ШТАММ MYROIDES ODORATIMIMUS ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОЙ ДЕГРАДАЦИИ АФЛАТОКСИНА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2022 года по МПК C12N1/20 A23L5/20 C12R1/01 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники

[001] Настоящее изобретение относится к области микроорганизмов и, в частности, относится к штамму Myroides odoratimimus для биологического контроля для эффективной деградации афлатоксина и его применению.

Описание известного уровня техники

[002] Aspergillus flavus представляет собой патогенный гриб, который может продуцировать тип в высокой степени канцерогенного и высокотоксичного грибного токсина, афлатоксина, включающего семейства B, G и M, где B1 является наиболее распространенным и наиболее токсичным. Афлатоксин может повсеместно загрязнять пищевые культуры, такие как виды арахиса, кукуруза и т. д., и серьезно угрожать здоровью людей и домашнего скота, что приводит к значительным экономическим потерям. Следовательно, необходимо срочно усовершенствовать обработку от загрязнения Aspergillus flavus и токсинами.

[003] Традиционные способы удаления афлатоксина B1 (AFB1) в основном включают адсорбцию, экстракцию, термическую обработку, радиационную обработку, кислотно-щелочную обработку и окислительно-восстановительную обработку, которые иногда затратны по времени и усилиям, имеют низкую скорость детоксикации и могут легко вызвать потерю питательных веществ. Однако биологический способ имеет преимущества в отношении безопасности, высокой эффективности и долгосрочности. Следовательно, для сельскохозяйственной промышленности и экономических выгод Китая очень важно увеличить количество исследований в области биологической обработки от афлатоксина.

[004] Бактериальная и метаболическая биодеградация афлатоксина не являются широко известными. Stenotrophomonas maltophilia, проверенный с применением куморовой среды, как проведено Guan Shu, Li Junxia et al., способен к деградации афлатоксина со скоростью деградации 82,5%. Wang Ning et al. изучили оранжево-красный штамм Myxococcus из фекалий серых тонкотелых обезьян и обнаружили, что скорость деградации AFB1 составляет 78,2% при оптимальных условиях культивирования. В существующем уровне техники не было сообщений о применении Myroides odoratimimus для деградации афлатоксина.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

[005] Техническая проблема, решаемая с помощью настоящего изобретения, заключается в предоставлении штамма 3J2MO Myroides odoratimimus для биологического контроля для эффективной деградации афлатоксина и его применении ввиду недостатков существующего уровня техники. Штамм 3J2MO Myroides odoratimimus для биологического контроля по настоящему изобретению способен в значительной степени к деградации афлатоксина.

[006] С целью решения вышеупомянутой технической проблемы, техническое решение, принятое согласно настоящему изобретению, заключается в описанном ниже.

[007] Штамм 3J2MO Myroides odoratimimus для биологического контроля был депонирован в Китайском центре коллекции типовых культур (называемом CCTCC) 13 июня 2017 года с адресом депонирования: Уханьский университет, Ухань, Китай и под номером депонирования в CCTCC № M 2017329.

[008] По настоящему изобретению 100 мкл почвы после градиентного разбавления, собранной с арахисового поля в Хуангпи, Хубэй, размазывают по твердой культуральной среде лизогенного бульона (LB) для культивирования. Выращенные бактерии отбирают с помощью инокуляционной петли и переносят в свежую твердую культуральную среду LB для посева в чашку штрихами. После нескольких пересадок отбирают одну колонию. Штамм 3J2MO, характеризующийся значительным эффектом деградации в отношении афлатоксина, подвергают скринингу в эксперименте по деградации афлатоксина и депонируют в Китайском центре коллекции типовых культур (называемом CCTCC) с адресом депонирования: Уханьский университет, Ухань, Китай и под номером депонирования в CCTCC № M 2017329. Тип штамма идентифицируют с применением специфической в отношении 16S rDNA технологии амплификации в сочетании с морфологическими характеристиками и физиологическими и биохимическими экспериментами. Из результата видно, что штамм представляет собой штамм Myroides odoratimimus, принадлежащий к Актиномицетам, род Brevibacterium.

Таблица 1. Главные биологические характеристики Myroides odoratimimus 3J2MO

[009] Предоставлен препарат для деградации афлатоксина, который включает фермент Myroides odoratimimus 3J2MO.

[0010] В соответствии с решением, полученная форма препарата представляет собой жидкость, распыляемый порошок, сухой смачиваемый порошок или сухую смачиваемую гранулу.

[0011] В соответствии с решением препарат является жидким, и конечная концентрация Myroides odoratimimus 3J2MO в препарате составляет (1-9) × 10⁷ КОЕ/мл.

[0012] В соответствии с решением препарат представляет собой ферментативный бульон c Myroides odoratimimus 3J2MO, а конечная концентрация Myroides odoratimimus 3J2MO в ферментативном бульоне c Myroides odoratimimus 3J2MO составляет (1-9) × 10⁷ КОЕ/мл.

[0013] В соответствии с решением способ получения ферментативного бульона c Myroides odoratimimus 3J2MO заключается в следующем. Myroides odoratimimus 3J2MO активируют в чашке с LB и культивируют в инкубаторе при 28^oC в течение 24 часов. Посредством иглы отбирают одну колонию Myroides odoratimimus, переносят в жидкую культуральную среду LB и культивируют со встряхиванием в течение от 12 часов до 24 часов. Захватывают от 1% до 3% культурального бульона, переносят в свежую жидкую культуральную среду LB и культивируют со встряхиванием в течение от 12 часов до 4 часов с получением ферментативного бульона c антагонистическим штаммом 3J2MO Myroides odoratimimus.

[0014] Представлен способ деградации афлатоксина, и конкретный способ применения заключается в следующем. Препарат для деградации афлатоксина наносят или распыляют на поверхность биологического образца или смешивают с биологическим образцом для деградации афлатоксина, для предотвращения и устранения загрязнения афлатоксином биологического образца.

[0015] Представлен способ деградации афлатоксина, и конкретный способ применения заключается в следующем. Ферментативный бульон c Myroides odoratimimus 3J2MO наносят или распыляют на поверхность биологического образца или смешивают с биологическим образцом для деградации афлатоксина, для предотвращения и устранения загрязнения афлатоксином биологического образца.

[0016] Благоприятные эффекты настоящего изобретения

[0017] В настоящем изобретении впервые предусмотрен штамм 3J2MO Myroides odoratimimus с хорошим эффектом деградации в отношении афлатоксина из почвы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ РАСКРЫТЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0018] По настоящему изобретению 100 мкл почвы после градиентного разбавления, собранной с арахисового поля в Хуангпи, Хубэй, размазывают по твердой культуральной среде лизогенного бульона (LB) для культивирования. Выращенные бактерии отбирают с помощью инокуляционной петли и переносят в свежую твердую культуральную среду LB для посева в чашку штрихами. После нескольких пересадок отбирают одну колонию. Штамм 3J2MO, характеризующийся значительным эффектом деградации в отношении афлатоксина, подвергают скринингу в эксперименте по деградации афлатоксина и депонируют в Китайском центре коллекции типовых культур (называемом CCTCC) под номером депонирования в CCTCC № M 2017329.

[0019] Вариант осуществления 1

[0020] 1) Myroides odoratimimus 3J2MO активируют в чашке с LB и культивируют в инкубаторе при 28°C в течение 24 часов. Посредством иглы отбирают одну колонию Myroides odoratimimus , переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28^oC и 200 об.·мин.^-1 в течение 12 часов. Захватывают 1% культурального бульона, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28^oC и 200 об.·мин.^-1 в течение 12 часов с получением ферментативного бульона с антагонистическим штаммом.

[0021] 2) Стандартный раствор афлатоксина B1 добавляют в ферментативный бульон с Myroides odoratimimus (с конечной концентрацией 1×10⁷ КОЕ/мл) для совместного культивирования в культуральной среде LB при 28^oC и 200 об./мин. в течение 5 дней с 3 повторами на обработку.

[0022] 3) Измеряют содержание афлатоксина B1 в культуральном бульоне (таблица 2).

Таблица 2. Эффект деградации бактерий для биологического контроля в отношении афлатоксина

[0023] Из результатов эксперимента видно, что скорость деградации штамма Myroides odoratimimus CCTCC № M 2017329 афлатоксина составляет приблизительно 95,61%, что указывает на то, что штамм обладает способностью к деградации афлатоксина.

[0024] Вариант осуществления 2

[0025] Бобы арахиса, полученные с арахисового поля Хубэй, измельчают в порошок и 0,5 г порошка арахиса взвешивают в чашке Петри. Добавляют 500 мкл раствора спор Aspergillus flavus, продуцирующего токсин (5 × 10⁵/мл), и культивируют в инкубаторе при 28°C в течение 7 дней.

[0026] Ферментативный бульон из 500 мкл штамма CCTCC № M 20177329 добавляют к порошку арахиса, заполненному спорами, такое же количество культуральной среды LB используют в качестве контроля и культивируют в культуральной среде при 28^oС в течение 5 дней с 3 повторами на эксперимент.

[0027] Добавляют 15 мл 70% метиловового спирта и помещают в шейкер на 30 минут после встряхивания. Добавляют 8 мл сверхчистой воды к 3 мл супернатанта для перемешивания и центрифугирования.

[0028] Отбирают 8 мл супернатанта и определяют содержание афлатоксина В1 с помощью иммуноаффинной колонки, способом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (таблица 3), с 3 повторами на эксперимент.

Таблица 3. Эффект обработки бактерий для биологического контроля в отношении арахиса, загрязненного Aspergillus flavus

[0029] Из результатов эксперимента видно, что уровень профилактики и контроля штамма CCTCC № M 2017329, влияющий на выработку токсина Aspergillus flavus на арахисе, составляет приблизительно 98,76%, что указывает на то, что штамм обладает хорошим эффектом обработки в отношении арахиса, загрязненного Aspergillus flavus.

[0030] Вариант осуществления 3

[0031] 1) Myroides odoratimimus 3J2MO активируют в чашке с LB и культивируют в инкубаторе при 28°C в течение 24 часов. Посредством иглы отбирают одну колонию активированного Myroides odoratimimus, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28^oC и 200 об.·мин.^-1 в течение 12 часов. Захватывают 1% культурального бульона, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28^oC и 200 об.·мин.^-1 в течение 12 часов с получением ферментативного бульона с антагонистическим штаммом.

[0032] 2) Стандартный раствор афлатоксина B2 добавляют в ферментативный бульон с Myroides odoratimimus (с конечной концентрацией 1×10⁷ КОЕ/мл) для совместного культивирования в культуральной среде LB при 28^oC и 200 об./мин. в течение 5 дней с 3 повторами на обработку.

[0033] 3) Измеряют конечное содержание афлатоксина B2 в культуральной среде и рассчитывают скорость деградации.

[0034] После расчета экспериментального результата скорость деградации штаммом CCTCC № M2017329 Myroides odoratimimus афлатоксина B2 составляет 96,23%, что указывает на то, что штамм обладает способностью к деградации афлатоксина B2.

[0035] Вариант осуществления 4

[0036] 1) Myroides odoratimimus 3J2MO активируют в чашке с LB и культивируют в инкубаторе при 28°C в течение 24 часов. Посредством иглы отбирают одну колонию активированного Myroides odoratimimus, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28^oC и 200 об.·мин.^-1 в течение 12 часов. Захватывают 1% культурального бульона, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28^oC и 200 об.·мин.^-1 в течение 12 часов с получением ферментативного бульона с антагонистическим штаммом.

[0037] 2) Стандартный раствор афлатоксина G1 добавляют в ферментативный бульон с Myroides odoratimimus (с конечной концентрацией 1×10⁷ КОЕ/мл) для совместного культивирования в культуральной среде LB при 28^oC и 200 об./мин. в течение 5 дней с 3 повторами на обработку.

[0038] 3) Измеряют конечное содержание афлатоксина G1 в культуральной среде и рассчитывают скорость деградации.

[0039] После расчета экспериментального результата скорость деградации штаммом CCTCC № M2017329 Myroides odoratimimus афлатоксина G1 составляет 96,73%, что указывает на то, что штамм обладает способностью к деградации афлатоксина G1.

[0040] Вариант осуществления 5

[0041] 1) Myroides odoratimimus 3J2MO активируют в чашке с LB и культивируют в инкубаторе при 28°C в течение 24 часов. Посредством иглы отбирают одну колонию активированного Myroides odoratimimus, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28^oC и 200 об.·мин.^-1 в течение 12 часов. Захватывают 1% культурального бульона, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28^oC и 200 об.·мин.^-1 в течение 12 часов с получением ферментативного бульона с антагонистическим штаммом.

[0042] 2) Стандартный раствор афлатоксина G2 добавляют в ферментативный бульон с Myroides odoratimimus (с конечной концентрацией 1×10⁷ КОЕ/мл) для совместного культивирования в культуральной среде LB при 28^oC и 200 об./мин. в течение 5 дней с 3 повторами на обработку.

[0043] 3) Измеряют конечное содержание афлатоксина G2 в культуральной среде и рассчитывают скорость деградации.

[0044] После расчета экспериментального результата скорость деградации штаммом CCTCC № M2017329 Myroides odoratimimus афлатоксина G2 составляет 97,55%, что указывает на то, что штамм обладает способностью к деградации афлатоксина G2.

[0045] Вариант осуществления 6

[0046] 1) Myroides odoratimimus 3J2MO активируют в чашке с LB и культивируют в инкубаторе при 28°C в течение 24 часов. Посредством иглы отбирают одну колонию активированного Myroides odoratimimus, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28^oC и 200 об.·мин.^-1 в течение 12 часов. Захватывают 1% культурального бульона, переносят в треугольную колбу, содержащую 15 мл жидкой культуральной среды LB, и культивируют со встряхиванием при 28^oC и 200 об.·мин.^-1 в течение 12 часов с получением ферментативного бульона с антагонистическим штаммом.

[0047] 2) Стандартный раствор афлатоксина M1 добавляют в ферментативный бульон с Myroides odoratimimus (с конечной концентрацией 1×10⁷ КОЕ/мл) для совместного культивирования в культуральной среде LB при 28^oC и 200 об./мин. в течение 5 дней с 3 повторами на обработку.

[0048] 3) Измеряют конечное содержание афлатоксина M1 в культуральной среде и рассчитывают скорость деградации.

[0049] После расчета экспериментального результата скорость деградации штаммом CCTCC № M2017329 Myroides odoratimimus афлатоксина M1 составляет 97,55%, что указывает на то, что штамм обладает способностью к деградации афлатоксина M1.

[0050] Вариант осуществления 7

[0051] Используется тот же способ, что и в патентном документе CN 105925513 A. Сравниваются эффекты деградации в отношении афлатоксина B1 штаммом Flavobacterium под номером депонирования в CICC 20907 в патентном документе и штаммом CCTCC № M2017329 Myroides odoratimimus по настоящему изобретению. Результаты сравнения показаны в таблице 4. Из результатов видно, что способность к деградации штаммом CCTCC № M2017329 Myroides odoratimimus афлатоксина B1, обеспечиваемая по настоящему изобретению, значительно превышает способность к деградации штаммом CICC 20907 Flavobacterium афлатоксина B1 по патентному документу CN 105925513 A.

Таблица 4. Сравнение способности к деградации афлатоксина B1 по настоящему изобретению и штаммом CICC 20907 Flavobacterium согласно патенту 105925513 A

[0052] В сочетании вариантов осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 штамм CCTCC № M2017329 Myroides odoratimimus по настоящему изобретению обладает очень сильной способностью к деградации всех пяти типов распространенных афлатоксинов. После изучения отечественных и зарубежных ссылок, штамм с такой сильной способностью к деградации пяти типов распространенных афлатоксинов не был обнаружен внутри страны и за рубежом.

Группа изобретений относится к штамму Myroides odoratimimus для биологического контроля для эффективной деградации афлатоксина, продуцируемого Aspergillus flavus, и его применению. Штамм 3J2MO Myroides odoratimimus депонирован в Китайском центре коллекции типовых культур (называемом CCTCC) 13 июня 2017 года под номером депонирования в CCTCC № M 2017329. Предложены также препарат для деградации афлатоксина, содержащий указанный штамм, а также способ деградации афлатоксина с использованием препарата. Штамм Myroides odoratimimus для биологического контроля обеспечивает эффективную деградацию афлатоксина. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Штамм 3J2MO Myroides odoratimimus для биологического контроля для деградации афлатоксина, продуцируемого Aspergillus flavus, депонированный в Китайском центре коллекции типовых культур (называемом CCTCC) 13 июня 2017 года под номером депонирования в CCTCC № M 2017329.

2. Препарат для деградации афлатоксина, где препарат cодержит штамм 3J2MO Myroides odoratimimus по п. 1.

3. Препарат по п. 2, где полученная форма препарата представляет собой жидкость, распыляемый порошок, сухой смачиваемый порошок или сухую смачиваемую гранулу.

4. Препарат по п. 2, где препарат представляет собой жидкость, и конечная концентрация штамма 3J2MO Myroides odoratimimus в препарате составляет 1×10⁷ – 9×10⁷ КОЕ/мл.

5. Препарат по п. 2, где препарат представляет собой ферментативный бульон с Myroides odoratimimus 3J2MO, и конечная концентрация Myroides odoratimimus 3J2MO в ферментативном бульоне с Myroides odoratimimus 3J2MO составляет 1×10⁷ – 9×10⁷ КОЕ/мл.

6. Препарат по п. 5, где способ получения ферментативного бульона со штаммом 3J2MO Myroides odoratimimus предусматривает: активацию штамма 3J2MO Myroides odoratimimus в чашке с лизогенным бульоном (LB) с последующим культивированием в инкубаторе при 28°C в течение 24 ч; отбор посредством иглы одной колонии Myroides odoratimimus, подлежащей переносу в жидкую культуральную среду и культивированию со встряхиванием в течение от 12 до 24 ч; захват от 1% до 3% культурального бульона, подлежащего переносу в свежую жидкую культуральную среду LB и культивированию со встряхиванием в течение от 12 до 24 ч; получение ферментативного бульона c антагонистическим штаммом 3J2MO Myroides odoratimimus.

7. Способ деградации афлатоксина, где препарат по п. 2 наносят или распыляют на поверхность биологического образца или смешивают с биологическим образцом для деградации афлатоксина.

8. Способ деградации афлатоксина, где препарат по п. 5 наносят или распыляют на поверхность биологического образца или смешивают с биологическим образцом для деградации афлатоксина.