СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ОСТРОГО ПОСТЛУЧЕВОГО ПАНКРЕАТИТА У ЖИВОТНЫХ Российский патент 2025 года по МПК A61K31/198 A61N5/10 A61P39/06 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной радиобиологии, биохимии и морфологии, и может быть использовано для применения в качестве радиопротекторного фармакологического средства уменьшения выраженности лучевого панкреатита.

Воздействие ионизирующего излучения на органы брюшной полости приводит к развитию признаков постлучевого панкреатита, таких как кровоизлияния, некрозы, отек, воспалительная инфильтрация разной степени тяжести (Schoonbroodt D., Zipf A., Hermann G., Jung M. Histological findings in chronic pancreatitis after abdominal radiotherapy. Pancreas. 1996; 12: 313-315). Электроны, по сравнению с другими видами ионизирующего излучения (такими как Х- и γ-излучения), характеризуются более мягким воздействием на клетки. Поэтому применение облучения электронами весьма актуально в связи с необходимостью оптимизации способов лучевой терапии органов брюшной полости.

На ранних сроках исследования (первые дни после облучения) воздействие ионизирующего излучения приводит к радиационно-индуцированной гибели клеток островков Лангерганса и ацинарных клеток поджелудочной железы с развитием острого и/или подострого панкреатита с формированием фокальных некрозов, клеточной воспалительной инфильтрации, геморрагий, отека, признаков фиброза паренхимы и др. Это связано с активацией прямых и косвенных механизмов лучевого повреждения. Прямой механизм заключается в формировании хромосомных аберраций в результате прямого действия электронов на нити ядерной и митохондриальной ДНК с образованием одно- и двунитевых разрывов и сшивок. Это приводит к активации каскадов внутреннего и церамидного путей апоптоза и некрозу, вызванному переходом проницаемости митохондрий (mitochondrial permeability transition driven necrosis, MPT-driven necrosis) (Sia J, Szmyd R, Hau E, Gee HE. Molecular Mechanisms of Radiation-Induced Cancer Cell Death: A Primer. Front Cell Dev Biol. 2020; 8:41. Published 2020 Feb 13. doi:10.3389/fcell.2020.00041; Kam WW, Banati RB. Effects of ionizing radiation on mitochondria. Free Radic Biol Med. 2013; 65:607-619. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2013.07.024).

Кроме того, воздействие ионизирующего излучения приводит к радиолизу вне- и внутриклеточной воды с образованием свободных радикалов (активных форм кислорода, реактивных форм азота, продуктов перекисного окисления липидов), что ведет к повреждению внутриклеточных макромолекул (белков, липидов и др.) и нарушению проницаемости цитоплазматической мембраны. Это связано с развитием оксидативного стресса, нарушением функции эндогенной редокс-системы, истощением и снижением активности антиоксидантной защиты и токсическим повреждением клеток с активацией каскада внешнего пути апоптоза и последующей клеточной гибелью.

Воспаление, возникающее в ответ на радиационную клеточную гибель, приводит к привлечению в зону облучения иммунных клеток (тучных клеток, макрофагов и Т-лимфоцитов). Эти клетки в ответ на радиационно-индуцированное формирование DAMPs (молекулярные фрагменты, ассоциированные с повреждениями) синтезируют большое количество провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкины (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-33,), различные транскрипционные и метаболические факторы (TNF-α, IFN-γ, NF-κB, SMAD2/3), а также факторы роста (TGF-β, PDGF и др). (Moustafa EM, Moawed FSM, Abdel-Hamid GR. Icariin Promote Stem Cells Regeneration and Repair Acinar Cells in L-arginine / Radiation -Inducing Chronic Pancreatitis in Rats. Dose Response. 2020;18(4):1559325820970810. Published 2020 Oct 30. doi:10.1177/1559325820970810). Вследствие этого в поджелудочную железу мигрируют иммунные клетки, такие как CD3-T-лимфоциты, CD68-макрофаги, тучные клетки, и др. (Moustafa EM, Moawed FSM, Abdel-Hamid GR. Icariin Promote Stem Cells Regeneration and Repair Acinar Cells in L-arginine / Radiation -Inducing Chronic Pancreatitis in Rats. Dose Response. 2020;18(4):1559325820970810. Published 2020 Oct 30. doi:10.1177/1559325820970810).

Исследование радиопротекторных средств, способных предотвращать развитие оксидативного стресса, токсического повреждения клеток свободными радикалами, и последующих воспалительных процессов представляется необходимым и перспективным направлением радиационной медицины.

Известно исследование, где было доказана радиопротекторная активность препарата Амифостина, который рекомендован к применению в клинической практике для защиты нормальных тканей от лучевого повреждения (Yang W, Pan L, Cheng Y, et al. Amifostine attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice through inhibition of the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. Sci Rep. 2023;13(1):10485. Published 2023 Jun 28. doi:10.1038/s41598-023-34060-8).

Однако, данный препарат обладает рядом недостатков, таких как неудобный способ введения, высокая стоимость, токсичность и др. Поэтому тема разработки способов и средств профилактики постлучевых осложнений остается по-прежнему актуальной.

Одним из лекарственных препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами, является N-ацетилцистеин (N-AC). В некоторых исследованиях была показана роль этого препарата в снижении уровней каспазы-3, малонового диальдегида (маркера пероксидации липидов) и экспрессии факторов воспаления (TNF-α, NF-κB), а также в стимуляции эндогенной антиоксидантной защиты посредством увеличения уровня глутатиона (Yilmaz H, Mercantepe F, Tumkaya L, Mercantepe T, Yilmaz A, Yilmaz Rakici S. The potential antioxidant effect of N-acetylcysteine on X-ray ionizing radiation-induced pancreas islet cell toxicity. Biochem Biophys Res Commun. 2023;685:149154. doi:10.1016/j.bbrc.2023.149154). Более того, некоторые авторы обнаружили позитивные эффекты N-AC при оксидативном стрессе в модели KrasG12D-индуцированного панкреатита и гепатита, где данный препарат снижал уровни экспрессии TNF-α и NF-κB. Это привело к ограничению воспаления и снижению уровня клеточной гибели (Minati MA, Libert M, Dahou H, Jacquemin P, Assi M. N-Acetylcysteine Reduces the Pro-Oxidant and Inflammatory Responses during Pancreatitis and Pancreas Tumorigenesis. Antioxidants (Basel). 2021;10(7):1107. Published 2021 Jul 11. doi:10.3390/antiox10071107).

Известна работа, посвященная изучению противолучевой эффективности N-ацетилцистеина у животных (крыс), подвергнутых X- облучению (Yilmaz H, Mercantepe F, Tumkaya L, Mercantepe T, Yilmaz A, Yilmaz Rakici S. The potential antioxidant effect of N-acetylcysteine on X-ray ionizing radiation-induced pancreas islet cell toxicity. Biochem Biophys Res Commun. 2023;685:149154. doi:10.1016/j.bbrc.2023.149154). В данной работе показано, что применение N-ацетилцистеина до и после рентгеновского облучения крыс в сублетальной дозе смягчает пагубное воздействие ионизирующего излучения на островковые клетки поджелудочной железы благодаря своей способности бороться с окислительным стрессом.

Другая известная работа посвящена противолучевой эффективности N-ацетилцистеина у животных (крыс), подвергнутых γ- облучению (Haroun R.A-H., Abdel-Aziz N., Soha Saad S. The protective effect of N-acetyl cysteine against selenium toxicity and gamma irradiation in rats. Drug and Chemical Toxicology. 2023. Vol. 46, Issue 3. P. 482-490). Приведенные данные также свидетельствуют об эффективном противодействии N-ацетилцистеина проявлениям оксидативного стресса, вызываемого у животных действием ионизирующего (гамма) излучения.

Нужно отметить, что N-ацетилцистеин не только не токсичен сам по себе, но и обладает свойством уменьшения/подавления токсичности других лекарственных препаратов при композиционном применении (RU 2291689 C2. Херценберг Л.А., Де Роса С.К., Андрус Д. Композиции N-ацетилцистеина и способы лечения и профилактики токсичности лекарственных средств. 2006).

Известен способ профилактики радиационных поражений, касающийся противолучевой эффективности N-ацетилцистеина (SU1 797 195 A1. Антушевич А.Е., Красильников И.И., Деев С.П., Мясоедов А.Ф.. 1991). Но в данном работе присутствует только формула этого изобретения - без каких-либо подробностей.

Таким образом, представлялось целесообразным проведение исследования радиопротекторной эффективности N-ацетилцистеина при облучении электронами, которое является относительно щадящим (по сравнению с рентгеновским и гамма-излучениями), перспективным и малоизученным методом лучевой терапии. Кроме того, не менее важной представляется разработка и апробация применения N-ацетилцистеина в качестве антиоксидантного средства защиты нормальных тканей от лучевого воздействия. Авторы пришли к выводу, что N-ацетилцистеин обладает рядом преимуществ по сравнению с общепринятыми радиопротекторными препаратами.

Исходя из этих предпосылок, авторы провели сравнительное исследование противолучевой эффективности N-ацетилцистеина и Амифостина в модели индуцированного облучением электронами острого лучевого панкреатита у крыс.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективное подавление проявлений острого постлучевого панкреатита N-ацетилцистеином при профилактическом введении этого препарата (до электронотерапии).

Технический результат достигается тем, что за 1 час до каждого локального облучения электронами в области спины в зоне проекции поджелудочной железы в разовой очаговой дозе 5 Гр в режиме фракционирования при мощности дозы 1 Гр/мин, энергия 10 МэВ и частота 9 Гц, размер поля ∅ 50 мм до суммарной очаговой дозы 25 Гр, интраперитонеально вводят фармакологическое средство N-ацетилцистеин в дозе 120 мг/кг.

Изобретение поясняется подробным описанием, примерами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 - Структурная формула N-ацетилцистеина (N-ацетил-L-цистеин, NAC).

Фиг. 2 - Результаты биохимического исследования крови (глюкозы, инсулина, амилазы), уровней супероксиддисмутазы и малонового диальдегида, а также оценки выраженности панкреатита (суммарный балл по гистологическим критериям) в контроле и экспериментальных группах на 7, 30, 60 и 90 сутки: а) глюкоза, ммоль/л; б) инсулин, нг/мл; в) амилаза, Ед/л; г) супероксиддисмутаза, ед/мл; д) малоновый диальдегид, нмоль/мл; е) суммарный балл по гистологическим критериям. Данные представлены в виде средних значений (диапазон), приведены значения теста Краскела-Уоллиса и U-теста Манна-Уитни. SOD - супероксиддисмутаза, MDA - малоновый диальдегид, N-АС - N-ацетилцистеин. Статистически значимые различия (р <0.05): ^а - 7 сутки vs 30 сутки в той же группе, ^b - при сравнении с 60 сутками в той же группе, ^с - при сравнении с 90 сутками в той же группе; * - по сравнению с контролем; ^! - по сравнению с группой облучения на том же сроке; ⁺ - Amifostine vs N-AC.

Фиг. 3 - Морфометрический анализ фрагментов поджелудочной железы в контроле и экспериментальных группах на 7, 30, 60 и 90 сутки: количество островков (в 1 мм²), площадь островков (μm²), диаметр островков (μm) и количество эндокринных клеток в островке (в %): а) количество островков в 1 мм²; б) площадь островков, μm²; в) диаметр островков, μm; г) количество эндокринных клеток в островке, %. Данные представлены в виде средних значений (диапазон), приведены значения теста Краскела-Уоллиса и U-теста Манна-Уитни. SOD - супероксиддисмутаза, MDA - малоновый диальдегид, N-АС - N-ацетилцистеин. Статистически значимые различия (р <0.05): ^а - 7 сутки vs 30 сутки в той же группе, ^b - при сравнении с 60 сутками в той же группе, ^с - при сравнении с 90 сутками в той же группе; ^* - по сравнению с контролем; ^! - по сравнению с группой облучения на том же сроке; ⁺ - Amifostine vs N-AC.

Фиг. 4 - Поджелудочная железа животных контрольной и экспериментальных групп:

а) верхний ряд - морфологическая картина, окрашивание гематоксилином и эозином (H&E), увеличение ×200. Клеточный воспалительный инфильтрат (стрелка), панкреатический островок (звёздочка);

б) средний ряд - иммуногистохимическая картина с антителами к инсулину (Ins.), увеличение ×200;

в) нижний ряд - иммуногистохимическая картина с антителами к глюкагону (Glu.), увеличение ×200. Масштабная линейка - 50 μm. Распределение количества позитивных клеток при иммуногистохимических реакциях с антителами к инсулину и глюкагону на 7, 30, 60 и 90 сутки;

г) диаграмма распределения Инсулин- и Глюкагон- позитивных клеток в панкреатических островках в поджелудочной железе лабораторных животных через 7, 30, 60 и 90 суток в контрольной и опытных группах (в %), график. Статистически значимые различия (р <0.05): а - 7 сутки и 30 сутки в той же группе, b - при сравнении с 60 сутками в той же группе, с - при сравнении с 90 сутками в той же группе; * - по сравнению с контролем; ! - по сравнению с группой облучения на том же сроке; + - АМИ и N-АЦ. СОД - суммарная очаговая доза, N-АЦ - N-ацетилцистеин, АМИ - амифостин.

Фиг. 5 - Иммуногистохимическая оценка маркеров воспаления IL-1β (провоспалительный цитокин), CD3 (Т-лимфоциты) и CD68 (макрофаги) в поджелудочной железе контрольной и опытных групп, увеличение ×400:

а) иммуногистохимическая реакция клеток поджелудочной железы на провоспалительный цитокин IL-1β. Увеличение количества IL-1β-иммунопозитивных клеток - маркера провоспалительных цитокинов, преимущественно эндокриноцитов панкреатического островка, после однократного локального воздействия электронами во фракционном режиме в суммарной очаговой дозе 25 Гр. При предлучевом ведении N-ацетилцистеина в дозе 120 мг/кг число IL-1β-иммунопозитивных клеток близко к контрольным значениям. Масштабная линейка - 25 μm;

б) иммуногистохимическая реакция на CD3 (Т-лимфоцитов) в поджелудочной железе. Увеличение количества CD3-иммунопозитивных клеток - маркера цитотоксических Т-лимфоцитов после однократного локального воздействия электронами во фракционном режиме в суммарной очаговой дозе 25 Гр. При предлучевом ведении N-ацетилцистеина в дозе 120 мг/кг число CD3-иммунопозитивных клеток близко к контрольным значениям. Масштабная линейка - 25 μm;

в) иммуногистохимическая реакция на CD68 (макрофагов) в поджелудочной железе. Увеличение количества CD68-иммунопозитивных клеток - маркера макрофагов после однократного локального воздействия электронами во фракционном режиме в суммарной очаговой дозе 25 Гр. При предлучевом ведении N-ацетилцистеина в дозе 120 мг/кг число CD68-иммунопозитивных клеток близко к контрольным значениям. Масштабная линейка - 25 μm;

г) распределение уровней экспрессии провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6, IL-10 в поджелудочной железе контрольной и опытных групп на 7 сутки после облучения;

д) распределение уровней экспрессии провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6, IL-10 в поджелудочной железе контрольной и опытных групп на 90 сутки после облучения. Распределение уровней экспрессии IL-1β, IL-6, IL-10 в поджелудочной железе контрольной и опытных групп на 7 и 90 сутки, график (г, д). Данные представлены в виде средних значений (диапазон), приведены значения теста Краскела-Уоллиса и U-теста Манна-Уитни. SOD - супероксиддисмутаза, MDA - малоновый диальдегид, N-АС - N-ацетилцистеин. Статистически значимые различия (р <0.05): ^а - 7 сутки vs 30 сутки в той же группе, ^b - при сравнении с 60 сутками в той же группе, ^с - при сравнении с 90 сутками в той же группе; ^* - по сравнению с контролем; ^! - по сравнению с группой облучения на том же сроке; ⁺ - Amifostine vs N-AC.

Использованные аббревиатуры в описании:

N-AC - N-ацетилцистеин;

СОД - суммарная очаговая доза облучения;

MDA - малоновый диальдегид;

SOD - супероксиддисмутаза;

Glu - глутатион;

ПЖЖ - поджелудочная железа.

Способ осуществляют следующим образом.

Экспериментальным животным (крысам) превентивно (за 1 час до локального облучения электронами) интраперитонеально вводят фармакологическое средство N-ацетилцистеин (N-ацетил-L-цистеин, N-AC - производное аминокислоты цистеина) (Фиг. 1) в дозе 120 мг/кг.

Экспериментальные исследования.

Крысы породы Вистар (Rattus Wistar; n=180) были поделены на шесть экспериментальных групп:

I - контрольная (n=20), которым вводили раствор NaCl 0,9%;

II (n=40) - фракционное локальное облучение электронами в суммарной очаговой дозе (СОД) 25 Гр;

III (n=40) - интраперитонеальное введение N-ацетилцистеина в дозе 120 мг/кг за 1 час до локального облучения электронами в СОД 25 Гр;

IV (n=40) - интраперитонеальное введение Амифостина в дозе 150 мг/кг за 30 минут до локального облучения электронами в СОД 25 Гр;

V (n=20) - интраперитонеальное введение N-ацетилцистеина в дозе 120 мг/кг;

VI (n=20) - интраперитонеальное введение Амифостина в дозе 150 мг/кг.

По 5 животных из групп I, V, VI и по 10 животных из групп II, III, IV выводили из эксперимента путем введения высоких доз анестетика (кетамин+ксилазин) через 1 неделю, 1 месяц, 2 месяца и 3 месяца после последней фракции облучения.

Модель лучевого панкреатита.

Животных подвергали частичному локальному облучению электронами в области спины в зоне проекции поджелудочной железы (суммарная доза 25 Гр, мощность дозы 1 Гр/мин, энергия 10 МэВ и частота 9 Гц, размер поля ∅ 50 мм) с использованием линейного ускорителя (“NOVAC-11”, радиологическое отделение экспериментального сектора МРНЦ им. А.Ф. Цыба, Обнинск, Россия).

Животным III и V групп вводили N-ацетилцистеин в дозе 120 мг/кг в форме интраперитонеальных инъекций.

Животным IV и VI групп интраперитонеально вводили Амифостин (препарат сравнения) в форме в дозе 150 мг/кг в форме порошка, разведенного в фосфатно-буферном растворе по стандартной методике (Vujaskovic Z, Feng QF, Rabbani ZN, Samulski TV, Anscher MS, Brizel DM. Assessment of the protective effect of amifostine on radiation-induced pulmonary toxicity. Exp Lung Res. 2002;28(7):577-590. doi:10.1080/01902140290096791).

Доза препаратов в соответствии с инструкцией является терапевтической и была рассчитана для крыс с использованием межвидовых коэффициентов пересчета дозы лекарственных препаратов для доклинических исследований.

Cпособ поясняется примерами выполнения.

Пример 1 - Результаты сравнения биохимических показателей сыворотки крови облученных экспериментальных животных при введении N-ацетилцистеина и Амифостина.

Биохимический анализ сыворотки крови проводили следующим образом: в крови измеряли уровень глюкозы (аорту канюлировали полиэтиленовым катетером) с использованием глюкометра One Touch Verio Reflect (ООО «ЛайфСкан Раша», Россия), а также инсулина и амилазы при помощи биохимического анализатора PRIETEST TOUCH (DIXION, Россия).

При исследовании уровня глюкозы, инсулина и амилазы в плазме крови животных II группы (облучение) обнаружили увеличение уровней глюкозы и амилазы на 38,3% и в 2,6 раза по сравнению с контролем; уровень инсулина в этой группе оказался снижен на 40%. В то же время, введение N-ацетилцистеина до облучения привело к менее выраженным изменениям изучаемых биохимических показателей крови: уровень глюкозы и амилазы был увеличен на 18,3 и на 45,5% соответственно, а инсулина - снижен на 18,0% (Фиг. 2 б). На ранних сроках N-ацетилцистеин был эффективнее Амифостина, а в группе облучения в течение всего эксперимента не наблюдали положительной тенденции исследуемых показателей.

Пример 2 - Результаты сравнения маркеров оксидативного стресса облученных экспериментальных животных при введении N-ацетилцистеина и Амифостина.

В гомогенате тканей поджелудочной железы после фракционного облучения электронами в дозе 25 Гр обнаружили увеличение уровня малонового диальдегида (MDA) в 5,9 раза и снижение уровня супероксиддисмутазы (SOD) на 39,1%. Менее выраженное изменение показателей MDA и SOD обнаружили в III группе (N-AC + облучение): увеличение MDA в 2,5 раза и уменьшение SOD на 21,5% по сравнению с контролем. В V группе уровень MDA был значимо (на 13,1%) ниже, чем в контроле (Фиг. 2 д). На ранних сроках N-ацетилцистеин был эффективнее Амифостина, а в группе облучения в течение всего эксперимента не наблюдали положительной тенденции исследуемых показателей.

Пример 3 - Результаты сравнения гистологического исследования поджелудочной железы облученных экспериментальных животных при введении N-ацетилцистеина и Амифостина.

При морфологическом исследовании через неделю после локального облучения электронами в СОД 25 Гр во II группе (облучение) наблюдали нарушение гистоархитектоники поджелудочной железы, обусловленное наличием признаков острого постлучевого панкреатита: кистозное расширение большинства ацинусов, их вакуолизация, фокальный некроз, геморрагии, отёк и лимфоцитарная инфильтрация. На фоне введения N-ацетилцистеина в III группе (N-AC + облучение) отмечали незначительное изменение глубины и диапазона повреждений поджелудочной железы (на 1-2 балла) (Фиг. 2 е). На первой неделе N-ацетилцистеин был эффективнее Амифостина, однако позднее степень гистологических изменений значимо не отличалась в группах введения радиопротекторов. В группе облучения в течение всего эксперимента не наблюдали положительной тенденции исследуемых показателей.

Результаты биохимического исследования крови экспериментальных животных показывают, что предлучевое введение N-АСС способствует восстановлению уровней глюкозы (Фиг. 2а), инсулина (Фиг. 2б), амилазы (Фиг. 2в), супероксиддисмутазы (Фиг. 2г) и малонового диальдегида (Фиг. 2д) до значений, близких к контрольным, что свидетельствует о противолучевой эффективности N-АСС.

Пример 4 - Результаты сравнения морфометрического исследования поджелудочной железы облученных экспериментальных животных при введении N-ацетилцистеина и Амифостина.

При исследовании поджелудочной железы во II группе (облучение) было выявлено значительное снижение основных морфометрических показателей по сравнению с контрольной группой: количества (на 69,7%), площади (на 38,3%) и диаметра (на 35,5%) панкреатических островков, а также общего числа эндокриноцитов в одном островке - на 47,0%. В III группе (N-AC + облучение) предварительное введение N-ацетилцистеина привело к снижению числа (на 31,3%), площади (на 8,6%) и диаметра (на 13,3%) панкреатических островков, а также общего числа эндокриноцитов в одном островке на 14,0% по сравнению с контролем (Фиг. 3 а, б, в, г). На ранних сроках N-ацетилцистеин по некоторым параметрам был эффективнее Амифостина, а в группе облучения в течение всего эксперимента не наблюдали положительной тенденции исследуемых показателей.

Пример 5 - Результаты сравнения иммуногистохимического исследования поджелудочной железы облученных экспериментальных животных при введении N-ацетилцистеина и Амифостина.

При иммуногистохимическом исследовании в панкреатических островках контрольной группы выявили окрашивание эндокринных клеток с антителами к инсулину (3 балла) и глюкагону (2 балла). Через неделю после воздействия фракционного облучения электронами в СОД 25 Гр наблюдали снижение уровней экспрессии инсулина (в 2,2 раза; 2 балла) и глюкагона (в 1,5 раза; 1 балл) по сравнению с контрольной группой. В группе предлучевого введения N-ацетилцистеина через неделю после облучения электронами в СОД 25 Гр количество иммунопозитивных эндокринных клеток было приближено к контрольным значениям: инсулин - в 1,5 раза меньше (2-3 балла), глюкагон - в 1,2 раза меньше (2 балла) (Фиг. 4 а, б, в, г,). На ранних сроках N-ацетилцистеин был эффективнее Амифостина по критерию защиты β-клеток (инсулин), а в группе облучения в течение всего эксперимента не наблюдали положительной тенденции исследуемых показателей.

Пример 6 - Результаты сравнения уровней маркеров воспаления в поджелудочной железе облученных экспериментальных животных при введении N-ацетилцистеина и Амифостина.

В группе предлучевого введения N-ацетилцистеина до локального облучения электронами поджелудочной железы в суммарной дозе 25 Гр на всех сроках обнаружили экспрессию как провоспалительных (IL-1β, IL-6), так и противовоспалительных (IL-10) цитокинов в некоторых эндокринных клетках островков поджелудочной железы и единичных ациноцитах (Фиг. 5 а).

При иммуногистохимических реакциях с антителами к CD3+ T-лимфоцитам через неделю после облучения электронами обнаружили единичные CD3-позитивные клетки, аналогично контрольной группе (1 балл). Однако к третьему месяцу их количество увеличилось (2 балла). Интересно, что иммуномечение этих клеток наблюдали преимущественно в расширенных междольковых септах вдоль кровеносных сосудов, а также в единичных эндокринных клетках (дисперсное мембранное окрашивание) некоторых островков поджелудочной железы (Фиг. 5 б).

При иммуногистохимических реакциях с антителами к CD68 в контрольной группе на первой неделе эксперимента наблюдали единичные СD68+ макрофаги (1 балл). Локальное облучение электронами в суммарной дозе 25 Гр привело к постепенному увеличению их количества в течение эксперимента, которое на третьем месяце составило около 6 клеток в поле зрения (2 балла). Важно отметить, что эти клетки располагались преимущественно периваскулярно (Фиг. 5 в).

Распределение уровней экспрессии провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6, IL-10 в поджелудочной железе контрольной и опытных групп на 7 сутки (Фиг. 5г) и 90 сутки (Фиг. 5д) после облучения свидетельствует о более выраженном процессе постепенного уменьшения воспалительной реакции на фоне предлучевого введения N-АСС по сравнению с облученным контролем.

Вывод.

Авторами проведена оценка эффективности применения N-ацетилцистеина в качестве радиопротектора. Было обнаружено снижение степени выраженности воспалительной реакции по сравнению с таковой у облученных животных, протекция пролиферативно-апоптотического соотношения в поджелудочной железе (ПЖЖ), а также сохранение структуры органа. Вероятно, данные свойства этого препарата связаны с его антиоксидантным эффектом, который заключается как в связывании гидроксильных радикалов, так и в стимуляции ферментов эндогенной антиоксидантной защиты, что доказано измерением уровней SOD и MDA и не противоречит данным других исследований (Watanabe M, Borges FT, Pessoa EA, et al. Renoprotective effect of N-acetylcysteine depends upon the severity of the ischemia reperfusion injury. Braz J Med Biol Res. 2021;54(11):e9941. Published 2021 Sep 3. doi:10.1590/1414-431X2021e9941).

Данные механизмы обусловлены наличием в структуре N-AC тиольнойок группы, способной к непосредственному связыванию с активными формами кислорода, такими как OH, H₂O₂, HOCl и др. (Onur E, Paksoy M, Baca B, Akoglu H. Hyperbaric oxygen and N-acetylcysteine treatment in L-arginine-induced acute pancreatitis in rats. J Invest Surg. 2012;25(1):20-28. doi:10.3109/08941939.2011.593694; Schwalfenberg GK. N-Acetylcysteine: A Review of Clinical Usefulness (an Old Drug with New Tricks). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453. Published 2021 Jun 9. doi:10.1155/2021/9949453). В результате, количество свободных радикалов значительно снижается, что обусловливает такие эффекты N-AC как: противовоспалительное, антиапоптотическое и цитопротективное действие (Minati MA, Libert M, Dahou H, Jacquemin P, Assi M. N-Acetylcysteine Reduces the Pro-Oxidant and Inflammatory Responses during Pancreatitis and Pancreas Tumorigenesis. Antioxidants (Basel). 2021;10(7):1107. Published 2021 Jul 11. doi:10.3390/antiox10071107).

Более того, по результатам оценки отсроченных эффектов обнаружено косвенное репаративное свойство этого препарата, который ускоряет восстановление поджелудочной железы (особенно островков Лангерганса) после воздействия электронов. Данный эффект можно назвать косвенным ввиду того, что он обусловлен также снижением количества свободных радикалов на ранних этапах.

Таким образом, при облучении животных электронами было обнаружено, что активация перечисленных молекулярных каскадов приводит к резкому увеличению экспрессии цитокинов, индуцируя клеточную воспалительную инфильтрацию макрофагами (CD68+) и тучными клетками. Это также свидетельствует о круциальной роли микроокружения в развитии и поддержании воспалительной реакции. Кроме того, обнаружено значительное повышение числа Т-лимфоцитов по результатам иммуногистохимических исследований с антителами к их общему маркеру CD3. Данные изменения эффективно предотвращаются при предлучевом введении N-ацетилцистеина. Действие этого препарата связано с уменьшением количества свободных радикалов и стимуляцией редокс-системы, что приводит к ограничению апоптотической гибели клеток экзо- и эндокринной части поджелудочной железы, а также предотвращению развития признаков лучевого панкреатита.

Хотя препарат Амифостин, обладающий доказанной эффективностью при лучевых повреждениях, рекомендован к широкому применению в клинической практике врачей-онкологов, но его стоимость, способ введения и токсичность ограничивают его использование. Поэтому N-AC представляется не только более удобным и простым аналогом, но и демонстрирует более высокую эффективность по сравнению с Амифостином. Этот факт делает N-AC потенциально более удачным выбором в качестве радиопротектора при облучении электронами, а его эффективность продемонстрирована в настоящем изобретении каждым методом исследования. Авторами было сделано заключение, что N-ацетилцистеин способен к эффективному подавлению воспалительной реакции в поджелудочной железе.

Предложенный способ позволяет снизить степень как острых, так и поздних осложнений при воздействии электронами на поджелудочную железу.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной радиобиологии, биохимии и морфологии, и может быть использовано для профилактики острого постлучевого панкреатита у животных. За 1 ч до каждого локального облучения электронами в области спины в зоне проекции поджелудочной железы в разовой очаговой дозе 5 Гр в режиме фракционирования до суммарной очаговой дозы 25 Гр животному интраперитонеально вводят N-ацетилцистеин в дозе 120 мг/кг. Способ обеспечивает эффективное подавление проявлений острого постлучевого панкреатита за счет введения N-ацетилцистеина до электронотерапии. 5 ил., 6 пр.

Способ профилактики острого постлучевого панкреатита у животных, характеризующийся тем, что за 1 час до каждого локального облучения электронами в области спины в зоне проекции поджелудочной железы в разовой очаговой дозе 5 Гр в режиме фракционирования при мощности дозы 1 Гр/мин, энергия 10 МэВ и частота 9 Гц, размер поля ∅ 50 мм до суммарной очаговой дозы 25 Гр, интраперитонеально вводят фармакологическое средство N-ацетилцистеин в дозе 120 мг/кг.