СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛА С КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ РАСТЕНИЙ Российский патент 2025 года по МПК C07K1/14 C12P21/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к выделению белков из клеток.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Способы выделения белков из клеток или клеточных агрегатов включают осмотический лизис, ферментативный или химический лизис, обработку ультразвуком и механическое разрушение. Для механического разрушения клетки обычно измельчают гомогенизатором или миксером.

Для разделения клеточных агрегатов и для получения суспензии из клеток также можно использовать непродолжительную обработку, при этом происходит только частичный лизис всей клеточной массы (Orellana-Escobedo et al., Plant Cell Rep. 2015, 34(3):425-33).

Если белок выделяют из отдельных органелл или клеточных компартментов, клеточные органеллы обычно выделяют до разрушения, а затем разрушают изолят.

Witzel и др., Plant Methods 2011, 7:48; Лири и др., J Vis Exp., 2014; (94): 52113; и Córdoba-Pedregosa et al., Plant Physiology 1996, 112(3):1119-1125, описывают способы экстракции белков из апопласта растительных клеток. Апопластом называется пространство вне протопласта. Он состоит из клеточных стенок и межклеточного пространства. Способы, описанные в этих публикациях, включают осмотическую экстракцию различными растворами для инфильтрации (например, солями) и центрифугирование. Однако этот способ имеет недостаток, заключающийся в том, что при такой экстракции может происходить извлечение только доступных для инфильтрации материалов.

В US 2015/0140644 A1 и AU 2017202473 B2 описаны способы получения белков из апопласта, которые включают этапы лизиса клеточной стенки, инкубации и экстракции. В этом случае возможны ферментативные или химические модификации белков.

Целью изобретения является создание улучшенных средств выделения или экстракции материалов из апопласта, в частности материала, секретированного в апопласт.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу отделения экспрессированного материала от поверхности клеток растений или от апопласта, причем клетки растений подвергают роторностаторной обработке в жидкой среде, при этом удельная теплота, выделяемая ротор-статором при вращении ротора, составляет не более 3 кДж на кг жидкой среды и на г/л сухого вещества растительных клеток, и удельная теплоотдача в среду составляет не более 1,5 кДж на кг жидкой среды в минуту и на г/л сухого вещества растительных клеток.

Аналогичным образом, в другом аспекте изобретение относится к способу отделения экспрессированного материала от поверхности одной или более растительных клеток или апопласта, где одну или более растительных клеток обрабатывают в жидкой среде в ротор-статоре, причем теплота, выделяемая ротор-статором при вращении ротора, составляет не более 30 кДж на кг жидкой среды, и теплоотдача в среду составляет не более 1,5 кДж на кг жидкой среды в минуту.

Параметры обоих аспектов можно комбинировать, поскольку они по существу являются просто разными контрольными величинами, обеспечивающими реализацию сущности изобретения. Подробное описание изобретения и все предпочтительные варианты осуществления, представленные в настоящем описании, относятся ко всем аспектам изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к роторностаторной обработке растений или растительных клеток в щадящем режиме, которая, в отличие от обычной гомогенизации, позволяет отделить материал от апопластов клеток или растений. Протопласты должны оставаться в значительной степени интактными, чтобы избежать загрязнения выделяемого экспрессированного материала компонентами клетки из находящихся внутри клетки протопластов. Поэтому, согласно изобретению, интенсивность и продолжительность роторностаторной обработки ограничены. Было показано, что роторностаторная обработка с выделением малого количества энергии, определяемого как удельная теплота или теплоотдача, обеспечивает удовлетворительное отделение желаемого экспрессированного материала. Отличные результаты могут быть получены, когда максимальная удельная теплота, выделяемая ротор-статором при вращении ротора, составляет 3 кДж на кг жидкой среды и на г/л сухой массы растительных клеток, и когда максимальная удельная теплоотдача в среду при вращении ротора составляет 1,5 кДж на кг жидкой среды в минуту и на г/л сухого вещества растительных клеток. Такие же хорошие результаты были получены, когда теплота, выделяемая ротор-статором при вращении ротора, составляла не более 30 кДж на кг жидкой среды, и когда теплоотдача в среду составляла не более 1,5 кДж на кг жидкой среды в минуту. Согласно изобретению растения или растительные клетки не гомогенизируют, а лишь обрабатывают до такой степени, при которой экспрессированный материал отделяется от поверхности или апопласта.

Согласно способу по изобретению экспрессированный материал получают с поверхности клеток или из апопласта (совокупности клеточных стенок и межклеточного пространства). Такой материал попадает в эти участки, как правило, в результате секреции и обычно также находится в культуральной среде растительных клеток. Однако в ходе создания изобретения было обнаружено, что к поверхности, в частности, к клеточной стенке или апопласту прикреплено большое количество секретированного материала. Этот прикрепленный материал получают в соответствии с изобретением, причем способ по изобретению позволяет увеличить его получение. Наблюдается 10-кратное увеличение выхода, т.е. выделения секретированного экспрессированного материала, по сравнению с процессами без роторностаторной обработки.

Для получения достаточного количества экспрессированного материала (целевого продукта) интенсивность и продолжительность обработки, и мощность ротор-статора выбирают таким образом, чтобы они находились в пределах максимальных параметров согласно изобретению. Однако интенсивность и продолжительность обработки, а также мощность, которые соответствуют выделяемой энергии, выраженную в количестве теплоты или удельной теплоты, ограничены, поскольку при более высоком выделении энергии происходит загрязнение продукта.

Предпочтительно удельная теплота, выделяемая ротор-статором при вращении ротора, составляет не более 3 кДж на кг жидкой среды и на г/л сухого вещества растительных клеток (сокращенно 3 кДж/кг/(г/л) или 3 кДж/кг/г/л). В частности, предпочтительно поддерживать удельную теплоту на более низком уровне, чтобы дополнительно уменьшить остаточное загрязнение. Таким образом, предпочтительно, чтобы выделяемая ротор-статором удельная теплота составляла не более 2,75 кДж/кг/(г/л), или более предпочтительно не более 2,5 кДж/кг/(г/л), не более 2,25 кДж/кг/(г/л), не более 2 кДж/кг/(г/л), не более 1,75 кДж/кг/(г/л), не более 1,5 кДж/кг/(г/л), не более 1,25 кДж/кг/(г/л) или не более 1 кДж/кг/(г/л).

Независимо от указания количества растений в соответствии с изобретением также определяли необязательный параметр - выделенная теплота. В некоторых вариантах осуществления этот параметр является значимым, поскольку ротор-статор выделяет энергию в клеточную среду независимо от растительных клеток, что может проявляться в нагреве. Предпочтительно теплота, выделяемая ротор-статором при вращении ротора, составляет не более 30 кДж на кг жидкой среды (сокращенно кДж/кг), предпочтительно не более 25 кДж/кг, не более 20 кДж/кг, не более 15 кДж/кг или не более 10 кДж/кг.

Эту выделенную удельную теплоту или выделенную теплоту можно регулировать, например, путем ограничения продолжительности обработки и/или интенсивности обработки (а также параметрами удельной теплоотдачи или теплоотдачи):

В способе по изобретению ротор-статор работает с низкой интенсивностью, т.е. теплота (или тепловыделение), выделяемая при определенной интенсивности определенного процесса с выбранными параметрами, может быть измерена в сравнительном эксперименте, например, путем повышения температуры воды или другой среды с известной теплоемкостью. При определении теплоты процесса следует исключить или учитывать в расчетах другие влияющие на температуру эффекты, в частности температурные потери, чтобы получить теплоту или теплоотдачу самого ротор-статора; предпочтительно теплоту или теплоотдачу определяют в сосуде Дьюара.

Независимо от устройства релевантной считается удельная теплоотдача или теплоотдача («удельная» необязательно относится к указанию на количество растительного материала, как указано выше). Предпочтительно удельная теплоотдача в среду составляет не более 1,5 кДж на кг жидкой среды в минуту и на г/л сухого вещества растительных клеток (сокращенно кДж/кг/мин/(г/л) или кДж/кг/мин/г/л). Особенно предпочтительно, чтобы эта удельная теплоотдача составляла не более 1,25 кДж/кг/мин/(г/л), не более 1 кДж/кг/мин/(г/л), не более 0,8 кДж/кг/мин/(г/л), не более 0,6 кДж/кг/мин/(г/л), не более 0,5 кДж/кг/мин/(г/л), не более 0,4 кДж/кг/мин/(г/л), не более 0,3 кДж/кг/ мин/(г/л), не более 0,2 кДж/кг/мин/(г/л), не более 0,15 кДж/кг/мин/(г/л), не более 0,125 кДж/кг/мин/(г/л) или не более 0,1 кДж/кг/мин/(г/л). Аналогично этому теплоотдача в среду предпочтительно составляет не более 1,5 кДж на кг жидкой среды в минуту (сокращенно кДж/кг/мин). Эта теплоотдача предпочтительно составляет не более 1,25 кДж/кг/мин, не более 1 кДж/кг/мин, не более 0,8 кДж/кг/мин, не более 0,6 кДж/кг/мин, не более 0,5 кДж/кг/мин или не более 0,4 кДж/кг/мин.

Чем интенсивнее или продолжительнее обработка, тем больше материала извлекают. Предпочтительно теплота (ротор-статора), выделяемая при вращении ротора, составляет по меньшей мере 1 кДж на кг жидкой среды, особенно предпочтительно по меньшей мере 2 кДж/кг, и/или удельная теплота ротор-статора составляет по меньшей мере 0,1 кДж на кг жидкой среды и на г/л сухого вещества растительных клеток, особенно предпочтительно по меньшей мере 0,2 кДж/кг/(г/л).

Теплоотдача в среду при вращении ротора предпочтительно составляет по меньшей мере 0,2 кДж на кг жидкой среды в минуту, предпочтительно по меньшей мере 0,4 кДж/кг/мин, и/или удельная теплоотдача в среду составляет по меньшей мере 0,02 кДж на кг жидкой среды в минуту и на г/л сухого вещества растительных клеток, предпочтительно по меньшей мере 0,04 кДж/кг/мин/(г/л).

Экспрессированный материал предпочтительно содержит белки. Белки, в частности, рекомбинантно экспрессированные белки, могут специфически контролироваться соответствующими сигнальными последовательностями секреторного пути, вследствие чего происходит их накопление на поверхности или в апопласте. Предпочтительно экспрессированный материал находится в апопласте растительных клеток, из которого он может быть извлечен способом по изобретению. Также предпочтительно экспрессированный материал представляет собой секретированный материал, предпочтительно белки, секретированные через клеточную мембрану или клеточную стенку.

Согласно изобретению, ротор-статор используется для обработки растительных клеток в жидкой среде для извлечения экспрессированного материала.

Ротор-статор содержит по меньшей мере один ротор, который в результате своего вращательного движения оказывает сдвиговое усилие на клетки растений. Под действием сдвигового усилия поверхность растительных клеток или апопласт и клеточные стенки (структурно) разрыхляются, подвергаются механическому воздействию, стираются, или их поверхности частично разрушаются.

Ротор вращается относительно статора. Статор может представлять собой корпус или деталь, сопряженную с ротором. Ротор может иметь режущие или перемешивающие элементы с кромками или перемешивающими поверхностями. Обычная конструкция имеет гребенчатую структуру со множеством режущих выступов (например, зубьев или зубцов), которые обычно расположены параллельно оси вращения и оказывают сдвиговое или режущее воздействие. В контексте настоящего описания «множество» может представлять собой, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более перемешивающих выступов.

Статор может быть выполнен в виде детали, сопряженной с ротором и, в частности, его режущими или перемешивающими элементами. Необязательно статор, аналогично ротору, может иметь собственные режущие или перемешивающие элементы, например, также в виде гребенки. Такие конструкции известны в стержневых гомогенизаторах, как описано в DE 10,2005,031,459 A1.

В других вариантах осуществления статор может представлять собой герметичную конструкцию, которая является обычной для проточных гомогенизаторов. Пример проточного ротор-статора описан в WO 2009/062610 A1.

Примерами ротор-статоров являются стержневые гомогенизаторы или сдвиговые насосы. Сдвиговые насосы используются, в частности, для проточных систем.

Между ротором и статором предпочтительно имеется зазор, например, по меньшей мере размером с клетку растения или более, чтобы клетки растения, по меньшей мере в виде протопласта, могли проходить между ротором и статором. Подходящими размерами зазоров являются 50 мкм, 70 мкм, 80 мкм, 100 мкм, 150 мкм или более, а также любой диапазон между этими расстояниями. Максимальный размер предпочтительно составляет не более 500 мкм или не более 300 мкм, или не более 200 мкм.

Как уже указывалось, интенсивность поддерживается на низком уровне с целью сохранения растительных клеток в форме протопласта, чтобы избежать или уменьшить загрязнение подлежащего сбору секретированного экспрессированного материала внутриклеточным содержимым. В случае обычных моделей ротор-статора, для этой цели уменьшают скорость, например, в вариантах осуществления, в которых ротор работает с максимальной скоростью 15000 об/мин, предпочтительно от 1000 до 15000 об/мин. Возможные скорости находятся в диапазоне от 3000 до 14000, от 4000 до 13000, от 5000 до 12000 или от 6000 до 11000 оборотов в минуту.

Растительные клетки могут находиться в контейнере, в котором размещен ротор-статор. Для этого ротор-статор может быть помещен в емкость со средой. Такая конструкция «периодического» действия (для непостоянного процесса) используется, в частности, со стержневым гомогенизатором. В крупномасштабном производстве предпочтительно использовать потоковые ротор-статоры. Согласно этому варианту, ротор-статор может иметь внутреннее пространство с по меньшей мере одним входом и одним выходом, через которые непрерывно протекает жидкая среда, проходящая через внутреннее пространство. Примером этого является сдвиговый насос для непрерывного процесса.

Предпочтительно статор ограничивает объем от 10 см³ (0,01 л) до 1 м³ (1000 л). Предпочтительные объемы находятся в пределах от 0,1 л до 800 л, или от 0,5 л до 600 л, или от 1 л до 400 л, от 2 л до 200 л. Предпочтительными являются объемы до 100 л, особенно предпочтительно от 0,65 л до 50 л, например, от 1 л до 40 л. Эти объемы особенно подходят для обработки растительных клеток в культуральных средах.

Предпочтительно количество обрабатываемой жидкой среды составляет до 50000 кг, предпочтительно от 0,5 г до 50000 кг, например, от 1 г до 25000, от 2 г до 10000 кг, от 5 г до 5000 кг, от 10 г до 2500 кг, от 20 г до 1000 кг, от 30 г до 500 кг, от 50 г до 250 кг, от 100 г до 100 кг, 200 г до 50 кг, 500 г до 250 кг, 1 кг до 100 кг, 2 кг до 50 кг или 4 кг до 20 кг. Такие количества предпочтительно используются за 1 проход периодического процесса.

Растительные клетки предпочтительно присутствуют в жидкой среде в концентрации от 0,2 г/л до 60 г/л (масса растительных клеток в виде сухого вещества). При этом предпочтительные концентрации растительных клеток (всегда сухие вещества) составляют от 0,5 г/л до 50 г/л, от 1 г/л до 40 г/л, от 2 г/л до 30 г/л, от 4 г/л до 20 г/л, особенно предпочтительно примерно 10 г/л, например, от 5 г/л до 15 г/л. Особенно эффективно эти концентрации растительных клеток могут быть обработаны с помощью ротор-статора.

Предпочтительно клетки растений обрабатывают в ротор-статоре в течение от 2 минут до 150 минут. В непрерывном процессе это время относится к среднему времени обработки растительных клеток. Предпочтительное время составляет, в частности, от 3 до 120 мин, от 5 до 100 мин, от 8 до 80 мин, от 10 до 60 мин, или более предпочтительно от 12 до 40 мин. Другое возможное время предпочтительно составляет от 1 часа до 24 часов, предпочтительно от 2 часов до 20 часов, от 3 часов до 16 часов, от 4 часов до 12 часов. Таким образом, любое предпочтительное время обработки находится в диапазоне от 3 минут до 24 часов и в любом диапазоне между указанными временами обработки или даже больше.

Растительные клетки предпочтительно можно культивировать в суспензионной культуре. Эту суспензию можно обрабатывать непосредственно как жидкую среду способом по изобретению. В качестве альтернативы сначала также можно выделить мох, например, из твердой культуры, жидкой культуры или суспензионной культуры, а затем суспендировать в водной среде в условиях, подходящих для роторностаторной обработки. Растения, особенно подходящие для способа по изобретению, представляют собой недревесные растения. Предпочтительно растения представляют собой водоросли и мхи, особенно мохообразные. Мохообразным растением или клеткой предпочтительно является мох, предпочтительно P. patens. Мохообразное может представлять собой любое мохообразное, но предпочтительно его выбирают из мха, печеночника или роголистника, наиболее предпочтительно из класса Bryopsida или родов Physcomitrella, Funaria, Sphagnum, Ceratodon, Marchantia и Sphaerocarpos. Особенно предпочтительным является Physcomitrella patens. Способ по изобретению наиболее предпочтительно осуществлять с использованием клеток из ткани растений, например, протонемы мха Physcomitrella patens. Предпочтительные водоросли выбирают из зеленых водорослей, например, из отряда Chlorellales, предпочтительно из семейства Chlorellaceae, более предпочтительно из рода Auxenochlorella или Chlorella, в частности из Chlorella vulgaris, и из отряда Volvocales, предпочтительно из семейства Haematococcaceae, более предпочтительно из рода Haematococcus, в частности из Haematococcus pluvialis, и порядка Eustigmatales, предпочтительно семейств Loboceae, Chlorobothryaceae, Pseudocharaciopsidaceae и Eustigmataceae. Другими предпочтительными растениями являются табак, бобы или чечевица. Предпочтительно растение представляет собой водное растение, например, из рода Lemna, Spirodela, Landoltia, Wolffia или Wolffiella.

Изобретение относится к растительным клеткам. В контексте настоящего описания «растительная клетка» может относиться к выделенной клетке, одиночной клетке, а также к клетке растительной ткани или полученной из нее, предпочтительно ткани, выбранной из каллуса, протонемы, флоэмы, ксилемы, мезофилла, стебля, листа, слоевища, хлоронемы, ризоида или гаметофора, или клетки растительного организма.

В способе по изобретению среда предпочтительно имеет физиологический рН, в частности, как уже было описано, для сохранения протопластов (клеточных компонентов внутри клеточной стенки, особенно из клеточной мембраны) с целью предотвращения загрязнения экспрессированного материала в апопласте/на поверхности клеток. pH жидкой среды предпочтительно находится в пределах от 3,5 до 8,5, более предпочтительно от 4 до 8, или от 4,5 до 7, или от 5 до 6,5, особенно от 5,5 до 6, или комбинации этих диапазонов, таких как от pH 5 до 8.

Аналогичным образом, для защиты протопластов осмолярность жидкой среды предпочтительно должна быть физиологической, в частности, чтобы избежать стресса набухания, например, когда осмолярность является слишком низкой. При необходимости может быть указан верхний предел осмолярности, чтобы избежать стресса осмотического усадки. Предпочтительно осмолярность среды составляет по меньшей мере 0,1 осмоль/л или предпочтительно по меньшей мере 0,150 осмоль/л. Осмолярность можно регулировать растворенными веществами, такими как соли или другие компоненты среды, такие как сахар или сахарные спирты. Предпочтительно используют соль щелочного металла, такого как Na⁺ и/или K⁺. В качестве аниона предпочтительно используют галогенид, такой как Cl^-, F^- или I^-, фосфат или ацетат. Также возможны буферные компоненты, такие как Трис (трис(гидроксиметил)аминометан).

Кроме того, для дополнительной защиты протопластов в жидкую среду для роторностаторной обработки могут быть добавлены поверхностно-активные полимеры. Поверхностно-активные полимеры описаны, например, в WO 2013/156504 A1, и предпочтительно включают незаряженные полимеры, такие как эмульгаторы, например, полиалкилгликоли, в частности полиэтиленгликоль. В частности, полимер представляет собой неионогенный водорастворимый поверхностно-активный полимер. Предпочтительно он не приводит к денатурации белка. Примерами являются полимеры или сополимеры, выбранные из простых полиэфиров, таких как полиалкилгликоли, полисорбаты или поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, водорастворимые производные целлюлозы, такие как гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза или гидроксиэтилцеллюлоза, сополимер винилпирролидона и винилацетата (коповидон), поливинилацетат, частично гидролизованный поливиниловый спирт, сополимеры поливинилового спирта и полиэтиленгликоля и их смеси. Другими вариантами являются полисорбат, например, полиоксиэтилен сорбитан монолаурат, полиоксиэтилен сорбитан моноолеат, полиоксиэтилен сорбитан монопальмитат, полиоксиэтилен сорбитан моностеарат, полиоксиэтилен сорбитан тристеарат, предпочтительно полисорбат 80 (полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеат, Tween® 80), полиоксиэтилен (40) стеарат. Поверхностно-активный полимер предпочтительно присутствует в среде в концентрации по меньшей мере 0,05% по массе, особенно предпочтительно по меньшей мере 0,08%, по меньшей мере 0,1% или по меньшей мере 1,5% (все проценты даны в % по массе). Молекулярная масса поверхностно-активного полимера, например, ПЭГ и т.п., предпочтительно составляет не менее 500 Да, более предпочтительно по меньшей мере 1000 Да, по меньшей мере 1500 Да, по меньшей мере 2000 Да, по меньшей мере 3000 Да, по меньшей мере 4000 Да, по меньшей мере 6000 Да, по меньшей мере 8000 Да, по меньшей мере 10000 Да, по меньшей мере 20000 Да, по меньшей мере 30000 Да. Особенно предпочтительной является молекулярная масса от 500 Да до 2000000 Да, предпочтительно от 1000 Да до 200000 Да или от 1200 Да до 80000 Да.

Жидкая среда предпочтительно представляет собой водную среду, в частности воду или водные смеси, совместимые с клетками. В частности, она может быть культуральной средой для (и с) растительных клеток, при условии, что растения не были предварительно отделены от нее.

Предпочтительно, чтобы экспрессированный материал был экспрессирован перед роторностаторной обработкой растительных клеток с тем, чтобы он накапливался на поверхности растительных клеток или в апопласте. Растительные клетки можно культивировать и/или выращивать, например, в среде в условиях, обеспечивающих рост растений (питательная среда, свет), которые общеизвестны (см., например, Frank et al. Plant Biol 7, (2005):220-227). Экспрессию или культивирование предпочтительно осуществляют в течение от 13 минут до 1 месяца (30 дней) или дольше, например, от 2 месяцев (60 дней), например, от 1 часа до 22 дней, или от 5 часов до 15 дней, например от 10 часов до 7 дней, или от 20 часов до 3 дней. В непрерывной клеточной культуре с периодическим удалением клеток для извлечения продукта (экспрессированного материала) эти временные диапазоны или минимальное время может соответствовать среднему времени нахождения клетки в культуре.

Следует избегать других процедур, которые приводят к повреждению, лизису или гомогенизации протопласта. Клеточная стенка предпочтительно не подвергается лизису, в частности, не не подвергается ферментативному лизису и/или химическому лизису химически, и/или осмолитическому лизису и/или лизису ультразвуком. Помимо роторностаторной обработки по изобретению, клеточная стенка предпочтительно должна оставаться нетронутой или неповрежденной. В частности, клеточная мембрана (протопласт) должна оставаться интактной, при этом жизнеспособность клеток не играет особой роли в способе по изобретению, но необходимо избегать контаминации жидкой среды внутриклеточными компонентами, в частности клеточной плазмой.

Далее настоящее изобретение описано с помощью приведенных ниже чертежей и примеров, и не ограничивается этими вариантами осуществления.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1: Определение количества выделяемой в воду энергии гомогенизатором Ultraturraxstab T25 (IKA/Staaufen). (A) Кривая температуры для 1,5 л воды при скорости вращения 10000 об/мин; (B) Вычисленное количество выделенной энергии [кДж]; (C) Вычисленное количество выделенной энергии [кДж/кг].

Фиг. 2: Определение количества выделяемой в воду энергии гомогенизатором Shearpump FSP712VC-2.2kW-FU (Fristram/Hamburg). (A) Кривая температуры для 50 л воды при скорости вращения 2800 об/мин (B) Вычисленное количество выделенной энергии [кДж]. (C) Вычисленное количество выделенной энергии [кДж/кг].

Фиг 3: Процент высвобождения продукта, связанного с биомассой (moss-aGal), при обработке с помощью сдвигового насоса (пунктирная линия) и Ultraturraxstab T25 (сплошная линия). Обработку культуры в реакторе с помощью сдвигового насоса выполняли в объеме 50 л. Обработку культуру в реакторе с помощью Turraxstab T25 выполняли в объеме 0,65 л.

Фиг. 4: Удельное выделение энергии Ultraturraxstab T25 (A) и сдвиговым насосом (B), в обоих случаях для 10 г/л сухой биомассы. Удельное выделение энергии Ultraturraxstab T25 в контрольном примере при 19000 об/мин на 1 г/л сухой биомассы (С).

Фиг 5: Процент высвобождения связанного с биомассой продукта (moss-aGal) при обработке с помощью сдвигового насоса (пунктирная линия) и Ultraturraxstab T25 (сплошная линия). Обработку культуры в реакторе с помощью сдвигового насоса выполняли в объеме 50 л. Обработку культуры в реакторе с помощью Turraxstab T25 выполняли в объеме 0,65 л. Биомасса: 9,2 г/л (сдвиговый насос), 8,2 г/л (T25).

Фиг. 6: Вестерн-блот анализ высвобождения продукта (moss-aGal) по сравнению с высвобождением внутриклеточных маркерных белков (Rubisco, большая субъединица). Внутриклеточные белки в солевых средах (например, 20 мМ трис, 100 мМ NaCl, pH=7) могут быть обнаружены в минимальных количествах при выделении энергии до 32,9 кДж/кг. В условиях осмотического стресса (деминерализованная вода) обнаружение возможно при примерно 10 кДж/кг. Количество целевого белка (moss-aGal) увеличивается в солевых средах и в условиях осмотического стресса в зависимости от количества выделяемой энергии.

Фиг. 7: Микроскопический анализ процесса с использованием Т25 в деминерализованной воде. Клетки мха сохраняют целостность до выделения энергии на уровне 16,5 кДж/кг. При выделении энергии на уровне 32,9 кДж/кг клетки остаются целыми, но количество присутствующих частиц заметно увеличено, что свидетельствует о начале разрушения клеток.

Фиг. 8: Микроскопический анализ процесса с использованием Т25 в солевом буфере (20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, pH=7). Клетки мха сохраняют целостность до выделения энергии на уровне 16,5 кДж/кг. При выделении энергии на уровне 32,9 кДж/кг клетки остаются целыми, но количество присутствующих частиц заметно увеличено, что свидетельствует о начале разрушения клеток.

Фиг. 9: Микроскопический анализ процесса с использованием сдвигового насоса в солевой среде (реакторная культура). Клетки мха сохраняют целостность до выделения энергии на уровне 18,41 кДж/кг. При выделении энергии на уровне 27,20 кДж/кг целостность клеток сохраняется, но количество присутствующих частиц заметно увеличено, что свидетельствует о начале разрушения клеток.

Фиг. 10: Микроскопический анализ процесса с использованием сдвигового насоса в деминерализованной воде. Клетки мха сохраняют целостность до выделения энергии на уровне 9,62 кДж/кг. При выделении энергии на уровне 18,41 кДж/кг целостность клеток сохраняется, но количество присутствующих частиц заметно увеличено, что свидетельствует о начале разрушения клеток.

Фиг. 11: Микроскопический анализ клеток мха в процессе с ультразвуковой обработкой в качестве контрольного изображения разрушения клеток. Клетки теряют свою целостность уже через короткий промежуток времени (1 мин ультразвуковой обработки). Уже через 3 мин видны только фрагменты клеток и пустые клеточные оболочки. (Эффективность 100% в партии 50 мл).

Фиг.12: Сравнительный пример: определение количества выделенной в воду энергии гомогенизатором Т25 (IKA/Staaufen) при высокой энергии и скорости 19000 об/мин (A) Температурный профиль 1 л воды. (B) Вычисленное количество выделенной энергии [кДж]. (C) Вычисленное количество выделенной энергии [кДж/кг].

Фиг. 13: Сравнительный пример: Значительно более быстрое высвобождение продукта при 19000 об/мин, в частности, при выделении энергии до 7 кДж/кг. Выделении энергии до 84 кДж/кг приводит к потере продукта из-за высокой температуры и напряжения сдвига.

Примеры:

Пример 1: Определение количества выделяемой энергии при использовании Turraxstab и сдвигового насоса.

В качестве параметра измерения количества выделяемой в водную среду энергии использовали температуру. 1,5 л H₂O диспергировали в сосуде Дьюара с помощью Turraxstab T25-S25N-18G (IKA Staufen) при 10000 об/мин в течение 30 мин и измеряли температурный профиль. Во время тестирования комнатная температура находилась в пределах 20,5-20,7°С. Величину выделяемой энергии определяли по удельной теплоотдаче (4190 Дж кг-1K-1) H₂O. Для сравнения с литературными данными (Orellana-Escobedo et al., Plant Cell Rep. 2015, 34(3), 425-433) определяли величину выделяемой энергии аналогичным образом при 19000 об/мин.

С помощью сдвигового насоса (Shearpump FSP 712, Fristam Hamburg) осуществляли циркуляцию 50 л H₂O со скоростью 2800 об/мин из резервуара для хранения Nalgene через шланги из армированного ПВХ. Измерение температуры в резервуаре для хранения Nalgene выполняли с помощью датчика температуры (прецизионный термометр, G002.1, Carl Roth). Экспериментальная установка была реализована в помещении с температурой 19°С. В этом эксперименте температурными потери в окружающую среду не учитывались. Величину выделяемой энергии вычисляли по удельной теплоотдаче (4190 Дж кг-1К-1) воды.

Пример 2: Получение культуры мха

Штаммы-продуценты мха культивировали аксиально в течение 3-4 недель в 200-литровых одноразовых биореакторных мешках (Cellbag 200, GE Healthcare) в биореакторах Wave^ТМ Rocking Motion (Wave200, Ge Healthcare). Параметры культивирования были следующими: частота встряхивания находилась в пределах от 19 до 25 об/мин, угол встряхивания составлял 9°, температура находилась в пределах от 24 до 26°С, скорость газообразования составляла 2 л/мин, и обогащение приточного воздуха составляло 2% СО₂. Для освещения использовали 4 светодиодных модуля со светодиодами «теплого белого» света, которые были установлены над биореакторными мешками (серийные номера от 120268 до 120282, Infors AG). Мох выращивали при круглосуточном непрерывном освещении. Чреда SM07 (100 мМ NaCl, 6,6 мМ KCL, 2,0 мМ MgSO₄×7H₂O, 1,8 мМ KH₂PO₄, 20,4 мМ Ca(NO₃)₂×4H₂O, 0,05 мМ Fe Na-ЭДТА, 4,9 мМ сольват, 0,1% (вес/объем) ПЭГ4000, 100,26 мкМ H₃BO₃, 0,11 мкМ CoCl₂×6H₂O, 0,1 мкМ CuSO₄×5H₂O, 5 мкМ KI, 85,39 мкМ MnCl₂×4H₂O, 1,03 мкМ Na₂MoO₄×2H₂O, 0,11 мМ NiCl₂×6H₂O, 0,04 Na₂SeO₃×5H₂O, 0,039 Zn-ацетат x 2H₂O), дополненная витаминами 1000x Nitsch (смесь витаминов Nitsch, Duchefa, согласно инструкциям производителей), служила в качестве среды с минеральными солями. Значение рН, равное 5-6, контролировали с помощью WAVEPOD I и Pump20 (GE Healthcare) путем автоматического добавления 0,25 М H₂SO₄ и 0,25 М NaOH. Экспрессию рекомбинантной α-галактозидазы (aGal или α-Gal A) осуществляли как описано в WO 2016/146760 A1 («moss-aGal»).

Пример 3: Высвобождение связанного со мхом продукта и аналитические методы

Для анализа динамики высвобождения связанного со мхом продукта на культуру, полученную в примере 2, воздействовали разной энергией, выделяемой Turraxstab T25-S25N-18G и Shearpump FSP 712. Определение концентрации высвобождаемого продукта cPL (cPL) выполняли методом moss-aGal-ELISA (Biogenes/Германия). Степень разрушения клеток определяли с помощью микроскопического анализа изображений клеток мха (микроскоп: Axiovert 200 oper Stemi SV11, снабженный камерой AxioCam; программное обеспечение AxioSoft и источник холодного света KL 1500 LCD (Carl Zeiss)). Сравнение с микроскопическими изображениями полного разрушения осуществляли с помощью микроскопического анализа после разрушения ультразвуком в объеме 50 мл (зонд: UW2070, Bandelin; усилитель: HD 2070, Bandelin) при 100% мощности в течение 20 мин. Для качественного анализа высвобождаемого продукта и внутриклеточного маркера, белка Rubisco, на молекулярном уровне использовали вестерн-блоттинг. В качестве вторичных антител использовали анти-aGal (H00002717-D01P, Abnova) и анти-Rubisco (AS03037, Agrisera) и анти-Rabbit HRP (Abcam, AS03037).

Для анализа соотношения между высвобождаемым (cPL) и связанным со мхом высвобождаемым продуктом (cPX) необработанную культуру подвергали обработке для разрушения клеток с помощью шаровой мельницы (стальные шары: RB-3/G20W, Schleer; шаровая мельница: MM300, Retsch). После отделения клеточных фрагментов концентрацию продукта определяли с помощью ELISA (Biogenes). В этом анализе определяли экспрессированный белок aGal (α-галактозидазу, также «moss-aGal») в апопластическом пространстве.

Пример 4: Результаты и обсуждение

Величину энергии (в виде тепла в кДж/кг, на кг жидкой среды), выделяемой в культуральную среду (кг) двумя разными гомогенизаторами - Turraxstab T25-S25N-18G и Shearpump FSP 712 - определяли путем измерения температуры (фиг. 1-5). В этом примере гомогенизаторы были настроены на низкую скорость вращения для обеспечения низкой теплоотдачи (в кДж/кг/мин). Таким образом можно было определить общее количество теплоты за определенный период времени (0-60 мин). В этом случае выделяемую в воду энергию вычисляли с помощью относительного температурного коэффициента для H₂O [4,182 кДж/кг*К] на основе измеренной температуры. Вычисляли теплоту (фиг. 1-3) или удельную теплоту относительно сухого вещества частей растения (фиг. 4-5).

На фиг. 3 и 5 показано высвобождение продукта, желаемого белка (рекомбинантная aGal из мха, «moss-aGal»), который накапливается на поверхности и в апопласте, соответственно. С усилением обработки высвобождение также увеличивается.

В сравнительных испытаниях Turraxstab работал в режиме высокой теплоотдачи, а именно при 19000 об/мин (фиг. 4С, 12-13). Теплоотдача была примерно в 100 раз выше, чем при щадящей обработке при 10000 об/мин (см. фиг. 4А и 4С). Работа в режиме высокой теплоотдачи быстро приводила к высвобождению продукта, но также и к разрушению клеток (протопластов), в результате чего происходит загрязнение внеклеточного продукта внутриклеточными компонентами. Эти эффекты проявляются уже через 1 минуту обработки.

На фиг.6 показано качество высвобожденного продукта, внеклеточного белка (moss aGal), и внутриклеточного белка Rubisco. Rubisco обнаружен в высоких концентрациях в растительных клетках и поэтому использовался в качестве высокочувствительного маркера утечки содержимого клеток. В экспериментах с физиологическим раствором увеличение высвобождения Rubisco можно наблюдать при высоком уровне выделения энергии (теплоты) - более 32,9 кДж/кг. В сравнительном тесте с деминерализованной водой (деионизированная вода) загрязнение Rubisco происходит раньше, примерно при 10 кДж/кг, поскольку дополнительно к сдвиговому усилию, вызываемому гомогенизатором, проявляются осмолитические эффекты. Различное количество теплоты (выделения энергии) контролировали по времени обработки.

Эти результаты отражены в микроскопическом анализе клеточных агрегатов после обработки. На фиг. 7 показаны результаты после обработки ротор-статором Ultraturrax в деминерализованной воде; на фиг. 8 показаны результаты после обработки ротор-статором Ultraturrax в физиологических условиях (20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, pH=7). На фиг. 9 показаны агрегаты клеток после обработки с помощью сдвигового насоса в физиологических условиях. С увеличением времени обработки (теплоты) увеличивается количество частиц, предположительно образованных разрушенными клетками. Начиная примерно с 30 кДж/кг разрушение клеток увеличивается. Для сравнения на фиг.10 показаны испытания в деминерализованной воде со сдвиговым насосом. В этом случае сопоставимые частицы встречаются уже при энергии примерно 20 кДж/кг.

Для сравнения с фиг.7-10 на фиг.11 показано разрушение клеток ультразвуком. Клетки теряют целостность уже через 1 мин.

Это означает, что, с одной стороны, следует ограничить выделение энергии в единицу времени (интенсивность вращения ротор-статора; теплоотдачу), а также абсолютное количество выделяемой энергии (теплоты) - в данном эксперименте, контролируемое продолжительностью обработки. Эти параметры могут использоваться сами по себе или относительно биомассы (сухая биомасса, TBM). Разумными максимальными показателями мягкого процесса, который позволяет отделить как можно больше абсорбированных или связанных с апопластом продуктов, оставляя при этом протопласты практически неповрежденными, являются 3 кДж/кг на г/л сухого вещества и 1,5 кДж/кг/мин на г/л или 30 кДж/кг и 1,5 кДж/кг/мин. В зависимости от интенсивности вращения возможное время обработки при такой низкой теплоотдаче составляет от 2 минут до 150 минут, которое, как правило, является более длительным, по сравнению с короткими, но интенсивными режимами обработки, которые использовались до настоящего времени.

Изобретение относится к способу отделения экспрессированного материала от поверхности растительных клеток или апопласта. Способ отделения экспрессированного материала от поверхности или апопласта растительных клеток, где растительные клетки обрабатывают в жидкой среде с помощью ротора-статора, где удельная теплота, выделяемая ротором-статором при вращении ротора, не превышает 3 кДж на кг жидкой среды и на г/л сухого вещества растительных клеток и удельная теплоотдача в среду не превышает 1,5 кДж на кг жидкой среды в минуту и на г/л сухого вещества растительных клеток. Вышеописанный способ позволяет в щадящем режиме удовлетворительно отделить экспрессированный материал от поверхности или апопласта растительных клеток. 14 з.п. ф-лы, 13 ил., 4 пр.

1. Способ отделения экспрессированного материала от поверхности или апопласта растительных клеток, где растительные клетки обрабатывают в жидкой среде с помощью ротора-статора, где удельная теплота, выделяемая ротором-статором при вращении ротора, не превышает 3 кДж на кг жидкой среды и на г/л сухого вещества растительных клеток и удельная теплоотдача в среду не превышает 1,5 кДж на кг жидкой среды в минуту и на г/л сухого вещества растительных клеток.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экспрессированный материал находится в апопласте растительной клетки.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что теплота ротора-статора, выделяемая при вращении ротора, составляет по меньшей мере 1 кДж на кг жидкой среды и/или удельная теплота ротора-статора составляет по меньшей мере 0,1 кДж на кг жидкой среды и на г/л сухого вещества растительных клеток.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что теплоотдача в среду при вращении ротора составляет по меньшей мере 0,2 кДж на кг жидкой среды в минуту и/или удельная теплоотдача в среду составляет по меньшей мере 0,02 кДж на кг жидкой среды в минуту и на г/л сухого вещества растительных клеток.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что экспрессированный материал содержит белки и/или экспрессированный материал представляет собой секретированный материал, предпочтительно белки, секретированные через клеточную мембрану.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что ротор-статор помещают в емкость со средой.

7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что ротор-статор имеет внутреннее пространство, имеющее по меньшей мере один вход и выход, через которые непрерывно протекает жидкая среда, проходящая через внутреннее пространство.

8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что статор ограничивает объем от 10 см³ до 1 м³, и/или количество обрабатываемой жидкой среды составляет до 50 кг, предпочтительно от 0,5 г до 50 кг.

9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что растительные клетки присутствуют в концентрации от 0,2 г/л до 60 г/л в жидкой среде (масса растительных клеток в пересчете на сухую массу).

10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что растительные клетки представляют собой клетки мха, предпочтительно клетки P. patens.

11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что ротор работает с максимальной скоростью 15000 об/мин, предпочтительно от 1000 до 15000 об/мин.

12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что ротор-статор представляет собой стержневой гомогенизатор или сдвиговый насос, и/или где статор имеет гребенчатую структуру.

13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что теплота, выделяемая ротор-статором при вращении ротора, составляет не более 30 кДж на кг жидкой среды, и теплоотдача в среду составляет не более 1,5 кДж на кг жидкой среды в минуту.

14. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что среда имеет рН в диапазоне от 5 до 8 и/или осмолярность по меньшей мере 0,1 осмоль/л.

15. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что клетки растений обрабатывают ротор-статором в течение от 2 минут до 150 минут.