СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ МУЖСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/68 G01N33/487 G01N1/28 G01N33/569 C12Q1/06 C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при диагностике нарушений сперматогенеза и бесплодия в урологии, андрологии, репродукции, дерматовенерологии, онкологии для выявления этиологии и патогенеза патозооспермии.

По оценке Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), 48 млн пар и 186 млн человек в мире не способны зачать ребенка без медицинской помощи, что составляет 15-20% всего населения репродуктивного возраста [WHO health topics. Infertility. https://www.who.int/health-topics/infertility#tab=tab_1 (дата обращения 28.01.22)].

Распространенность мужского бесплодия варьирует в зависимости от географического положения и составляет от 20% до 70% [Agarwal A, Mulgund A, Hamada A, Chyatte MR. А unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 2015;13:37. https://doi.org/10.1186/s12958-015-0032-1].

За последние четыре декады лет причины, связанные с мужским бесплодием, приобрели большую актуальность и стали предметом глубоких исследований, что подтверждается снижением на 50-60% концентрации сперматозоидов в мужской популяции репродуктивного возраста [Levine H, Jørgensen N, Martino-Andrade A, et al. Temporal trends in sperm count: a systematic review and meta-regression analysis. Hum Reprod Update. 2017;23(6):646-659. https://doi.org/10.1093/humupd/dmx022].

Среди возможных факторов, связанных с сценариями патоспермии, отмечены острые и хронические инфекции мужских добавочных половых желез, поскольку на них приходится от 6,6 до 50% [Moretti E, Figura N, Campagna MS, Iacoponi F, Gonnelli S, Collodel G. Infectious Burden and Semen Parameters. Urology. 2017;100:90-96. https://doi.org/10.1016/j.urology.2016.10.032; Ahmadi MH, Mirsalehian A, Sadighi Gilani MA, Bahador A, Talebi M. Asymptomatic Infection With Mycoplasma hominis Negatively Affects Semen Parameters and Leads to Male Infertility as Confirmed by Improved Semen Parameters After Antibiotic Treatment. Urology. 2017;100:97-102. https://doi.org/10.1016/j.urology.2016.l 1.018].

Однако этиология большинства скрытых и рецидивирующих MAGI, также, как и бесплодие супружеской пары остаются в 30-50% случаев неясными ввиду отсутствия информативных лабораторных данных [Agarwal A, Parekh N, Parmer Selvam MK, et al. Male Oxidative Stress Infertility (MOSI): Proposed Terminology and Clinical Practice Guidelines for Management of Idiopathic Male Infertility. World J Mens Health. 2019;37(3):296-312. https://doi.org/10.5534/wjmh.190055].

Известны способы диагностики мужской репродуктивной функции.

Оценку и вычисление концентрации нейтрофильных гранулоцитов/пероксидазо-положительных лейкоцитов в эякуляте осуществляют с помощью цитохимического окрашивания орто-толуидином (см. Руководство ВОЗ По исследованию и обработке эякулята человека. - издательство «КАПИТАЛ ПРИНТ», Москва, 2012, пятое издание, ISBN 978-5-905106-09-05 (раздел 2.18.1.5-1.7; рис. 2.14; 3.11).

Недостатки данного способа следующие:

1. отсутствует коммерчески доступный набор для окрашивания, реактив: как правило предлагается 6 реагентов, которые сложно купить в виду того, что они являются прекурсорами,

2. сложно готовить к использованию, ввиду того, что современные лаборатории используют, как правило, исключительно готовые наборы реагентов и не имеет необходимого поверенного оборудования: весов, оборудования для титрования,

3. используемый орто-толуидин является особо опасным канцерогеном, что обуславливает риск для здоровья персоналу,

4. результаты считают в усовершенствованном гемоцитометре Нейбауэра, который отсутствует на российском лабораторном рынке оборудования и расходных материалов с необходимым регистрационным удостоверением,

5. формула подсчета адаптирована к гемоцитометру Нейбауэра, что вызывает определенные трудности.

Известен способ оценки и вычисления концентрации нейтрофильных гранулоцитов (лейкоцитов)/пероксидазо-положительных клеток (ППК) в эякуляте. При его осуществлении используют полуколичественную оценку содержания лейкоцитов в эякуляте на тест-полоске с помощью иммунохроматографического метода, основанного на ферментативной активности лейкоцитарной эстеразы (без цитохимического окрашивания) (см. В.В. Долгов, С.А. Луговская, Н.Д. и др. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. - М. - Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2006. - 145 с., 199 ил., 5-94789-144-1. Стр. 70).

Недостатки данного способа заключаются в следующем:

1. Способ позволяет осуществить только приблизительное определение концентрации и только нейтрофильных гранулоцитов/перокисидазо-положительных лейкоцитов в эякуляте,

2. Не дает точного представления о наличии или отсутствии воспалительного процесса у мужчины.

3. Метод определения - неколичественный (полуколичественный «на тест-полоске»: > или <1×10⁶/мл), что противоречит рекомендациям ВОЗ.

4. Лейкоцитарная эстераза появляется в биожидкости при разрушении лейкоцитов, что может привести к ложноположительной диагностике (пиоспермии).

Известен способ количественной оценки содержания круглых клеток (нейтрофильных и других лейкоцитов, макрофагов, клеток сперматогенеза) (концентрации) без цитохимического окрашивания ППК в эякуляте (см. Е.Е. Брагина. Протокол проведения спермиологического исследования. - Андрология и генитальная хирургия. - 2014, №1, с. 20).

Недостатки данного способа следующие.

1. Производится определение концентрации только круглых клеток (всех подряд), а не только ППК в эякуляте.

2. Метод не дает точного представления о наличии или отсутствии воспалительного процесса у мужчины.

3. Метод не приемлем для мониторинга содержания лейкоцитов в сперме.

4. Идентификация лейкоцитов происходит путем субъективной оценки («на глаз») по косвенным идентификационным признакам, что не соответствует рекомендациям ВОЗ.

Известен способ определения концентрации сперматозоидов в 1 милилитре (мл) эякулята (см. Руководство ВОЗ По исследованию и обработка эякулята человека, издательство «КАПИТАЛ ПРИНТ», Москва, 2012, пятое издание, ISBN 978-5-905106-09-05 (раздел 2.7, 2.8.1, 2.8.4, стр. 34-47).

Недостатки данного способа следующие.

1. Вычисление концентрации осуществляется только сперматозоидов в 1 милилитре (мл) эякулята.

2. Подсчет проводят в усовершенствованном гемоцитометре Нейбауэра, которого нет на российском лабораторном рынке оборудования и расходных материалов с регистрационным удостоверением.

3. Фиксация и разведение образца спермы происходит рабочим раствором, состоящим из сложной прописи химических веществ - прекурсоров (п. 2.7.5 руководства ВОЗ), которые не используются в современной клинико-диагностической лаборатории. Одним из таких прекурсоров является особо опасный канцероген - формалин.

4. Оценка требуемого разведения для дальнейшего подсчета концентрации сперматозоидов основана на сложных математических расчетах и также адаптирована к гемоцитометру Нейбауэра (Руководство ВОЗ, стр. 40-41 глава 2.8.1).

5. Все формулы для подсчета адаптированы к гемоцитометру Нейбауэра.

Известен способ измерения концентрации сперматозоидов в 1 милилитре (мл) эякулята, (см. Е.Е. Брагина. Протокол проведения спермиологического исследования. - Андрология и генитальная хирургия. - 2014, №1, с. 18-19).

Согласно данному способу производят подготовку препарата, фиксацию эякулята, приготовление счетной камеры, заполнение окошек гемоцитометра эякулятом, осаждение сперматозоида в камере, определение количества больших квадратов, необходимых для подсчета сперматозоидов, измерение количества сперматозоидов в 1 миллилитре (мл) эякулята в препарате в камере Горяева и вынесение заключения.

Недостатки данного способа следующие.

1. Осуществляется только измерение концентрации сперматозоидов в 1 миллилитре (мл) эякулята.

2. Фиксация и разведение образца спермы проводится несколькими рабочими растворами (50 г NaHCO₃, 10 мл 36-40% раствора формальдегида (насыщенный раствор)). Один из них - прекурсор и является особо опасный канцерогеном формальдегидом. Фиксация физиологическим раствором долгая (до полной остановки подвижных клеток), что отражается на времени оборота теста в лаборатории/ТАТ (время оборота теста/turn around time) и вносит дополнительные погрешности.

3. Оценка качества требуемого разведения для дальнейшего подсчета концентрации сперматозоидов многоэтапна и усложнена: при приготовлении препарата (10 мкл, покровное стекло 22×22 мм), глубина препарата примерно 20 мкм. Используется специальный подсчет сперматозоидов в поле зрения для определения оптимального разведения. При диаметре поля зрения микроскопа (измерять объективом - микрометром) 500 мкм обнаружение 4 сперматозоидов в поле зрения примерно соответствует 1 млн/мл. Если диаметр поля зрения 250 мкм - 1 сперматозоид в поле зрения соответствует 1 млн/мл. В этом случае пользоваться табл. 2 следует после умножения количества обнаруженных сперматозоидов на 4).

4. Этап определения количества больших квадратов, необходимых для подсчета сперматозоидов также усложняет процесс исследования, что отражается на ТАТ.

Для идентификации микроорганизмов у бесплодных пар и у пациентов с подозрением на инфекции мужских добавочных половых желез (Male accessory gland infection/MAGI) клиническими рекомендациями (КР) Европейской ассоциации урологов/European Association of Urology (EAU, 2022) наряду с СПЖ и постмассажной порции мочи рекомендуется использовать эякулят [EAU Guidelines on Sexual and Reproductive Health A. Salonia (Chair), C. Bettocchi, J. Carvalho, G. Corona, Т.Н. Jones, A. , J.I. Martinez-Salamanca, S. Minhas (Vice-chair), E.C. , P. Verze; Guidelines Associates: L. Boeri, P. Capogrosso, A. Cocci, K. Dimitropoulos, M. Gül, G. Hatzichristodoulou, A. Kalkanli, V. Modgil, U. Milenkovic, G. Russo, T. Tharakan, © European Association of Urology 2021; EAU Guidelines on urological Infections. 2022. Accessed January 28, 2022. https://d56bochluxqnz.cloudfront.net/documents/full-guideline/EAU-Guidelines-on-Urological-Infections-2022.pdf].

Нормативно-правовые акты (НПА) российских коллег рекомендуют для поиска возбудителей инфекций использовать уретральный соскоб (УС)/уретральное отделяемое (УО) или эякулят [Приказ Минздрава России от 31.07.2020 N 803н "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению"; "Клинические рекомендации "Мужское бесплодие" (утв. Минздравом России), разработчик: общероссийская общественная организация "Российское общество урологов", одобрено Научно-практическим Советом Минздрава РФ, 2021 г.; Федеральные клинические рекомендации. Дерматовенерология 2015: Болезни кожи. Инфекции, передаваемые половым путем. - 5-е изд., перераб. и доп. - М.: Деловой экспресс, 2016. - 768 с.; Приказ Минздрава России от 29.12. 2012, №1673 н «Об утверждении стандарта первичной медико-санитарной помощи при хроническом простатите (обследование в целях установления диагноза и лечения); Приказ Минздрава России №1675н от 29.12. 2012 «Об утверждении стандарта первичной медико-санитарной помощи при неспецифическом и другом уретрите»; Приказ Минздрава России от 9 ноября 2012 №696н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при острых простатите, орхите и эпидидимите»; Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 30 октября 2012 г. №556н "Об утверждении стандарта медицинской помощи при бесплодии с использованием вспомогательных репродуктивных технологий"].

В настоящее время на пути поиска этиологического фактора MAGI в сочетании с мужским бесплодием представляются сомнительными существующие лабораторные алгоритмы с участием УО/УС и секрета предстательной железы (СПЖ) ввиду низкой диагностический ценности заявленных локусов, а также по причине отсутствия возможности воспроизводства и стандартизации по количеству и качеству взятого биоматериала [Сапожкова Ж.Ю., Шабалова И.П., Касоян К.Т. Исследование осадка эякулята в диагностике инфекций, передаваемых половым путем: Учебное пособие. Москва, 2017; Сапожкова Ж.Ю., Милованова Г.А., Пацап О.И. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. Маркеры и методы. Часть II // Лабораторная и клиническая медицина. Фармация. 2021. Т. 1, No 2. С. 65-79. DOI: 10.14489/lcmp.2021.02.рр.065-079].

Таким образом, известные способы являются низкоинформативными и малодостоверными. В этой связи стоит задача создания своевременной и правильной диагностики количественного состава биотопа осадка эякулята, которая наряду с известными дигностическими подходами позволит избежать назначение дополнительных дорогостоящих лабораторных и инструментальных методов и необоснованную антибиотикотерапию, что отражает концепцию управления здоровьем и долголетием на основе корректного планирования медицинской и экономической эффективности в организации здравоохранения.

Известен способ диагностики нарушения мужской репродуктивной функции на основе микробиологического (МБА) (культурального) исследования цельного эякулята и на основе молекулярного (МАНК/ПЦР-РВ) исследования УО/УС и СПЖ (Приказ Минздрава России от 29.12. 2012, №1673 н «Об утверждении стандарта первичной медико-санитарной помощи при хроническом простатите (обследование в целях установления диагноза и лечения)), который является наиболее близким к заявляемому способу и прият в качестве ближайшего аналога (прототипа).

К недостаткам известного способа относится:

- большинство этиологических агентов инфекционно-воспалительных процессов являются некультивируемыми или плохо культивируемыми в силу своих биологических свойств;

- существующие лабораторные алгоритмы с участием УО/УС и СПЖ имеют низкую эффективность ввиду отсутствия диагностический ценности перечисленных локусов, так как инвазивный процесс получения этих видов биоматериала связан с дискомфортом и, зачастую, болевыми ощущениями у пациента, что в результате не позволяет отобрать полноценный биологический образец для исследования.

Определение количества облигатно-анаэробных условно-патогенных микроорганизмов (ОАУПМО) и их соотношение в биотопе, а также выделение устойчивых типов бактериальных сообществ, связанных с нарушением мужской фертильности, не предоставляется возможным с помощью МБА в виду ограничения диагностических возможностей метода. Как следствие, имеет место риск ложноотрицательных результатов, что определяет трудности этиотропной терапии, переход заболевания в хроническую форму и рецидивирующий характер течения.

Сущность изобретения

Изобретение направлено на решение задачи повышения диагностической достоверности.

Технический результат, достигаемый при использовании представленного способа, состоит в расширении спектра диагностики этиологических факторов инфекционной природы нарушения мужской репродуктивной функции, повышения информативности и достоверности диагностики.

Технический результат достигается за счет того, что в способе диагностики мужской репродуктивной функции, включающем сбор биологического материала, осуществление диагностики и на основе полученных данных формирование заключения о мужской репродуктивной функции, в качестве биологического материала используют эякулят, перемещают эякулят в пробирки порциями, осуществляют обработку порций эякулята на медицинской центрифуге при скорости вращения 1500 об/мин в течение 15 мин, - стерильной пипеткой удаляют надосадочную жидкость, 50 мкл осадка эякулята переносят в пробирку с транспортной средой для молекулярного исследования оценки структуры биотопа осадка эякулята, не менее 10 мкл осадка эякулята переносят в тупфер с угольной средой для культурального исследования оценки структуры биотопа осадка эякулята, для диагностики одновременно проводят микробиологический и молекулярный анализ, микробиологический анализ осуществляют путем количественного измерения концентрации микроорганизмов резидентной флоры или ее микробных ассоциаций и путем измерения количества нерезидентных бактерий в концентрации ≥10³ КОЕ/мл, молекулярный анализ включает количественный анализ биотопа осадка эякулята по спектру условно-патогенных микроорганизмов: грамположительных факультативно анаэробных микроорганизмов Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Corynebacterium spp., грамотрицательных факультативно анаэробных микроорганизмов Haemophilus spp., Pseudomonas aeruginosa/Ralstonia spp./Burkholderia spp.), группы Enterobacteriaceae/Enterococcus spp., облигатно анаэробных условно-патогенных микроорганизмов - Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Bacteroides spp./Porphyromonas spp./Prevotella spp., Anaerococcus spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium cluster, и грибов рода Candida, - заключение о нормальной или нарушенной мужской репродуктивной функции формируют по наличию нормальной или нарушенной структуры биотопа осадка эякулята, при этом за нормальную структуру биотопа осадка эякулята принимают образцы осадка эякулята с отсутствием или наличием в них монокультуры грамположительных факультативно анаэробных микроорганизмов или их микробных ассоциаций, за нарушение структуры биотопа осадка эякулята принимают дисбаланс между нормофлорой и облигатно анаэробными условно-патогенными микроорганизмами, грамотрицательными факультативно анаэробными микроорганизмами, группой Enterobacteriaceae/Enterococcus spp., микоплазмами и грибами рода Candida при нарушении структуры бактериального микробиома или значимой бактериоспермии при концентрации бактерий ≥10³ ГЭ/мл.

Технический результат усиливается за счет того, что при проведении микробиологического анализа измеряют концентрацию грамм-положительных факультативно анаэробных микроорганизмов, монокультуры Staphylococcus epidermididis, Staphylococcus heamolyticus, Streptococcus group viridans, Streptococcus oralis. О наличии дисбаланса судят по количественному соотношению мироорганизмов, определяющих нормальную и патологическую микробиоту. Для выявления дисбаланса исследуют фрагменты ДНК микроорганизмов, содержащихся в пробирке после сбора эякулята. Для выявления дисбаланса исследуют полуколичественные соотношения микроорганизмов, определяющих нормальную и патологическую микробиоту по колониеобразующим единицам, попавшим на питательную среду для культивирования бактерий.

Описание графических материалов

Сущность изобретения и возможность достижения технического результата будут более понятны из последующего описания со ссылками на фигуры графических материалов, где показано:

на фиг. 1 - статус осадка эякулята мужчин с MAGI и бесплодием, установленный МАНК/ПЦР-РВ/Андрофлор и МБА. *р<0,01, Хи-квадрат,

на фиг. 2 - преобладающие группы при нормоценозе и значимой бактериоспермии осадка эякулята. *р<0,01 для варианта 3 и 4 (Хи-квадрат),

на фиг. 3 - структура значимой бактериоспермии осадка эякулята по преобладающим группам. Статистические значимые отличия для ОАУПМО,

на фиг. 4 - структура биотопа осадка эякулята по выявленным микроорганизмам. *р<0,01, Хи-квадрат,

на фиг. 5 - приведена таблица с результатами чувствительности возбудителя к антибактериальным препаратам,

на фиг. 6 - приведены результаты исследований осадка эякулята в соответствии с заявленным способом,

на фиг. 7 - приведены результаты посева на микрофлору и чувствительность к антибиотикам, расширенный спектр,

на фиг. 8 - приведены результаты микробиологического исследования цельного эякулята,

на фиг. 9 - приведены результаты исследования микробиоты в соответствии с известным способом,

на фиг. 10 - приведены результаты микробиологического исследования осадка эякулята

1,

на фиг. 11 -приведены результаты микробиологического исследования осадка эякулята

2,

на фиг. 12 - приведены результаты анализа посева МПО на микрофлору,

на фиг. 13 - приведены результаты молекулярного исследования по известному способу,

на фиг. 14 - приведены результаты микробиологическое исследование цельного эякулята,

на фиг. 15 - приведены результаты микробиологического (культурного) исследования,

на фиг 16 - приведены результаты исследования по заявленному способу,

на фиг. 17 - приведены результаты исследования посева на микрофлору и чувствительности к антибиотикам, расширенный спектр.

При проверке гипотез статистически значимыми результаты считались при достигнутом уровне значимости Р<0,05. Сравнение несвязанных групп по качественным признакам проводилось с использованием теста (критерия) Хи-квадрат.

На материалах заявки (описании и на фигурах) приняты следующие обозначения.

ППК - пероксидазо-положительные клетки,

ОАУПМО - облигатно-анаэробные условно-патогенные микроорганизмы,

ГОФАМО - грамотрицательные факультативно анаэробные микроорганизмы,

ЭЭ - группа бактерий Enterobacteriaceae/Enterococcus spp.,

ГПФАМО - грамм-положительными факультативно анаэробными микроорганизмами,

КАНД - грибы рода Candida,

МКП - микоплазмы,

NGS - секвенирование нового поколения/Next Generation Sequencing,

TAT - время оборота теста/turn around time,

MAGI - инфекции мужских добавочных половых желез/Male accessory gland infection,

КР - клинические рекомендации,

EAU - Европейская ассоциация урологов/European Association of Urology,

СПЖ - секрет предстательной железы,

УО/УС - уретральное отделяемое/уротрельный соскоб,

МБ - микробиологическое (культуральное) исследование,

МАНК/ПЦР-РВ - метод амплификации нуклеиновых кислот/полимеразно-цепная реакция в реальном времени,

КОЕ/мл - колиниеобразующие единицы/мл,

ГЭ/мл - геном-эквивалент/ мл,

СХТБ - синдром хронической тазовой боли,

СНМП - симптомы нижних мочевых путей,

СХМБ - синдром хронической мошоночной боли,

ВЗОМТ - воспалительными заболеваниями органов малого таза,

ОБМ - общая бактериальная масса,

НПА - нормативно-правовые акты,

РФ - Российская Федерация.

Осуществление способа

Способ лабораторной диагностики мужской репродуктивной функции включает сбор биологического материала, осуществление диагностики и на основе полученных данных формирование заключения о мужской репродуктивной функции. В качестве биологического материала используют эякулят. Перемещают эякулят в конусовидные стерильные одноразовые полипропиленовые пробирки порциями. Осуществляют обработку порций эякулята на центрифуге медицинской серии СМ ("СИА "ЭЛМИ", Латвия), регистрационное удостоверение (РУ) № РЗН 2016/4617 от 26.08.2016; при скорости вращения 1500 об/мин в течение 15 мин. Стерильной пипеткой Пастера удаляют надосадочную жидкость. 50 мкл осадка эякулята переносят стерильным наконечником с помощью дозатора пипеточного одноканального объемом 20-200 мкл в пробирку типа Eppendorf с транспортной средой для теста «Андрофлор» для молекулярного исследования оценки структуры биотопа осадка эякулята. Не менее 10 мкл осадка эякулята переносят другим стерильным наконечником с помощью дозатора пипеточного одноканального объемом 20-200 мкл в тупфер с угольной средой для культурального исследования оценки структуры биотопа осадка эякулята. Для диагностики одновременно проводят микробиологический и молекулярный анализ.

Микробиологический анализ, а именно идентификацию полученных колоний микроорганизмов осуществляют путем количественного измерения концентрации микроорганизмов резидентной флоры или ее микробных ассоциаций и путем измерения количества нерезидентных бактерий в концентрации ≥10³ КОЕ/мл с помощью время-пролетной матрично-ассоциированной лазерной десорбционной ионизационной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) на анализаторе Vitek MS (BioMerieux; Франция), РУ № ФСЗ 2012/12091 от 23.06.21; или на анализаторе микробиологическом «BactoSCREEN» (ООО «НПФ «ЛИТЕХ», Россия), РУ № РЗН 2016/5127 от 20.12.2016.

Молекулярный анализ, а именно идентификацию и количественный анализ биотопа осадка эякулята по спектру условно-патогенных микроорганизмов проводили на детектирующих амплификаторах ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) (амплификатор детектирующий «ДТпрайм», РУ № ФСР 2011/10229 от 03.03.2011 и/или "ДТлайт" в модификации 5S, РУ № ФСР 2011/10228 от 03.03.2011):

грамположительных факультативно анаэробных микроорганизмов Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Corynebacterium spp.,

грамотрицательных факультативно анаэробных микроорганизмов Haemophilus spp., Pseudomonas aeruginosa/Ralstonia spp./Burkholderia spp.),

группы Enterobacteriaceae/Enterococcus spp.,

облигатно анаэробных условно-патогенных микроорганизмов - Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Bacteroides spp./Porphyromonas spp./Prevotella spp., Anaerococcus spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium cluster, и

грибов рода Candida.

Заключение о нормальной или нарушенной мужской репродуктивной функции формируют по наличию нормальной или нарушенной структуры биотопа осадка эякулята. При этом за нормальную структуру биотопа осадка эякулята принимают образцы осадка эякулята с отсутствием или наличием в них монокультуры грамположительных факультативно анаэробных микроорганизмов или их микробных ассоциаций. За нарушение структуры биотопа осадка эякулята принимают дисбаланс между нормофлорой и облигатно анаэробными условно-патогенными микроорганизмами, грамотрицательными факультативно анаэробными микроорганизмами, группой Enterobacteriaceae/Enterococcus spp., микоплазмами и грибами рода Candida при нарушении структуры бактериального микробиома или значимой бактериоспермии при концентрации бактерий ≥10³ ГЭ/мл.

За период с 2017 по 2021 гг. было обследовано 529 мужчин, обратившихся с целью прегравидарной подготовки, по поводу бесплодия или направленных гинекологом для исключения MAGI у сексуальных партнеров.

Критерии включения в обследование: мужчины от 18 до 59 лет; наличие у пациентов жалоб на отсутствие беременности у партнерши, соблюдение полового воздержания в течение 3-5 суток до исследования для исключения возможной контаминации материала транзиторной микробиоты полового партнера; отсутствие активных жалоб, характерных для MAGI и/или в анамнезе MAGI (специфический или неспецифический уретрит, хронический или острый простатит, орхит, эпидидимит).

Критериями исключения из обследования были:

- применение антибактериальных и противовирусных препаратов в последние 4 недели до обследования;

- использование местных лекарственных препаратов в течение трех недель, предшествующих обследованию, наличие у пациентов синдром хронической тазовой боли, симптомы нижних мочевых путей, синдром хронической мошоночной боли;

- наличие эрректильной дисфункции;

- отсутствие нарушений кариотипа, микроделеций AZF локуса Y хромосомы, мутаций гена CFTR;

- наличие у пациентов сексуальных партнеров - женщин с рецидивирующими нарушениями влагалищного биоценоза, с ВЗОМТ (воспалительными заболеваниями органов малого таза).

Согласно Руководству ВОЗ 6-ого издания по лабораторному исследованию эякулята человека (WHO 2021) сперму, полученную путем мастурбации, помещали в одноразовые широкогорлые контейнеры, избегая касания стенок и крышки контейнера руками [WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Available at: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787].

Непосредственно перед сбором материала пациенту требовалось помочиться, полностью опорожнив мочевой пузырь, предварительно провести туалет наружных половых органов.

Транспортировку проб эякулята в лабораторию осуществляли в термоконтейнере в течение не более 4 ч с момента сбора образца.

В лабораторных условиях эякулят переносили из транспортировочных контейнеров в конусовидные одноразовые полипропиленовые пробирки, центрифугировали при 1500 об/мин 15 мин на центрифуге медицинской серии СМ ("СИА "ЭЛМИ", Латвия), регистрационное удостоверение (РУ) № РЗН 2016/4617 от 26.08.2016; после чего удаляли надосадочную жидкость пипеткой Пастера, 50 мкл осадка эякулята переносили стерильным наконечником с помощью дозатора пипеточного одноканального объемом 20-200 мкл в пробирку типа Эппендорф с транспортной средой для теста молекулярного анализа структуры микробиома.

Не менее 10 мкл оставшегося осадка эякулята переносили другим стерильным наконечником с помощью дозатора пипеточного одноканального объемом 20-200 мкл в тупфер с угольной средой для МБА анализа.

Оценка микробного состава осадка эякулята проводилась в различных коммерческих лабораториях г. Москвы.

Идентификацию полученных колоний микроорганизмов производили методом время-пролетной матрично-ассоциированной лазерной десорбционной ионизационной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) на анализаторе Vitek MS (BioMerieux; Франция), РУ № ФСЗ 2012/12091 от 23.06.21 или на анализаторе микробиологическом «BactoSCREEN» (ООО «НПФ «ЛИТЕХ», Россия), РУ № РЗН 2016/5127 от 20.12.2016.

2. Для идентификации и количественного определения структуры бактериального микробиома использовали МАНК/ПЦР-РВ с тестом молекулярного анализа структуры микробиома согласно инструкции производителя [Инструкция по применению набора реагентов для исследования микрофлоры урогенитального тракта мужчин методом ПЦР в режиме реального времени. Фасовка стандартная (S). Варианты комплектации: Андрофлор® и Андрофлор® Скрин (ООО НПО «ДНК-Технология», Россия). Доступно по ссылке: https://www.dna-technology.ru/sites/default/files/393-4_s_androflorskrin_ivd_b_2021-06-21_0.pdf], РУ № РЗН 2016/4490 от 25.07.2016 на детектирующих амплификаторах ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) (амплификатор детектирующий «ДТпрайм», РУ № ФСР 2011/10229 от 03.03.2011 и/или "ДТлайт" в модификации 5S, РУ № ФСР 2011/10228 от. 03.03.2011).

После реакции амплификации по показателю индикаторного цикла с помощью специального программного обеспечения (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) проводился автоматический расчет общей бактериальной массы (ОБМ) и каждого из микроорганизмов в представленном образце осадка эякулята в геном-эквивалентах на 1 мл (ГЭ/мл).

Расчет доли отдельных видов и преобладающих групп бактерий проводили относительно суммы всех выявленных в образце микроорганизмов.

Спектр условно-патогенных микроорганизмов, определяемых тестом молекулярного анализа структуры микробиома представлен:

1) ГПФАМО - Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Corynebacterium spp.;

2) ГОФАМО - Haemophilus spp., Pseudomonas aeruginosa/Ralstonia spp./Burkholderia spp.;

3) группой ЭЭ;

4) ОАУПМО - Gardnerella vaginalis, Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Bacteroides spp./Porphyromonas spp./Prevotella spp., Anaerococcus spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium cluster;

5) группой МКП - Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum,

6) группой КАНД.

По результатам МАНК/ПЦР-РВ за норму принимали образцы осадка эякулята с отсутствием или наличием в них монокультуры ГПФАМО или их микробных ассоциаций.

Дисбаланс между нормофлорой и ГОФАМО, ЭЭ, ОАУПМО, МКП и КАНД принимали за нарушение структуры бактериального микробиома или значимой бактериоспермии при концентрации бактерий ≥10³ ГЭ/мл.

По результатам МБА за нормальную флору исследуемых образцов осадка эякулята считали наличие в них ГПФАО, а именно монокультуры Staphylococcus epidermididis, Staphylococcus heamolyticus, Streptococcus group viridans, Streptococcus oralis и другой резидентной флоры или ее микробных ассоциаций.

Статистический анализ данных проведен с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2013 и Statistica 10.0 (StatSoft, Inc.). Различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты исследований

Сравнительный анализ демонстрирует что значимая бактериоспермия осадка эякулята чаще выявлялась по данным МАНК/ПЦР-РВ молекулярного анализа структуры микробиома, чем МБА - 402 (76%) и 237 (44,8%) соответственно, что является статистически значимым (р<0,01) (Фиг. 1).

Это связано с большим спектром выявляемых микроорганизмов в молекулярном тесте, имеющий важную диагностическую значимость.

В группе с нормальной флорой по результатам МАНК/ПЦР-РВ молекулярного анализа структуры микробиома статистически значимо чаще выявлялись ассоциации микроорганизмов 103 (81,1%), напротив при МБА статистически больше высеивалась монокультура 216 (74%). Это связано с особенностями роста микроорганизмов на питательных средах, в связи с подавлением роста одних микроорганизмов другими (Фиг. 2).

Анализ структуры образцов со значимой бактериоспермией в осадке эякулята, установленный двумя методами, указывает на полное совпадение микробного статуса только в 40 (7,6%) из 529 случаев (Таб. 1) https.//cloud.mail.ru/public/sghA/BBnbko7Zn.

Совпадение прослеживались по преобладающим группам: МКП - U. urealyticum и М. hominis; КАНД - Candida spp. По преобладающей группе ЭЭ также имело место полное совпадение, но с разным микробным пейзажем, который был представлен другими бактериями ввиду отличия диагностических панелей методов: МАНК/ПЦР-РВ молекулярного анализа структуры микробиома - группе ЭЭ; МБА - Enterococcus faecalis и Enterobacter cloacae.

В остальных случаях микробиота при МБА либо отсутствовала 83 (15,7%), либо спектр выявленных микроорганизмов отличался. Важно подчеркнуть, что в силу диагностических возможностей методов только с помощью МБ удалось обнаружить E. coli, которая, по данным литературы, является одной из возможных причин MAGI и репродуктивных нарушений у мужчин и требует принципиально другой антибактериальной терапии в отличии от других ГОФАМО.

При сравнении структуры значимой бактериоспермии двумя технологиями не выявлено статистических различий по структуре выделенных групп микроорганизмов, кроме кластеров преобладающей группы ОАУПМО, бактерии которой являются некультивируемыми или плохо культивируемыми на стандартных питательных средах (Фиг. 3).

Отмечаются статистически значимые отличия МАНК/ПЦР-РВ молекулярного анализа, структуры микробиома и МБА между следующими преобладающими группами в структуре значимой бактериоспермии осадка эякулята:

1) ГОФАМО - Pseudomonas aeruginosa/Ralstonia spp./Burkholderia spp. (p<0,01) и Haemophilus spp. (p<0,01), что связано с трудностями культивирования данных микроорганизмов на стандартных питательных средах;

2) ЭЭ в монокультуре Enterobacteriaceae spp./Enterococcus spp. - по данным МАНК/ПЦР-РВ молекулярного анализа структуры микробиома встречались значительно реже по сравнению с МБА (р<0,01), вероятнее всего кластер ЭЭ по данным МАНК/ПЦР-РВ встречался в большинстве случаев в составе ассоциаций микроорганизмов, чем представлял монокультуру.

Между технологиями прослеживаются статистически значимые отличия в преобладающей группе ГПФАМО с нормальной флорой осадка эякулята: не выявляется монокультура Corynebacterium spp. (р<0,01) в виду трудностей культивирования МБА; а монокультура Staphylococcus spp. (р<0,01) и Streptococcus spp. (р<0,01) чаще встречается с помощью МБА; данные микроорганизмы выделяются в большинстве случаев также в составе ассоциаций микроорганизмов с помощью МАНК/ПЦР-РВ молекулярного анализа структуры микробиома.

Различия частоты встречаемости других микроорганизмов были статистически не значимы.

Следует отметить статистически значимые отличия в оценке общего статуса осадка эякулята (нормофлора/значимая бактериоспермия) между двумя лабораторными методами. Так, количественную оценку общей бактериальной массы, характерной для нормофлоры, с большей частотой отражает МАНК/ПЦР-РВ молекулярный анализ структуры микробиома (р<0,01) (Фиг. 4).

Профессиональный резонанс в мире по отношению к причинно-следственной связи между MAGI и мужским бесплодием еще далеко не окончен, к тому же действующие международные и российские НПА не содержат четких указаний о выборе референсного метода и наиболее информативного мужского биологического образца для лабораторного обследования при репродуктивных нарушениях [EAU Guidelines on Sexual and Reproductive Health A. Salonia (Chair), C. Bettocchi, J. Carvalho, G. Corona, Т.Н. Jones, A. , J.I. Martinez-Salamanca, S. Minnas (Vice-chair), E.C. , P. Verze; Guidelines Associates: L. Boeri, P. Capogrosso, A. Cocci, K. Dimitropoulos, M. Gül, G. Hatzichristodoulou, A. Kalkanli, V. Modgil, U. Milenkovic, G. Russo, T. Tharakan, © European Association of Urology 2021; EAU Guidelines on urological Infections. 2022. Accessed January 28, 2022. https://d56bochluxqnz.cloudfront.net/documents/full-guideline/EAU-Guidelines-on-Urological-Infections-2022.pdf].

В этом контексте результаты ранних и поздних научных публикаций все же позволяют проследить эволюцию диагностических возможностей МАНК/ПЦР-РВ и МБА в оценке структуры биотопа эякулята у мужчин с бесплодием.

Исследования последних лет демонстрируют необходимость применения молекулярно-генетических исследований (секвенирование нового поколения/Next Generation Sequencing/NGS или ПЦР-РВ) наряду с МБА, который на протяжении многих десятилетий являлся традиционным методом верификации диагноза при инфекционно-воспалительных заболеваниях урогенитального тракта. Преимущества использования технологий NGS или ПЦР-РВ связаны с возможностью выявления микроорганизмов из биопленок, микробов, трансформированных в L-формы и некультивируемой анаэробной микрофлоры [Juan Antonio García-Velasco et al. What fertility specialists should know about the vaginal microbiome: a review / REPRODUCTIVE BIOMEDICINE ONLINE, 35 (2017), 103-112.]

За рубежом структуру микробиома урогенитального тракта принято оценивать с помощью NGS, массовое использование которой ограничено недостатками: дорогостоящее оборудование, технологические сложности исполнения анализа и высокая стоимость (несколько тысяч евро/анализ). В этой связи секвенирование молекул ДНК и РНК урогенитального биотопа более подходит для научных исследований, а не для рутинного использования в медицинской практике.

Для решения клинических задач в медицинских лабораториях РФ широко используются технология МАНК/ПЦР-РВ, основанная на идентификации фрагментов генома микроорганизмов, с чувствительностью и специфичностью метода 98-99%, сокращение ТАТ до 3-4 часов с момента поступления биоматериала в лабораторию, низкую стоимость теста.

В список действий предлагаемого способа входит молекулярный тест оценки структуры микробиома - это российская разработка на основе ПЦР-РВ, не имеющая аналогов в мире, представляет количественную оценку нарушения структуры микробиома в заявленном локусе.

Результаты молекулярного теста не зависят от культуральных свойств и морфологических особенностей микроорганизма, позволяют с одинаковой эффективностью выявлять аэробные и анаэробные, трудно культивируемые и некультивируемые бактерии, вирусы, простейшие; тест делает возможным рутинное определение широкого перечня клинически значимых микроорганизмов.

Использование некультивационной технологии не требует сохранения жизнеспособности микробов и, как следствие, упрощает требования к хранению и транспортировке биоматериала.

Важность исследования микробного состава семенной жидкости мужчин с бесплодием подчеркивается во многих мировых публикациях. В настоящее время осадок эякулята является приоритетным биологическим образцом для понимания инфекционно-воспалительных причин репродуктивных нарушений [Сапожкова Ж.Ю. Способ микроскопической диагностики качества спермы после седиментации эякулята: Патент на интеллектуальную собственность, 2019. © 2 686685. URL http://new.fips.ru: Sapozhkova Z., Kasoyan K., Kovalchuk E., Shabalova I. Sperm Sediment Cytology: A New Technique for Diagnosing Occult Urologic Infections // Acta Cytologica. 2017. Vol. 61, N3. P. 247-251. DOI 10.1159/000469653], так как представляет собой свободный от спермоплазмы концентрированный материал, включающий клеточное содержимое всех мужских добавочных половых желез.

Процесс не инвазивного получения эякулята можно отнести к конкурентным преимуществам по сравнению с процессом сбора образца СПЖ и УО/УС для поиска ценных диагностических находок различными лабораторными методами [Сапожкова Ж.Ю., Милованова Г.А., Пацап О.И. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. Маркеры и методы. Часть II // Лабораторная и клиническая медицина. Фармация. 2021. Т. 1, №2. С. 65-79. DOI: 10.14489/lcmp.2021.02.рр.065-079].

Отмечено, что образцы цельного эякулята значительно отличаются по вязкости и гомогенности и уступают по выявляемости микроорганизмов, что может приводить к неравномерному распределению микробных клеток в объеме исследуемого биоматериала.

К примеру, перед проведением ПЦР-РВ для снижения вязкости образца необходимо дополнительно обрабатывать цельный эякулят средой с муколитиком [Ворошилина Е.С, Зорников Д.Л., Паначева Е.А. (2019). Сравнительное исследование микробиоты эякулята методом количественной ПЦР и культуральным методом. Вестник Российского государственного медицинского университета, (1), 44-49.], что может приводить к потере диагностических находок, к повышению себестоимости теста и увеличению ТАТ.

Заранее подготовленный осадок эякулята представляет собой очищенный от белковых примесей материал, что способствует заведомо полноценному протеканию ПЦР-РВ, исключая ингибирование TAG-полимеразы.

Уже на рубеже XX века исследования Jarvi K at al. (1996) отражали преимущества ПЦР перед МБА в диагностике инфекционных возбудителей в осадке эякулята фертильных и инфертильных мужчин.

Результаты, полученные с помощью ПЦР показывали, что в сперме у 66% бессимптомных бесплодных мужчин и в 66% доноров спермы были обнаружены бактерии в клинически-значимой концентрации >10⁴/мкл, в то время как МБ выявил бактериоспермию только у 27% бесплодных мужчин и ни у одного из доноров спермы.

В четырех из этих образцов осадка эякулята анализ секвенирования ДНК выявил в среднем девять различных видов бактерий на образец, из которых почти 90% видов были анаэробами [Jarvi K, Lacroix JM, Jain A, Dumitru I, Heritz D, Mittelman MW. Polymerase chain reaction-based detection of bacteria in semen. Fertil Steril. 1996;66(3):463-467.].

Эти, данные указывают на риски получения ложноотрицательных результатов с помощью МБА, особенно в отношении анаэробных бактерий.

Альтернативная технология на основе молекулярно-биологических методов может безошибочно подтвердить или опровергнуть роль инфекции в мужском бесплодии.

Были получены результаты по составу бактериального профиля у мужчин с бесплодием:

1) анаэробы: 6 видов Peptostreptococcus,

2) 2 вида Prevotella, 2 вида Veillonella, Corynebacterium group, Rubrivirax, Actinobacillus spp. и Eubacterium spp;

3) аэробы: Streptococcus salivarius, Streptococcus pneumoniae и Burkholderia pickettii.

Спустя две декады лет недостаток мировых научных публикаций об оценке микробного статуса эякулята пополнили наблюдения российских разработчиков, ученых и практикующих врачей на ПЦР-РВ с тестом молекулярного анализа структуры микробиома.

Исследование с 2019 г демонстрирует преимущество метода молекулярных тестов, а именно ПЦР РВ, в сравнении со стандартным МБА эякулята.

ПЦР РВ может быть рекомендована как скрининговый метод.

Для повышения точности выявления микроорганизмов, перед сбором образца эякулята целесообразно назначение препарата «Лонгидаза», который способствует дренированию ацинусов предстательной железы [Почерников Д.Г., Постовойтенко Н.Т., Стрельников А.И. Сравнительный анализ культурального и молекулярно-генетического методов в исследовании микробиоты эякулята при мужской инфертильности. Андрология и генитальная хирургия 2019;20(2):40-7].

Для комплексной оценки микробиоты эякулята работы Воршилиной Е.С. и соавт. (2019, 2020) также подтверждают преимущества молекулярного теста молекулярного анализа структуры микробиома - перед моно-МБ.

Использование только МБА для определения структуры биотопа позволило выявить лишь часть присутствующих в образце микроорганизмов, при этом каждый 6-й образец был «стерильным», то есть ложно отрицательным.

Применение ПЦР-РВ позволило идентифицировать от 8 до 15 групп микроорганизмов в количестве 10²-10⁶ ГЭ/мл во всех исследованных пробах эякулята, при этом в большинстве проб преобладала одна из групп микроорганизмов. Во всех 86 образцах спермы, кроме вида, выявленного МБ, были обнаружены представители других групп бактерий.

Согласно данным МБА, преобладающая группа микроорганизмов в эякуляте полностью соответствовала результатам молекулярного анализа структуры микробиома только в 21 (24,4%) из 86 проб; в остальных случаях микробиота при МБА либо отсутствовала 14 (16,8%), либо спектр выявленных микроорганизмов отличался.

Получение дискордантных результатов было обусловлено невозможностью выявить при МБ некультивируемые и трудно культивируемые группы ОАУПМО [Ворошилина Е.С., Зорников Д.Л., Паначева Е.А. (2019). Сравнительное исследование микробиоты эякулята методом количественной ПЦР и культуральным методом. Вестник Российского государственного медицинского университета, (1), 44-49.].

Авторам удалось провести кластерный анализ микробиоты эякулята пациентов с нарушением репродукции и эректильной дисфункцией с помощью, что указывало на гетерогенность микробиома спермы, где выделяются четыре устойчивые кластера с преобладанием укрупненной группы микроорганизмов: ОАУПМО (20,7% Bacteroides spp./Porphyromonas spp./Prevotella spp., в 17% Eubacterium spp., в 16,9% Peptostreptococcus spp.); ЭЭ (11,7% Enterobacteriaceae/Enterococcus spp.) и представители нормофлоры - ГПФАМО (21% Corynebacterium spp.) и в 19,7% Lactobacillus spp.].

Исследования подчеркивают, что пациенты с бесплодием демонстрируют нарушения структуры бактериального микробиома эякулята, преобладающей группой в котором является ОАУПМО, некоторые микроорганизмы ГОФАМО (Pseudomonas aeruginosa/Ralstonia spp./Burkholderia spp. и Haemophilus spp.), а также представители монокультуры ЭЭ.

Необходимо отметить, что в отличии от МБА, технология МАНК/ПЦР-РВ молекулярного анализа структуры микробиома позволяет идентифицировать в количественном формате другие клинически значимые микроорганизмы и их ассоциации, в частности, характерных для значимой бактериоспермии - ОАУПМО, ГОФАМО и ЭЭ в составе микробных ассоциаций; для нормофлоры - ГПФАМО в виде монокультуры Corynebacterium spp.; Staphylococcus spp. и Streptococcus spp. в составе микробных ассоциаций. Большинство микроорганизмов, определяемых с помощью МАНК/ПЦР-РВ не высеваются на стандартных питательных средах, являются трудно культивируемыми или некультивируемыми в силу своих биологических свойств, но, как удалось установить, являются доминирующими в микробном пейзаже осадка эякулята мужчин с MAGI и бесплодием, что может объяснять причину недостоверной диагностики и не корректной лекарственной терапии.

Другой сильной стороной молекулярного анализа структуры микробиома является максимально укороченное ТАТ, что позволяет за срок 3-4 час иметь представление о расширенном микробиоме осадка эякулята с установлением доминирующих групп микроорганизмов.

Важность применения МБА по-прежнему остается актуальной, так как с помощью этого метода можно определить чувствительность микроорганизмов к антибиотикам и обнаружить различные энтеробактерии, медикаментозная терапия которых может отличаться.

Далее приведены примеры практического использования представленного способа в сравнении с известным способом (прототипом).

Клинический пример 1

Мужчина 33 г., женат, детей нет, жалобы на отсутствие детей в браке на протяжении 3 лет, дискомфорт со стороны мужских добавочных половых желез (тянущие боли в мошонке, пульсирующие боли в области предстательной железы, часто зуд, жжение в промежности). После неоднократного обследования цельного эякулята молекулярным и микробиологическим методом на предмет инфекций результаты были не диагностически значимыми.

В соответствии с известным способом:

Молекулярное исследование УС:

1) ДНК облигатно анаэробных условно-патогенных микроорганизмов Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum не обнаружена;

2) ДНК дрожжеподобных грибов рода Candida не обнаружена;

3) ДНК облигатных патогенов С. trachomatis, T. vaginalis, N. gonorhoeae, Mycoplasma genitalium не обнаружена.

Микробиологическое исследование цельного эякулята: обнаружена монокультура ГПФАМО (коменсал нормальной флоры) Staphylococcus epidermidis в концентрации 10² КОЕ/мл (<10³ КОЕ/мл), что является не диагностически значимым количеством.

На фиг. 5 приведена таблица с результатами чувствительности возбудителя к антибактериальным препаратам.

Для установления этиологического фактора инфекционной природы, определяющий нарушение репродуктивной функции и дискомфорт со стороны мужских добавочных половых желез (оценка структуры микробиома, обнаружение облигатных патогенов) было выполнено молекулярное количественное исследование осадка эякулята.

В соответствии с представленным способом:

Молекулярное исследование осадка эякулята:

1) обнаружена ДНК ОАУПМО Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp. в концентрации 10^4.3 ГЭ/мл, Eubacterium spp. в концентрации 10^5.9 ГЭ/мл, Bacteroides spp./Porphyromonas spp./Prevotella spp. в концентрации 10^6.0 ГЭ/мл, Anaerococcus spp. в концентрации 10^4.9 ГЭ/мл, Peptostreptococcus spp. в концентрации 10^6.5 ГЭ/мл (концентрация общей бактериальной массы 10^6.7 ГЭ/мл), что является диагностически значимым количеством; обнаружена ДНК дрожжеподобного гриба рода Candida в концентрации 10^3.1 ГЭ/мл, что является диагностически значимым количеством.

2) ДНК облигатных патогенов C. trachomatis, T. vaginalis, N. gonorhoeae, Mycoplasma genitalium не обнаружена.

На фиг. 6 приведены результаты исследований осадка эякулята в соответствии с заявленным способом.

Микробиологическое исследование осадка эякулята: обнаружена Enterococcus faecalis 10⁵ КОЕ/мл и ГПФАМО Staphylococcus heamolyticus в концентрации 10⁴ КОЕ/мл (≥10³ КОЕ/мл), что является диагностически значимым количеством.

На фиг. 7 приведены результаты посева на микрофлору и чувствительность к антибиотикам, расширенный спектр

Клинический пример 2

Мужчина 37 г., дважды женат, жалобы на отсутствие детей в двух браках на протяжении 10 лет, незначительный дискомфорт со стороны мужских добавочных половых желез в виде спонтанных выделений по утрам и после приема алкогольных напитков. На протяжении 6 лет неоднократно обследовал цельный эякулят молекулярным и микробиологическим методом на предмет инфекций, результаты были не диагностически значимыми.

В соответствии с известным способом:

Молекулярное исследование УС: 1) ДНК облигатно анаэробных условно-патогенных микроорганизмов Gardnerella vaginalis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum не обнаружена; 2) ДНК облигатных патогенов C. trachomatis, Mycoplasma genitalium не обнаружена.

На фиг. 8 - приведены результаты микробиологического исследования цельного эякулята.

Микробиологическое исследование цельного эякулята 1: обнаружена нормобиота слизистых мочевыводящих путей в виде грамм-положительных факультативно анаэробных микроорганизмов Staphylococcus xylosus и Streptococcus viridans, что расценивается как «рост клинически значимой микробиоты не обнаружен».

На фиг. 9 приведены результаты исследования микробиоты в соответствии с известным способом.

Для установления этиологического фактора инфекционной природы, определяющий нарушение репродуктивной функции и дискомфорт со стороны мужских добавочных половых желез (оценка структуры микробиома, обнаружение облигатных патогенов) было выполнено молекулярное количественное исследование осадка эякулята.

В соответствии с заявленным способом:

Молекулярное исследование осадка эякулята:

1) обнаружена ДНК ГОФАМО Haemophilus spp. в концентрации 10^4.3 ГЭ/мл, что является диагностически значимым количеством;

2) ДНК облигатных патогенов C. trachomatis, T. vaginalis, N. gonorhoeae, Mycoplasma genitalium не обнаружена.

На фиг. 10 приведены результаты микробиологического исследования осадка эякулята 1

Микробиологическое исследование осадка эякулята 1: рост микроорганизмов не обнаружен.

На фиг. 11 приведены результаты микробиологического исследования осадка эякулята 2.

Микробиологическое исследование осадка эякулята 2: обнаружен рост нормальной бактериальной флоры в низком титре.

На фиг. 12 приведены результаты анализа посева МПО на микрофлору.

Клинический пример 3

Мужчина 30 г., женат, детей нет, жалобы на отсутствие детей в браке на протяжении 2-х лет, жалобы у супруги - бактериальный вагиноз, зуд, жжение после незащищенного полового акта, короткие эпизоды выздоровления после длительных многократных лечений сменяются рецидивами нарушения вагинального биотопа, молочницы. После неоднократного обследования цельного эякулята молекулярным и микробиологическим методом на предмет инфекций результаты были не диагностически значимыми.

Известный способ:

Молекулярное исследование УС:

1) ДНК облигатно анаэробных условно-патогенных микроорганизмов Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum не обнаружена;

2) ДНК дрожжеподобных грибов рода Candida не обнаружена;

3) ДНК облигатных патогенов C. trachomatis, T. vaginalis, N. gonorhoeae, Mycoplasma genitalium не обнаружена.

На фиг. 13 приведены результаты молекулярного исследования по известному способу.

Микробиологическое исследование УС/УО: обнаружена монокультура ГПФАМО (коменсал нормальной флоры) Staphylococcus epidermidis в концентрации 10³ КОЕ/мл (<=10³ КОЕ/мл), что является не диагностически значимым количеством.

На фиг. 14 приведены результаты микробиологическое исследование цельного эякулята,

Микробиологическое исследование цельного эякулята: в исследуемом материале микрофлоры не обнаружено.

На фиг. 15 приведены результаты микробиологического (культурного) исследования.

Для установления этиологического фактора инфекционной природы, определяющий нарушение репродуктивной функции и дискомфорт со стороны мужских добавочных половых желез (оценка структуры микробиома, обнаружение облигатных патогенов) было выполнено молекулярное количественное исследование осадка эякулята.

Заявленный способ:

Молекулярное исследование осадка эякулята: 1) Структура бактериального микробиома соответствует норме; Candida spp. ниже порогового значения;

2) ДНК облигатных патогенов C. trachomatis, T. vaginalis, N. gonorhoeae, Mycoplasma genitalium не обнаружена.

На фиг 16 приведены результаты исследования по заявленному способу.

Микробиологическое исследование осадка эякулята: обнаружена Enterococcus faecalis 10⁵ КОЕ/мл, что является диагностически значимым количеством.

На фиг. 17 приведены результаты исследования посева на микрофлору и чувствительности к антибиотикам, расширенный спектр.

Результаты исследования видны из таблицы.

Рассмотренные клинические случаи использования диагностики по заявляемому способу наглядно показывают преимущества использования заявляемого способа диагностики, которые позволяет позволяют расширить диапазон распознаваемых до 90%.

МБА и МАНК/ПЦР-РВ в осадке эякулята могут являться взаимодополняющими. Введение молекулярного анализа структуры микробиома осадка эякулята в алгоритм обследования пациентов расширит диагностические возможности врача, будет способствовать полноценному обследованию мужчин с MAGI и бесплодием.

Анализ практикующих врачей лабораторной медицины и урологов-андрологов РФ по работе с осадком эякулята с помощью двух технологий представляется ценным профессиональным кейсом для пересмотра протоколов лабораторного обследования пациентов мужского пола в прегравидарной подготовке супружеской пары, в том числе рекомендуемым для обсуждения и пересмотра действующих КР и НПА РФ.

Применение заявляемого способа позволяет диагностики избежать назначения дополнительных лабораторных методов, инструментальных диагностических процедур и необоснованной антибиотикотерапии, что отражает концепцию управления здоровьем и долголетием на основе корректного планирования медицинской и экономической эффективности в организации здравоохранения.

Таким образом, применение представленного способа позволяет исключить недостатки, присущие известным способам.

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, андрологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики нарушения мужской репродуктивной функции. Проводят сбор биологического материала. На основе полученных данных формируют заключение о мужской репродуктивной функции. В качестве биологического материала используют эякулят. Для диагностики одновременно проводят микробиологический и молекулярный анализ. Микробиологический анализ, а именно идентификацию полученных колоний микроорганизмов осуществляют путем количественного измерения концентрации микроорганизмов резидентной флоры или ее микробных ассоциаций и путем измерения количества нерезидентных бактерий в концентрации ≥10³ КОЕ /мл с помощью времяпролетной матрично-ассоциированной лазерной десорбционной ионизационной масс-спектрометрии или на анализаторе микробиологическом. Молекулярный анализ, а именно идентификацию и количественный анализ биотопа осадка эякулята по спектру условно-патогенных микроорганизмов проводят на детектирующих амплификаторах, который включает: грамположительные факультативно анаэробные микроорганизмы Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Corynebacterium spp., грамотрицательные факультативно анаэробные микроорганизмы Haemophilus spp., Pseudomonas aeruginosa/Ralstonia spp./Burkholderia spp., группу Enterobacteriaceae/Enterococcus spp., облигатно анаэробные условно-патогенные микроорганизмы - Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Bacteroides spp./Porphyromonas spp./Prevotella spp., Anaerococcus spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium cluster, и грибы рода Candida. Нарушение мужской репродуктивной функции диагностируют при концентрации ДНК в осадке эякулята более или равной 10³ ГЭ/мл: облигатно анаэробных условно-патогенных микроорганизмов и/или грамотрицательных факультативно анаэробных микроорганизмов и/или группы Enterobacteriaceae /Enterococcus spp. и/или микоплазм и/или грибов рода Candida, при обнаружении в осадке эякулята микроорганизмов резидентной флоры или ее микробных ассоциаций или нерезидентных бактерий в концентрации более или равной 10³ КОЕ/мл. Способ обеспечивает возможность расширения спектра диагностики этиологических факторов инфекционной природы нарушения мужской репродуктивной функции, повышения информативности и достоверности диагностики за счет одновременного проведения микробиологического и молекулярного анализа осадка эякулята. 3 з.п. ф-лы, 17 ил., 3 пр.

1. Способ лабораторной диагностики нарушения мужской репродуктивной функции, включающий сбор биологического материала, осуществление диагностики и на основе полученных данных формирование заключения о мужской репродуктивной функции, отличающийся тем, что

в качестве биологического материала используют эякулят,

перемещают эякулят в конусовидные стерильные одноразовые полипропиленовые пробирки порциями,

осуществляют обработку порций эякулята на центрифуге медицинской при скорости вращения 1500 об/мин в течение 15 мин,

- стерильной пипеткой Пастера удаляют надосадочную жидкость,

- 50 мкл осадка эякулята переносят стерильным наконечником с помощью дозатора пипеточного одноканального объемом 20-200 мкл в пробирку Эппендорфа с транспортной средой для теста «Андрофлор» для молекулярного исследования оценки структуры биотопа осадка эякулята,

- не менее 10 мкл осадка эякулята переносят другим стерильным наконечником с помощью дозатора пипеточного одноканального объемом 20-200 мкл в тупфер с угольной средой для культурального исследования оценки структуры биотопа осадка эякулята,

- для диагностики одновременно проводят микробиологический и молекулярный анализ,

- микробиологический анализ, а именно идентификацию полученных колоний микроорганизмов осуществляют путем количественного измерения концентрации микроорганизмов резидентной флоры или ее микробных ассоциаций и путем измерения количества нерезидентных бактерий в концентрации ≥10³ КОЕ/мл с помощью времяпролетной матрично-ассоциированной лазерной десорбционной ионизационной масс-спектрометрии или на анализаторе микробиологическом,

- молекулярный анализ, а именно идентификацию и количественный анализ биотопа осадка эякулята по спектру условно-патогенных микроорганизмов проводят на детектирующих амплификаторах, при этом спектр условно-патогенных микроорганизмов включает:

грамположительные факультативно анаэробные микроорганизмы Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Corynebacterium spp.,

грамотрицательные факультативно анаэробные микроорганизмы Haemophilus spp., Pseudomonas aeruginosa/Ralstonia spp./Burkholderia spp.,

группу Enterobacteriaceae/Enterococcus spp.,

облигатно анаэробные условно-патогенные микроорганизмы - Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Bacteroides spp./Porphyromonas spp./Prevotella spp., Anaerococcus spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium cluster, и

грибы рода Candida,

при этом диагностируют нарушение мужской репродуктивной функции при концентрации ДНК в осадке эякулята более или равной 10³ ГЭ/мл: облигатно анаэробных условно-патогенных микроорганизмов и/или грамотрицательных факультативно анаэробных микроорганизмов и/или группы Enterobacteriaceae /Enterococcus spp. и/или микоплазм и/или грибов рода Candida, при обнаружении в осадке эякулята микроорганизмов резидентной флоры или ее микробных ассоциаций или нерезидентных бактерий в концентрации более или равной 10³ КОЕ/мл.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при проведении микробиологического анализа измеряют концентрацию граммположительных факультативно анаэробных микроорганизмов, монокультуры Staphylococcus epidermididis, Staphylococcus heamolyticus, Streptococcus group viridans, Streptococcus oralis.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при проведении молекулярного анализа исследуют фрагменты ДНК микроорганизмов, содержащихся в пробирке после сбора эякулята.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при проведении микробиологического анализа исследуют полуколичественные соотношения микроорганизмов, определяющих нормальную и патологическую микробиоту по колониеобразующим единицам, попавшим на питательную среду для культивирования бактерий.