакуумная сушка,
где натрий карбоксиметилцеллюлоза представляет собой связующий агент, трегалоза представляет собой агент, обладающий осмопротекторными и адгезивными свойствами, источник питательных элементов и связующий агент, кремнеземная глина или смесь глин представляет собой носитель и нетоксигенные или неафлатоксигенные конидии Aspergillus представляют собой агент, предназначенный для биоконтроля.

19. Способ приготовления вододиспергируемого гранулированного состава, предназначенного для биоконтроля, включающего агент, предназначенный для биоконтроля, по п.18, где кремнеземная глина или смесь глин включает кальцинированный каолин, бентонит, каолинит или смектит.

20. Способ приготовления вододиспергируемого гранулированного состава, предназначенного для биоконтроля, включающего агент, предназначенный для биоконтроля, по п.18, где кремнеземная глина или смесь глин представляет собой кальцинированную каолиновую глину.

21. Способ приготовления вододиспергируемого гранулированного состава, предназначенного для биоконтроля, включающего агент, предназначенный для биоконтроля, по п.18, где способом вакуумной сушки изготавливают гранулы.

22. Способ по п.21, где гранулы, изготовленные способом вакуумной сушки, повторно диспергируют в воде для получения состава, пригодного для распыления.

23. Способ по п.22, где гранулы, изготовленные способом вакуумной сушки, повторно диспергируют в воде для получения состава, пригодного для распыления, включающего 0,2-2,0% гранул (мас./об.).

24. Способ по п.18, где вододиспергируемый гранулированный состав, предназначенный для биоконтроля, представляет собой стабильный состав, сохраняющий количество колоний на уровне 10⁸-10⁹ КОЕ/г после длительного периода хранения.

25. Способ по п.18, где вододиспергируемый гранулированный состав, предназначенный для биоконтроля, представляет собой стабильный состав, включающий агент биоконтроля, сохраняющий его фенотип и способность к активной колонизации зерна после длительного периода хранения.

26. Способ снижения загрязнения афлатоксином продовольственного и кормового сырья, включающий обработку указанного сырья вододиспергирующим гранулированным составом, предназначенным для биоконтроля, включающим агент, предназначенный для биоконтроля, по п.1, приготовленным способом, включающим стадии:
(а) смешивание сухих ингредиентов, включая натрий карбоксиметилцеллюлозу, трегалозу и кремнеземную глину или смесь глин до визуально гомогенного состояния;
(b) суспендирование эффективного количества конидий Aspergillus нетоксикогенных или неафлатоксикогенных, в пептоном растворе, содержащем трегалозу, для приготовления раствора, содержащего конидии; и
(c) смешивание указанных сухих ингредиентов с раствором, содержащим конидии, для приготовления вододиспергируемого гранулированного состава, предназначенного для биоконтроля,
(d) вакуумная сушку,
где натрий карбоксиметилцеллюлоза представляет собой связующий агент, трегалоза представляет собой агент, обладающий осмопротекторными и адгезивными свойствами, источник питательных элементов и связующий агент, кремнеземная глина или смесь глин представляет собой носитель и нетоксигенные или неафлатоксигенные конидии Aspergillus представляют собой агент, предназначенный для биоконтроля.

27. Способ снижения загрязнения афлатоксином продовольственного и кормового сырья по п.26, где кремнеземная глина или смесь глин включает кальцинированный каолин, бентонит, каолинит или смектит.

28. Способ снижения уровня загрязнения афлатоксином продовольственного и кормового сырья по п.27, где кремнеземная глина или смесь глин представляет собой кальцинированную каолиновую глину.

29. Способ по любому из пп.26-28, где указанное сырье выбрано из группы, включающей: арахис, кукурузу, семена хлопчатника, зерна хлебных культур, маслины и лесные орехи.