СПОСОБ СОЗДАНИЯ ОРТОТОПИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ САРКОМЫ МЯГКИХ ТКАНЕЙ ЧЕЛОВЕКА, ПРОРАСТАЮЩЕЙ В ТРУБЧАТУЮ КОСТЬ, НА ИММУНОДИФИЦИТНЫХ МЫШАХ ЛИНИИ BALB/C NUDE Российский патент 2025 года по МПК A61B17/00 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается способа трансплантации фрагмента саркомы мягких тканей человека, прорастающей в трубчатую кость мыши линии Balb/c Nude, для получения ортотопической пациентоподобной модели, имеющей структурные и физиологические особенности и отражающей схожую картину формирования опухолевого поражения трубчатых костей у человека.

Саркома мягких тканей (СМТ) представляет собой солидное онкологическое заболевание соединительнотканного происхождения с высокой степенью метастатического поражения. Иммунологически саркомы часто характеризуются недостатком опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов и иммуносупрессивным микроокружением (см. Aoki Y, Yamamoto J, Tome Y, Hamada K, Masaki N, Inubushi S, Tashiro Y, Bouvet M, Endo I, Nishida K, Hoffman RM. Over-methylation of Histone H3 Lysines Is a Common Molecular Change Among the Three Major Types of Soft-tissue Sarcoma in Patient-derived Xenograft (PDX) Mouse Models. Cancer Genomics Proteomics. 2021 Nov-Dec;18(6):715-721. doi: 10.21873/cgp.20292. PMID: 34697064; PMCID: PMC8569816). Анатомическая локализация первичного заболевания представляет собой важную переменную, влияющую на лечение и исход. Наиболее распространенными первичными локализациями являются конечности (43%), туловище (10%), внутренние органы (19%), забрюшинное пространство (15%) или голова и шея (9%). Десмоидные опухоли, или агрессивный фиброматоз, представляют собой редкий подтип новообразований мягких тканей, который характеризуется локальной инфильтрацией. Рабдомиосаркома является наиболее часто встречаемой у детей и подростков и реже встречается у взрослых (см. von Mehren M, Kane JM, Agulnik M, Bui MM, Carr-Ascher J, Choy E, Connelly M, Dry S, Ganjoo KN, Gonzalez RJ, Holder A, Homsi J, Keedy V, Kelly CM, Kim E, Liebner D, McCarter M, McGarry SV, Mesko NW, Meyer C, Pappo AS, Parkes AM, Petersen IA, Pollack SM, Poppe M, Riedel RF, Schuetze S, Shabason J, Sicklick JK, Spraker MB, Zimel M, Hang LE, Sundar H, Bergman MA. Soft Tissue Sarcoma, Version 2.2022, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. J Natl Compr Canc Netw. 2022 Jul;20(7):815-833. doi: 10.6004/jnccn.2022.0035. PMID: 35830886; PMCID: PMC10186762).

Местный контроль с широкой хирургической резекцией с адъювантной лучевой терапией или без нее имеет показатель успеха, близкий к 90%. Однако примерно у 40-50% пациентов с крупной (>5 см) глубокой СМТ высокой степени злокачественности в конечном итоге развиваются отдаленные метастазы, преимущественно в легких. В этих случаях вероятность излечения резко снижается, а 5-летняя выживаемость колеблется от 25% до 30%, несмотря на хирургическое лечение (см. Omori T, Tazawa H, Yamakawa Y, Osaki S, Hasei J, Sugiu K, Komatsubara T, Fujiwara T, Yoshida A, Kunisada T, Urata Y, Kagawa S, Ozaki T, Fujiwara T. Oncolytic virotherapy promotes radiosensitivity in soft tissue sarcoma by suppressing anti-apoptotic MCL1 expression. PLoS One. 2021 Apr 22;16(4):e0250643. doi: 10.1371/journal.pone.0250643. PMID: 33886686; PMCID: PMC8061981).

Таким образом, существует необходимость в изучении особенностей сарком для лучшего понимания течения онкозаболевания.

Для изучения патогенеза данного заболевания используют животные модели, а именно мышей, которые имеют близкое сходство к человеческому ДНК, что является ценным материалом в онкопатологии. В настоящее время саркомы до конца не исследованы, поэтому остается необходимость создания экспериментальных моделей, отражающих более точную картину развития заболевания.

Известен способ создания модели СМТ у мышей линии BALB/c Nude в возрасте 5-6 недель, вводили инъекцию опухолевых клеток KP1 miR-16 в тазобедренную мышцу конечностей мышей (см. Sachdeva M, Whitley MJ, Mito JK, Ma Y, Lev DC, Cardona DM, Kirsch DG. MicroRNA-16 suppresses metastasis in an orthotopic, but not autochthonous, mouse model of soft tissue sarcoma. Dis Model Mech. 2015 Aug 1;8(8):867-75. doi: 10.1242/dmm.017897. Epub 2015 Jun 4. Erratum in: Dis Model Mech. 2015 Sep;8(9):1169. PMID: 26044957; PMCID: PMC4527278). Преимуществом данного способа является получение большого количества животных опухоленосителей. Недостатком данного способа можно отметить, что получение первичной культуры клеток увеличивает сроки проведения эксперимента, а также имплантация культуры клеток, а не гетерогенного материала, взятого от пациента, так как известно, что гетерогенный состав клеточной популяции опухолей повторяет индивидуальные черты онкогенеза.

Известен способ подкожной трансплантации фрагмента опухоли остеосаркомы человека мышам линии Balb/c Nude (см. Wu N. F. et al. The first mouse model of primary osteosarcoma of the breast // in vivo. – 2021. – Т. 35. – №. 4. – С. 1979-1983). Опухолевый материал размером 2 мм³ трансплантировали по методу Hozumi, а именно на дорсальной стороне тела мыши осуществляли рассечение кожи длиной 1 см и создавали карман, путем отделения кожи от мышечной ткани. Фрагмент первичной опухоли вместе с окружающей условно здоровой тканью был помещен в созданный карман, затем операционную рану ушивали. Данный способ обладает высоким процентом прижевляемости опухолевой ткани (90,2%), однако гетеротопические модели не несут в себе тождественного отражения поведения опухоли, так как помещены в чужеродное микроокружение.

Известен способ создания ортотопической трансплантации остеосаркомы человека в большеберцовую кость мышам линии Balb/c Nude (см. Inoue M. et al. Trabectedin suppresses osteosarcoma pulmonary metastasis in a mouse tumor xenograft model // Journal of Orthopaedic Research®. – 2022. – Т. 40. – №. 4. – С. 945-953). Животным на бедре делали разрез кожи размером 8 мм, лапу сгибали в коленном суставе, обнажали четырехглавую мышцу и икроножную мышцу и проводили разрез. Затем делали прокол диаметром 5 мм проксимального отдела большеберцовой кости. После чего вводили лезвие в кость на 2,5 мм, вращали для создания отверстия в кости в 1 мм и помещали фрагмент опухоли. Далее проводили послойное ушитие операционной раны. Преимуществом способа является ортотопический сайт имплантации. Однако необходимо отметить, что недостатками является небольшой фрагмент опухоли, помещенный в отверстие кости, который может не прижиться, а вследствие этого не произойдет роста опухолевого узла.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является способ создания ортотопической модели саркомы мягких ткани человека, прорастающей в трубчатую кость, у мышей линии Balb/c Nude.

Технический результат изобретения достигается тем, что проводят разрез кожи и мышц послойно, начиная с передней поверхности правой половины живота мыши на 5 мм выше тазобедренного сустава, заканчивают разрез на 5 мм выше коленного сустава, далее выделяют тупым и острым путем с помощью микрохирургических инструментов сосудисто-нервный пучок: бедренную артерию, бедренную вену, бедренный нерв по внутренней поверхности бедра, пересекают и перевязывают сосудисто-нервный пучок на уровне средней трети бедра, выполняют ампутацию задней свободной конечности на расстоянии 5 мм от перевязанного сосудисто-нервного пучка, помещают фрагмент опухоли саркомы мягких тканей человека размером 4 × 1 × 1 мм³ в бедренную кость, закрепляют одним узлом лигатуры в центре, сшивают двуглавую мышцу бедра, ушивают послеоперационную рану непрерывным обвивным швом.

Способ осуществляется следующим образом.

Эксперимент проводился на мышах линии Balb/c Nude.

После иссечения опухоли у пациента ее фрагмент помещают в среду Хенкса. Время от момента резекции опухолевого материала у человека до имплантации в тело трубчатую кость мыши не должно превышать 15 минут.

Все хирургические манипуляции проводятся под наркозом (см. Пат. 2712916 РФ. Способ проведения наркоза у мышей Balb/c Nude при оперативных вмешательствах / Колесников Е.Н., Лукбанова Е.А., Ванжа Л.В., Максимов А.Ю., Кит С.О., Гончарова А.С., Заикина Е.В., Миндарь М.В., Ткачев С.Ю., Ходакова Д.В., Волкова А.В.).

Для обеспечения трансплантации фрагмента опухоли СМТ человека проводят разрез кожи и мышц послойно, начиная с передней поверхности правой половины живота мыши на 5 мм выше тазобедренного сустава, заканчивают разрез на 5 мм выше коленного сустава, далее выделяют тупым и острым путем с помощью микрохирургических инструментов сосудисто-нервный пучок по внутренней поверхности бедра (бедренная артерия, бедренная вена, бедренный нерв), пересекают и перевязывают сосудисто-нервный пучок на уровне средней трети бедра, выполняют ампутацию задней свободной конечности на расстоянии 5 мм от перевязанного сосудисто-нервного пучка, помещают фрагмент опухоли СМТ человека размером 4 × 1 × 1 мм³ в бедренную кость, закрепляют одним узлом лигатуры в центре, сшивают двуглавую мышцу бедра, ушивают послеоперационную рану непрерывным обвивным швом.

Изобретение иллюстрируется фигурами (1-6).

На Фиг. 1 изображено выделение сосудисто-нервного пучка по внутренней поверхности бедра мыши линии Balb/c Nude.

На Фиг. 2 изображен разрез мышц мыши линии Balb/c Nude.

На Фиг. 3 изображено лигирование сосудисто-нервного пучка мыши линии Balb/c Nude.

На Фиг. 4 изображена имплантация опухолевого фрагмента СМТ человека в трубчатую кость мыши линии Balb/c Nude.

На Фиг. 5 изображено ушитие мышц нижней свободной конечности мыши линии Balb/c Nude.

На Фиг. 6 изображен окончательный вид мыши линии Balb/c Nude после проведенной хирургической манипуляции.

Пример применения способа

Данным способом была проведена трансплантация самцу мыши линии Balb/c Nude весом 28 г., возраст 9 недель.

После иссечения опухоли у пациента ее фрагмент помещают в среду Хенкса. Время от момента резекции опухолевого материала у человека до имплантации в тело трубчатую кость мыши не должно превышать 15 минут.

Все хирургические манипуляции проводят под наркозом (см. Пат. 2712916 РФ. Способ проведения наркоза у мышей Balb/c Nude при оперативных вмешательствах / Колесников Е.Н., Лукбанова Е.А., Ванжа Л.В., Максимов А.Ю., Кит С.О., Гончарова А.С., Заикина Е.В., Миндарь М.В., Ткачев С.Ю., Ходакова Д.В., Волкова А.В.).

Для обеспечения трансплантации фрагмента опухоли СМТ человека проводят разрез кожи и мышц послойно, начиная с передней поверхности правой половины живота мыши на 5 мм выше тазобедренного сустава, заканчивают разрез на 5 мм выше коленного сустава, далее выделяют тупым и острым путем с помощью микрохирургических инструментов сосудисто-нервный пучок по внутренней поверхности бедра (бедренная артерия, бедренная вена, бедренный нерв), пересекают и перевязывают сосудисто-нервный пучок на уровне средней трети бедра, выполняют ампутацию задней свободной конечности на расстоянии 5 мм от перевязанного сосудисто-нервного пучка, помещают фрагмент опухоли СМТ человека размером 4 × 1 × 1 мм³ в бедренную кость, закрепляют одним узлом лигатуры в центре, сшивают двуглавую мышцу бедра, ушивают послеоперационную рану непрерывным обвивным швом.

Технико-экономическая эффективность заключается в том, что ортотопическая модель саркомы мягких тканей человека, созданная таким способом, позволяет изучать этиологию, патогенез СМТ человека, а также оценить эффективность различных лекарственных и лучевых воздействий на опухоль.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии. Проводят разрез кожи и мышц послойно, начиная с передней поверхности правой половины живота мыши на 5 мм выше тазобедренного сустава. Заканчивают разрез на 5 мм выше коленного сустава, далее выделяют тупым и острым путем с помощью микрохирургических инструментов сосудисто-нервный пучок: бедренную артерию, бедренную вену, бедренный нерв по внутренней поверхности бедра. Пересекают и перевязывают сосудисто-нервный пучок на уровне средней трети бедра, выполняют ампутацию задней свободной конечности на расстоянии 5 мм от перевязанного сосудисто-нервного пучка. Помещают фрагмент опухоли саркомы мягких тканей человека размером 4 × 1 × 1 мм³ в бедренную кость, закрепляют одним узлом лигатуры в центре, сшивают двуглавую мышцу бедра. Ушивают послеоперационную рану непрерывным обвивным швом. Способ позволяет получить ортотопическую пациентоподобную модель саркомы мягких тканей (СМТ) человека, имеющую структурные и физиологические особенности и отражающую схожую картину формирования опухолевого поражения трубчатых костей у человека, изучать этиологию, патогенез, а также оценить эффективность различных лекарственных и лучевых воздействий на опухоль. 6 ил., 1 пр.

Способ создания ортотопической модели саркомы мягких тканей человека, прорастающей в трубчатую кость, на иммунодифицитных мышах линии BALB/c Nude, заключающийся в том, что проводят разрез кожи и мышц послойно, начиная с передней поверхности правой половины живота мыши на 5 мм выше тазобедренного сустава, заканчивают разрез на 5 мм выше коленного сустава, далее выделяют тупым и острым путем с помощью микрохирургических инструментов сосудисто-нервный пучок: бедренную артерию, бедренную вену, бедренный нерв по внутренней поверхности бедра, пересекают и перевязывают сосудисто-нервный пучок на уровне средней трети бедра, выполняют ампутацию задней свободной конечности на расстоянии 5 мм от перевязанного сосудисто-нервного пучка, помещают фрагмент опухоли саркомы мягких тканей человека размером 4 × 1 × 1 мм³ в бедренную кость, закрепляют одним узлом лигатуры в центре, сшивают двуглавую мышцу бедра, ушивают послеоперационную рану непрерывным обвивным швом.