Средства на основе дегидроэпиандростерона, обладающие избирательной цитопротекторной, противовоспалительной, иммуномодулирующей активностями, и способы их получения Российский патент 2025 года по МПК C07J5/00 C07J31/00 C07J75/00 A61K31/56 A61K31/5685 A61P29/00 A61P35/00 A61P37/00 

Группа изобретений относится к медицинской и органической химии и медицине, в частности к производным дегидроэпиандростерона (ДГЭА).

Предлагаемые соединения обладают избирательной питопротекторной, противовоспалительной и иммуномодулирующей активностью, что позволяет использовать их в защите от электромагнитного облучения и в борьбе с воспалительными заболеваниями.

Известны соединения, близкие по структуре и биологической активности к предлагаемым - сложные эфиры ДГЭА [Sokolov М. N. и др. The Effects of the Steroids 5-Androstenediol and Dehydroepiandrosterone and Their Synthetic Derivatives on the Viability of K562, НеГа, and Wi-38 Cells and the ruminol-Stimulated Chemiluminescence of Peripheral Blood Mononuclear Cells from Healthy Volunteers // Biomolecules. 2024 T. 14 №3. C. 373; Riva, S.; Klibanov, A.M. Enzymochemical regioselective oxidation of steroids without oxidoreductase // J. Am. Chem. Soc. 1988,110, 3291-3295; Ruddock, Р.Г.; Williams, D.J.; Reese, P.B. The scope and limitations of the reaction of 55-steroids with mercury(II) trifluoroacetate // Steroids 1998,63, 650-664], которые требуют увеличения целевой активности (защитного цитопротекторного действия) и селективности для противоопухолевой терапии, а также повышения биодоступности.

Известен сам ДГЭА, обладающий иммуностимулирующей, регенерирующей, нейропротекторной и противоопухолевой активностями с возможностью перорального применения [Li LJ. и др. Dehydroepiandrosterone (DHEA) Sensitizes Irinotecan to Suppress Head and Neck Cancer Stem-Like Cells by Downregulation of WNT Signaling // Front. Oncol. 2022 T. 12 C. 775541; Schwartz, A. G. Dehydroepiandrosterone, Cancer, and Aging // Aging Dis. 2022 T. 13 C. 423-432.].

Однако ДГЭА обладает низкой биодоступностью (3,1%) при пероральном применении у обезьян [Leblanc М. и др. Bioavailability and pharmacokinetics of dehydroepiandrosterone in the cynomolgus monkey // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003 T. 88 №9C. 4293-302].

Известны мази, гели с ДГЭА для наружного применения, а также таблетки для перорального применения при различных патологиях. Ниже приведены сведения о них.

Известны таблетки с ДГЭА для применения при недостаточном уровне тестостерона, для поддержания физиологических уровней андрогенов, улучшения сексуальной функции, настроения и здоровья, имеющие массу 60-120 мг и состоящие из 60-85% от массы гранул ДГЭА; 6-35% от массы гранул микрокристаллической целлюлозы; 0-20% от массы гранул одного или более фармацевтически приемлемых ингредиентов гранул; и - 0-40 масс. % одного или более фармацевтически приемлемых компонентов таблетки [RU 2627111, С2].

Описана комбинация селективных модуляторов рецепторов эстрадиола с некоторым количеством эстрогена или предшественника полового стероидного гормона, выбранного из группы, состоящей из ДГЭА, сульфата ДГЭА, андрост-5-ен-3b,17b-диола и соединений, превращающихся in vivo в один из указанных предшественников или эстроген для снижения массы тела (лечения ожирения) [RU 2519642, С2]

Помимо способов получения ДГЭА синтетическим путем, существуют методы индукции синтеза эндогенного ДГЭА.

Известно вещество, стимулирующее выработку ДГЭА, и способ его получения для борьбы со старением и улучшения жизненных функций, а также другие лекарственные средства, содержащие это вещество. Применяемые препараты на его основе включают продукты питания, пищевые добавки, биодобавки, лосьоны, косметику [ЕР 2599492 А1].

Вещество, стимулирующее выработку ДГЭА, содержит экстракт трюфелей. Однако известный способ получения ДГЭА дорог и весьма трудоемкий, экономически невыгоден.

Известны лекарственные формы ДГЭА в виде вагинального геля содержащего 6.5 мг ДГЭА для лечения атрофии влагалища у менопаузальных женщин [US 8268806, В2; US 8957054, В2; US 8629129, В2].

Известен препарат Прастерон на основе ДГЭА, который успешно используется в клинической практике в виде вагинального геля, с клинически доказанной эффективностью (порядка 9 зарегистрированных клинических исследований) [в базе WIPO и PubChem под номером CID 5881 (Prasterone)].

Известен способ получения кристаллической модификации 3β-гидрокси-5-андростен-17-она (дегидроэпиандрастерона, прастерона, ДГЕА) Fill, которая может быть использована в медицине и фармацевтической промышленности (RU 2820659, С2).

Цистеин - это аминокислота, широко распространенная как один из компонентов парентерального питания и используемая при получении антидотов, например ацетилцистеина, применяемом при передозировке ацетоминофена. Цистеин является важным источником серы в метаболизме человека, и является незаменимой аминокислотой для младенцев, пожилых людей и людей с определенными метаболическими заболеваниями или синдромами мальабсорбции.

Цистеин обычно синтезируется в организме человека при наличии достаточного количества метионина и оказывает цитопротекторное, антиоксидантное действие.

Существует безопасное нетоксичное лекарственное средство на основе цистеина - цистеина гидрохлорид, в виде раствора для инъекций, ELCYS, 34.5 mg/1mL, одобрен FDA и производится компанией Baxter Healthcare Corporation [https://www.accessdata.fda.gov/dragsatfda_docs/label/2019/210660lbl.pdf].

Известны конъюгаты ДГЭА с моноаминами, [Panada J. и др. New 3β-hydroxysteroid-indolamine conjugates: Design, synthesis and inhibition of C6 glioma cell proliferation // Steroids 2020 Т. 164 С. 108728]. Показано, что конъюгаты ДГЭА с триптамином повышают in vitro уровень глутатиона и оказывают антипролиферативное действие на клетки глиомы С6. Данные соединения были синтезированы как цитотоксические стероиды с целью применения в исключительно в онкологической практике.

Техническая задача состоит в получении новых модифицированных стероидных соединений, содержащих фрагмент аминокислоты и обладающих избирательной цитопротекторной, противовоспалительной и иммуномодулирующей активностями, а также в разработке способов их получения.

Технический результат, достигаемый при осуществлении заявляемой группы изобретений, заключается в расширении арсенала средств, обладающих избирательной цитопротекторной, противовоспалительной и иммуномодулирующей активностью.

Нами были синтезированы конъюгаты ДГЭА с цистеином, обладающие цитопротекторной, противовоспалительной и иммуномодулирующей активностями. Новые соединения и способы их получения являются предметом настоящего изобретения.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Предлагаются средства на основе дегидроэпиандростерона, обладающие избирательной цитопротекторной, противовоспалительной и иммуномодулирующей активностью, общей формулы:

где R выбран из следующей группы трет-бутоксикарбонил, Н.

Предлагаются способы получения указанного выше средства, где R соответствует трет-бутоксикарбонилу, в котором проводят этерификацию ДГЭА с S-бензил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-пистеином в присутствии третичного амина и конденсирующего реагента. При этом в качестве третичного амина (1,5-2,5 эквивалента) могут быть использованы диизопропилэтиламин, триэтиламин и N-метилморфолин. В качестве конденсирующих реагентов (1,5 эквивалента) могут быть использованы 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид/1-гидроксибензотриазол, 1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксид гексафторфосфат/1-гидроксибензотриазол, 1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксидтетрафтор-борат/1-гидроксибензотриазол.

Предлагается также способ получения патентуемого средства, где R соответствует Н, в котором проводят взаимодействие (3S,8R,9S,10R,13S,14S)-10,13-диметил-17-оксо-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17-тетрадекагидро-1Н-циклопента-[а]фенантрен-3-ил S-бензил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-цистеината с избытком трифторуксусной кислоты, с образованием соответствующей трифторуксусной соли (3S,8R,9S,10R,13S,14S)-10,13-диметил-17-оксо-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-ил S-бензил-L-цистеината.

Таким образом, получены новые производные ДГЭА, содержащие модифицированную гидроксильную группу в 3-ем положении стероидного каркаса, общей формулы:

где R выбран из следующей группы: трет-бутоксикарбонил, Н.

Заявляемые соединения представляют собой бесцветные или слабоокрашенные кристаллические вещества, хорошо растворимые в хлористом метилене, хлороформе, тетрагидрофуране, спирте, диметилсульфоксиде. Структура и индивидуальность заявляемых соединений подтверждены элементным анализом, рентгеноструктурным анализом, данными ЯМР ¹Н, ЯМР ¹³С, тонкослойной хроматографией.

Предложен способ получения ранее неизвестных производных ДГЭА, содержащих модифицированную гидроксильную группу в 3-ем положении стероидного каркаса, общей формулы:

где R выбран из следующей группы трет-бутоксикарбонил, Н.

Пример 1.

Получение (3S,8R,9S,10R,13S,14S)-10,13-диметил-17-оксо-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17-тетрадекагидро-1Н-циклопента-[а]фенантрен-3-ил S-бензил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-пистеината (код RVVS_012).

К раствору 1,00 г (1 эквивалент) ДГЭА, 1,20 г (1,05 эквивалента) S-бензил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-цистеина, 0,52 г (1,5 эквивалента) 1-гидроксибензотриазола и 0,9 мл (2,0 эквивалента) диизопропилэтиламина в 25 мл дихлорметана при перемешивании добавляют 1,45 г (1,5 эквивалента) 1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксид гексафтор-фосфат при комнатной температуре. Через 24 часа в реакционную смесь добавляют при перемешивании 25 мл дистиллированной воды. Через 1 час органический слой отделяют, промывают насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушат безводным сульфатом натрия, растворитель удаляют при пониженном давлении на ротационном испарителе. Твердый остаток очищают перекристаллизацией из гексана. Получают 1.03 г (51%) заявленного соединения в виде белого твердого вещества, Т.пл. 195°С (разложение). ¹Н ЯМР (300 МГц; CDCl₃) δ м.д. 7.19 - 7.44 (м, 5 Н), 5.37 - 5.45 (м, 1 Н), 5.28 (д, 3=1.10 Гц, 1 Н), 4.58 - 4.78 (м, 1 Н), 4.49 (д, J=5.87 Гц, 1 Н), 3.75 (с, 2 Н), 2.78 - 2.94 (м, 2 Н), 2.23 - 2.54 (м, 4 Н), 1.80 - 2.20 (м, 8 Н), 1.38 - 1.76 (м, 18 Н), 0.84 - 1.35 (м, 11 Н), 0.90 (с, 3 Н). ¹³С ЯМР (75 МГц, CDCl₃) δ м. д.: 220.90, 170.45, 170.40, 139.61, 137.80, 128.99, 128.59, 127.23, 122.22, 75.30, 51.74, 50.32, 50.17, 47.55, 42.27, 37.97, 37.89, 37.25, 36.87, 36.80, 35.87, 33.87, 33.82, 31.65, 31.50, 31.46, 30.82, 28.37, 27.65, 21.91, 20.42, 20.37, 19.46, 19.37, 13.58.

Пример 2.

Получение трифторуксусной соли (3S,8R,9S,10R,13S,14S)-10,13-диметил-17-оксо-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-ил S-бензил-L-цистеината (код SGV_047).

К раствору 0,50 г (1 эквивалент) (3S,8R,9S,10R,13S,14S)-10,13-диметил-17-оксо-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17-тетрадекагидро-1Н-циклопента-[а]фенантрен-3-ил S-бензил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-цистеината (I) в 15 мл дихлорметана добавляют 5 мл (25-кратный избыток) трифторуксусной кислоты. Реакционную смесь перемешивают в течение 24 часов при комнатной температуре. Растворитель упаривают при пониженном давлении. После охлаждения промывают водой, насыщенным раствором хлорида натрия. Стеклообразный остаток растирают с диэтиловым эфиром. Получают 0,49 г (96%) заявленного соединения в виде белого твердого вещества. Т.пл. 200°С. (разложение) ¹Н ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) δ м.д. 7.18 - 7.48 (м, 5 Н), 5.42 (т, J=5.50 Гц, 1 Н), 4.59 (д, J=8.44 Гц, 1 Н), 4.49 (уш. с, 1 Н), 4.04 - 4.43 (м, 4 Н), 3.81 - 3.89 (м, 1 Н), 2.89 (д, J=5.87 Гц, 1 Н), 2.25 - 2.46 (м, 4Н), 1.94-2.17 (м, 3 Н), 1.75 - 1.92 (м, 4 Н), 1.36- 1.72 (м, 10Н), 1.09 - 1.34 (м, 4 Н), 0.94 - 1.06 (м, 5 Н), 0.81 (м, 3 Н), ¹³С ЯМР (75 MHz, ДМСО-d₆) δ м.д. 219.59, 219.50, 167.56, 139.06, 137.59, 128.95, 128.40, 127.08, 122.21, 122.17, 119.95, 75.56, 69.90, 50.85, 50.75, 49.45, 46.77, 42.17, 36.19, 35.25, 31.38, 31.10, 30.96, 30.85, 30.17, 27.02, 21.38, 19.85, 19.10, 18.91, 13.14.

Пример 3.

Исследовано действие RVVS_012 и SGV_047 на жизнеспособность фибробластов методом МТТ.

Цитопротекторное действие новых андростенов на фибробласты человека (клеточная культура Ncu-f8) было оценено с помощью МТТ-теста. Клетки были проинкубированы 24 часа с исследуемыми стероидами в концентрации 10^-5 М, 200μL × 12 лунок для каждого вещества, в контроль был добавлен ДМСО (диметилсу льфоксид).

На фиг.1 представлено влияние новых стероидов RVVS_012 и SGV_047 на жизнеспособность фибробластов Ncu-f8, измеренное методом МТТ-теста; выявили статистически достоверное по отношению к контролю (t-тест Стьюдента, Р<0,05) повышение жизнеспособности фибробластов Ncu-f8: на 10% при 24 ч. инкубации с RVVS_012 и на 26% при 24 ч. инкубации с SGV_047.

Полученные данные свидетельствуют о наличии цитопротекторного эффекта у обоих соединений (более выраженного у вещества SGV_047).

Пример 4.

Исследовано действие RVVS_012 и SGV_047 на жизнеспособность клеток HeLa методом МТТ.

При помощи МТТ-теста было оценено действие новых андростенов в отношении клеток рака шейки матки HeLa. Клетки были проинкубированы 24 часа с исследуемыми стероидами в концентрации 10^-5 М, 200μL × 12 лунок для каждого вещества, в контроль был добавлен растворитель диметилсульфоксид (ДМСО). Результаты, представленные на Фиг. 2 выявили статистически значимое по отношению к контролю (t-тест Стьюдента, Р<0,05) угнетение жизнеспособности опухолевых клеток HeLa: на 10%) при 24 ч. инкубации с RVVS_012 и с SGV_047 соответственно.

Полученные данные свидетельствуют о наличии у обоих соединений антипролиферативного эффекта в отношении опухолевых клеток и указывает на наличие избирательности в их цитопротективном эффекте - повышении жизнеспособности у нормальных клеток и понижении ее у опухолевых клеток.

Пример 5. Исследовано действие RVVS-012 и SGV-047 на жизнеспособность макрофагов крови человека методом МТТ.

Из крови здоровых добровольцев (n=6, возраст 21±2,4, индекс массы тела 22,5±1,3) была выделена мононуклеарная фракция (МНФК), которую проинкубировали с исследуемыми стероидами в концентрации 10^-5 М в течение 24 ч. в концентрации 10^-5 М, 200μL × 12 лунок для каждого вещества, в контроль был добавлен ДМСО. Результаты (Фиг. 3) не выявили статистически значимых различий по отношению к контролю (использовался t-тест Стьюдента).

Отсутствие влияния SGV-047 и RVVS-012 (10 мкМ) на жизнеспособность МНФК свидетельствует о его безопасности для клеток иммунной системы и целесообразности использования для подавления воспалительных реакций и при электромагнитном воздействии, восстановлению качества жизни пациентов и возможности применения в качестве эффективного средства в терапии воспалительных заболеваний различной этиологии.

Пример 6.

Исследовано действие RVVS-012 и SGV-047 на спонтанную и индуцированную оксидантную активность макрофагов крови человека. Соединения подавляют спонтанную оксидантную активность макрофагов крови человека, проявляя противовоспалительное иммуномодулирующее действие.

Из крови здоровых добровольцев (n=6, возраст 21±2,4, индекс массы тела 22,5±1,3) была выделена мононуклеарная фракция (МНФК), которую проинкубировали с исследуемыми стероидами в концентрации 10^-5 М в течение 24 ч. После этого была оценена генерация активных форм кислорода (АФК) макрофагами методом люминол-зависимой хемилюминесценции.

Стимулированную люминолзависимую хемилюминесценцию (СЛХЛ) измеряли с помощью хемилюминометра Люм-100, DiSoft, Россия. Данные оценивали с помощью программного обеспечения PowerGraph 3.3 Professional (DiSoft, Москва, Россия). Площадь под кривой хемилюминесценции оценивали с помощью введения сульфата бария в конец кинетики (светосумму).

Хемилюминесценцию образцов, измеряемую в относительных световых единицах (ОСЕ), регистрировали в течение 10 мин. Измерения проводили сразу после забора образцов крови, доведенных до 750 мкл раствором Хэнкса (рН=7,45), который затем был подвергнут инкубации при 37°С в течение 45 мин. Далее инкубированный образец был добавлен в кювету хемилюминометра, и было добавлено 150 мкл раствора люминола (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Мичиган, США) в концентрации 4,5 мМ (конечная концентрация в образце составила 0,56 мМ). Спонтанную кинетику регистрировали в течение 3 мин, после чего добавляли 300 мкл активатора окислительной активности клеток (стимулятор люминесценции - сульфат бария, фирма «ВИПС-МЕД», Фрязино, Россия) в концентрации 34,3 мМ (конечная концентрация в пробе - 8,6 мМ) и регистрировали кинетику стимулированной хемилюминесценции в течение 10 мин. Конечный объем пробы составлял 1200 мкл. Измерение хемилюминесценции проводили при температуре 37°С в течение 10 мин. Светосумму стимулированной люминол-зависимой хемилюминесценции измеряли сразу после добавления препаратов к свежим мононуклеарам (МНФК).

Оба исследуемых вещества, RVVS-012 и SGV-047, снижали спонтанное свечение клеток МНФК (Фиг. 4), что свидетельствует о наличии у них противовоспалительной активности.

В то же время, после индукции МНФК фитогемагглютинином в концентрации 0,1 мг/мл, наблюдалось увеличение генерации АФК у макрофагов, проинкубированных с RVVS-012 и ее снижение у клеток обработанных SGV-047 (Фиг. 5).

Полученные данные указывают на наличие выраженной иммуномодулирующей активности у обоих соединений. Инкубация с индуктором воспаления ФГА составляла 6 часов, поэтому инкубированные клетки представляют собой модель острой фазы воспаления. Соединение RVVS-012 активируют макрофаги, а генерация АФК способствует борьбе с потенциальным инфекционным агентом. Соединение SGV-047 подавляет активность макрофагов, поэтому может в перспективе использоваться в борьбе с хроническими инфекциями и воспалением.

В нашем исследовании окислительная способность МНФК измерялась методом люминол-зависимой хемилюминесценции. Этот метод является очень ценным показателем, позволяющим оценить важные типы активности лекарственных препаратов, такие как антиоксидантная, противовоспалительная и противоаллергическая, а также оценить, как гидрофильные и гидрофобные компоненты могут влиять на перекисное окисление липидной мембраны клеток, образование радикалов в митохондриях и влияние окислительного стресса на организм при системном васкулите, сахарном диабете 2 типа, ревматоидном артрите и болезни Паркинсона [Proskurnina, Е. V. и др. Kinetic chemiluminescence as a method for oxidative stress evaluation in examinations of patients with type 2 diabetes mellitus // Bull. Exp. Biol. Med. 2016 T. 161 C. 131-133., Gaudio, E. и др. Leukocyte coping capacity chemiluminescence as an innovative tool for stress and pain assessment in calves undergoing ring castration. // J. Anim. Sci. 2018 T. 96 C. 4579-4589., Pavlik, T.I. и др. The Effect of Progestins on Cytokine Production in the Peripheral Blood Mononuclear Cells of Menopausal Women and Their Luminol-Dependent Chemiluminescence // Molecules 2023 T. 28 C. 4354].

Изобретение относится к средству, обладающему избирательной цитопротекторной, противовоспалительной и иммуномодулирующей активностями, общей формулы:

где R выбран из следующей группы: трет-бутоксикарбонил, H, а также к способу его получения, где R соответствует трет-бутоксикарбонилу, в котором проводят этерификацию ДГЭА с S-бензил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-цистеином в присутствии третичных аминов и конденсирующих реагентов, и к способу его получения, где R соответствует Н, в котором проводят взаимодействие (3S,8R,9S,10R,13S,14S)-10,13-диметил-17-оксо-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17-тетрадекагидро-1Н-циклопента-[а]фенантрен-3-ил S-бензил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-цистеината с трифторуксусной кислотой с образованием трифторуксусной соли (3S,8R,9S,10R,13S,14S)-10,13-диметил-17-оксо-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а] фенантрен-3-ил S-бензил-L-цистеината. Технический результат: получены новые соединения, которые обладают избирательной цитопротекторной, противовоспалительной и иммуномодулирующей активностями, что позволяет использовать их в защите от электромагнитного облучения и в борьбе с воспалительными заболевания. 3 н. 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 6 пр.

1. Средство, обладающее избирательной цитопротекторной, противовоспалительной и иммуномодулирующей активностями, общей формулы:

где R выбран из следующей группы: трет-бутоксикарбонил, H.

2. Способ получения средства по п. 1, где R представляет собой трет-бутоксикарбонил, в котором проводят этерификацию дегидроэпиандростерона S-бензил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-цистеином в присутствии третичного амина и конденсирующего реагента.

3. Способ получения по п. 2, в котором в качестве третичного амина используют диизопропилэтиламин, или триэтиламин, или N-метилморфолин.

4. Способ получения по п. 2, в котором в качестве конденсирующего реагента используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорид/1-гидроксибензотриазол, или 1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксид гексафторфосфат/1-гидроксибензотриазол, или 1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксид тетрафтор-борат/1-гидроксибензотриазол.

5. Способ получения средства по п. 1, где R представляет собой H, в котором проводят реакцию (3S,8R,9S,10R,13S,14S)-10,13-диметил-17-оксо-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17-тетрадекагидро-1H-циклопента-[а]фенантрен-3-ил S-бензил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-цистеината с трифторуксусной кислотой в течение 24 часов при комнатной температуре, а затем выпаривают растворитель.