ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ПНЕВМОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2024 года по МПК C07K14/315 C12N15/70 C07K17/02 A61K39/09 A61P31/04 A61P37/04 

Область техники

Изобретение относится к генной инженерии, микробиологии, биотехнологии и иммунологии, а именно к иммунобиологическому средству на основе рекомбинантного белка PBD-CbpA, иммобилизованного на бактериеподобных частицах (БПЧ). Заявленное иммунобиологическое средство вызывает специфический иммунный ответ против Streptococcus pneumoniae и может использоваться для профилактики пневмококковой инфекции.

Уровень техники

Streptococcus pneumoniae (пневмококк) - грамположительная инкапсулированная бактерия, являющаяся широко распространенным возбудителем инфекционных заболеваний у человека. Термин «пневмококковая инфекция» объединяет группу заболеваний, вызываемых S. pneumoniae, включающую как неинвазивные клинические формы (бронхит, пневмония, острый средний отит, острый синусит), так и наиболее опасные инвазивные формы (пневмония, сопровождающаяся бактериемией, сепсис, гнойный менингит), которые могут привести к летальному исходу. Пневмококковая инфекция является ведущей причиной тяжелых пневмоний у детей до двух лет и занимает первое место среди бактериальных пневмоний в целом, а также второе место в структуре бактериальных менингитов с тяжелым течением.

Пневмококковая инфекция передается в основном воздушно-капельным путем, особенно восприимчивы к развитию тяжелых форм инфекции дети (0-2 лет), пожилые люди старше 65 лет, лица с ослабленным иммунитетом и сопутствующими хроническими заболеваниями. В основе патогенетического механизма развития, поддержания, распространения пневмококковой инфекции и развития антибиотикорезистентности лежит носительство пневмококка (назофарингеальная колонизация), которое может протекать бессимптомно либо сопровождаться клинической симптоматикой острого респираторного заболевания (острый средний отит, синусит). Пневмококк часто выступает как сопутствующий инфекционный агент при заболеваниях дыхательных путей вирусного генеза (гриппе, ОРВИ, коронавирусной инфекции), осложняя их течение и терапию.

Полисахаридная капсула - главный фактор вирулентности, выполняющий функцию защиты пневмококка от опсонизации и последующего фагоцитоза. Капсульные полисахариды являются поверхностными антигенами и распознаются иммунной системой организма-хозяина, вследствие чего характеризуются высокой вариабельностью. По химическому строению и антигенным свойствам капсульных полисахаридов выделяют более 100 серотипов S. pneumoniae отличающихся вирулентностью, распространенностью и устойчивостью к антибиотикам, из них порядка 25 серотипов наиболее распространены и вызывают инвазивные формы пневмококковой инфекции.

Согласно позиции Всемирной организации здравоохранения, вакцинация - единственный способ существенного снижения заболеваемости пневмококковой инфекцией. Наблюдаемое повышение уровня антибиотикорезистентности S. pneumoniae подчеркивает важность осуществления коллективной иммунопрофилактики.

Используемые в настоящее время пневмококковые вакцины можно разделить на два типа: полисахаридные и конъюгированные. В России вакцинация от пневмококковой инфекции включена в Национальный календарь профилактических прививок и Календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям с 2014 года. На территории России зарегистрированы импортные вакцины: полисахаридная вакцина Пневмовакс 23 (Merck Sharp & Dohme, США), полисахаридные конъюгированные вакцины Синфлорикс (GlaxoSmithKline Biologicals, Бельгия) и Превенар 13 (Pfizer Ireland Pharmaceuticals, Ирландия), по лицензии производится 13-валентная полисахаридная конъюгированная вакцина Пнемотекс (Нанолек, Россия) - аналог вакцины Превенар 13. Следует отметить, что отечественные вакцины против пневмококка на сегодняшний день отсутствуют.

Поливалентная пневмококковая полисахаридная вакцина Пневмовакс 23 представляет собой очищенные полисахаридные антигены S. pneumoniae 23 серотипов (1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F) и формирует иммунитет к указанным серотипам, вызывающим до 90% инвазивных пневмококковых инфекций. Однако полисахаридные антигены - слабые стимуляторы адаптивной иммунной системы, они не распознаются Т-клетками и индуцируют краткосрочный иммунный ответ без формирования иммунологической памяти. Показано, что вакцины, содержащие только полисахаридные антигены, неэффективны при использовании у детей младше двух лет. Это существенное ограничение пневмококковых вакцин данного типа, поскольку именно возрастная группа детей младше двух лет относится к группе высокого риска по развитию пневмококковой инфекции в форме пневмонии, менингита и в первую очередь должна быть охвачена профилактической вакцинацией.

В полисахаридных конъюгированных вакцинах полисахаридные антигены конъюгированы с белковым носителем (дифтерийного или столбнячного анатоксина, детоксицированного дифтерийного токсина CRM 197). Превенар 13 эффективен в отношении 13 серотипов S. pneumoniae (1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F), Синфлорикс - против 10 серотипов (1, 4, 5, 6В, 7F, 14, 18С, 19F и 23F). Полисахаридные конъюгированные вакцины индуцируют формирование Т-клеточного иммунного ответа против S. pneumoniae, в том числе у детей в возрасте до двух лет, и на сегодняшний день считаются стандартом эффективности, поскольку существенно снижают показатели заболеваемости и смертности от пневмококковой инфекции, распространенности антибиотикоустойчивых штаммов, а также уменьшают уровень назофарингеального носительства пневмококка, способствуя формированию коллективного иммунитета.

Однако все пневмококковые вакцины на основе полисахаридных антигенов имеют существенный недостаток - узкую специфичность, они обеспечивают иммунную защиту только от ограниченного числа серотипов S. pneumoniae, полисахаридные антигены которых входят в состав вакцины, а в отношении остальных циркулирующих в популяции серотипов возбудителя (невакцинных серотипов, некапсулированных штаммов) не оказывают протективного эффекта, что представляет серьезную проблему для контроля пневмококковой инфекции.

Потребность в разработке нового поколения серотип-независимых пневмококковых вакцин возрастает и в связи с повсеместно наблюдаемым ростом устойчивости S. pneumoniae к пенициллину и другим антибиотикам вследствие передачи генов устойчивости к антибиотикам путем внутри- и межвидовой рекомбинации.

Новым направлением в разработке противопневмококковых средств выступает создание вакцин на основе рекомбинантных поверхностных антигенов пневмококка, нацеленных на стимулирование мукозального иммунитета и предотвращающих назофарингеальную колонизацию, обеспечивающих иммунную защиту в отношении как неинвазивных, так и наиболее опасных инвазивных пневмококковых инфекций и являющихся серотип-независимыми, поскольку они обеспечивают формирование противопневмококкового иммунного ответа независимо от серотипа S. pneumoniae.

Наиболее предпочтительными кандидатами для разработки белковых вакцин выступают факторы вирулентности пневмококков, которые имеют консервативные последовательности и широко представлены во всех серотипах S. pneumoniae. Существенные преимущества белковых вакцин - их универсальность (серотип-независимость), невысокая стоимость и более простое производство относительно конъюгатных вакцин.

Предпочтительными кандидатными антигенами для разработки вакцин являются факторы вирулентности пневмококка вследствие их консервативности и представленности во всех серотипах S. pneumoniae. В качестве кандидатов было изучено несколько белков S. pneumoniae: PspA (пневмококковый поверхностный белок А), CbpA (холин-связывающий белок А, другие названия этого белка - PspC, Hic, SpsA), PcpA (пневмококковый холин-связывающий белок), PsaA (пневмококковый поверхностный антиген А), PhtD (гистидиновый триадный белок D), EF-Tu (прокариотический фактор элонгации), Ply (пневмолизин) и др.; созданные на их основе кандидатные иммуногенные композиции проходят доклинические и клинические испытания (Aceil J., Avci F.Y. Pneumococcal surface proteins as virulence factors, immunogens, and conserved vaccine targets // Front. Cell Infect. Microbiol. - 2022. - V. 12. - P. 832254. - Doi: 10.3389/fcimb.2022.832254; Li S., Liang H., Zhao S.H., Yang X.Y., Guo Z. Recent progress in pneumococcal protein vaccines // Front. Immunol. - 2023. - V. 14. - P. 1278346. - Doi: 10.3389/fimmu.2023.1278346).

Перспективной мишенью для разработки противопневмококковых вакцин является консервативный поверхностный холин-связывающий белок CpbA (также известный как PspC) - фактор вирулентности, который имеется у всех пневмококков. CpbA - основной адгезин патогена, он способен связываться с секреторным IgA, компонентом комплемента C3 и фактором комплемента H, что предопределяет его важную роль в колонизации, адгезии и инвазии. Связывание CpbA с фактором H нарушает альтернативный каскад комплемента, способствуя защите клеток пневмококка от опсонизации. Связываясь с компонентом комплемента С3 на поверхности пневмококка, CpbA опосредует транслокацию патогена из носоглотки в нижние дыхательные пути и кровоток, способствуя развитию тяжелых форм инфекции.

CpbA обладает высокой иммуногенностью в отношении S. pneumoniae. Показано, что вакцинные композиции на основе CpbA вызывают эффективный иммунный ответ и обеспечивают защиту от инвазивных форм пневмококковой инфекции и от бактерионосительства у мышей (Ogunniyi A.D., Woodrow M.C., Poolman J.T., Paton J.C. Protection against Streptococcus pneumoniae elicited by immunization with pneumolysin and CbpA // Infect. Immun. - 2001. - V. 69. - P. 5997-6003. - Doi: 10.1128/iai.69.10.5997-6003.2001).

Примечательно, что антиген CpbA как вакцинный кандидат индуцировал эффективное формирование противопневмококкового иммунного ответа не только в составе иммуногенных композиций с другими антигенами, но и в качестве единственного иммуногена (Cao J., Gong Y., Li D., Yin N., Chen T., Xu W., Zhang X., Yin Y. CD4⁺ T lymphocytes mediated protection against invasive pneumococcal infection induced by mucosal immunization with ClpP and CbpA // Vaccine. - 2009. - V. 27. - P. 2838-2844. - Doi: 10.1016/j.vaccine.2009.02.093; Balachandran P., Brooks-Walter A., Virolainen-Julkunen A., Hollingshead S.K., Briles D.E. Role of pneumococcal surface protein C in nasopharyngeal carriage and pneumonia and its ability to elicit protection against carriage of Streptococcus pneumoniae // Infect. Immun. - 2002. - V. 70. - P. 2526-2534. - doi: 10.1128/iai.70.5.2526-2534.2002).

Иммуногенные композиции для профилактики и лечения пневмококковых инфекций на основе слитых белков, включающих полипептид CbpA и/или цитолизоидный полипептид, описаны в патенте US10632183B2. После трехкратного введения этих композиций мышам линии Balb/c была показана выработка антител против CbpA S. pneumoniae при инфицировании разными серотипами пневмококка, а также перекрестная активность в отношении менингококка.

Таким образом, поверхностный антиген CpbA обладает большим потенциалом для обеспечения эффективного иммунного ответа против широкого спектра серотипов S. pneumoniae.

В качестве носителя (системы доставки) для рекомбинантных антигенов перспективно использование бактериеподобных частиц (БПЧ) (Zhou X., Gao M., De X., Sun T., Bai Z., Luo J., Wang F., Ge J. Bacterium-like particles derived from probiotics: progress, challenges and prospects // Front. Immunol. - 2023. - V. 14. - P. 1263586. - Doi: 10.3389/fimmu.2023.1263586), которые представляют собой свободный от клеточного содержимого и белков пептидогликан из бактерий родов Lactobacillus или Lactococcus, имеющих статус GRAS (общепризнаны как безопасные). Прочное связывание и равномерное распределение рекомбинантных антигенов на поверхности БПЧ обеспечивается аффинным взаимодействием за счет пептидогликан-связывающего домена (PBD), входящего в состав рекомбинантного белка.

БПЧ характеризуются рядом преимуществ: простотой приготовления, низкой стоимостью, стабильностью, безопасностью, высокой нагрузочной способностью, высокой эффективностью доставки целевых антигенов, а также адъювантными свойствами. БПЧ соответствуют размеру и форме бактериальной клетки, обеспечивая множественное взаимодействие (авидность) рецепторов B-лимфоцитов с рекомбинантными антигенами на поверхности БПЧ и, как следствие, усиленную презентацию антигена Т-хелперам (CD4⁺), выработку противовоспалительных цитокинов и формирование эффективного иммунного ответа.

Таким образом, на основании анализа уровня техники можно сделать вывод об актуальности разработки новых технических решений в области создания серотип-независимых пневмококковых вакцин на основе рекомбинантных белковых антигенов.

Раскрытие изобретения

Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка нового эффективного средства на основе белковых антигенов S. pneumoniae для специфической профилактики пневмококковой инфекции.

Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке иммунобиологического средства на основе рекомбинантного белка PBD-CbpA для индукции специфического иммунного ответа против S. pneumoniae.

Указанный технический результат достигается тем, что создан рекомбинантный белок PBD-CbpA с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1, обладающий иммуногенностью в отношении S. pneumoniae, а также разработан способ получения рекомбинантного белка PBD-CbpA, иммобилизованного на бактериеподобных частицах, который включает следующие этапы:

- получение рекомбинантного белка PBD-CbpA в составе клеточных экстрактов Escherichia coli, трансформированных экспрессионной плазмидой, которая содержит химерный ген с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 2, кодирующий рекомбинантный белок PBD-CbpA;

- получение бактериеподобных частиц, представляющих собой очищенный от клеточного содержимого пептидогликан бактерий родов Lactobacillus или Lactococcus;

- иммобилизацию рекомбинантного белка PBD-CbpA на бактериеподобных частицах за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации с последующей отмывкой от несвязавшихся бактериальных белков и получением целевого продукта.

Также технический результат заключается в получении иммунобиологического средства на основе рекомбинантного белка PBD-CbpA для профилактики пневмококковой инфекции.

Иммунологически активный рекомбинантный белок PBD-CbpA содержит фрагмент поверхностного антигена CbpA из S. pneumoniae, слитый с пептидогликан-связывающим доменом (PBD) белка AtlA из Staphylococcus aureus, обеспечивающим иммобилизацию рекомбинантного белка PBD-CbpA на бактериеподобных частицах (БПЧ) за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации. Заявленное иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного белка PBD-CbpA, иммобилизованного на БПЧ, индуцирует специфический иммунный ответ против S. pneumoniae и может использоваться для профилактики пневмококковой инфекции, расширяя арсенал средств борьбы с данным патогеном.

Пептидогликан бактерий родов Lactobacillus или Lactococcus, составляющих основу БПЧ, является лигандом Toll-подобного рецептора 2 (TLR2) и NOD-подобных рецепторов NOD1 и NOD2, которые играют важную роль в обнаружении компонентов клеточной стенки, таких как пептидогликан и его фрагменты. Механизм действия заявленного иммунобиологического средства на основе рекомбинантного белка PBD-CbpA заключается в имитации бактериеподобными частицами с иммобилизованным на них фрагментом антигена CbpA инфицирования организма патогеном S. pneumoniae и увеличении антигенной нагрузки, что обеспечивает множественное взаимодействие (авидность) рецепторов B-лимфоцитов с антигеном и, как следствие, усиленную презентацию антигена Т-хелперам (CD4⁺). После распознавания лиганда активируются TLR2- и NOD-зависимые сигнальные каскады, что приводит к многократному усилению экспрессии цитокинов и защитных антител против связанного с БПЧ фрагмента антигена CbpA.

В качестве антигена для индукции иммунного ответа против S. pneumoniae в составе иммуногенного рекомбинантного белка по изобретению содержится фрагмент консервативного поверхностного белка CbpA, который присутствует у всех серотипов S. pneumoniae. Поэтому иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного белка PBD-CbpA является универсальным (серотип-независимым) и может использоваться для профилактики заболеваний, вызываемых широким спектром серотипов S. pneumoniae.

В качестве системы доставки иммуногенного рекомбинантного белка PBD-CbpA по изобретению используется высокомолекулярный носитель - бактериеподобные частицы (БПЧ), полученные из бактерий родов Lactobacillus или Lactococcus GRAS-статуса, характеризующиеся безопасностью, высокой эффективностью доставки целевых антигенов, а также выраженными адъювантными свойствами вследствие стимуляции пролиферации CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов и индукции ответа Th1-типа.

Осуществление изобретения

Для реализации изобретения были поставлены следующие задачи:

1) получение БПЧ высокой степени очистки из бактерий родов Lactobacillus или Lactococcus;

2) получение рекомбинантного белка PBD-CbpA с последовательностью SEQ ID NO 1 и молекулярной массой 68,3 кДа, эффективно экспрессирующегося в клетках Escherichia coli BL21, легко поддающегося очистке и иммобилизации на БПЧ.

Решение первой поставленной задачи обеспечивается разработкой методики получения БПЧ, представляющих собой очищенную от клеточного содержимого пептидогликановую оболочку, полученную из культур бактерий родов Lactobacillus или Lactococcus (пример 1).

Методика получения БПЧ включает два этапа:

1) культивирование культуры бактерий родов Lactobacillus или Lactococcus с последующей отмывкой бактериальных клеток от культуральной жидкости;

2) последовательное кипячение в растворах додецилсульфата натрия, трихлоруксусной кислоты и соляной кислоты осадка бактериальных клеток с получением очищенного препарата БПЧ.

Ступенчатая обработка детергентом и кипячение в растворах кислот позволяют максимально полно разрушить все органические компоненты на поверхности пептидогликана и эффективно удалить все внутриклеточное содержимое (включая бактериальные белки, ДНК, липополисахариды), при этом не разрушая после обработки пептидогликановую оболочку, сохраняя первоначальную форму и размер клетки.

По разработанной методике был получен препарат БПЧ высокой степени очистки для последующей иммобилизации целевого рекомбинантного белка.

Решение второй поставленной задачи обеспечивается получением рекомбинантного белка PBD-CbpA (SEQ ID NO 1) с молекулярной массой 68,3 кДа (пример 2), включающего пептидогликан-связывающий домен (PBD) белка AtlA из Staphylococcus aureus для обеспечения иммобилизации рекомбинантного белка на поверхности БПЧ, спейсер с последовательностью PGSGSGSGSGSGARS и фрагмент поверхностного антигена CbpA из Streptococcus pneumonia), обладающего иммуногенностью в отношении пневмококка.

Способ получения рекомбинантного белка PBD-CbpA включает следующие стадии:

1) получение рекомбинантного белка PBD-CbpA в составе клеточных экстрактов штамма-продуцента Е. coli BL21, экспрессирующих химерный ген, кодирующий рекомбинантный белок PBD-CbpA;

2) иммобилизацию рекомбинантного белка PBD-CbpA на бактериеподобных частицах с последующей отмывкой от несвязавшихся бактериальных белков и получением целевого продукта.

Была спланирована нуклеотидная последовательность химерного гена (SEQ ID NO 2), кодирующая рекомбинантный белок PBD-CbpA, для эффективной экспрессии в E. coli последовательность химерного гена оптимизировали по кодонному составу и вторичной структуре мРНК.

Химерный ген с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 2 синтезировали химико-ферментативным методом с последующим клонированием, в результате была получена плазмида pPBD-CbpA, кодирующая рекомбинантный белок PBD-CbpA. Для экспрессии рекомбинантного белка предпочтительно использование клеток Е. coli BL21 и их производных, обеспечивающих высокий уровень синтеза целевого рекомбинантного белка, а также плазмидных векторов экспрессии типа рЕТ.

Поскольку рекомбинантный белок PBD-CbpA выделяют из клеточных экстрактов при помощи аффинного взаимодействия с БПЧ за счет пептидогликан-связывающего домена, то иммобилизованный на БПЧ рекомбинантный белок PBD-CbpA не содержит примесей других бактериальных белков, ДНК штамма-продуцента, липополисахаридов и эндотоксинов.

Разработанная схема представляет собой недорогую, гибкую, эффективную и простую в использовании альтернативу традиционным технологиям и позволяет проводить в одну стадию процедуру по связыванию, очистке, иммобилизации и формулированию на поверхностности БПЧ рекомбинантных белков, имеющих в своем составе последовательность PBD.

В составе рекомбинантного белка PBD-CbpA представлен пептидогликан-связывающий домен (PBD), соответствующий первому пептидогликан-связывающему домену белка AtlA из Staphylococcus aureus. В аминокислотной последовательности фрагмента PBD может содержаться одно или более изменений (до 15%) относительно природного полипептида, но не в лиганд-связывающих областях.

PBD присоединен к фрагменту антигена CbpA через оптимально сконфигурированный спейсер с последовательностью PGSGSGSGSGSGARS. Спейсер необходим для обеспечения представления фрагмента антигена CbpA на поверхности белковой молекулы, а также оптимальной презентации иммунной системе человека. Помимо представленного спейсера, в состав рекомбинантного белка может входить любая другая последовательность спейсера приемлемой длины, обеспечивающая вышеуказанные свойства.

Существенное преимущество заявленного изобретения обеспечивается использованием БПЧ в качестве безопасного высокомолекулярного носителя рекомбинантного антигена. БПЧ представляют собой свободную от клеточного содержимого и белков пептидогликановую оболочку бактерий родов Lactobacillus или Lactococcus, имеющих статус GRAS (общепризнаны как безопасные). БПЧ соответствует размеру и форме бактериальной клетки, обеспечивая множественное взаимодействие (авидность) рецепторов B-лимфоцитов с рекомбинантными антигенами на поверхности БПЧ и, как следствие, усиленную презентацию антигена Т-хелперам (CD4⁺), выработку противовоспалительных цитокинов и формирование эффективного иммунного ответа.

Еще одно значительное преимущество заявленного рекомбинантного белка PBD-CbpA является следствием использования в его составе пептидогликан-связывающего домена (PBD), который обеспечивает прочное связывание с носителем за счет аффинных взаимодействий и равномерное распределение фрагмента антигена CbpA S. pneumoniae на БПЧ. За счет связывания рекомбинантного белка PBD-CbpA с БПЧ формируются молекулярные комплексы большого размера (1-2 мкм), обеспечивающие иммуногенность и устойчивость к деградации протеазами, в связи с чем фрагмент поверхностного антигена S. pneumoniae CbpA по настоящему изобретению присутствует в организме человека более продолжительное время, оказывая более длительное воздействие на иммунную систему, и при этом безопасен в применении.

Таким образом, в результате реализации второй поставленной задачи было получено иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного белка PBD-CbpA, иммобилизованного на БПЧ. Иммуногенность заявленного иммунобиологического средства была изучена на мышах линии BALB/c (пример 3). Показано, что иммунобиологическое средство по изобретению вызывает формирование высокого титра защитных антител против фрагмента антигена CbpA S. pneumoniae.

Реализация изобретения подтверждается характерными примерами, которые приведены исключительно с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения каким-либо способом рамок данного изобретения.

Пример 1. Получение бактериеподобных частиц (БПЧ)

Для получения бактериеподобных частиц бактерии родов Lactobacillus или Lactococcus выращивали в бульоне, содержащем сердечно-мозговой экстракт с 2% глюкозы в течение 18-20 ч при 37°С. Клетки бактерий осаждали центрифугированием при 7728 g в течение 10 мин. Осадок дважды ресуспендировали деионизированной водой с последующим осаждением центрифугированием для удаления остатков культуральной жидкости. Полученную клеточную массу суспендировали в 0,5%-ном растворе додецилсульфата натрия из расчета 10 мл раствора на 1 г биомассы.

Суспензию кипятили на водяной бане в течение 2 ч при постоянном помешивании, после чего центрифугировали при 7728 g в течение 10 мин. Осадок промывали ресуспендированием в деионизированной воде с последующим осаждением центрифугированием при тех же условиях до полного удаления пены. Промытый осадок суспендировали в 10%-ном растворе ТХУ из расчета 2 мл раствора на 100 мг осадка. Полученную суспензию кипятили на водяной бане 30 мин при постоянном перемешивании, после чего центрифугировали при 7728 g в течение 10 мин. Осадок промывали ресуспендированием в деионизированной воде с последующим осаждением центрифугированием при тех же условиях. Осадок суспендировали в растворе 0,1 M HCl из расчета 3 мл раствора на 100 мг осадка. Полученную суспензию кипятили на водяной бане 30 мин при постоянном перемешивании, после чего центрифугировали при 7728 g в течение 10 мин. Полученный осадок промывали ресуспендированием в деионизированной воде с последующем осаждением центрифугированием при тех же условиях. Затем осадок (100 мг/мл) БПЧ суспендировали в натрий-фосфатном буфере (рН 7,4) и стерилизовали автоклавированием.

Полученные очищенные БПЧ хранили при 4°С до иммобилизации рекомбинантного белка PBD-CbpA.

Пример 2. Получение рекомбинантного белка PBD-CbpA, иммобилизованного на БПЧ.

Была спланирована нуклеотидная последовательность химерного гена (SEQ ID NO 2), кодирующая пептидогликан-связывающий домен (PBD) белка AtlA из Staphylococcus aureus, спейсер и фрагмент поверхностного антигена CbpA из Streptococcus pneumoniae. Химерный ген синтезировали химико-ферментативным методом с последующим клонированием.

На основе плазмидного вектора экспрессии типа рЕТ получили плазмиду pPBD-CbpA, кодирующую белок PBD-CbpA, путем клонирования химерного гена (SEQ ID NO 2) в указанную материнскую плазмиду.

Далее полученной плазмидой pPBD-CbpA трансформировали клетки Е. coli BL21. В культуру добавляли 3 мкл 0,1 Μ раствора изопропил-β-D- тиогалактопиранозида (ИПТГ) и выращивали в течение 3 ч при 37°С. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма Е. coli BL21 [pPBD-CbpA], обнаруживали появление дополнительной белковой полосы, молекулярная масса которой соответствовала ожидаемой для рекомбинантного белка PBD-CbpA - 68,3 кДа.

Уровень синтеза целевого белка в Е. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Показано, что рекомбинантный белок PBD-CbpA синтезируется в клетках Е. coli в растворимой форме. Для получения рекомбинантного белка PBD-CbpA клеточную культуру штамма Е. coli BL21 [pPBD-CbpA] выращивали в 1 л среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 15 мкл 0,1 Μ раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 5500 g в течение 15 мин. Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с лизоцимом. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком. После центрифугирования при 12000 g растворимый белок PBD-CbpA оставался в надосадочной жидкости.

Для иммобилизации рекомбинантного белка PBD-CbpA к полученному после центрифугирования супернатанту добавляли 1/10 объема суспензии БПЧ и инкубировали при 25°C в течение 2 ч. Далее центрифугировали при 8000 об/мин, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере. Отмывку БПЧ повторяли 3 раза.

Целевой продукт представлял собой суспензию рекомбинантного белка PBD-CbpA, иммобилизованного на БПЧ.

Пример 3. Оценка иммуногенности иммунобиологического средства на основе рекомбинантного белка PBD-CbpA

Иммуногенность иммунобиологического средства на основе рекомбинантного белка PBD-CbpA, иммобилизованного на бактериеподобных частицах, оценивали в исследованиях на самках мышей инбредной линии BALB/c в возрасте шести недель. Животных разделили на три группы, в каждой группе было по пять особей. Первой опытной группе мышей подкожно вводили иммунобиологическое средство, содержащее иммобилизованный на БПЧ рекомбинантный белок PBD-CbpA, в дозировке 10 мкг трехкратно с интервалом в три недели между инъекциями. Второй опытной группе мышей по той же схеме и в такой же дозировке вводили неиммобилизованный рекомбинантный белок PBD-CbpA. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор.

Через 14 дней после последней инъекции производили отбор сывороток крови и определяли титр антител к фрагменту антигена CbpA S. pneumoniae методом иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты эксперимента представлены в таблице 1. В каждой группе вычисляли средние значения титра антител - полученные по пяти животным значения параметра разведения усредняли и вычисляли средние значения параметров разведения (титр).

Таблица 1 - Определение методом ИФА титров антител к фрагменту антигена CbpA S. pneumoniae в образцах сывороток крови мышей после введения иммунобиологического средства

Вводимый препарат Значение параметра разведения (титр) Среднее значение
титра антител мышь 1 мышь 2 мышь 3 мышь 4 мышь 5 PBD-CbpA на БПЧ 6 × 10⁴ 5 × 10⁴ 4 × 10⁴ 8 × 10⁴ 7 × 10⁴ 6 × 10⁴ PBD-CbpA 2 × 10² 1 × 10² 1 × 10² 3 × 10² 1 × 10² 2 × 10² Физиологический раствор 1 × 10¹ 1 × 10¹ 2 × 10¹ 1 × 10¹ 2 × 10¹ 2 × 10¹

Из данных таблицы 1 следует, что иммунобиологическое средство по изобретению на основе рекомбинантного белка PBD-CbpA, иммобилизованного на БПЧ, вызывает формирование высокого титра защитных антител против фрагмента антигена CbpA S. pneumoniae. Показано, что иммобилизованный на БПЧ рекомбинантный белок PBD-CbpA индуцирует более высокий уровень антител по сравнению с неиммобилизованным рекомбинантным белком PBD-CbpA.

Таким образом, поставленная техническая задача, а именно разработка нового эффективного средства на основе белковых антигенов для специфической профилактики пневмококковой инфекции, обеспечивающего индукцию иммунного ответа против S. pneumoniae, решена получением заявленного иммунобиологического средства на основе рекомбинантного белка PBD-CbpA, иммобилизованного на БПЧ.

Приведенные примеры подтверждают промышленную применимость изобретения.

Перечень последовательностей

SEQ ID 1 - Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка PBD-CbpA

SEQ ID 2 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантный белок PBD-CbpA

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="ИМУННОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО

БЕЛКА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ПНЕВМОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-02-22">

<ApplicantFileReference>111111</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр

эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»

Министерства здравоохранения Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe

uchrezhdenie Natsionalnyi issledovatelskii tsentr epidemiologii i

mikrobiologii imeni pochetnogo akademika N F Gamalei Ministerstva

zdravookhraneniia Rossiiskoi Federatsii</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">ИМУННОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА

ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ПНЕВМОКОККОВОЙ

ИНФЕКЦИИ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>621</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..621</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MGSKAGGTVTPTPNTKLTVAANNGVAQIKPTNSGLYTTVYDKTGKATNE

VQKTFAVSKTATLGNQKFYLVQDYNSGNKFGWVKEGDVVYNTAKSPVNVNQSYSIKSGTKLYTVPWGTSK

QVAGSVSGSGNQTFKASKQQQIDKSIYLYGSVNGKSGWVSKAYLRSPGSGSGSGSGSGARSFASKSERKV

HYSIRKFSVGVASVVVASLVMGSVVHATENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEE

YVKKIVGESYAKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAVSKFEKDS

SSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTITYKTLELEIAES

DVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAEAEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKG

RAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPT

NTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAK

RKAAEEDKVKRS</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>2082</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2082</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>attaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaatttcaca

cagaattcattaaagaggagaaattaaccatgggatccaaagcgggcggcaccgtgaccccgaccccgaa

caccaaactgaccgtggcggcgaacaacggcgtggcgcagattaaaccgaccaacagcggcctgtacacc

accgtgtacgataaaaccggcaaagcgaccaacgaagtgcagaaaacctttgcggtgagcaaaaccgcga

ccctgggcaaccagaaattttatctggtgcaggattacaacagcggcaacaaatttggctgggtgaaaga

aggcgatgtggtgtacaacaccgcgaaaagcccggtgaacgtgaaccagagctacagcattaaaagcggc

accaaactgtacaccgtgccgtggggcaccagcaaacaggtggcgggcagcgtgagcggcagcggcaacc

agacctttaaagcgagcaaacagcagcagattgataaaagcatttacctgtacggcagcgtgaacggcaa

aagcggctgggtgagcaaagcgtacctgagatccccgggttctggctccggctctggttccggttctggc

gccagatcctttgcttccaagagtgaacgcaaagtgcattacagtattcgcaaattcagcgtgggcgtag

ccagcgtggtggtggccagcctggtgatgggtagcgtggtgcatgcgaccgaaaacgaaggcgcgacaca

ggttccgaccagcagcaatcgcgccaatgaaagccaggccgaacagggtgaacagccgaaaaagttagat

agcgaacgtgataaagcccgcaaagaagtggaagaatatgtgaagaagattgtgggtgaaagctacgcca

aaagcaccaaaaaacgccacaccattaccgtggcgctggtgaatgaactgaacaacattaagaatgagta

cctgaacaagatcgtggaaagcaccagcgaaagccagcttcagattctgatgatggaaagccgtagcaaa

gtggatgaagcggtgagcaagtttgaaaaagatagttcatcgagtagctcaagcgatagcagcaccaaac

cggaagccagcgataccgcaaaaccgaacaaacccaccgaaccgggcgaaaaagtggccgaagcgaaaaa

aaaagtggaagaagcggaaaaaaaagcgaaagatcagaaagaagaagatcgccgcaactatccgaccatt

acgtacaaaacgctcgaattggaaatcgcggaaagcgatgtggaagtcaagaaagctgaacttgagctag

tcaaagtgaaagcgaatgaaccgcgcgatgaacagaaaattaaacaggcggaagcggaggtcgaatccaa

gcaggcagaagccacccgcctgaaaaaaattaaaaccgaccgtgaagaagcggaagaagaagccaaacgt

cgcgcggatgcgaaagaacaaggtaaaccgaaaggtcgcgcgaaacgtggcgtaccgggtgaactggcga

ccccggataaaaaagaaaacgatgccaaaagcagcgattctagcgtgggcgaggaaacgcttccgagccc

gtcactgaaacctgagaaaaaggttgctgaagcggagaagaaagtggaagaagcgaaaaagaaagcggaa

gatcagaaagaagaggatcgccgtaactatccaaccaacacctataaaaccctggaactggaaatcgcag

aaagtgacgtggaagtgaagaaggctgaactagaactggtcaaagaagaagcgaaagaaccgcgcaacga

ggaaaaagtgaaacaggcgaaagcggaagtggaaagcaaaaaggctgaagcgactaggctggagaagatc

aaaacggatcgcaagaaagcggaggaagaagctaaacgtaaagcggcggaagaagataaagtgaaaagat

cttaatccggaatttcgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgtt

acaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggca

gtt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Группа изобретений относится к области генной инженерии, микробиологии, биотехнологии и иммунологии. Предложен иммунологически активный рекомбинантный белок PBD-CbpA с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, содержащий пептидогликан-связывающий домен (PBD) белка AtlA из Staphylococcus aureus и фрагмент поверхностного антигена CbpA из Streptococcus pneumoniae. Также предложен способ получения и иммобилизации рекомбинантного белка PBD-CbpA на бактериеподобных частицах. Получено иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного белка PBD-CbpA, иммобилизованного на бактериеподобных частицах, направленное на индукцию иммунного ответа против Streptococcus pneumoniae. Изобретение расширяет арсенал средств, используемых для профилактики пневмококковой инфекции. 3 н.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.

1. Рекомбинантный белок PBD-CbpA с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, обладающий иммуногенностью в отношении Streptococcus pneumoniae.

2. Способ получения рекомбинантного белка PBD-CbpA по п. 1, иммобилизованного на бактериеподобных частицах, который включает следующие этапы:

- получение рекомбинантного белка PBD-CbpA в составе клеточных экстрактов Escherichia coli, трансформированных экспрессионной плазмидой, которая содержит химерный ген с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, кодирующий рекомбинантный белок PBD-CbpA;

- получение бактериеподобных частиц, представляющих собой очищенный от клеточного содержимого пептидогликан бактерий родов Lactobacillus или Lactococcus;

- иммобилизацию рекомбинантного белка PBD-CbpA на бактериеподобных частицах за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации с последующей отмывкой от несвязавшихся бактериальных белков и получением целевого продукта.

3. Иммунобиологическое средство для профилактики пневмококковой инфекции на основе рекомбинантного белка PBD-CbpA, полученное способом по п. 2.