МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ УВЕЛИЧЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА КОРНЕВЫХ КЛУБЕНЬКОВ И ПОВЫШЕНИЯ АКТИВНОСТИ НИТРОГЕНАЗЫ КОРНЕВЫХ КЛУБЕНЬКОВ У БОБОВЫХ КУЛЬТУР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Настоящая заявка является продолжением заявки согласно РСТ № PCT/CN 2022/131941, поданной 15 ноября 2022 г., которая испрашивает преимущество приоритета по заявке на патент Китая № 202111344653.8, поданной 15 ноября 2021 г. Все содержание каждой из вышеупомянутых заявок на патенты включено в данный документ посредством ссылки и является частью настоящего изобретения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники

[0001] Настоящее изобретение принадлежит к области технической микробиологии, и в частности относится к микробиологическому средству для обеспечения увеличения количества корневых клубеньков и повышения активности нитрогеназы корневых клубеньков у бобовых культур и его применению.

Описание известного уровня техники

[0002] Корни бобовых культур, таких как разновидности арахиса, могут сосуществовать с ризобиями в почве с обеспечением нодуляции и фиксации азота. Когда корни разновидностей арахиса прорастают и растут, ризобии проникают через корневые трещины, стимулируя развитие клеток коры корня и постепенно формируя макроскопические корневые клубеньки на главных корнях и боковых корнях. Ризобии осуществляют колонизацию и размножаются в больших количествах в корневых клубеньках, образуют множество сферических бактероидов в определенный период и осуществляют биологическую фиксацию азота под действием нитрогеназы, превращая азот воздуха в азотное удобрение и обеспечивая азотным питанием бобовые культуры, что не только улучшает плодородие почвы, способствует высокой урожайности сельскохозяйственной культуры, но также обеспечивает снижение расхода химических удобрений и уменьшение загрязнения окружающей среды. Таким образом, биологическая фиксация азота играет важную роль в улучшении почвенного питания и решении задачи устойчивого развития сельского хозяйства и энергетики.

[0003] Однако чрезмерная зависимость от химически синтезированных удобрений, длительное чрезмерное или необоснованное их применение в практическом сельскохозяйственном производстве приводит к затвердеванию почвы, дефициту микроэлементов и дисбалансу питательных веществ в почве, что подавляет рост, размножение и нодуляцию ризобий и азотфиксирующих бактерий в почве, приводя к уменьшению количества корневых клубеньков и снижению эффективности биологической фиксации азота у бобовых культур, таких как разновидности арахиса. Кроме того, бобовые растения характеризуются высокой специфичностью в отношении симбиоза с ризобиями, количество эффективных ризобий во вновь засаженной почве часто невелико, а для полного проявления эффекта, состоящего в обеспечении фиксации азота, необходимо осуществлять искусственную инокуляцию высокоэффективными и элитными штаммами. Микробиологическое средство является экологически безопасным удобрением и может повышать плодородие почвы, способствовать размножению полезных микроорганизмов в почве, оптимизировать микроэкологическую среду, улучшать биологическую азотфиксирующую способность бобовых культур и обеспечивать повышение урожайности. Поэтому скрининг в отношении высокоэффективных азотфиксирующих микроорганизмов и применение удобрений на основе клубеньковых азотфиксирующих микроорганизмов всегда были горячими точками в области исследований биологической фиксации азота, и в последние годы область микробиологических удобрений быстро развивалась, а число их разновидностей продолжало увеличиваться. Однако из-за типов штаммов, способности к фиксации азота, технологии производства, количества живых бактерий и т. п. эффект микробиологического удобрения не очевиден. В настоящее время не существует продуктов, которые могут применяться в крупномасштабном производстве и оказывать значимые эффекты в отношении нодуляции и фиксации азота, в частности таких, которые способны индуцировать «супернодуляцию» у бобовых культур.

[0004] Таким образом, с учетом недостатков предшествующего уровня техники объектом настоящего изобретения является разработка и применение микробиологического средства, направленного на эффективное способствование увеличению количества корневых клубеньков у бобовых культур и улучшению эффекта, состоящего в обеспечении биологической фиксации азота. Микробиологическое средство по настоящему изобретению в основном разработано на основе 4 экзогенных и эндофитных штаммов - Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus laterosporu, Bacillus mucilaginosus и Enterobacter ludwigii (CN 105586300 B), выделенных из бобов и ризосферы арахиса в основных районах его производства в Китае, и обладает эффектами, состоящими в обеспечении значимого увеличения количества, веса и плотности расположения корневых клубеньков у бобовых культур, таких как разновидности арахиса, повышении активности нитрогеназы в корневых клубеньках, увеличении содержания хлорофилла в листьях, увеличении содержания азота в растениях и общей биомассы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] С учетом недостатков предшествующего уровня техники, техническая проблема, решаемая настоящим изобретением, заключается в получении микробиологического средства для обеспечения увеличения количества корневых клубеньков и повышения активности нитрогеназы корневых клубеньков бобовых культур и его применении для усиления эффективности нодуляции и фиксации азота у бобовых культур, таких как разновидности арахиса. Микробиологическое средство может эффективно способствовать увеличению количества корневых клубеньков с активностью нитрогеназы и повышению активности нитрогеназы корневых клубеньков, обеспечивать рост сельскохозяйственной культуры, улучшение урожайности сельскохозяйственной культуры и качества продукта.

[0006] Для решения вышеупомянутых технических проблем в настоящем изобретении представлены следующие технические решения:

[0007] представлено микробиологическое средство для обеспечения увеличения количества корневых клубеньков и повышения активности нитрогеназы корневых клубеньков у бобовых культур, составленное из 4 микроорганизмов, включая Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus laterosporu, Bacillus mucilaginosus Krassilnikov и Enterobacter ludwigii, путем раздельного ферментационного культивирования, концентрирования и смешивания.

[0008] При этом Bacillus amyloliquefaciens представляет собой штамм Bacillus amyloliquefaciens BA-HZ54 с номером доступа в CCTCC № M 20211295, который депонирован 20 октября 2021 г. в Китайском центре коллекции типовых культур (сокращенно CCTCC) Уханьского университета, Ухань, Китай.

[0009] Brevibacillus laterosporu представляет собой штамм Brevibacillus laterosporu BL-TS08 с номером доступа в CCTCC № M 20211296, который депонирован 20 октября 2021 г. в Китайском центре коллекции типовых культур (сокращенно CCTCC) Уханьского университета, Ухань, Китай.

[0010] Bacillus mucilaginosus Krassilnikov представляет собой штамм Bacillus mucilaginosus Krassilnikov BM-TS05 с номером доступа в CCTCC № M 20211297, который депонирован 20 октября 2021 г. в Китайском центре коллекции типовых культур (сокращенно CCTCC) Уханьского университета, Ухань, Китай.

[0011] При этом Enterobacter ludwigii представляет собой штамм Enterobacter ludwigii BG10-1 с номером доступа в CCTCC № M 2016014, который депонирован 7 января 2016 г. в Китайском центре коллекции типовых культур Уханьского университета (CN 201610155898.9).

[0012] Предпочтительно в микробиологическом средстве количество живых бактерий Bacillus amyloliquefaciens составляет 2×10⁹ КОЕ/г или больше, количество живых бактерий Brevibacillus laterosporu составляет 2×10⁹ КОЕ/г или больше, количество живых бактерий Bacillus mucilaginosus Krassilnikov составляет 1×10¹⁰ КОЕ/г или больше, и количество живых бактерий Enterobacter ludwigii составляет 1×10¹⁰ КОЕ/г или больше.

[0013] Вышеуказанные четыре штамма микроорганизмов выделены из бобов арахиса и ризосфер в основных районах производства арахиса в Китае.

[0014] Дополнительно микробиологическое средство в соответствии с настоящим изобретением представляет собой средство в виде гранулы, порошка или водного раствора, предпочтительно гранулы, содержащее живые бактерии в высокой концентрации.

[0015] Согласно вышеуказанному решению носитель гранулы включает гуминовую кислоту, тапиоковую муку и бентонитовое связующее вещество. Весовое соотношение гуминовой кислоты, тапиоковой муки и бентонитового связующего вещества составляет приблизительно 8,5:10:0,5, при этом при этом для получения носителя в виде гранул для последующего применения сырьевые материалы равномерно смешиваются, и гранулируются, и высушиваются в печи.

[0016] Согласно вышеуказанному решению микробиологическое средство по настоящему изобретению получают путем соединения концентрированных растворов бактериальных штаммов с носителем в форме частиц. В частности, концентрированные талломы, полученные центрифугированием ферментационных бульонов штаммов, растворяют в соответствующем количестве воды для равномерного распыления и адсорбции на носителе в форме частиц.

[0017] Представлено применение микробиологического средства для обеспечения увеличения количества корневых клубеньков с активностью нитрогеназы и повышения активности нитрогеназы корневых клубеньков у бобовых культур.

[0018] Согласно вышеуказанному решению конкретный способ применения включает применение микробиологического средства при норме внесения 2-4 кг/му на стадии посева или в период роста бобовых культур. В частности, микробиологическое средство может быть внесено отдельно или в смеси с основным удобрением, подлежащим искусственному внесению путем разбрасывания/внесения в лунки или механического распределения по почве.

[0019] Согласно вышеуказанному решению бобовые культуры включают без ограничения разновидности арахиса, разновидности сои, люцерну, астрагал китайский и т. п.

[0020] Согласно вышеуказанному решению применение дополнительно предусматривает индуцирование супернодуляции бобовых культур.

[0021] Полезные эффекты настоящего изобретения заключаются в следующем.

[0022] 1. Микробиологическое средство по настоящему изобретению может эффективно обеспечивать увеличение корневых клубеньков и усиление активности нитрогеназы в корневых клубеньках у бобовых культур, таких как разновидности арахиса, разновидности сои, люцерна и астрагал китайский, индуцировать супернодуляцию в корнях, значимо улучшать активность нитрогеназы и эффект биологической фиксации азота в корнях и повышать способность бобовых культур поставлять азотные питательные вещества, а также характеризуется обеспечением благоприятных эффектов, состоящих в способствовании росту культур, повышении содержания хлорофилла, содержания азота и накопления сухого вещества в растениях и в конечном итоге повышении урожайности и качества культур, обеспечивая значительные экономические выгоды.

[0023] 2. Микробиологическое средство по настоящему изобретению, которое можно применять отдельно или применять с удобрением на стадии посева, является простым и удобным в применении, характеризуется простой внесения и небольшой нормой внесения на му (всего 2-4 кг/му), что значительно снижает затраты и повышает эффективность.

[0024] 3. Микробиологическое средство по настоящему изобретению не только позволяет избежать загрязнения окружающей среды и энергетических потерь, вызванных чрезмерным внесением химических удобрений, но также способствует повышению плодородия почвы и улучшению экологической среды сельскохозяйственных угодий, характеризуется значительными экологическими преимуществами и имеет большое значение для сокращения применения удобрений, пиковых выбросов углекислого газа и углеродной нейтральности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0025] Фиг. 1: микробиологическое средство для обеспечения увеличения количества корневых клубеньков у бобовых культур.

[0026] Фиг. 2: сравнение корневых клубеньков разновидностей арахиса на контрольном участке и участке, обработанном микробиологическим средством.

[0027] Фиг. 3: сравнение силы роста контрольных растений арахиса и растений арахиса, обработанных микробиологическим средством.

[0028] Фиг. 4: сравнение активности нитрогеназы в корневых клубеньках контрольных растений арахиса и обработанных растений арахиса.

[0029] Фиг. 5: сравнение сырого веса контрольных растений арахиса и обработанных растений арахиса на квадратный метр.

[0030] Фиг. 6: сравнение сухого веса одного контрольного растения арахиса и одного обработанного растения арахиса.

[0031] Фиг. 7: сравнение количества и веса корневых клубеньков в одном контрольном растении арахиса и в одном обработанном растении арахиса.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0032] Пример 1. Способ получения микробиологического средства для обеспечения увеличения количества корневых клубеньков у бобовых культур

[0033] 1. Идентификация штаммов

[0034] Микробные штаммы, предусмотренные в настоящем изобретении, получали из бобов арахиса и ризосфер в Таншане, Хэбэй и Хэчжоу, Гуанси путем традиционного выделения и очистки бактерий и молекулярной идентификации последовательности 16S rDNA. При этом штамм Bacillus amyloliquefaciens BA-HZ54 с номером доступа в CCTCC № M 20211295, штамм Brevibacillus laterosporu BL-TS08 с номером доступа в CCTCC № M 20211296 и штамм Bacillus mucilaginosus Krassilnikov BM-TS05 с номером доступа в CCTCC № M 20211297 были депонированы 20 октября 2021 г. в Китайском центре коллекции типовых культур (сокращенно CCTCC) Уханьского университета. Enterobacter ludwigii был депонирован 7 января 2016 г. в Китайском центре коллекции типовых культур Уханьского университета (заявка на патент Китая № 201610155898.9) с номером доступа в CCTCC № M 2016014.

[0035] 2. Получение микробиологического средства

[0036] 1) Осуществление микробиологической ферментации. Активированные Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus laterosporu, Bacillus mucilaginosus Krassilnikov и Enterobacter ludwigii по отдельности инокулировали в жидкую среду (содержащую 3,5-4,0% кукурузной муки, 1,5-2,0% пептона, 0,4-0,5% K₂HPO₄+KH₂PO₄ (1:1) и 1 л воды, имеющую pH 7,0-7,2 и стерилизованную при 121°C в течение 20 мин) в асептических условиях и проводили культивирование со встряхиванием в конической колбе при 180 об/мин при 37°C в течение 24 ч. Затем культивированные штаммы по отдельности инокулировали в ферментационный резервуар объемом 300 л при норме инокуляции 1% для осуществления ферментации. Ферментационное культивирование проводили при температуре 30-37°C, рН 7,0-7,2 и скорости перемешивания 180-220 об./мин и ферментацию прекращали, когда количество бактерий достигало 1×10¹⁰ КОЕ/мл.

[0037] 2) Получение носителя в форме частиц для микробиологического средства. Носитель в форме частиц состоит из гуминовой кислоты, тапиоковой муки и бентонитового связующего вещества. Сырьевые материалы присутствовали в носителе в форме частиц в соотношении 8,5:10:0,5. Сырьевые материалы равномерно перемешивали, гранулировали с помощью гранулятора и высушивали в печи для последующего применения.

[0038] 3) Получение продукта, представляющего собой микробиологическое средство. Придерживаясь необходимого для получения 1 кг микробиологического удобрения соотношения ферментационных бульонов, предусматривающего 200 мл Bacillus amyloliquefaciens + 200 мл Brevibacillus laterosporu + 1 л Bacillus mucilaginosus Krassilnikov + 1 л Enterobacter ludwigii, бактерии, полученные центрифугированием ферментационных бульонов четырех штаммов, в указанных объемах растворяли в соответствующем количестве воды с получением смешанной бактериальной суспензии, которую затем распыляли на носитель в смесителе (массовое соотношение бактериальной суспензии и носителя составляло 1:10) и осуществляли высушивание при низкой температуре (≤60°C) с получением микробиологического средства (см. фиг. 1) и микробиологическое средство упаковывали с получением готового продукта, представляющего собой микробиологическое средство. Разработанное микробиологическое средство характеризуется количеством живых бактерий Bacillus amyloliquefaciens, составляющим 2×10⁹ КОЕ/г или больше, количеством живых бактерий Brevibacillus laterosporu, составляющим 2×10⁹ КОЕ/г или больше, количеством живых бактерий Bacillus mucilaginosus Krassilnikov, составляющим 1×10¹⁰ КОЕ/г или больше, и количеством живых бактерий Enterobacter ludwigii, составляющим 1×10¹⁰ КОЕ/г или больше.

[0039] Пример 2. Эффект применения микробиологического средства в отношении способствования увеличению количества корневых клубеньков у бобовых культур, таких как разновидности арахиса

[0040] 1. Схема полевых испытаний

[0041] Полевое показательное применение продукта, представляющего собой микробиологическое средство, осуществляли в основных районах производства бобовых культур, таких как разновидности арахиса, в Чжэнъяне, Хэнани, Таншане, Хэбэе, Фусине, Ляонине, Сянъяне, Хубэе и т. п. Китая, при этом используемая для испытания площадь составляла 50 му на каждом опытном участке, были предусмотрены контрольная группа и группа обработки и между группой обработки и контрольной группой была предусмотрена изоляционная зона.

[0042] Контрольная группа: площадь составляла 25 му, разновидность представляла собой местную основную разновидность, использовали местный традиционный метод посева и традиционные полевые работы, такие как прополка, контроль вредителей и контроль интенсивности роста.

[0043] Группа обработки: площадь, разновидность, метод посева и техника полевых работ были такими же, как и в контрольной группе, и, исходя из этого, продукт, представляющий собой микробиологическое средство, равномерно смешивали с основным удобрением при норме внесения 2 кг/му с обеспечением равномерного распределения по почве с удобрением механическим или ручным способом на стадии посева арахиса.

[0044] 2. Исследование и определение нодуляции

[0045] По сравнению с контрольной группой, группа обработки имеет следующие преимущества: (1) разновидности арахиса характеризуются наличием развитых корневых систем, стабильной силой роста и отсутствием преждевременного увядания; (2) количество корневых клубеньков значительно увеличилось - в 50 раз или больше; состояния корневых систем и нодуляции исследовали перед сбором урожая арахиса и определяли количество, вес и плотность расположения корневых клубеньков (по меньшей мере 5 образцов растений для каждой контрольной группы и группы обработки на разных опытных участках). Результаты показаны на фиг. 2 и фиг. 7: по сравнению с контрольной группой растения арахиса характеризовались наличием более развитых корневых систем и более стабильной силой роста; обработка микробиологическим средством значительно способствовала увеличению количества корневых клубеньков на каждом опытном участке, в контрольной группе корневые клубеньки арахиса были редкими, а в группе обработки корневые клубеньки арахиса были многочисленными и плотно расположенными; и количество и вес корневых клубеньков на растение значительно увеличились, в 50 раз или больше, после обработки микробиологическим средством. Приведенные выше результаты показывают, что количество, вес и плотность расположения корневых клубеньков значительно увеличиваются в группе обработки микробиологическим средством по сравнению с контрольной группой, и микробиологическое средство по настоящему изобретению может эффективно способствовать нодуляции и фиксации азота в корневых системах бобовых культур, таких как разновидности арахиса.

[0046] Пример 3. Эффект применения микробиологического средства в отношении повышения активности нитрогеназы в корневых клубеньках бобовых культур, таких как разновидности арахиса

[0047] Схема полевых испытаний была такой же, как и в примере 2.

[0048] Активность нитрогеназы отражает силу азотфиксирующей способности корневых клубеньков, и для дополнительного выяснения того, обладают ли корневые клубеньки растений арахиса, обработанных микробиологическим средством, активностью нитрогеназы, определяли активность нитрогеназы в корневых клубеньках в контрольной группе и группе обработки с помощью метода восстановления ацетилена, который является общепризнанным специалистами в данной области техники, и конкретные стадии были следующими.

[0049] 1) Настройка параметров газовой хроматографии. Пиковые значения этилена и ацетилена определяли методом водородного пламенно-ионизационного выявления (FID) в соответствии с настоящим изобретением. Стадии процесса подробно описаны в инструкции к прибору. Рабочие параметры газового хроматографа китайского производства серии GC-4000 были следующими: температура испарительной камеры: 120°C; температура хроматографической камеры: 60°C; водородное пламя: 130°C; давление в колонке: приблизительно 0,1 МПа; давление воздуха: приблизительно 0,2 МПа; давление водорода: приблизительно 0,05 МПа; давление газа-носителя (N₂): приблизительно 0,3 МПа; затухание: 1× или 2×, и колонка: GDX-502.

[0050] При выявлении 50-100 мкл образца газа отбирали с помощью микродозатора, и время удерживания этилена в хроматографической колонке составляло 1,5-2,5 мин.

[0051] 2) Выявление активности нитрогеназы в корневых клубеньках. Соответствующее количество корневых клубеньков помещали во флакон, горлышко флакона закрывали резиновой пробкой, и для каждой экспериментальной обработки было предусмотрено 5 или больше повторностей. С помощью шприца из флакона извлекали 1/10 объема воздуха, создавая отрицательное давление внутри флакона, и вводили 1/10 объема газообразного ацетилена в качестве субстрата для нитрогеназы. Для протекания реакции флакон помещали в условия с температурой 28°C на 2 ч, а затем флакон извлекали для осуществления выявления.

[0052] 3) Построение стандартной кривой для этилена. В 6 стеклянных флаконов одинакового объема с использованием микродозатора по отдельности добавили определенный объем газообразного этилена для определения значений пиков этилена. Выбор градиента объема этилена зависит от способности образцов корневых клубеньков к восстановлению этилена. Принцип заключается в том, чтобы диапазон значений площади пиков на стандартной кривой охватывал значения площади пиков всех исследуемых образцов при измерении исследуемых образцов и образцов стандартной кривой при одинаковых условиях хроматографирования.

[0053] Объем этилена = K × площадь пика.

[0054] K представляет собой коэффициент отклика, который может быть рассчитан посредством линейной регрессии на основании значений объема этилена и соответствующих значений площади пиков на стандартной кривой.

[0055] 4) Расчет активности фермента.

[0056] Активность нитрогеназы представляет собой число молей ацетилена, которое восстанавливается корневыми клубеньками в единицу времени на единицу веса:

[0057] Активность нитрогеназы = число молей ацетилена/сырой вес клубеньков × время реакции.

[0058] Согласно зависимости между числом молей газа и его объемом, температурой и давлением число молей можно получить из объема этилена:

[0059] где: t°C - температура воздуха по Цельсию; P - давление газа, обычно принимаемое за 760 мм рт.ст.;

[0060] 22,4 - объем 1 моля газа в стандартном состоянии составляет 22,4 л; 273 - абсолютная температура.

[0061] Результаты показали, что обработка микробиологическим средством эффективно обеспечивала нодуляцию в корнях арахиса, и все эти корневые клубеньки обладали активностью нитрогеназы, а активность нитрогеназы на грамм корневых клубеньков и активность нитрогеназы в корнях на растение значительно повышались после обработки микробиологическим средством (фиг. 4). Диапазон активности нитрогеназы на грамм корневых клубеньков контрольных растений арахиса составлял 0,027-0,68 мкмоль/г⋅час при среднем значении 0,36 мкмоль/г⋅час, а диапазон активности нитрогеназы на грамм корневых клубеньков растений арахиса в группе обработки составлял 1,19-2,98 мкмоль/г⋅час при среднем значении 2,07 мкмоль/г⋅час. Активность нитрогеназы на грамм корневых клубеньков растений арахиса в группе обработки являлась повышенной в 5 раз или больше по сравнению с контрольной группой. Диапазон активности нитрогеназы в корнях на контрольное растение арахиса составлял 0,020-0,33 мкмоль/растение⋅ч при среднем значении 0,18 мкмоль/растение⋅ч, а диапазон активности нитрогеназы в корнях на растение арахиса в группе обработки составлял 4,51-10,60 мкмоль/растение⋅ч при среднем значении 7,10 мкмоль/растение⋅ч. Активность нитрогеназы в корнях на растение арахиса в группе обработки была увеличена в 40 раз.

[0062] Результаты показывают, что микробиологическое средство по настоящему изобретению может обеспечивать значительное повышение активности нитрогеназы в корневых клубеньках бобовых культур, таких как разновидности арахиса, и повышение биологической азотфиксирующей способности и эффективности фиксации азота корневых клубеньков, и имеет важное практическое значение для обеспечения азотными питательными веществами бобовых культур, таких как разновидности арахиса, сокращения применения удобрений в сельскохозяйственных угодьях, пиковых выбросов углекислого газа и углеродной нейтральности и т. п.

[0063] Пример 4. Применение микробиологического средства для увеличения содержания хлорофилла в бобовых культурах, таких как разновидности арахиса

[0064] Схема полевых испытаний была такой же, как и в примере 2.

[0065] В период роста растений арахиса исследовали силу роста и состояние листьев растений и обнаружили, что по сравнению с контрольным участком сила роста растений арахиса была выше, а листья были более зелеными на участке, обработанном микробиологическим средством (фиг. 3). Листья арахиса собирали в период роста арахиса и содержание хлорофилла в листьях из таких опытных участков, как Хэнань, Цзилинь, Хубэй, Хунань и Сычуань, определяли с помощью спектрофотометрии (на каждом опытном участке случайным образом отбирали по 3 образца и каждый образец получали путем смешивания по меньшей мере 5 листьев из отдельного растения). Стадии обработки образцов и способы выявления, в частности, приведены в «Rapeseed - Determination of chlorophyll content - Spectrometric method» в национальном стандарте GB/T 22182-2008.

[0066] Результаты сравнения содержания хлорофилла после обработки микробиологическим средством приведены в таблице 1. Содержание хлорофилла в листьях арахиса в контрольной группе составляло 447,49-498,16 мг/кг при среднем значении 471,57 мг/кг, а содержание хлорофилла в листьях арахиса после обработки микробиологическим средством по настоящему изобретению составляло 492,70-531,39 мг/кг при среднем значении 511,54 мг/кг. Обработка микробиологическим средством значительно повысила содержание хлорофилла в листьях арахиса, которое увеличилось на 5,45%-13,39% по сравнению с контрольной группой при среднем увеличении на 8,48%.

[0067] Результаты показывают, что микробиологическое средство по настоящему изобретению обладает эффектами, состоящими в улучшении азотного питания культур, увеличении содержания хлорофилла и содержания азота в листьях с увеличением тем самым содержания белка и улучшением питательного качества культур.

[0068]

Таблица 1. Сравнение содержания хлорофилла после обработки микробиологическим средством

[0069] Пример 5. Применение микробиологического средства для увеличения биомассы и накопления сухого вещества у бобовых культур, таких как разновидности арахиса

[0070] Схема полевых испытаний была такой же, как и в примере 2.

[0071] Исследовали и взвешивали сырой вес надземных частей растения, сырой вес бобов арахиса и сухой вес растений арахиса на квадратный метр (для контроля и обработки случайным образом выбирали по 3 точки на каждом опытном участке, при этом на каждую точку приходилось 2 квадратных метра для отбора образцов и определения) и отдельные растения (для контроля и обработки случайным образом выбирали по 10 или больше растений на каждом опытном участке) в период сбора урожая.

[0072] Результаты определения сырого веса надземных частей и сырого веса подземных частей растений арахиса на квадратный метр на участках показательного применения в основных районах производства арахиса, таких как Ляонин, Цзилинь, Хэнань, Цзянсу и Хубэй, показаны на фиг. 5: на каждом опытном участке диапазон значений сырого веса надземных частей растений арахиса на квадратный метр на контрольном участке составлял 0,1-2,67 кг при среднем значении 1,42 кг, а диапазон значений сырого веса надземных частей растений арахиса на квадратный метр на участке обработки составлял 0,2-3,54 кг при среднем значении 2,15 кг, что было в 1,5 раза больше, чем на контрольном участке; и на каждом опытном участке диапазон значений сырого веса бобов арахиса на квадратный метр на контрольном участке составлял 0,6-1,01 кг при среднем значении 0,86 кг/м², а диапазон значений сырого веса бобов арахиса на квадратный метр на участке обработки составлял 0,8-1,28 кг при среднем значении 1,03 кг, что было в 1,2 раза больше, чем на контрольном участке.

[0073] Определяли сухой вес надземных частей растения на растение арахиса, и результаты показаны на фиг. 6: сухой вес надземных частей растения на растение арахиса на контрольном участке составлял 15,9-40,9 г при среднем значении 26,8 г, а сухой вес надземных частей растения на растение арахиса на участке обработки микробиологическим средством составлял 28,6-41,8 г при среднем значении 34,1 г, и сухой вес на растение на участке обработки был увеличен на 27,2% по сравнению с контрольным участком.

[0074] Результаты показывают, что обработка микробиологическим средством оказывает эффект, состоящий в увеличении надземной и подземной биомассы и накоплении сухого вещества у бобовых культур, таких как разновидности арахиса, с обеспечением таким образом повышения урожайности и качества сельскохозяйственной культуры.

[0075] Микробиологическое средство, разработанное путем смешивания Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus laterosporu, Bacillus mucilaginosus Krassilnikov и Enterobacter ludwigii, в соответствии с настоящим изобретением может эффективно обеспечивать увеличение количества корневых клубеньков у бобовых культур, таких как разновидности арахиса, повышение активности нитрогеназы и эффективности биологической фиксации азота корневыми клубеньками, способствовать росту сельскохозяйственной культуры, обеспечивать увеличение содержания хлорофилла в листьях и сырого веса надземных частей и подземных частей растения, способствовать накоплению сухого вещества и обеспечивать улучшение урожайности и качества сельскохозяйственной культуры, и характеризуется очевидными экономическими и экологическими преимуществами, имеет широкие перспективы применения на бобовых культурах, таких как разновидности арахиса, разновидности сои, люцерна и астрагал китайский, и имеет большое значение для сокращения применения удобрений на сельскохозяйственных угодьях, пиковых выбросов углекислого газа, углеродной нейтральности и развития высокого качества в сельскохозяйственной отрасли.

Настоящее изобретение принадлежит к области технической микробиологии и, в частности, относится к микробиологическому средству для обеспечения увеличения количества корневых клубеньков и повышения активности нитрогеназы корневых клубеньков у бобовых культур и его применению. Микробиологическое средство составлено из 4 микроорганизмов, включая Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus laterosporu, Bacillus mucilaginosus Krassilnikov и Enterobacter ludwigii, путем раздельного ферментационного культивирования, концентрирования и смешивания. Микробиологическое средство может эффективно способствовать увеличению количества корневых клубеньков и повышению активности нитрогеназы корневых клубеньков, обеспечивать рост сельскохозяйственной культуры, улучшение урожайности сельскохозяйственной культуры и качества продукта. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.

1. Микробиологическое средство для способствования увеличению количества корневых клубеньков и повышению активности нитрогеназы корневых клубеньков у бобовых культур, составленное из 4 микроорганизмов, включая Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus laterosporu, Bacillus mucilaginosus Krassilnikov и Enterobacter ludwigii, путем раздельного ферментационного культивирования, концентрирования и смешивания, при этом Bacillus amyloliquefaciens представляет собой штамм Bacillus amyloliquefaciens BA-HZ54 с номером доступа в CCTCC № M 20211295; Brevibacillus laterosporu представляет собой штамм Brevibacillus laterosporu BL-TS08 с номером доступа в CCTCC № M 20211296; Bacillus mucilaginosus Krassilnikov представляет собой штамм Bacillus mucilaginosus Krassilnikov BM-TS05 с номером доступа в CCTCC № M 20211297; и Enterobacter ludwigii представляет собой штамм Enterobacter ludwigii BG10-1 с номером доступа в CCTCC № M 2016014; при этом микробиологическое средство характеризуется количеством живых бактерий Bacillus amyloliquefaciens, составляющим 2×10⁹ КОЕ/г, количеством живых бактерий Brevibacillus laterosporu, составляющим 2×10⁹ КОЕ/г, количеством живых бактерий Bacillus mucilaginosus Krassilnikov, составляющим 1×10¹⁰ КОЕ/г, и количеством живых бактерий Enterobacter ludwigii, составляющим 1×10¹⁰ КОЕ/г.

2. Микробиологическое средство по п. 1, где микробиологическое средство представляет собой средство в виде гранулы, порошка или водного раствора, содержащее живые бактерии.

3. Микробиологическое средство по п. 2, где носитель гранулы содержит гуминовую кислоту, тапиоковую муку и бентонитовое связующее вещество при весовом соотношении 8,5:10:0,5, и при этом для получения носителя в форме частиц для последующего применения сырьевые материалы равномерно смешиваются, гранулируются и высушиваются в печи.

4. Микробиологическое средство по п. 3, где микробиологическое средство представляет собой гранулу, полученную путем составления концентрированных растворов бактериальных штаммов с носителем гранулы.

5. Применение микробиологического средства по п. 1 в способствовании повышению количества корневых клубеньков и активности нитрогеназы в корневых клубеньках у бобовых культур.

6. Применение по п. 5, где конкретный способ применения включает применение микробиологического средства при норме внесения 2-4 кг/му на стадии посева или в период роста бобовых культур.

7. Применение по п. 5, где бобовые культуры включают без ограничения разновидности арахиса, разновидности сои, люцерну и астрагал китайский.

8. Применение по п. 5, дополнительно предусматривающее индуцирование супернодуляции у бобовых культур.