Штамм "SAU-21Л" бактерий Staphylococcus aureus для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к получению нового штамма Staphylococcus aureus «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики мастита коров.

Молочное животноводство является одним из ведущих направлений в структуре агропромышленного комплекса Российской Федерации. Производство безопасного и качественного молока коров является актуальной задачей молочного животноводства. Молоко и молочные продукты являются одними из самых важных продуктов питания человека. Серьезную угрозу для здоровья человека представляют инфекции, которыми могут болеть домашние животные. Одно из этих заболеваний - мастит [1, 2].

Мастит - это воспалительный процесс, протекающий в тканях молочной железы коров. Последствия мастита приносят огромные экономические потери, складывающиеся из снижения молочной продуктивности и ухудшение качества молока, выбраковкой продукции из-за снижения пищевых и технологических свойств, затраты на лечение, а также оплату труда ветеринарных работников [3, 4].

Предрасполагающие и сопутствующие факторы, к которым относят иммунный статус животного, не соблюдение зоогигиенических, профилактических и лечебных мероприятий, не выполнение преддоильной и постдоильной гигиены вымени, отсутствие или неудовлетворительная дезинфекция систем доения и др., так же оказывают большое влияние на развитие болезни [5, 6, 7, 8].

Мастит отличается от большинства других заболеваний животных большим видовым разнообразием бактериальных возбудителей данной патологии. В настоящее время выделено более 140 возбудителей мастита, чаще всего это стафилококки, стрептококки, колиформные бактерии, энтерококки, микоплазмы, дрожжи. Эти патогенные микроорганизмы проникают в вымя, размножаются и вырабатывают вредные вещества, которые приводят к воспалению, снижению выработки молока и изменению его качества [9, 10, 11].

Среди видов бактерий, наиболее часто связанных с маститом, выделяют виды рода Staphylococcus, а именно Staphylococcus aureus (далее по тексту - S. aureus) - золотистый стафилококк, выявляемость которого составляет до 40% [12 - 16].

Антибиотики, применяемые для лечения животных, часто дают неудовлетворительный результат, из-за развития антибиотикорезистентности у некоторых штаммов. Еще одним отрицательным моментом является то, что используемые препараты в течение длительного времени выделяются с молоком, тем самым приводя к экономическим потерям [17, 18, 19].

Патогенность золотистого стафилококка связана с выработкой факторов вирулентности, которые помогают бактерии обойти защитные силы хозяина, следовательно, позволяя микроорганизму колонизировать молочные железы жвачных животных. Эти факторы включают структурные компоненты (коллаген, фибриноген, белки, связывающие эластин, пенициллинсвязывающий белок, тейхоевую кислоту, белки α, β-лактамазы, протеазы, капсулы и слизь), ферменты (коагулаза, стафилокиназа, ДНКаза, фосфатаза, липаза, фосфолипаза, гиалуронидаза) и токсины (стафилококковые энтеротоксины, синдром токсического шока токсин 1, лейкоцидин, гемолизины и эксфолиатин). Кроме того, S. aureus обладает специфическими механизмами, такими как образование биопленки, защищающую его от неблагоприятных факторов, в том числе антибактериальной терапии [13, 20, 21].

Известен штамм S. aureus 113, его конструкция и применение. Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Staphylococcus aureus 113, обладающий антилизоцимной активностью, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под регистрационным номером №1253 и может быть использован для отбора антибактериальных средств, пригодных для эффективной борьбы с персистирующими патогенными стафилококками [22].

Известен способ исследования борьбы с биопленками S. aureus препаратом на основе наночастиц серебра и диметилсульфоксида. Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может быть использовано для оценки разрушения биопленок. Изобретение позволяет оценить способность препарата на основе наночастиц серебра и диметилсульфоксида препятствовать образованию биопленок S. aureus [23].

Известен штамм бактериофага S. aureus SA20, обеспечивающий разрушение биопленок, образуемых бактериями рода Staphylococcus. Изобретение относится к микробиологии. Предложенный штамм обеспечивает разрушение биопленок, образуемых бактериями рода Staphylococcus, и содержит ген, кодирующий альфа-субъединицу рибонуклеотидредуктазы 1b. Штамм депонирован в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером Ph-1312. Штамм бактериофага обладает широким спектром литической активности в отношении тест-штаммов и клинических изолятов бактерий рода Staphylococcus и может быть использован при создании антимикробных препаратов, вызывающих гибель бактерий рода Staphylococcus [24].

Известен штамм бактерий S. aureus, используемый для приготовления препарата, снижающего уровень сенсибилизации к инфекционным и неинфекционным аллергенам. Изобретение относится к биотехнологии и аллергологии. Штамм S. aureus С-2 хранится в музее Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича под №222. Штамм S. aureus С-2 используют для получения лекарственного препарата, проявившего высокие антиаллергические и противомикробные свойства при бронхолегочных заболеваниях [25].

Известен штамм бактерии Staphylococcus aureus b-0186, используемый для приготовления стафилококкового диагностикума. Изобретение относится к области ветеринарии, в частности ветеринарной микробиологии и представляет собой штамм бактерии Staphylococcus aureus В-0186, для тестирования антител к антигенам микробной клетки стафилококка. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в изыскании вирулентного штамма Staphylococcus aureus В-0186. Штамм бактерий Staphylococcus aureus В-0186, депонирован в Лаборатории генофонда микроорганизмов ТОО «Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт», используемый для изготовления стафилококкового диагностикума. [26].

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие штамм микроорганизма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus аналогичное заявляемому, т.е. изобретение соответствует критерию «новизны».

Выделение штамма микроорганизма при мастите коров, и использование его в качестве производственного штамма, способствующего формированию иммунитета к циркулирующим патогенам, вызывающих мастит, который не влиял бы на качество молока и оказывал положительный экономический эффект, является актуальным направлением и будет способствовать обеспечению страны безопасной продукцией, снижению применения антибактериальных препаратов в животноводстве и за счет этого выходом продукции на экспорт.

Задачей изобретения является получение штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus для использования при разработке и изготовлении средств специфической профилактики мастита коров.

Техническая результатом изобретения является расширение арсенала актуальных производственных штаммов вида Staphylococcus aureus, обладающих новыми биологическими характеристиками, и пригодных для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита крупного рогатого скота.

Указанная проблема решена путем получения штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus, который может использоваться при изготовлении биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров.

Изолят S. aureus, послуживший источником для получения штамма «SAU-21Л», был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2021 г. при проведении бактериологических исследований проб молока, от коров из хозяйства Ростовской области.

Штамм «SAU-21Л» относится к семейству Staphylococcaceae роду Staphylococcus виду Staphylococcus aureus, депонирован во Всероссийскую государственную коллекцию экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №383 - деп / 22-17 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров, экспериментально показана выработка антител на введение моновакцины, изготовленной из антигена данного штамма, лабораторным животным.

Штамм «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологическая характеристика

Штамм «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus семейства Staphylococcaceae, рода Staphylococcus, вида Staphylococcus aureus обладает морфологическими признаками, характерными для бактерий рода Staphylococcus.

При микроскопии штамм «SAU-21Л» бактерий S. aureus представляет грамположительные кокки, располагающиеся в виде скопления клеток, напоминающих «грозди винограда».

Бактерии на твердых питательных средах формируют выпуклые, округлой формы колонии с ровными краями, с гладкой блестящей поверхностью, диаметром от 1,2 до 1,5 мм желто-оранжевого цвета. На кровяном агаре клетки бактерии образуют аналогичные колонии с зоной неполного просветления питательной среды вокруг колонии - α-гемолиз.

Культуральные свойства

- неподвижный факультативный анаэроб, оптимальная температура роста (37,0±0,5)°С;

- на сердечно-мозговом агаре (далее по тексту - СМА) колонии имеют вид желто-оранжевых колоний с ровными краями, с гладкой блестящей поверхностью, диаметром от 1,2 до 1,5;

- на агаре с кровью образуют аналогичные колонии с зоной α-гемолиза;

- на жидкой среде - сердечно-мозговой бульон (далее по тексту - СМБ) - сопровождается равномерным помутнением.

Хорошо сохраняется при условии лиофильного высушивания с сахарозо-желатиновой средой, а также при быстром замораживании и хранении при - 40°С.

Биохимические свойства

При посеве на среды Гисса или коммерческую тест-систему API Staph проявляет следующие биохимические свойства, представленные в таблице 1:

- наличие ферментов: D-глюкозы, щелочной фосфатазы, аргининдегидролазы, уреазы;

- подкисление: D-фруктозы, D-маннозы, мальтозы, лактозы, D-трегалозы, D-маннитола, сахарозы, N-ацетилглюкозамина;

- отсутствие подкисления: ксилитола, D-мелибиозы, раффинозы, ксилозы, метил-α-D-глюкопиранозида;

- восстановление нитратов до нитритов;

- накопление ацетилметилкарбинола.

Антигенная активность

Стимулирует образование в крови животных типоспецифичных антител, обладающих защитным действием против стафилококкоза, выявляемых в реакции агглютинации (РА).

Инактивированный антиген из штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus индуцирует выработку антител, выявляемые методами реакции агглютинации (РА) и иммуноферментным анализом (ИФА).

Биотехнологические свойства

Оптимальными условиями культивирования штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus являются следующие:

- чашки Петри с питательными средами: сывороточный агар Колумбия, кровяной агар Колумбия; посевы инкубируют в течение 24 ч при температуре (37,0±0,5)°С;

- флаконы с жидкой питательной средой (сывороточный сердечно-мозговой бульон (СМБ); посев инкубируют при температуре (37,0±0,5)°С в течение 18-24 ч.

Чистоту культуры проверяют методом световой микроскопии мазков, окрашенных по Граму.

По завершении культивирования агаровую культуру штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus смывают стерильным физиологическим раствором в объеме 5,0 см³ на одну чашку, определяют концентрацию бактериальной суспензии по оптическому стандарту мутности. По результатам визуальной стандартизации доводят концентрацию исходной бактериальной суспензии до 10⁹ м.к./см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus чувствителен к ампициллину с клавулановой кислотой, цефалоспоринам, гентамицину и фосбаку плюс Т.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами в составе инактивированной вакцины не обладает. Иммунизация кроликов в удвоенной терапевтической дозе вакцины, в соответствии с ГОСТ 31926, не вызывает местной-раздражительной и воспалительной реакций после инъекции.

Патогенные свойства - штамм «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus патогенен для белых мышей.

Вирулентность - высоковирулентен.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами - штамм «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами.

Условия хранения.

При хранении штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus в нативном состоянии при температуре минус (70,0±5,0)°С допустимая длительность хранения без освежения составляет 12 мес., а при хранении в лиофилизированном состоянии при той же температуре - 10 лет.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Культивирование штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus с целью получение антигена

Для культивирования штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus использовали питательную среду - сердечно-мозговой бульон.

Для получения бактериальной массы был использован ферментер «Biotron LiFlus GX», оснащенный системами регистрации и регулирования основных параметров культивирования: температуры, концентрации водородных ионов, скорости вращения мешалки и расхода кислорода для аэрации. Объем питательной среды в аппарате составлял 7,0 л. Культивирование проводили в течение 24 часов при температуре (37,0±0,5)°С с постоянной подачей кислорода в количестве 1 л/ч.

Через 24 ч культивирования в бактериальную суспензию добавляли 0,2% формалина по объему. Инактивацию проводили 24 часа при непрерывном перемешивании (100 об/мин) и поддержании температуры в диапазоне (37,0-37,5)°С. Для определения полноты инактивации через 24 часа после внесения формалина бактериальную суспензию высевали «газоном» в количестве 1,0 см³ на чашку Петри с СМА. Инкубацию чашек Петри проводили в течение 48 часов при температуре (37,0±0,5)°С в условиях обычной атмосферы. При просмотре чашек Петри с СМА рост культур бактерий S. aureus отсутствовал, что характеризовало положительное проведение инактивации.

Пример 2. Определение патогенных свойств штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus проводили в реакции плазмокоагуляции и дермонекротической пробе в соответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диагностике стафилококкоза животных» (утв. Госагропромом СССР, 1987) [27], а также по определению гемолитической активности и обнаружению фермента гиалуронидазы в соответствии с учебным пособием «Диагностика стафилококкозов и стрептококкозов» [28].

Для определения плазмокоагуляции штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus использовали набор кроличьей сухой цитратной плазмы АО «НПО «Микроген»». Первично содержимое ампулы с плазмой растворяли стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида в 1,0 см³, после чего доводили до конечного объема - 6,0 см³ тем же раствором. В 6 стерильных пробирок стерильной пипеткой вносили по 0,5 см³ полученного раствора плазмы. Пробирки были разделены на контрольные и опытные образцы (по 3 шт в каждой группе). В пробирки (опытные образцы) вносили по одной бактериологической петле культуры штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus и ресуспендировали. Пробирки (опытные и контрольные образцы) инкубировали при (37,0±0,5)°C в течение 4 ч. Учет результатов проводили через 1, 2, 4, 18, 24 ч. Положительным результатом реакции является - образование сгустка в первые 4 ч наблюдения, отрицательным - отсутствие образования желеобразного сгустка в течение 18 ч инкубации. Образование желеобразного сгустка после 4 ч инкубации расценивают как сомнительный результат. В пробирках с контрольным образцом образование сгустка должно отсутствовать.

Оценку дермонекротической реакции проводили на кроликах, массой 2,0-2,5 кг. За день до проведения опыта кроликам была выстрижена шерсть на поверхности бедра, площадью 2х2 см. Для постановки реакции использовали суточную бульонную культуру стафилококка, которую вводили внутрикожно в выстриженные участки кожи в дозе 0,2 см³. Наблюдение за кроликами вели в течение 4 дней.

При положительном результате на месте введения культуры через сутки появляется покраснение, на вторые сутки кожа темнеет и образуется некроз.

Гемолитическую активность штамма исследовали на кровяном агаре Колумбия с добавлением 5 % дефибринированной крови барана. Для этого бактериологической петлей выполняли посев культуры штамма на поверхность агаровой среды и инкубировали при (37,0±0,5)°С в течение 24 ч. Известны четыре типа гемолизинов стафилококков: альфа-гемолизин (α) - зона лизиса узкая, лизис полный; бета-гемолизин (β) - зона лизиса широкая, лизис после инкубирования при (37,0±0,5)°С неполный, полный в результате дополнительного выдерживания посевов в течение 18 ч при 4,0-15,0°С; дельта-гемолиз (δ) - зона гемолиза узкая, четко ограниченная, гемолиз полный; гамма-гемолиз (γ) - отсутствие гемолиза. Штамм стафилококков может синтезировать один тип гемолизина или несколько в различных комбинациях. При тестировании гемолитической активности у штаммов, особенно от КРС, необходимо учитывать наличие β-гемолизина и целесообразность дополнительного выдерживания посевов после инкубирования также при 4-15°С.

Определение наличия фермента гиалуронидазы (фактор проникновения) проводили в тесте декапсуляции. Для этого брали штамм капсулообразующего вида бактерий - Pasteurella multocida серогруппы А (далее по тексту - P. multocida), имеющая в составе капсулы гиалуроновую кислоту (субстрат для гиалуронидазы). На кровяной агар Колумбия крестообразно засевали штрихом культуру Р. multocida и под углом 90° аналогично в виде линии культуру штамма стафилококка. Посевы инкубировали при (37,0±0,5)°С в течение 24 часов. При наличии гиалуронидазы колонии бактерий P. multocida вблизи штриха стафилококков образуют более мелкие и тусклые колонии за счет разрушения капсулы ферментом, который диффундирует в толщу агара (результат положительный).

При проведенных тестах было установлено, что штамм «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus является плазмокоагулирующим, образование сгустка произошло за 1 ч, обладает дерматонекротическим действием, ферментирует гиалуронидазу, при культивировании на кровяном агаре рост возбудителя сопровождается α -гемолизом.

Пример 3. Определение стабильности штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus при хранении.

Для получения бактериальной массы штамм «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus высевали на чашки Петри с СМА. Посевы инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в течение 24 ч. По завершению инкубирования агаровую культуру смывали стерильной сахарозо-желатозной средой (стабилизирующая среда) в объеме 5,0 см³ на одну чашку. Определяли концентрацию бактериальной суспензии по стандартному образцу мутности бактерийных взвесей «ОРМЕТ». По результатам визуальной стандартизации доводили концентрацию исходной бактериальной суспензии до 10⁹ м.к./см³.

Бактериальную суспензию фасовали по 0,5 см³ в ампулы соответствующей вместимости.

Процесс лиофилизации после внесения стабилизаторов сушки включает стадии замораживания, высушивания, досушивания и запаивания ампул.

Замораживание: бактериальную суспензию перед лиофилизацией промораживали. Для этого устанавливали три датчика контроля температуры материала в процессе сушки. При достижении температуры в материале минус (60±1)°С его выдерживали при внешней температуре не выше минус (70±1)°С в течение 24 ч, после чего процесс замораживания бактериальной суспензии считали законченным. Холодильную камеру сублиматора перед постановкой кассет с замороженным материалом дезинфицировали 70%-ным этиловым спиртом и охлаждали до температуры не выше минус (50±1)°С.

Высушивание: замороженный материал незамедлительно перегружали в камеру сублиматора. Сублимационная установка перед загрузкой должна находиться в режиме:

- температура полок - минус (50±1)°С;

- температура конденсора - минус (60±1)°С;

- вакуум-насос - в рабочем состоянии, отключен.

После загрузки камеры подключали вмороженные в материал датчики контроля температуры, камеру герметизировали и вакуумировали до остаточного давления 80-90 мм рт. ст., проводили процесс высушивания согласно установленному режиму: температура конденсора - минус 50-80°С, вакуум в камере - 80-90 мм рт. ст., время сушки - до 48 ч.

Досушивание: проводили при температуре материала 24-27°С в течение 12-16 ч. Давление в камере не должно быть выше 90 мм рт. ст. Общее время сушки с досушиванием составляет 60-64 ч.

Запаивание ампул: после завершения процесса сублимационного высушивания камеру сублиматора через стерилизующий фильтр заполняли стерильным воздухом, открывали и ампулы с материалом быстро перекладывали в эксикатор с осушенным силикагелем. Ампулы с материалом запаивали незамедлительно в день разгрузки в условиях стерильного бокса.

Датой изготовления штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus считали дату проведения лиофилизации.

Штамм «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus хранили в лиофилизированном виде в запаянных ампулах, упакованных в коробки из картона и металлические контейнеры, при температуре минус (40-70)°С. Срок хранения штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus с даты лиофилизации составляет 5 лет.

По истечении 6 месяцев хранения проводили вскрытие 5 ампул с лиофилизированной культурой штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus и определяли физико-химические и биологические показатели штамма. Все показатели соответствовали требуемым нормам, т.е. штамм при хранении в течение 6 месяцев не изменил свои свойства.

Пример 4. Определение биохимических свойств штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus проводили с помощью набора API Staph (BioMerieux) для идентификации бактерий семейства Staphylococcaceae и родственных микроорганизмов по: ферментации D-глюкозы, щелочной фосфатазы, аргининдегидролазы, уреазы; подкислению D-фруктозы, D-маннозы, мальтозы, лактозы, D-трегалозы, D-маннитола, ксилитола, D-мелибиозы, раффинозы, ксилозы, сахарозы, метил-α-D-глюкопиранозида, N-ацетилглюкозамина; восстановлению нитратов до нитритов, накоплению ацетилметилкарбинола.

В контейнер для инкубации (поднос и крышку) вносят 5 см³ очищенной воды для создания влажной атмосферы. Помещали стрип в контейнер для инкубации. В пробирку, содержащую 5 см³ стерильного физиологического раствора с помощью бактериологической петли вносили 2-3 изолированных колонии предлагаемого штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus и тщательно растирали в пробирке. Пипеткой распределяли суспензию по лункам стрипа, избегая образования пузырьков. Поднос накрывали крышкой и инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в течение 18-24 ч.

Продукцию каталазы определяли в тесте с 3%-ным раствором перекиси водорода.

Биохимические свойства штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus представленные в таблице 1, соответствуют свойствам Staphylococcus aureus, представленным в определителе Берджи. По результатам проведенных исследований штамм «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus относится к виду Staphylococcus aureus, роду Staphylococcus.

Пример 5. Определение агглютинирующей активности антигена.

Полученные препараты антигена, как описано в примере 1, исследовали в реакции агглютинации (РА) микрометодом для выявления агглютинирующей активности антигена по ниже описанной методике.

Принцип предлагаемого варианта реакции агглютинации на планшете микрометодом заключается в склеивании и выпадении в осадок антигенов
S. aureus под действием специфических антител (агглютининов) в специфической сыворотке крови кролика в присутствии солей электролитов, что визуально регистрировали образованием четко оформленного зонтика на дне лунки планшета. При отрицательной реакции агглютинации антиген оседает на дно в виде точки (пуговки).

Использовали иммуноспецифические компоненты реакции:

- специфическая сыворотка крови кролика, однократно иммунизированных антигеном штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus (положительный контроль);

- нормальная сыворотка крови кролика, не содержащая антител к S. aureus (отрицательный контроль);

- исследуемый антиген штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus (бактериальная суспензия, полученная методом культивирования в жидкой питательной среде, инактивированная формалином). Общую концентрацию микробных клеток в бактериальной суспензии определяют визуально по стандарту (эталону) мутности. Для постановки РА использовали инактивированный антиген из штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus с концентрацией микробных клеток 1×10⁹ в см³.

Для постановки РА готовили двукратные разведения антигена от 1:2 до 1:4096. Для этого во все лунки планшета вносили фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР) - (рН 7,2-7,4) в объеме 0,05 см³. В первую лунку добавляли подготовленные пробы антигена штамма «SAU-21Л» в объеме 0,05 см³, трехкратно пипетировали и переносили 0,05 см³ во вторую лунку и т.д. Из последней лунки после трехкратного пипетирования 0,05 см³ испытуемого материала удаляли в 2%-ый раствор едкого натрия или другой подобный дезинфектант.

Готовили рабочее разведение положительной и отрицательной контрольных сывороток (1:100) и вносили их во все лунки планшета с разведениями антигена в объеме 0,05 см³. Одновременно ставили контроли реакции:

- контроль антигена - в две лунки планшета вносили по 0,05 см³ ФСБР и антиген штамма «SAU-21Л». Агглютинация антигена полностью отсутствовала;

- контроль сывороток на спонтанную агглютинацию - к 0,05 см³ контрольной сыворотки крови добавляли 0,05 см³ ФСБР. Спонтанная агглютинация сывороток отсутствовала.

Планшеты с компонентами реакции инкубировали в течение 18 часов при температуре (37±0,5)°С в статическом состоянии в шейкере-инкубаторе, затем выдерживали в бытовом холодильнике при температуре 4°С в течение 1 часа, после чего производили визуальный учет реакции.

Реакцию учитывали после полного оседания бактериальных клеток в лунках с контролем антигена.

Титром исследуемого антигена считали его наибольшее разведение, которое дает четкую видимую агглютинацию («зонтик»).

Результат реакции считали положительным, если в лунке наблюдали четко выраженную агглютинацию в виде «зонтика», с титром в РА ≥1:16 (4 log₂).

Результат считали отрицательным, если антиген оседал на дно лунки в виде точки («пуговки»), с титром в РА <1:16 (4 log₂).

Агглютинирующий титр бактериальной суспензии штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus составил 1:2048 (11 log₂).

Пример 6. Получение экспериментальной модели вакцины на основе антигена из штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus

В качестве антигена при изготовлении вакцины против мастита коров использовали бактериальную суспензию штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus, полученную по примеру 1.

Для получения клеточного антигена из бактериальной суспензии использовали высокоскоростную проточную центрифугу BR 105BRLL, скорость подачи бактериальной суспензии составляла 1 л/час при вращении ротора 14000 об/мин. Общее время центрифугирования составило 15 мин. По окончанию работы ротор извлекали и перемещали в зону чистоты класса А.

Работу по стерильному извлечению бактериальной массы проводили в локальной чистой зоне 3W. Бактериальную массу снимали с внутренних стенок ротора центрифуги стерильным металлическим шпателем и погружали в стерильный стеклянный стакан. Предварительно в стакан был внесен стерильный фосфатно-солевой буферный раствор в объеме 0,05 л. После снятия всей бактериальной массы суспензию гомогенизировали в лабораторном гомогенизаторе Silverson L4R при комнатной температуре в течение 15 мин при частоте вращения мешалки 2500-2700 об/мин.

Полученную бактериальную суспензию фильтровали через стерильный многослойный марлевый фильтр в стерильную бутыль и определяли концентрацию клеток. При постоянном перемешивании бактериальную суспензию разбавляли стерильным фосфатно-буферным раствором до концентрации 1000 ОЕ/см³ (по стандартному образцу мутности бактерийных взвесей «ОРМЕТ»). Готовую суспензию клеточного антигена штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus до компоновки вакцины хранили в стеклянной бутыли под резиновой пробкой в комнате-рефрижераторе при температуре (4-8)°С. Перед перемещением на хранение антиген отбирали в количестве 5,0 см³ и проводили контроль на стерильность в соответствии с ГФ XIV, т.1, стр. 1201-1222 (ОФС.1.2.4.0003.15).

Для создания экспериментальной серии препарата в количестве 1,0 тыс. доз было использовано:

- инактивированный антиген штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus, в количестве 0,02 дм³;

- стерильный физиологический раствор, в количестве 0,48 дм³;

- адъювант Montanide ISA 206 VG, в количестве 0,5 кг;

- тиомерсал, в количестве 0,002 дм³.

С целью получения эмульсионного препарата, специфический иммуностимулятор (антиген) соединяли со стерильным физиологическим раствором, заявленное выше количество антигена сопоставимо с 2×10⁹ м.к./доза. Масло предварительно было перелито в стеклянную бутыль. Данный адъювант не пригоден для автоклавирования, поэтому перед эмульгированием он подвергался холодной стерилизации через капсульный фильтр (0,22 мкм). Все компоненты вакцины были нагреты до 35,0°С. Адъювант соединяли с антигеном при низких оборотах мешалки (250 об/мин) в течение 15 мин. Для получения стабильной эмульсии полуфабрикат вакцины охлаждали до 12°С и проводили повторное эмульгирование в течение 15 мин.

Данной вакциной было иммунизировано 5 кроликов внутримышечно прививной дозой 1,0 см³. У кроликов до иммунизации и через 21 день после вакцинации были отобраны пробы крови. Данные сыворотки проверили на наличие антител к бактериям S. aureus штамма «SAU-21Л» в РА и ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Установлено, что через 21 сутки после однократной иммунизации кроликов инактивированной цельной вакциной, изготовленной из штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus в сыворотке крови кроликов обнаружены антитела к бактериям S. aureus в ИФА в диапазоне титров от 9,64 до 11,64. log₂ (1:800-1:3200), и РА - 9 log₂ (1:512). Показано, что полученный штамм «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus обладает иммуногенными свойствами.

Таким образом, заявляемый штамм «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus может быть использован для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров»:

1. Белкин, Б. Л. Мастит коров: Этиология, патогенез, диагностика, лечение и профилактика: монография / Б. Л. Белкин, В. Ю. Комаров, В. Б. Андреев; под редакцией Б. Л. Белкина. - Орел: ОрелГАУ, 2015. - 112 с.

2. Ларионов, Г. А. Профилактика и лечение субклинического мастита коров / Г. А. Ларионов, Л. М. Вязова, И. В. Царевский. - Чебоксары: ООО "Типография "Новое время", 2016. - 132 с.

3. Argaw, Amare. Review on Epidemiology of Clinical and Subclinical Mastitis on Dairy Cows // Food Science and Quality Management - 2016 - Vol 52. - P. 56-65.

4. Mahzounieh, M. Bacteriological and epidimiological aspects of mastitis in Arak area dairy herds Iran / M. Mahzounieh, G. Zadfar, S. Yham Magami, et all.// Acta vet. Scan. Suppe. - 2003. - № 98. - Р. 270.

5. Дзюина, Ю. А. Маститы у коров, этиология, приемы терапии / Ю. А. Дзюина, И. В. Коваль // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: Сборник статей по материалам 77-й научно-практической конференции студентов по итогам НИР за 2021 год. В 3-х частях, Краснодар, 01 марта 2022 года / Отв. за выпуск А.Г. Кощаев. Том Часть 1. - Краснодар: Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина, 2022. - С. 334-337.

6. Ковальчук, С.Н. Маститы у коров (этиология, профилактика, лечение). Автореферат дисс. кандидата вет. наук / С.Н. Ковальчук. - Витебск.- 2006. - 18 с.

7. Никитина, М. В. Изучение этиологических факторов мастита крупного рогатого скота / М. В. Никитина, О. А. Столбова, Л. Н. Скосырских // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2019. - № 5 (79). - С. 197 - 200.

8. Осколкова, М. В.Влияние физико-химических факторов на возникновение маститов у коров / М. В. Осколкова, Э. В. Кузьмина // Известия ОГАУ. - 2015. - № 2 (52). - С. 98-100.

9. Авдуевская Н.Н. Сравнительный анализ видового состава и количественное соотношение микрофлоры при субклиническом и клиническом мастите коров / Авдуевская Н.Н. и др. // Ветеринария сегодня, Владимир, 2022. - с. 296-302.

10. Zhylkaidar, A. Prevention of Bovine Mastitis through Vaccination. / A. Zhylkaidar, K. Oryntaev, A. Altenov, E. Kylpybai, E. Chayxmet. // Arch Razi Inst. 2021 Nov 30;76(5). - P. 1381-1387.

11. Watts, J.L. 1988. Etiological agents of bovine mastitis. Veterinary Microbiology, 16(1). P 41 -66.

12 Авдуевская, Н. Н. Золотистый стафилококк - один из главных возбудителей мастита лактирующих коров / Н. Н. Авдуевская // Российский журнал Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. - 2020. - № 2(34). - С. 245-249.

13. Кабисова, Э. Н. Развитие биопленки стафилококка / Э. Н. Кабисова, Д. Т. Хадаева. // Молодой ученый. - 2022. - № 46 (441). - С. 51-53.

14. Назаров, М. В. Особенности диагностики, лечения и профилактики субклинического мастита у коров в период запуска и сухостоя / М. В. Назаров, Б. В. Гаврилов, Е. В. Попович // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2022. - № 6(98). - С. 170-174.

15. Сравнительный анализ видового состава и количественное соотношение микрофлоры при субклиническом и клиническом мастите коров / Н. Н. Авдуевская, А. В. Капустин, А. В. Горбатов, Е. В. Иванов // Ветеринария сегодня. - 2022. - Т. 11, № 4. - С. 296-302.

16. Фирсов, Г. М. Видовой состав микрофлоры секрета вымени коров при субклиническом мастите / Г. М. Фирсов // Известия Нижневолжского агроуниверситетского комплекса: Наука и высшее профессиональное образование. - 2008. - № 2(10). - С. 91-94.

17. Галкин А.В. О выявлении возбудителей мастита и их чувствительности к антибиотикам / Галкин А.В., Трепалина Е. // Эффективное животноводство. 2017. - № 7 (137). - с. 22-23.

18. Горбатенко, А.В. Возбудители клинических и субклинических маститов коров и их чувствительность к антибактериальным препаратам / А. В. Горбенко, Д. В. Гадзевич, С. А. Гужвинская [и др.] // Ветеринарна медицина. - 2013. - № 97. - С. 176 - 180.

19. Музыка, В. П. Антибиотикорезистентность в ветеринарной медицине / В. П. Музыка, Т. И. Стецко, М. В. Пашковская // Актуальные проблемы и инновации в современной ветеринарной фармакологии и токсикологии: материалы V Междунар. съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов, Витебск, 26-30 мая 2015 г. / Витебская государственная академия ветеринарной медицины. - Витебск: ВГАВМ, 2015. - С. 20-26.

20. Горбатов, А. В. Факторы вирулентности стрептококков и стафилококков и специфическая профилактика маститов у коров / А. В. Горбатов, Н. А. Соколова, М. Н. Лощинин // Российский журнал Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. - 2019. - № 4(32). - С. 428-433.

21. G Abril A, G Villa T, Barros-Velázquez J, Cañas B, Sánchez-Pérez A, Calo-Mata P, Carrera M. Staphylococcus aureus Exotoxins and Their Detection in the Dairy Industry and Mastitis. Toxins (Basel). 2020 Aug 20;12(9):537.

22. Патент RU 2 568 058 C2, от 25.11.2014 г.

23. Патент RU 2 795 607 C1, от 05.05.2023 г.

24. Патент RU 2 565 824 C1, от 19.11.2014 г.

25. Патент RU 2 058 387 C1, от 20.04.1996 г.

26. Патент KZ27866 от 25.12.2013 г.

27. «Методические указания по лабораторной диагностике стафилококкоза животных», утв. Госагропромом СССР, 1987.

28. А.А. Шевченко, О.Ю. Черных и др. / Диагностика стафилококкозов и стрептококкозов // учеб.пособие, Кубанский госуд. аграр. университет - Краснодар, 2013.

Таблица 1 Биохимические свойства штамма «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus (предлагаемое изобретение) Тест (показатели) Штамм
«SAU-21Л» Staphylococcus aureus
(предлагаемое изобретение) по определителю Берджи Наличие ферментов: D-глюкоза + + Щелочная фосфатаза + + Аргининдегидролаза + + Уреаза + + Подкисление: D-фруктозы + + D-маннозы + + Мальтозы + + Лактозы + + D-трегалозы + + D-маннитола + + Ксилитола - - D-мелибиозы - - Раффинозы - - Ксилозы - - Сахарозы + + Метил-α-D-глюкопиранозида - - N-ацетилглюкозамина + + Восстановление нитратов до нитритов + + Накопление ацетилметилкарбинола + + Примечание: «+» - положительный результат,
«-» - отрицательный результат.

Таблица 2 Результаты исследований проб сывороток крови кроликов на наличие антител в непрямом варианте ИФА и РА к штамму «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus Характеристика
сыворотки крови Результат
РА* Результат в непрямом варианте ИФA Совпадение
результатов
+/- 1 повторность 2 повторность Нормальная сыворотка крови кроликов (до иммунизации) <1:16-отриц. <1:200-отриц <1:200-отриц + <1:16-отриц. <1:200-отриц <1:200-отриц + <1:16-отриц. <1:200-отриц <1:200-отриц + <1:16-отриц. <1:200-отриц <1:200-отриц + <1:16-отриц. <1:200-отриц <1:200-отриц + Сыворотки крови кроликов
- 21 день после иммунизации 1:512-полож. 1:1600-полож. 1:1600-полож. + 1:512-полож. 1:3200-полож. 1:3200-полож. + 1:512-полож. 1:3200-полож. 1:3200-полож. + 1:512-полож. 1:1600-полож. 1:1600-полож. + 1:512-полож. 1:800-полож. 1:800-полож. + Гетерологичные сыворотки крови кроликов, содержащие
антитела к бактериям:
Pasteurella multocida отриц. отриц. отриц. + Streptococcus dysgalactiae отриц. отриц. отриц. +

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма «SAU-21Л» бактерий семейства Staphylococcaceae рода Staphylococcus вида Staphylococcus aureus, депонированного в Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №383 – деп./22-17 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Предложенный штамм культивируется на питательных средах – сердечно-мозговой агар и сердечно-мозговой бульон, штамм обладает выраженными свойствами, характерными для своего вида, является высоковирулентным, а также обладает антигенными и иммуногенными свойствами. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров. 2 табл., 6 пр.

Штамм «SAU-21Л» бактерий Staphylococcus aureus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №383 – деп./22-17 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров.