СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ КОККОВ Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 A61K39/85 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения антигенов из клеточных стенок бактерий, которые могут являться кандидатами в качестве компонентов препаратов для профилактики и лечения хронических воспалительных заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, относящихся к грамположительным коккам из родов Staphylococcus и Streptococcus.

Борьба с инфекционными заболеваниями, вызываемыми резистентными штаммами бактерий рода Staphylococcus, и, в частности, золотистым стафилококком - Staphylococcus aureus, является одной из наиболее актуальных проблем медицины уже на протяжении длительного времени. Противовоспалительная, антибактериальная и симптоматическая терапия не обеспечивает положительный эффект, что ведет к хронизации процесса. Возникает необходимость в использовании препаратов, воздействующих на иммунологический статус организма, то есть в вакцинах. Однако большинство стратегий вакцинации против S. aureus, концентрировались на однокомпонентных вакцинах на основе капсулярных полисахаридов или известных вирулентных факторов, обладающих мотивом LPXTG, таким как фибронектин-связывающий белок (FnBP), коллагено-подобный белок (СпВР), или хлопьеобразующий (клампинг) фактор A (ClfA), в качестве целей вакцинации [1, 2]. Однако, несмотря на перспективные результаты вакцинации, полученные на животных моделях, до сих пор большинство потенциальных вакцин, проверенных в клинических испытаниях, не обеспечили значительной защиты от инфекции S. aureus [3]. Вместе с тем, в клеточных стенках бактерий присутствуют нековалентно связанные с ней белки - ACW-белки (anchorless cell wall proteins). Белки, принадлежащие к этому классу, не обладают ни консервативным сигнальным пептидом, ни мотивом LPXTG и признаны в качестве отдельных факторов вирулентности грамположительных бактерий [4]. Большинство из этих ACW-белков являются многофункциональными, например, они участвуют в различных метаболических путях, а также в адгезии к внеклеточному матриксу и инвазии в клетки макроорганизма. Такие белки не могут быть выявлены скринингом последовательности генома из-за отсутствия консервативных эпитопов, таких как LPXTG, а, значит, требуют непосредственного выделения из клеточных стенок для идентификации.

Что касается современной стратегии совершенствования средств вакцинопрофилактики стрептококковых инфекций, то, как правило, она направлена на поиск и разработку новых вакцин для иммунизации лиц, относящихся к группам риска. Анализ протеома внеклеточных бактериальных микровезикул S. pneumoniae для идентификации иммунореактивных белковых антигенов, потенциальных кандидатов для включения в вакцины установил до 15 иммунореактивных белков антигенов, семь из которых цитозольные, а восемь белков связаны с клеточной поверхностью (MalX, ABC-транспортер, AmiA, AHA, LytC, IgA1-протеаза, PspA и предлагаемый предшественник |3-галактозидазы), что открывает новые потенциальные белки кандидаты для создания комбинированных вакцин, перспективных в плане защиты от пневмококкой инфекции [5].

Существуют различные способы получения антигенов из клеточных стенок бактерий. Одним из них является способ, основанный на дезинтеграции бактериальных клеток с добавлением солянокислого гидроксиламина, при этом процесс занимает длительное время - около 48 часов и нуждается в дополнительной очистке от цитоплазматических примесей [6]. Другой способ основан на полном или частичном лизисе пептидогликана клеточной стенки бактерии без нарушения целостности протопласта с использованием лизостафина (ЕС 3.4.24.75) [7] или трипсина [8]. Использование трипсина имеет преимущества в виде невысокой стоимости этого фермента, однако он практически не расщепляет муреиновый остов клеточной стенки золотистого стафилококка, к тому же трипсин частично разрушает получаемые белковые антигены. Поскольку трипсин не разрушает клеточную стенку стафилококка, то его можно использовать для получения антигенов, которые располагаются только на самой поверхности клетки, но не в самой клеточной стенке. Лизостафин в отличие от трипсина эффективно расщепляет муреиновую структуру клеточных стенок золотистого стафилококка, высвобождая максимально большое количество антигенов, которые ассоциированы с клеточной стенкой. Однако лизостафин обладает высокой стоимостью, поэтому использование 5U лизостафина для получения антигенов из 3×10⁹ клеток, как описано в работе [7], будет приводить к высокой стоимости полученных антигенов, а значит и вакцин полученных из этих антигенов таким способом. Существуют подходы, которые позволяют заметно уменьшить расход ферментных препаратов для разрушения клеточных стенок и высвобождения целевых антигенов [9, 10]. Однако это не позволяет полностью избавиться от необходимости приобретать дорогие ферменты, а также приводит к тому, что в готовом антигенном препарате будут содержаться посторонние белки (лизостафин, лизоцим и т.п.). Помимо этого лизоцим и лизостафин неэффективно расщепляют клеточные стенки стрептококков.

В связи с этим задачей заявленного изобретения является разработка более доступного способа, позволяющего получать антигены из клеточных стенок бактерий, как стафилококков так и стрептококков, без использования белковых ферментов.

Поставленная задача достигается путем разработки способа получения антигенов из клеточных стенок бактерий, который предусматривает получение очищенной от культуральной жидкости суспензии S. aureus в количестве 10¹⁰ клеток в 10 мл изотонического раствора, содержащем 30% маннитола, 10 мМ MES с рН 6.5, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, добавление к суспензии олигохитозана, со средневесовой молекулярной массой 5 кДа, в количестве 1 мкг, инкубации смеси в течение 15 мин при 37°С, отделением бактериальных протопластов центрифугированием при 2500 g в течение 5 мин, диализом полученного раствора против против 10 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7.5, концентрированием антигенов в пробирках с мембранами с порами 5 кДа и лиофильным высушиванием.

Использование олигохитозана с молекулярной массой 5 кДа позволяет получать антигены из клеточных стенок бактерий без использования белковых ферментов за счет эффекта, который был ранее нами описан в работе для высокомолекулярных поликатионов [11]: хитозан - поликатион, взаимодействует с клеточной стенкой, связывается с полианионными компонентами клеточной стенки - тейхоевыми и тейхуроновыми кислотами, тем самым вытесняя из комплекса с ними собственные бактериальные автолизины, которые в свою очередь начинают неконтролируемые процессы разрушения собственных клеточных стенок бактерий. За счет низкой молекулярной массы олигохитозана (всего 5 кДа) достигается повышенная проникающая способность этого полиаминосахарида в клеточные стенки бактерий, что позволяет использовать очень маленькие количества этого вещества. Кроме того, в отличие от более высокомолекулярных гомологов (10 кДа и более) олигохитозан с молекулярной массой 5 кДа не только хорошо растворим при рН близких к нейтральному, но также имеет более высокую степень протонирования полимерной молекулы, что позволяет более эффективно связываться с полианионами клеточных стенок бактерий и вытеснять автолизины (которые также заряжены положительно).

Таким образом, это позволяет избавиться от необходимости использования дорогостоящих ферментных препаратов, с итоговым получением того же количества бактериальных антигенов не загрязненных чужеродными белковыми молекулами. Стоимость олигохитозана с молекулярной массой 5 кДа составляет не более 1000 руб за 1 грамм (в ценах 2023 года), поэтому учитывая его мизерные количества использования практически слабо влияет на себестоимость потенциального продукта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка простого и более дешевого способа получения антигенов из клеточных стенок бактерий, относящихся к грамположительным коккам из родов Staphylococcus и Streptococcus, характеризующегося хорошей воспроизводимостью результатов, быстротой проведения реакции, отсутствием необходимости использовать белковые ферменты.

Пример 1. Получения антигенов из клеточных стенок S. aureus. Клетки S. aureus в количестве 10¹⁰ клеток ресуспендируют в 10 мл изотонического раствора, содержащем 30% маннитола, 10 мМ MES с рН 6.5, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF. Затем к полученной суспензии добавляют олигохитозан со средыевесовой молекулярной массой 5 кДа в количестве 1 мкг. При постоянном интенсивном но плавном перемешивании суспензию инкубируют в течение 15 мин при 37°С. Затем суспензию подвергают центрифугированию при 2500 g в течение 5 мин для отделения бактериальных протопластов. После отделения протопластов надосадочную жидкость, содержащую антигены, диализуют против 10 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7.5, (1:200 по объему) в течение 12 ч. После диализа антигены концентрируют и дополнительно промывают от маннитола буфером 10 мМ Трис-HCl, рН 7.5 в пробирках с мембранами с порами 5 кДа. После концентрирования антигенов раствор подвергают лиофильному высушиванию.

Пример 2. Получения антигенов из клеточных стенок проводим аналогично примеру 1, но вместо Staphylococcus aureus используем другой вид бактерий - Staphylococcus epidermidis.

Пример 3. Получения антигенов из клеточных стенок проводим аналогично примеру 1, но вместо Staphylococcus aureus используем другой вид бактерий - Streptococcus pneumoniae.

ЛИТЕРАТУРА

1. Fattom, A.L., G. Horwith, S. Fuller, M. Propst, Naso R. / Development of Staph VAX, a polysaccharide conjugate vaccine against S. aureus infection: from the lab pench to phase III clinical trials. // Vaccine 2004. 22:880-887.

2. Rivas J.M., Speziale P., Patti J.M., M Hook. / MSCRAMM-targeted vaccines and immunotherapy for staphylococcal infection. // Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 2004. 7:223-227.

3. Schaffer A.C., Lee J.C.. Vaccination and passive immunisation against Staphylococcus aureus. Int. J. Antimicrob. Agents 2008. 32(Suppl. 1):S71-S78.

4. Chhatwal G. S. 2002. Anchorless adhesins and invasins of Gram-positive bacteria: a new class of virulence factors. Trends Microbiol. 10:205-208.

5. Тюрин Ю.А., Зарипова A.3., Исаева Г.Ш., Мустафин И.Г., Баязитова Л.Т. / Протеомные технологии в разработке новых вакцин на основе серотип-неспецифичных белковых антигенов Streptococcus pneumoniae II Казанский мед. ж. 2019; 100 (4): 680-688.

6. Егорова Н.Б., Семенов Б.Ф., Курбатова Е.А., Ефремова В.Н., Каверина К.Г., Михайлова Н.А. / Поликомпонентная вакцина для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами // Патент RU №2209081.

7. Vytvytska О., Nagy Е., Bliiggel М., Meyer Н.Е., Kurzbauer R., Huber L.A., Klade C.S. / Identification of vaccine candidate antigens of Staphylococcus aureus by serological proteome analysis // Proteomics. 2002 (5):580-90.

8. Ventura C.L., Malachowa N., Hammer C.H., Nardone G.A., Robinson M.A., Kobayashi S.D., DeLeo F.R. / Identification of a novel Staphylococcus aureus two-component leukotoxin using cell surface proteomics // PLoS One. 2010 5(7):e11634. doi: 10.1371/journal.pone.0011634.

9. Куликов C.H., Тюрин Ю.А., Хайруллин Р.З. / Способ получения бактериальных антигенов // Заявка на изобретение №2018135145 от 04.10.2018. Решение о выдаче патента от 27.03.2019. Петент №2689161. Опубликован 24.05.2019.

10. Куликов С.Н., Тюрин Ю.А., Хайруллин Р.З. / Способ получения антигена стафилококка золотистого с использованием лизоцима и низкомолекулярного хитозана // Заявка на изобретение №2020121925 от 03.07.2020, Патент 2740366 от 13.01.2021.

11. Куликов С.Н., Хайруллин Р.З., Варламов В.П. / Влияние поликатионов на антибактериальную активность лизостафина // Прикладная биохимия и микробиология 2015. Т.51. №6. с. 610-615. DOI: 10.7868/S0555109915060082.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения антигенов из клеточных стенок бактерий, включающий добавление к клеткам грамположительных кокков из родов Staphylococcus и Streptococcus в количестве 10¹⁰ клеток в изотоническом растворе, содержащем 30% маннитола, 10 мМ MES с рН 6.5, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, олигохитозана со средневесовой молекулярной массой 5 кДа в количестве 1 мкг; затем смесь инкубируют 15 мин при 37°С, отделяют бактериальные протопласты центрифугированием при 2500 g в течение 5 мин, полученный раствор антигенов диализуют, концентрируют и высушивают лиофильно. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов получения антигенов из клеточных стенок бактерий стафилококков и стрептококков без использования белковых ферментов. 3 пр.

Способ получения антигенов из клеточных стенок бактерий, отличающийся тем, что при его проведении к клеткам грамположительных кокков из родов Staphylococcus и Streptococcus в количестве 10¹⁰ клеток в 10 мл изотонического раствора, содержащем 30% маннитола, 10 мМ MES с рН 6.5, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, добавляют олигохитозан со средневесовой молекулярной массой 5 кДа в количестве 1 мкг, инкубируют смесь в течение 15 мин при 37°С, отделяют бактериальные протопласты центрифугированием при 2500 g в течение 5 мин, полученный раствор антигенов диализуют, концентрируют и высушивают лиофильно.