Способ диагностики дисбиоза микробиоты секрета простаты у больных хроническим бактериальным простатитом Российский патент 2025 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к урологии, может быть использовано для диагностики хронического бактериального простатита после антибактериального лечения, а также при мониторинге и коррекции контроля лечения пациентов с ХБП.

Хронический простатит является наиболее распространенным урологическим диагнозом у мужчин моложе 50 лет и третьим по частоте диагностируемым мужским урологическим заболеванием. Несвоевременная диагностика и лечение хронического простатита может привести к серьезным осложнениям не только репродуктивного характера, но и таким осложнениям, как доброкачественная гиперплазия предстательной железы, а также рак предстательной железы [Vestby L.K., Grønseth T., Simm R., Nesse L.L. Bacterial Biofilm and its Role in the Pathogenesis of Disease. Antibiotics (Basel). 2020. Vol. 9 No.2. P. 59].

Термины микробиом и микробиота были включены в клиническую терминологию, и, несмотря на их различия, часто используются как одинаковые. Микробиом - это совокупность всех геномов микроорганизмов (комменсальных, патогенных и симбиотических) в анатомической среде, в то время как термин микробиота относится к бактериям, которые существуют в данной биосистеме [Lee J.W., Shim Y.H., Lee S.J. Lactobacillus colonization status in infants with urinary tract infection. Pediatr Nephrol. 2009; 24 (1): 135-139. https://doi.org/10.1007/s00467-008-0974-z].

Благодаря использованию метод секвенирование 16S рРНК для исследования секрета простаты и мочи, выявлено, что микробиом секрета простаты и мочи у здоровых не стерилен и сравнительный анализ показал, повышенное количество типов бактерий, таких как Clostridia и Bacteroides у пациентов хроническим простатитом [Shoskes D.A., Altemus J.,Polackwich A.S.,Tucky B.,Wang H.,Eng C.The urinary microbiome differs significantly between patients with chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome and controls as well as between patients with different clinical phenotypes.//Urology. 2016; (pii: S0090-4295(16)00267-3. https://doi.org/10.1016/j.urology.2016.02.043)], было выше в группе пациентов с ХП/СХТБ, чем в контрольной группе.

Изменения в микробиоме возникают при разном фенотипе и различной степени выраженности симптомов, что приводит к ожидаемому нарушению функции мочевыводящих путей и требует патогенетического лечения [Коган М.И., Набока Ю.Л., Исмаилов Р.С. Микробиота секрета простаты: сравнительный анализ хронического простатита категорий II и IIIA. Урология. 2020; 2: 16-22. https://doi. org/10.18565/urology.2020.2.16-22].

Основным методом лечения хронического бактериального простатита (ХБП) является прием антибактериальных препаратов (АБП), вместе с тем влияние этих препаратов на микробиоты простаты не известно. В литературе имеются работы связанные с влиянием антибиотиков на микрофлору кишечника и некоторых других органов, кроме простаты. С другой стороны, микробиота многих органов, включая мочевых путей во многом зависит от микробиоты кишечника [Жуков В.А., 2023; Sonnenburg E.D. И соавт., 2019].

Массовое неправильное применение антибиотиков привело к растущей резистентности к антибиотикам и нежелательным воздействием на экосистему микробиоты человека, которые в результате нарушения состава микробиоты и сопутствующей потери ее функциональных свойств люди, могут лишиться набора бактерий, оптимального для поддержания здоровья [Schwartz, D.J. и соавт., 2020]. Все это вызывает необходимость привлечения внимание к этой проблеме медицинскому сообществу и выработки четких инструкции со стороны органов управления здравоохранением.

Нарушение экологического баланса микробиома кишечника, обычно вызванное приемом антибиотиков, может вызывать и обострять заболевания разных органов, включая простату. В настоящее время для изучения разнообразия кишечной микробиоты существует технология метагеномного ДНК-секвенирования, с помощью которой возможно узнать, какие микроорганизмы присутствуют в кишечнике и какую патогенетическую роль играют в развитии воспалительных заболеваний. Кроме того, внедрение метагеномного ДНК-секвенирования приведет к снижению использованию антибиотиков за счет выявления устойчивых к антибактериальным препаратам микроорганизмов, что может привести к предотвращению растущей резистентности бактерий к антибактериальным препаратам [Khan F. U., Ihsan A.U., Khan H.U., Jana R., Wazir J., Khongorzul P., Waqar M., Zhou X. Comprehensive overview of prostatitis. Biomed Pharmacother. 2017. Vol. 94. P. 1064-1076]. Доказано, что основной причиной развития хронического рецидивирующего бактериального простатита является Escherichia coli, которая встречается самостоятельно или в сочетании различными видами других микроорганизмов, таких как Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus, Proteus, Klebsiella, Enterobacter и виды Serratia, то есть представителями кишечной микробиоты [Яковец Е.А., Шрайнер Е.В. Изучение роли кишечного микробиома у пациентов с хроническим бактериальным простатитом // Научное обозрение. Фундаментальные и прикладные исследования. - 2023. - № 5].

Залогом успешного устранения нарушений микробиомы лежит не только на знание таксономической и функциональной динамики изменений микробиомы на протяжении младенчества, детства и взрослой жизни, но и устойчивость микробиомы в зависимости от множества важных факторов, таких как характер, сроки, продолжительность и спектр курса антибиотиков, а также от факторов, влияющих на микробиом, таких как возраст, перемещения, основное заболевание, характер устойчивости к антибиотикам и диета [Schwartz, D.J. и соавт., 2020].

J.B. Marand A и соавт. (2021) обобщая литературу о микробиоме мочи, зафиксировали, что здоровые мочевыводящие пути содержат множество микроорганизмов, создающих микробиом мочи, но, как правило, отклонения в микробиоме наблюдаются у людей с урологическими заболеваниями. Изучение микробиоты мочи изменит подходы ведения пациентов в урологической практике. Молекулярные методы определения состава мочи позволят перестроить терапевтическую парадигму - вместо истребления патогенных микроорганизмов антибактериальными препаратами новые знания направлены на повышение роли полезных бактерий в биосистеме мочевыводящих путей и восстановлении нужных микробных сообществ в нижних отделах мочевыводящего тракта. Дальнейшие исследования различий между здоровыми и больными микробиомами, долгосрочного воздействия антибиотикотерапии на уробиом и влияния микробиомы мочи на общее состояние здоровья будут важны для формирования всестороннего понимания микробиома мочи и его взаимосвязи с организмом человека.

Аналогичное мнение на основании обзора литературы высказывают Colella M и соавт (2023) и отмечают, что мочевыводящие пути у здоровых людей не стерильны, дисбактериоз и негативное изменение качественного и количественного состава определенных штаммов микроорганизмов, вызванное местными или системными причинами, может привести к серьезным заболеваниям. Авторы отмечают, что несмотря на то, что мы находимся на ранней стадии разработки и коррекции дисбиоза пребиотиками и пробиотиками, есть обнадеживающие результаты, которые, безусловно, вызывают необходимость в дальнейших клинических исследований.

В настоящее время воздействие антибиотиков в основном изучена на микробиоты кишечника и необходимы дальнейшие исследования в исследовании микробиоты других органов, включая мочеполовых органов во взаимосвязи с кишечной микробиотой.

Стандартный посев и полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяют выявить патогенный микроорганизм, вызывающий бактериальный простатит, но не смогут отразить истинный статус возбудителей, так как многие некультивирумые аэробы и анаэробы, и вирусы не диагностируются. Кроме того, культуральным методом невозможно количественно определить микроорганизмы после лечения [Осипов Г.А., Родионов Г.Г., 2013].

В связи с выше указанное нами для оценки влияние антибактериальной терапии на микробиоты СПЖ использовался более доступный для практического применения метод газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХМС) биотопов - некультуральный метод идентификации микробных маркеров, который имеет широкий диагностический диапазон: единичный анализ дает информацию о количественном присутствии 57 микроорганизмов, включая анаэробы, актинобактерии, вирусы и грибы [Осипов Г.А., Родионов Г.Г., 2013].

Описана технология метагеномного ДНК-секвенирования, которая позволяет посчитать сотни видов бактерий кишечника, в том числе и некультивируемых. Данный метод является “золотым стандартом” для максимально полного анализа микробиоты кишечника. С помощью метагеномного ДНК-секвенирования можно узнать какие микроорганизмы и в каком процентном соотношении представлены в кишечнике, какие микроорганизмы влияют на здоровье и организм в целом, какую патогенетическую роль играют в развитии различных заболеваний, в том числе воспалительных заболеваний предстательной железы Изучение бактерий кишечной микрофлоры, присутствующих в эякуляте, как потенциальных прогностических маркеров хронического простатита имеет важное значение как для постановки диагноза, так и для выбора антибактериальных препаратов [Яковец Е.А., Шрайнер Е.В. Изучение роли кишечного микробиома у пациентов с хроническим бактериальным простатитом // Научное обозрение. Фундаментальные и прикладные исследования. - 2023. - № 5]. Внедрение метагеномного ДНК секвенирования приведет к снижению использования антибиотиков за счет выявления устойчивых к антибактериальным препаратам микроорганизмов, что может привести к предотвращению растущей резистентности бактерий к антибактериальным препаратам [Kulchavenya E.V., Brijatuk E.V., Kholtobin D.P., A CG. Current approach to diagnosis of chronic prostatitis. Urologiia. 2021. No. 2. P. 32-39].

Известен способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности, характеризующийся тем, что с помощью метода ПЦР в «реальном времени» в исследуемой биопробе определяют общее число геномов микроорганизмов, характерных для конкретного биотопа, число геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты, полученные величины сравнивают между собой, определяют соотношение между числом геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты и при превышении числа геномов нормобиоты относительно числа геномов условно-патогенной биоты в 1000 раз констатируют отсутствие дисбаланса, оценивая данный показатель как вариант нормы, а при значении данного показателя менее чем 1000 раз диагностируют дисбаланс и устанавливают степень его выраженности путем определения соотношения между числом геномов нормобиоты и общим числом геномов микроорганизмов, присутствующих в исследуемой пробе, а также между числом геномов условно-патогенной биоты и нормобиоты и при снижении числа геномов нормобиоты относительно общего числа геномов микроорганизмов в 10-100 раз и снижении числа геномов условно-патогенной биоты относительно числа геномов нормобиоты в 100-1000 раз устанавливают легкую степень дисбаланса, а при превышении числа геномов нормобиоты относительно общего числа геномов микроорганизмов более чем в 100 раз, и превышении числа геномов условно-патогенной биоты относительно числа геномов нормобиоты в 10 раз и более или менее этой величины устанавливают выраженную степень дисбаланса [патент RU №2362808, опубл. 27.07.2009].

Данная технология - запатентованная компанией «ДНК-Технология» [патент RU №2362808, опубл. 27.07.2009] и зарегистрированная в МЗ РФ в качестве медицинского диагностикума Андрофлор® (Регистрационное удостоверение № РЗН 2016/4490 от 25.07.2016 г.) - это способ количественного исследования микрофлоры урогенитального тракта мужчин методом ПЦР в реальном времени. В основе исследования - современные представления о сложном составе микробиома (набор микроорганизмов, живущих в организме человека) [https://www.uroweb.ru/partners_docs/ДНК_Технология/Андрофлор.pdf].

Недостатком указанного способа является исследование всего 24 микроорганизмов без определения вирусов, из-за низкого порога чувствительности при низком уровне микроорганизмов количественный подсчет невозможен и способ используют в качестве диагностики, что ограничивает его возможности.

Известен способ определения бактериологической обсеменённости мочи, секрета предстательной железы и эякулята факультативно-анаэробными и неклостридиально-анаэробными бактериями, включающий забор материала, его посев на селективные питательные среды, выделение и идентификацию культур микроорганизмов, отличающийся тем, что производят посев мочи, секрета предстательной железы и эякулята на среду Блаурокка, бульон Шадлера, агар Шадлера, кровяной агар (КА) на основе среды Мюллер-Хинтон, желчно-эскулиновый агар для бактероидов - для культивирования неклостридиально-анаэробных бактерий; среду Эндо, хромогенный селективный агар для энтерококков, хромогенный селективный агар для кандид, хромогенный селективный агар для клебсиелл, хромогенный селективный агар для стафилококков, КА на основе среды Мюллер-Хинтон - для культивирования факультативно-анаэробных бактерий в последовательных разведениях от 10-1 до 10-10 и выявляют факультативно-анаэробные и неклостридиально-анаэробные бактерии и их концентрацию с минимального уровня разведений 10-1 [Патент RU №2452774, опубл. 10.06.2012].

Недостатком данного метода является то, что исследование констатирует наличие бактериального простатита только культивируемым микроорганизмам и нет возможности определить некультивируемые аэробы и анаэробы и наличие вирусов, а также количественное определение микроорганизмов.

Близким к заявленному техническому решению является способ определения референтных значений показателей микроорганизмов в предстательной железе, исследуемых методом хромато-масс-спектрометрии, включающий в себя вычисление референтного диапазона норм, значение которых вычислено на основе выборки произвольной группы исследуемых объектов по каждому микроорганизму в конкретном биотопе конкретного обследуемого, для совокупности микроорганизмов, определяемой в исследуемом материале с помощью метода масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ), отличающийся тем, что в исследуемом биоматериале - секрете предстательной железы - методом МСММ одновременно определяют количественно содержание 57 микроорганизмов с одновременной оценкой общей микробной нагрузки и референтного значения норм по каждому микроорганизму внутри микробного сообщества для каждого конкретного обследуемого; проводят сравнение численности микроорганизмов в норме и патологии; анализируют структуры распределения численности микроорганизмов при разделении обследуемых пациентов на больных и здоровых - без патологии в анамнезе; анализируют непараметрическими методами гистограммы частотного распределения микроорганизмов, которые в правой части имеют высокий столб в нуле и ненулевые значения; по различию в частоте появления ненулевых значений тех или иных маркеров делают заключение об относительной распространенности того или иного микроорганизма у пациентов в секрете простаты.

2. Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов в предстательной железе, исследуемых методом хромато-масс-спектрометрии по п. 1, отличающийся тем, что значения показателей микроорганизмов отображают в таблицах и диаграммах с указанием референтных значений.

3. Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов в предстательной железе, исследуемых методом хромато-масс-спектрометрии по п. 1, отличающийся тем, что микроорганизмы, превышающие референтные значения, выделяют в диаграммах и таблицах цветом.

4. Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов в предстательной железе, исследуемых методом хромато-масс-спектрометрии по п. 1, отличающийся тем, что осуществляют произвольную выборку обследуемых с учетом возраста, или анамнеза, или жалоб, или клинической симптоматики [патент RU №2791489, опубл. 09.03.2023].

Недостатком данного изобретения является отсутствие конкретной информации о динамике микробиоты урогенитального тракта мужчин в секрете простаты у пациентов бактериальным простатитом до и после антибактериального лечения, так как в нем речь идет только о диагностике хронического абактериального простатита.

В качестве прототипа выбран способ диагностики хронического вирусного простатита, включающий получение биоматериала - секрета предстательной железы, далее методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии, определяют в биоматериале количество вирусов простого герпеса типа 1 и простого герпеса типа 2; и при определении суммарного количества вирусов простого герпеса типа 1 и типа 2 от 6,16×10⁵ до 294×10⁵ клеток/грамм диагностируют наличие хронического простатита вирусной этиологии.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вирусный простатит устанавливают после исключения бактериального простатита методами посева секрета простаты на флору, Андрофлоры и ПЦР.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осуществляют выборку обследуемых с учетом анамнеза, жалоб и клинической симптоматики простатита (патент RU №2819516, опубл. 21.05.2024).

Недостатком данного изобретения является отсутствие конкретной информации о динамики микробиоты урогенитального тракта мужчин в секрете простаты у пациентов с простатитом до и после антибактериального лечения, так как в нем речь идет только о диагностике вирусного простатита.

Таким образом, все существующие способы, в основном касаются проблем диагностики хронического абактериального и вирусного простатита, без исследования состояния микробиоты больных бактериальным простатитом в ходе лечения и после лечения.

Указанные недостатки устраняются в заявляемом техническом решении.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение является разработка достоверных диагностических критериев, позволяющих выявить степень дисбиоза микробиоты секрета простаты у больных хроническим бактериальным простатитом и определить адекватную тактику коррекции дисбиоза и тем самым разработать критерии существенных изменений структуры микрофлоры секрета простаты, требующих адекватной коррекции.

Поставленная задача решается тем, что в способе диагностики дисбиоза микробиоты секрета простаты у больных с установленным диагнозом хронический бактериальный простатит до начала антибактериального лечения в исследуемом биоматериале - секрете предстательной железы, методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-СМ) по стандартной медицинской технологии (МЗ РФ №НЮ-40006, 17.08.2009) определяют количественно содержание 57 микроорганизмов с одновременной оценкой общей микробной нагрузки для каждого конкретного обследуемого; проводят определение численности микроорганизмов до лечения; проводят антибактериальное лечение хронического бактериального простатита; проводят определение численности микроорганизмов после лечения; проводят сравнение численности микроорганизмов до и после лечения и выявляют дисбиоз микробиоты в секрете предстательной железы; назначают корригирующую терапию.

2. Способ диагностики дисбиоза микробиоты секрета простаты у больных хроническим бактериальным простатитом методом хромато-масс-спектрометрии по п. 1, отличающийся тем, что значения показателей микроорганизмов до проведения антибактериального лечения отображают в таблицах и диаграммах.

3. Способ диагностики дисбиоза микробиоты секрета простаты у больных хроническим бактериальным простатитом методом хромато-масс-спектрометрии по п. 1, отличающийся тем, что проводят антибактериальное лечение и повторно проводят исследование микробиоты предстательной железы, значения показателей микроорганизмов после проведения антибактериального лечения отображают в таблицах и диаграммах.

4. Способ диагностики дисбиоза микробиоты секрета простаты у больных хроническим бактериальным простатитом методом хромато-масс-спектрометрии по п. 1, отличающийся тем, что определяют степень выраженности дисбиоза секрета предстательной железы и назначают персонализированную корригирующую терапию.

Техническим результатом предложенного изобретения является повышение точности определения степени дисбиоза микробиоты секрета простаты у больных хроническим бактериальным простатитом, исследуемым методом ГХ-СМ, что позволяет выбрать адекватную тактику ведения конкретного пациента и снизить степень дисбиоза.

Социальная значимость данной проблемы обусловлена, тем, что широкое применение антибиотиков радикально изменило подходы и результаты лечения инфекционно-воспалительных заболеваний, однако вследствие избыточного и неконтролируемого их применения отмечается рост антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов с одной стороны и нежелательное воздействие с нарушением нормальной микробиомы человека с другой, которое приводят к снижению жизненно важные функции микробиоты, такие как пищеварительная, синтетическая, а также обеспечение колонизационной резистентности и регуляции иммунной системы организма [Sonnenburg E.D. И соавт., 2019]. На сегодняшний день работы связанные с влиянием антибиотиков на микробиом человека, в основном касаются микробиоты кишечника и редко других органов, кроме мочеполовых органов, включая предстательную железу.

Одной из причин высокого процента рецидива хронического бактериального простатита является с одной стороны формирование устойчивых штаммов микроорганизмов, с другой, разрушение экологии микробиомы человека, которое снижает жизненно важные функции органов, снижение иммунитета, что приводит к снижению защитных сил организма и обострение заболеваний, включая хронического бактериального простатита [Sonnenburg E.D. И соавт., 2019].

На основании сопоставления клинико-анамнестических данных, результатов лабораторных исследований и результатов статистического анализа нами разработаны количественные и качественные критерии, позволяющие диагностировать хронический бактериальный простатит, обусловленном патогенными микроорганизмами, проводить антибактериальное лечение, провести сопоставление данных до и после лечения у мужчин репродуктивного возраста, что позволяет выбрать объективную тактику коррекции дисбиоза микробиоты секрета простаты.

Кроме определения более 50 микроорганизмов различной группы, методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-СМ) определяются как резидентные, так и транзиторные микроорганизмы, а также уровень вирусов, что позволяет получить информацию о микробиоте предстательной железы, что также важно для проведения адекватного лечения.

В основу основных критериев дисбиоза микробиоты в секрете простаты у пациентов ХБП предложен разработанный нами показатель резкого снижения абсолютных величин почти всех групп микроорганизмов в секрете простаты, характерных клинических симптомов и длительного рецидивирующего течения хронического простатита, что в основном встречается у мужчин репродуктивного возраста.

Таким образом, полученные результаты о значимых снижениях уровня как абсолютных значений, так относительных величин показателей микроорганизмов по данным МСММ, указывает на выраженный дисбиоз микробиоты секрета простаты, что, что в корне меняет подход врача к лечению, так как только назначение корригирующей терапии сможет даст положительный результат.

Своевременно назначенная корригирующая терапия пробиотиками, пребиотиками и симбиотиками позволяет предупредить развитие частых рецидивов хронического бактериального простатита и развитие осложнений, связанных с нарушением репродуктивной функции (орхит, эпидидимит), и, как их следствие, бесплодия.

Таким образом, очевидна необходимость исследование микробиоты в секрете ПЖ после антибактериальной терапии (АБТ) и коррекции дисбиоза. Разработанная нами методика диагностики ХБП может применяться как для диагностики, так и для контроля лечения. Метод доступен в применении и может быть использован в условиях любой практической лаборатории.

Заявляемое изобретение иллюстрируется следующими графическими изображениями:

Фиг. 1. Состав микрофлоры СПЖ культуральным методом до и после лечения.

Таблица 1. Андрофлора у пациентов ХБП до и после лечения.

Таблица 2. Абсолютные показатели МСММ простаты в группе пациентов с ХБП до и после лечения.

Фиг. 2. МСММ секрета простаты у П. С., 45 лет до лечения.

Фиг. 3. МСММ секрета простаты у П. С., 45 лет после лечения.

Подробное описание способа и примеры его клинического выполнения

Способ осуществляется следующим образом.

Пациенту проводят общеклиническое исследование, включая жалобы, сбор анамнеза, проведение общего объективного осмотра и пальпаторное исследование органов мошонки и предстательной железы.

При выполнении клинического осмотра у пациента выясняют характер предъявляемых жалоб на момент осмотра или в анамнезе: характер мочеиспускания, боль, дискомфорт, болезненность во время и после половых контактов; учащенность, жжение, болезненность при мочеиспускании (дизурию).

Особенное внимание обращают состояние наружного отверстия уретры, полового члена, мошонки, лобка, промежности, перианальной области; наличие отделяемого из уретры. При сборе анамнеза, кроме даты начала заболевания выясняют длительность болезни, характер проводимого лечения. Обязательным условием является исключения пациента из исследования, если он принимал антибиотики или противовирусные препараты в ближайшие 3 мес.

После анализа полученных субъективных и объективных данных, устанавливают наличие или отсутствие клинических симптомов простатита - боли в промежности, над лоном, частота мочеиспускания, рези по ходу уретры, наличие выделения различного характера и степени выраженности, боль при мочеиспускании, возможные осложнения со стороны органов урогенитального тракта, степень их выраженности, наличие или отсутствие осложнений со стороны органов урогенитального тракта.

На 1 этапе у пациента хроническим бактериальным простатитом по стандарту выполняется микроскопия секрета простаты, где выявляется лейкоцитов более 10 в п/з, ПЦР и Андрофлора для исключения ИППП, а также стандартный посев секрета простаты где выявляют наличие патогенного или патогенных микроорганизмов - возбудителей ХБП (Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus). Пациенты при облигатных патогенах (Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium) исключены из исследования.

На 2 этапе у пациента с хроническим бактериальным простатитом осуществляют забор секрета предстательной железы (ПЖ) для выполнения анализа методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) после предварительной обработкой головки полового члена и наружного отверстия уретры водным раствором хлоргексидина. Накануне исследования пациент за сутки воздерживается от половых отношений и за 2 часа от мочеиспускания. Необходимые манипуляции осуществляет врач-уролог или обученный средний медперсонал. Поскольку в естественных условиях секрет ПЖ, проходя по уретре в составе семенной жидкости, смешивается с секретом других желез, для получения «чистого» материала требуется принятие в работу 2 или 3 порции секрета, что позволяет получить секрет ПЖ, в количестве 1-2 мл. Такого количества секрета предстательной железы достаточно для исследования.

Все образцы секрета простаты обрабатывают на «Микробиологическом анализаторе МАЭСТРО» (ООО «Интерлаб», Россия), который представляет ГХ-МС, оснащенный системой автоматического ввода проб и полным пакетом программного обеспечения необходимого для анализа ГХ-СМ, возможно применение зарубежного ГХ-МС (Agilent Technologies, США), вручную настраиваемого под требования медицинской технологии. В результате исследования ГХ-МС каждый отобранный образец характеризуется измеренным численным содержанием 57 микроорганизмов, включая анаэробы, актинобактериии, вирусы и грибы, а также тремя дополнительными показателями: суммарной микробной нагрузкой, содержанием эндотоксина и плазмалогена, итого - 60 показателей. Основное внимание обращали на количество каждого микрорганизма в секрете простаты.

Статистическое исследование проводили при помощи специальных статистических критериев. При проведении статистического исследования у пациентов с хроническим простатитом оценивалась диагностическая значимость каждого микроба и вируса. Сравнение проводилось по группам до и после проведения антибактериальной терапии. Распределения показателей отличались от нормального, в связи с этим был использован U-критерий Манна-Уитни (сравнивались медианы выборок, нижний и верхний квартиль) с уровнем значимости 0,05. Для статистической обработки данных и работы с графикой использовалась среда R.

Анализ полученных результатов проводили в три этапа.

На 1 этапе проанализировали жалобы, анамнез, данные объективного исследования, микроскопии секрета простаты, посев секрета простаты на флору, ПЦР в режиме реального времени и андрофлору. На основании полученных данных нами диагностирован бактериальный простатит.

На 2 этапе проводили МСММ секрета простаты, при этом мы исключали такие распространенные условно-патогенные микроорганизмы, как уреаплазмы, микоплазмы, трихомониаз, хламидиоз и после этого проводили антибактериальную терапию в течение 3-4 недель в зависимости от патогенности микроорганизма.

На 3 этапе после окончания лечения проводили стандартный анализ посева секрета простаты, чтобы убедиться о эрадикации патогенных микроорганизмов (Фиг. 1) и проводили МСММ секрета простаты.

После получения результатов исследования проводили сопоставление показателей микроорганизмов, полученных с помощью Андрофлоры и ГХ-МС до и после антибактериального лечения (Таблицы 1 и 2).

Показатели Андрофлоры указывают на исчезновение многих микроорганизмов, снижение уровня общей бактериальной массы, а также Staphylococcus spp, Streptococcus spp, кроме уровня Lactobacillus spp., что подтверждает данные МСММ о снижении показателей микроорганизмов после антибактериального лечения (Таблица 1). Исчезновение многих микроорганизмов на Андрофлоре, скорее всего, указывает о ее низкой чувствительности определения многих микроорганизмов при снижении их количества после лечения.

Согласно полученным данным статистического анализа показателей МСММ (Таблица 2), установлено резкое снижение абсолютных значений почти всех групп микроорганизмов. При этом уровень группы «Кокки, бациллы» снизился с 1049,50 [504,00; 1949,00]×10⁵ клеток/г до 142,00 [59,25; 391,50]×10⁵ клеток/г, уровень анаэробов с 1638,00 [1 185,50; 4 275,50]×10⁵ клеток/г до 221,50 [122,50; 607,75]×10⁵ клеток/г, уровень актинобактерии с 197,00 [94,25; 459,75]×10⁵ клеток/г до 40,00 [15,50; 62,00]×10⁵ клеток/г, уровень энтеробактерии с 452,50 [27,25; 1782,00]×10⁵ клеток/г до 87,00 [39,25; 182,75]×10⁵ клеток/г, уровень грамм отрицательных палочек с 79,00 [64,50; 116,00]×10⁵ клеток/г до 25,00 [14,00; 32,00]×10⁵ клеток/г, уровень грибы и дрожжи с 56,00 [17,25; 131,00]×10⁵ клеток/г до 23,00 [5,75; 37,00]×10⁵ клеток/г, уровень вирусов с 24,50 [11,25; 39,25]×10⁵ клеток/ г до 3,00 [2,25; 3,75]×10⁵ клеток/ г (р<0,0001; р=0,0004 р=0,0033).

Кроме того, зафиксировано снижение уровня резидентных МО с 2481,50 [1551,50; 4535,50]×10⁵ клеток/г до 327,50 [237,25; 784,75]×10⁵ клеток/г, транзиторных условно-патогенных с 1131,00 [667,75; 2417,50]×10⁵ клеток/г до 117,50 [63,25; 290,25]×10⁵ клеток/г, в норме не встречающийся микроорганизмов с 51,00 [36,25; 343,00]×10⁵ клеток/г до 10,00 [3,50; 37,50]×10⁵ клеток/г, сумма микроорганизмов с 4111,00 [2875,00; 8485,00]×10⁵ клеток/г. Кроме того, уровень плазмологен с и сумма эндотоксина с 0,28 [0,10; 0,42] до 0,10 [0,08; 0,16] (р<0,0001).

Таким образом, установлено статистически значимые различия показателей МСММ по всем группам микроорганизмов до и после лечения.

При анализе относительной величины (Таблица 1) в микробиоме отдельных микроорганизмов, отмечено снижение доли кокко-бациллярной флоры, актинобактерий, энтеробактерий, вирусов, транзиторных и в норме не встречающихся микроорганизмов, тогда как доля грамм отрицательных палочек увеличилась на 48,4% (р=0,0033), грибов и дрожжей на 74,4% (р<0,0001), анаэробов на 6,3% (р<0,0001), резидентных бактерий на 5,3% (р<0,0001). Снижение уровня плазмологена достигло 63,9% (р<0,0001), эндотоксина 64,3% (р<0,0001).

Анализ показал, что антибактериальная терапия приводят к снижению уровня абсолютных величин почти у всех микроорганизмов, независимо от принадлежностям к разным группам, тогда как относительные величины у одних групп увеличивались, а у других уменьшались.

Таким образом, результаты исследования показали резкое снижение показателей всех МО после лечения, что указывает на тяжелые изменения микробиоты СПЖ и это должно вызывать настороженность врачей при проведении АБТ пациентам хроническим бактериальным простатитом.

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1

Пациент С., 45 лет. Диагноз: хронический бактериальный простатит.

Обратился с жалобами на периодические ноющие боли в промежности, учащенное мочеиспускание с резью, снижении эрекции. Со слов болен в течение более 6 лет. Почти ежегодно лечиться от обострения простатита. По органам без особенностей.

При пальцевом ректальном исследовании простата неровной консистенции, резко болезненна. При микроскопии в секрете простаты обнаружены повышенное количество лейкоцитов до 25 в п/з и микрофлоры. В посеве СПЖ обнаружено Enterococcus faecalis 10.5 ст., в Андрофлоре - дисбиоз.

В анализе МСММ по сравнению до (Фиг. 2) и после проведения лечения отмечается выраженное снижение показателей по всем группам микроорганизмов (Фиг. 3). Сумма микроорганизмов с 2938×10⁵ клеток/г спустилась до 365×10⁵ клеток/г, что указывает на резкое угнетение микробиоты секрета ПЖ (Фиг. 2, 3).

Таким образом, данный клинический пример показывает, резкое угнетение микробиоты секрета ПЖ на фоне антибактериального лечения. При этом выявлено, что, несмотря на ирадикации кишечной палочки по данным посева секрета ПЖ, данные МСММ показывают снижение уровня показателей всех групп, что требует дальнейшего исследования в этом направлении.

Диагноз: Хронический бактериальный простатит. Выраженный дисбиоз микробиоты секрета простаты.

По результатам обследования была назначена корригирующая терапия пробиотиками в течение 1 мес. Контроль за ходом лечения осуществлялся проведением повторных анализов. На контрольной МСММ выявлено полное значительной улучшение показателей микроорганизмов.

Пример 2

Пациент Л-н, 49 лет. Диагноз: хронический бактериальный простатит. Поступил с жалобами на учащенное мочеиспускание и рези, боли в промежности. Со слов в течение более 8 лет ежегодно по 2-3 раза проходил курс лечения по поводу простатита с временным улучшением. В связи с усилением симптомов заболевания обратился с целью обследования и лечения. С целью верификации диагноза была выполнена микроскопия секрета простаты, где обнаружено повышение количества лейкоцитов 15-18 в п/з. Бактериологический посев секрета простаты выявил рост Proteus mirabilis 10. 4 ст. Андрофлора - умеренный дисбиоз.

Проведен анализ секрета простаты методом МСММ. После проведения антибактериального лечения в секрете простаты по данным посева микрофлоры отсутствует. Проведен анализ секрета простаты методов МСММ и после лечения выявлен выраженный дисбиоз. Больному назначено корригирующая терапия с улучшением признаков дисбиоза через 2 мес.

В ходе разработки заявляемого способа диагностики дисбиоза микробиоты секрета простаты у больных хроническим бактериальным простатитом, нами проведено исследование секрета простаты у 32 мужчин, возраст от 25 до 50 лет, средний возраст 36,42 года с различными жалобами или объективными признаками простатита. У всех было выполнено исследование секрета простаты - посев на микрофлору и чувствительность к антибиотикам - у всех выявлен рост патогенных микроорганизмов. По данным Андрофлор, у 30 пациентов - дисбиоз микробиоты секрета простаты разной степени и у остальных нормоценоз. В анализах МСММ после антибактериальной терапии выявлено выраженный дисбиоз микробиоты в секрете простаты.

Таким образом, впервые разработан способ диагностики дисбиоза микробиоты секрета простаты у больных хроническим бактериальным простатитом после антибактериального лечения и назначение коррелирующей терапии, который является высокоэффективным и доказательным. Он дает возможность провести достоверную диагностику дисбиоза секрета простаты на фоне антибактериальной терапии и провести адекватную коррекцию дисбиоза.

Заявляемый способ диагностики дисбиоза микробиоты секрета простаты у больных хроническим бактериальным простатитом обладает высокой точностью, информативностью, объективностью и доказательностью, опираясь на количественные и качественные критерии.

Он позволяет в короткие сроки, в течение 2 часов, провести диагностику дисбиоза секрета простаты после терапии, назначить своевременное этиотропное лечение, а также осуществлять динамическое наблюдение за эффективностью проводимой терапии.

Заявляемый способ апробирован в клинике на достаточно большом количестве пациентов, показал свою применимость и эффективность и может быть рекомендован к применению в урологической практике.

Изобретение относится к медицине, в частности к урологии, может быть использовано для диагностики хронического бактериального простатита после антибактериального лечения, а также при мониторинге и коррекции контроля лечения пациентов с ХБП. У пациентов с установленным диагнозом ХБП до начала лечения в секрете предстательной железы (СПЖ) методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии, определяют количественно содержание 57 микроорганизмов с одновременной оценкой общей микробной нагрузки; определяют численность микроорганизмов до лечения; проводят антибактериальное лечение ХБП; определяют численность микроорганизмов после лечения; сравнивают численность микроорганизмов до и после лечения и выявляют степень дисбиоза микробиоты в СПЖ; назначают корригирующую терапию. Способ позволяет определить степень выраженности дисбиоза СПЖ, осуществить динамический контроль за лечением и назначить персонализированную корригирующую терапию. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Способ диагностики дисбиоза микробиоты секрета простаты у больных хроническим бактериальным простатитом, включающий бактериологический анализ секрета предстательной железы и выявление возбудителей методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-СМ), отличающийся тем, что у пациентов с установленным диагнозом хронический бактериальный простатит до начала антибактериального лечения в исследуемом биоматериале - секрете предстательной железы, методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-СМ), определяют количественно содержание 57 микроорганизмов: Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Enterococcus spp., Streptococcus spp., Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacteroides fragilis, Bifidobacterium spp., Blautia coccoides, Clostridium tetani, Clostridium difficile, Clostridium histolyticum/Streptococcus pneumoniae, Clostridium perfringens, Clostridium propionicum, Clostridium ramosum, Eubacterium spp., Eggerthella lenta, Fusobacterium spp./Haemophilus spp., Lactobacillus spp., Peptostreptococcus anaerobius 18623, Peptostreptococcus anaerobius 17642, Prevotella spp., Propionibacterium spp., Propionibacterium acnes, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium jensenii, Ruminicoccus spp., Veillonella spp., Actinomyces spp., Actinomyces viscosus, Corynebacterium spp., Nocardia spp., Nocardia asteroides, Mycobacterium spp., Pseudonocardia spp., Rhodococcus spp., Streptomyces spp., Streptomyces farmamarensis, Enterobacteriaceae spp., Helicobacter pylori, Campylobacter mucosalis, Alcaligenes spp./Klebsiella spp., Kingella spp., Flavobacterium spp., Moraxella spp./Acinetobacter spp., Porphyromonas spp., Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Aspergillus spp., Candida spp., микроскопические грибы по кампестеролу, микроскопические грибы по ситостеролу, Herpes spp., цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, Chlamydia trachomatis с одновременной оценкой общей микробной нагрузки для каждого конкретного обследуемого; проводят определение численности микроорганизмов до лечения; проводят антибактериальное лечение хронического бактериального простатита; проводят определение численности микроорганизмов после лечения; проводят сравнение численности микроорганизмов до и после лечения, если отмечается выраженное снижение показателей по всем группам микроорганизмов, выявляют степень дисбиоза микробиоты в секрете предстательной железы и назначают корригирующую терапию.

2. Способ диагностики дисбиоза микробиоты секрета простаты у больных хроническим бактериальным простатитом методом хромато-масс-спектрометрии по п. 1, отличающийся тем, что значения показателей микроорганизмов до проведения антибактериального лечения отображают в таблицах и диаграммах.

3. Способ диагностики дисбиоза микробиоты секрета простаты у больных хроническим бактериальным простатитом методом хромато-масс-спектрометрии по п. 1, отличающийся тем, что исключают из рассмотрения Chlamydia trachomatis и после этого проводят антибактериальную терапию в течение 3-4 недель в зависимости от патогенности микроорганизма; затем повторно проводят исследование микробиоты путем посева секрета предстательной железы, значения показателей микроорганизмов после проведения антибактериального лечения отображают в таблицах и диаграммах.

4. Способ диагностики дисбиоза микробиоты секрета простаты у больных хроническим бактериальным простатитом методом хромато-масс-спектрометрии по п. 1, отличающийся тем, что определяют степень выраженности дисбиоза секрета предстательной железы и назначают персонализированную корригирующую терапию.