Способ повышения ингибирующей активности цефтазидима комплексом фенольных соединений Российский патент 2025 года по МПК A61K36/288 A61K31/05 A61P31/04 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к совместному применению антибиотика цефтазидима с комплексом фенольных соединений, извлеченных из Tarаxacum, в отношении клинических изолятов S.aureus и P.aeruginosa и может быть использовано в фармацевтике, вирусологии, медицине и ветеринарии.

В связи с широким распространением устойчивости микроорганизмов к существующим лекарственным препаратам потребность в разработке новых антибактериальных форм чрезвычайно велика. Использование комплексов фенольных соединений, отличающихся большим разнообразием, и антибиотиков может позволить получать антимикробные агенты разнообразной химической структуры и механизма действия, и обеспечить появления новых эффективных лекарственных средств. Совместное использование антибиотиков и других неантибиотических соединений, известных как антибиотические адъюванты, является общей стратегией, используемой для повышения активности антибиотиков и, таким образом, повышения восприимчивости резистентных штаммов бактерий.

Образующиеся смешанные или смешаннолигандные соединения могут мимикрировать и поступать в клетку по каналам, по которым идет транспорт биомолекул. Разрушаясь в клетке, они высвобождают антимикробный агент и облегчают его доступ к мишени действия.

Синергетический потенциал биологически активных веществ с традиционными противомикробными препаратами недостаточно изучен и может стать перспективным средством борьбы с возросшей антибиотикорезистентностью, поскольку количество бактериальных штаммов, устойчивых к этим агентам, увеличивается. Поэтому существует необходимость в исследованиях, касающихся спектра действия, дозировки, жизнеспособности клеток после лечения, среди других фармакологических аспектов этих соединений.

Предшествующий уровень изобретений.

Известен фитопрепарат скомплексованный с антибактериальным средством, состоящий из биологически активных веществ, экстрагированных из лекарственного растительного сырья, антибактериального средства, димексида и синтетического высокомолекулярного и низкомолекулярного полиэтиленоксидов, скомплексованных в форме адсорбционного сплава при следующем соотношении компонентов, мас.%: димексидный фитоэкстракт 1 : 10 5 - 15, полиэтиленоксид-карбовакс высокомолекулярный 20 - 40, антибактериальное средство или их смесь 0,5 - 1, полиэтиленоксид-олигомер низкомолекулярный - до 100. Препарат получают путем экстракции сырья абсолютным димексидом при температуре 90 - 100°С и интенсивом перемешивании в два приема: основная экстракция в течение 1 - 3 ч и после отделения вытяжки дополнительная 1 ч. Экстракт, отжатый от сырья под прессом, отстаивают 2 дня, фильтруют под прессом. В профильтрованном экстракте при той же температуре растворяют вначале полиэтиленоксиды, затем антибактериальные средства, предварительно растворенные в горячем димексиде (65 - 70°С), добавляют в раствор при температуре 70 - 90°С с учетом их термостабильности. Соотношение растительного сырья и экстрагента димексида 1 : 10. Недостатком данного способа является низкая технологичность указанных мероприятий, затрудняющая реализацию способа в реальных производственных условиях.

Известна фармацевтическая комбинированная композиция для лечения гнойных ран на основе фторхинолонов. Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к фармацевтическим композициям, применяемым при лечении обширных гнойно-некротических посттравматических, послеоперационных ран,обширных ожогов, а также ран после хирургического лечения острых гнойных заболеваний кожи и мягких тканей (абсцедирурющие фурункулы, карбункулы, маститы, гидрадениты, рожа и др.), при лечении больных с обширными атеросклеротическими ивенозными трофическими язвами, с синдромом диабетической стопы, осложненными инфекционным процессом, вызванным высокорезистентными грамположительными и грамотрицательными аэробными и анаэробными микроорганизмами, грибами, устойчивыми к подавляющему большинству антимикробных и противогрибковых препаратов. Первый вариант - композиция, содержащая фторхинолоны, более активные, чем офлоксазол, в сочетании с соответствующими целевыми добавками, расширяющими ее спектр действия. Второй вариант - это композиция офлоксацина в сочетании с соответствующими целевыми добавками, расширяющими спектр ее действия. Третий вариант - это композиция офлоксацина со стимулятором репаративного процесса и анестетиком в сочетании с соответствующими целевыми добавками. Предлагаемые композиции на основе фторхинолонов с вышеуказанными целевыми добавками инактивируют как грамположительные, так и грамотрицательные микроорганизмы, в том числе резистентные к антибиотикам, а также грибы и простейшие. Недостатком данного способа является высокая концентрация синтетических производных.

Известна ранозаживляющая противорубцовая мазь на основе капусты огородной (Brassica oleracea). Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к ранозаживляющей противорубцовой мази. Ранозаживляющая противорубцовая мазь, содержащая спиртовой экстракт листьев Brassica oleracea, вазелин, ланолин, лецинол, диоксидин (диоксисепт), лидокаин, гентамицин, витамин А (ретинола пальмитат), витамин Е (альфа-токоферола ацетат), фруктовые кислоты, отдушку, взятые в определенном соотношении компонентов, в котором экстракт листьев Brassica oleracea получен путем экстракции сырья 96% этиловым спиртом при соотношении сырье : экстрагент 1 : 5. Вышеописанная мазь обладает выраженными ранозаживляющими, противовоспалительными, регенерирующими свойствами, имеет оптимальную консистенцию при использовании. (Патент «Ранозаживляющая противорубцоваямазь на основе капустыогородной (brassica oleracea)», МПК A61K 36/31 (2006.01), A61K 9/06 (2006.01), A61P 17/02 (2006.01), опубл. 23.07.2019 Бюл. № 21). К недостаткам наружных ранозаживляющих препаратов относят большой расход медикаментов, ограниченность применения для патологий, требующих длительного лечения и осложненных гнойными выделениями.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения противовирусного средства на основе суммы флавоноидов из Alchemilla vulgaris L. Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению суммы флавоноидов из корней или надземной части Alchemilla vulgaris L. в качестве противовирусного средства в отношении РНК-содержащего вируса гриппа А и ДНК-содержащих ортопоксвирусов и вируса простого герпеса 2-го типа. Применение суммы флавоноидов из корней или надземной части Alchemilla vulgaris L. (манжетки обыкновенной), полученных путем экстракции корней этилацетатом, объединения этилацетатного экстракта, концентрирования его упариванием и осаждения концентрата в хлороформе или экстракции надземной части манжетки обыкновенной, собранной в начале цветения, этиловым спиртом с последующим объединением и упариванием экстракта, разведения его дистиллированной водой, очистки водного экстракта хлороформом, экстракции очищенного водного остатка этилацетатом, упаривания полученного экстракта и осаждения продукта хлороформом при определенных условиях, в качестве противовирусного средства в отношении РНК-содержащего вируса гриппа А и ДНК-содержащих ортопоксвирусов и вируса простого герпеса 2-го типа. Вышеописанная сумма флавоноидов эффективна в качестве противовирусного средства в отношении РНК-содержащего вируса гриппа А и ДНК-содержащих ортопоксвирусов и вируса простого герпеса 2-го типа. (Патент «Противовирусное средство на основе суммы флавоноидов из Аlchemilla Vulgaris L», МПК . A61K 36/73(2006.01), B01D 11/02(2006.01), A61P 31/12(2006.01), A61P 31/14(2006.01), A61P 31/16(2006.01), A61P 31/20(2006.01), A61P 31/22(2006.01), опубл. 10.04.2016 Бюл. № 10.) Недостатком данного способа является его ограниченная область применения, так как он эффективен только в отношении нескольких типов вирусов.

Проведенный патентно-информационный поиск показал, что отдельно взятые антибиотики или их комбинации встречаются в известных лечебных средствах подобного назначения, однако антибактериальное средство в предложенной совокупности ингредиентов и их соотношении в составе заявляемой композиции не были выявлены.

Техническим результатом заявляемого изобретения является смешаннолигандный антибактериальный комплекс, оказывающий аддитивное действие на бактериальные штаммы. Указанный технический результат достигается применением комплекса фенольных соединений, полученных из водно-спиртового экстракта Tarаxacum совместно с антибиотиком цефтазидимом в отношении клинических изолятов S. aureus и P. aeruginosa.

Суммарный комплекс фенольных соединений был получен из Tarаxacum методом гомогенизации растительного материала с последующим помещением его в круглодонную колбу с обратным холодильником, добавлением 96% этилового спирта из расчета 30 мл спирта на 1 г. сырья. Содержимое колбы кипятили на водяной бане в течение 50 минут с момента закипания водно-спиртовой смеси. Не допускалась утечка паров спирта при кипячении с обратным холодильником. По истечении указанного времени, колбу с растительным материалом охлаждали до комнатной температуры (23±1°С). Полученный экстракт фильтровали через фильтр Шотта в чистую колбу. Остаток растительного материала заливали 70% этанолом, кипятили обратным холодильником, остужали и фильтровали аналогичным способом.

Затем процедуру повторяли с добавлением 40% этанола.

На следующем этапе проводили очистку хлороформом от алколоидных примесей. Полученные очищенные водно-спиртовые извлечения переносили в круглодонную колбу со шлифом и упаривали досуха в роторном испарителе при температуре 40°С. Сухой остаток растворяли в подогретом 80 % этиловом спирте и хранили в холодильнике при –20°С. Исследование концентрации фенольных соединений в экстрактах определяли по методу Фолина-Чокальтеу.

Реактив Фолина-Чокальтеу готовили следующим способом: 5 г Na₂WO₄×2Н₂0 и 1,25 г Na₂МоО₄×2H₂0 помещали в круглодонную колбу на 200 мл, приливали 35 мл воды и хорошо перемешивали. К полученному раствору добавляли 2,5 мл 85%-ного раствора фосфорной кислоты и 5 мл концентрированной НСl (х.ч.). Колбу присоединяли к обратному холодильнику и кипятили в течение 10 ч. Затем в раствор добавляли 7,5 г Li₂S0₄, 5 мл воды и одну каплю брома. Раствор перемешивали и нагревали до удаления брома. После охлаждения объем доводили водой до 50 мл, фильтровали и разводили водой до получения 1 н. раствора кислоты. Полученный реактив имел соломенно-желтый цвет без оттенка зеленого. Наличие зеленого оттенка свидетельствовало бы о присутствии в нем продуктов реакции восстановления голубого цвета.

Для определения концентрации фенольных соединений в экстрактах строили калибровочную кривую. Готовили сток-раствор галловой кислоты 5 мг галловой кислоты растворяли в 10 мл 80 %-ного этанола. В соответствии с таблицей 1 в пробирки вносили определенные объемы сток – раствора галловой кислоты и добавляли 80% раствор этанола в объемах, необходимых для получения нужной концентрации. В первой пробирке – контроль.

В каждую из пробирок вносили 1,25 мл разведенного реактива Фолина – Чокальтеу 1 часть реактива – 9 частей воды. Через 3 минуты добавляли 1 мл 7,5 % раствора Na₂CO₃.

После добавления раствора Na₂CO₃ реакционная смесь приобретала синюю окраску, интенсивность которой была пропорциональна концентрации галловой кислоты в растворе. Пробирки встряхивали и оставляли на 2 часа.

По истечении времени проводили измерение оптической плотности на спектрофотометре ПЭ-5400 при длине волны 765 нм. По результатам строили калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрацию галловой кислоты в мг/л, по оси ординат – оптическую плотность раствора. Построение кривой осуществляли в трех повторностях.

Таблица 1 – Соотношение реактивов для построения калибровочной кривой методом Фолина-Чокальтеу

Концентрация, мг/л Объем сток-раствора галловой кислоты, мкл Объем 80% этанола для приготовления пробы, мкл Контроль,0 0,0 250 25 12,5 237,5 50 25 225 100 50 200 150 75 175 200 125 125

Для измерения концентрации фенольных соединений в экстрактах в пробирку помещали 0,25 мл исследуемого спиртового экстракта, в контрольную пробирку – 0,25 мл 80% этанола и затем во все пробирки добавляли по 1,25 мл разведенного реактива Фолина-Чокальтеу, а через 3 минуты по 1,0 мл Na₂CO₃.

Пробирки встряхивали и оставляли на 2 часа, после чего производили измерение оптической плотности при длине волны 765 нм. В качестве стандартного раствора использовали пробу «контроль».

Содержание фенольных соединений в экстракте определяли с помощью калибровочной кривой: графика проходящего через начало координат, отражающего зависимость оптической плотности ось ординат от концентрации ось абсцисс, содержащейся в них галловой кислоты.

Содержание внутриклеточных фенольных соединений в экстрактах рассчитывали по формуле 1:

F=(CF×Vэкстракта)/(m×1000),

где: F – общее содержание внутриклеточных фенольных соединений, мг-экв галловой кислоты/г сухого веса;

CF – концентрация фенольных соединений, рассчитанная по калибровочному графику, исходя из оптической плотности реакционных смесей, мг-экв. галловой кислоты/л;

V экстракта – общий объем экстракта, мл;

m – масса навески, г;

1000 – коэффициент перевода л в мл объем экстракта.

Оценка комплексного ингибирующего действия цефтазидима и фенольных соединений Tarаxacum осуществлялась с применением диффузионного метода агаровых лунок. Данный метод применялся для оценки индивидуальных, аддитивных и синергических эффектов противомикробного действия фенольных соединений Tarаxacum и антибиотика цефтазидима в отношении исследуемых бактериальных штаммов S.aureus и P.aeruginosa. Схема диффузионного метода агаровых лунок состояла в следующих действиях:

1) из чистых культур исследуемых микроорганизмов готовится суспензии;

2)в чистые чашки Петри с питательной средой (МПА) вносили по 135 мкл суспензии исследуемых микроорганизмов, далее проводили засевание «сплошным газоном» при помощи шпателя Дригальского;

3) используя пробойник, вырезаются 7 лунок по всей площади питательной среды, каждая лунка соответствует определенной концентрации вещества;

4) в лунки поочередно вносится по 30 мкл анализируемого антибактериального вещества; 5)проводят культивирование в термостате при 37°С в течении суток;6)оценивание ингибирующего действия осуществляли визуально с измерением диаметра зоны подавления роста бактерий.

Разведение концентраций антибактериальных веществ проводилось следующим образом. Заранее подготавливаются чистые пробирки. В первую пробирку вносится 5 мл дистиллированной воды, в остальные по 2,5 мл. Затем в первую пробирку добавляют необходимо количество исследуемого вещества, растворяют и хорошо перемешивают. Из первой пробирки переносят половину объема во вторую, из второй в третью и т.д. При этом каждый раз проводят пипетирование. В итоге получается серия разведений в каждой пробирке с двукратно убывающей концентрацией (таблица 2).

Таблица 2 - Экспериментальная оценка ингибирующих характеристик цефтазидима, комплекса фенольных соединений (Tarаxacum) и их комбинированного воздействия

S. aureus P. aeruginosa Концентрация, мг/л Зона ингибирования, Хср мм Концентрация, мг/л Зона ингибирования, Хср мм цефтазидим 0,00096 14,03+0,08 0,0608 12±0,46 0,00048 12,21±0,31 0,0304 10,16±0,23 0,00024 10,24±0,04 0,0152 8,13±0,22 0,00012 R 0,0076 R 0,00006 R 0,0038 R комплекс фенольных соединений ( Tarаxacum) 90 14,01±0,4 22,496 12,89±0,72 45 12,96±0,26 11,248 12,65±0,68 22,5 12,24±0,38 5,624 12,04±0,09 11,25 9,48±0,66 2,812 10,66±0,31 5,625 8,02±0,04 1,406 9,01±0,33 цефтазидим + комплекс фенольных соединений ( Tarаxacum) 0,00006/90 14,2±0,28 0,0038/22,496 14,04±0,50 0,00006/45 13,54±0,44 0,0038/11,248 12,98±0,34 0,00006/22,5 12,48±0,16 0,0038/5,624 12,3±0,17 0,00006/11,25 9,72±0,41*** 0,0038/2,812 10,80±0,56*** 0,00006/5,625 8,57±0,43*** 0,0038/1,406 9,05±0,23*** Примечание: ***p<0,001, по отношению к бактерицидной активности цефтазидима

В работе были скомбинирован комплекс антибиотик + сумма фенольных соединений из расчёта, что концентрация антибиотика составляла менее минимальной ингибирующей. Так в отношении P. aeruginosa исследуемый комплекс оказывает выраженное ингибирующее действие в концентрациях 0,0038 мг/л цефтазидима и 1,406 мг/л сумма фенольных соединений зона ингибирования роста 9,05±0,23 мм. В отношении S. aureus пороговые значения выраженного ингибирования роста 8,57±0,43 мм регистрируются при соотношении исследуемых веществ в концентрации 0,00006 мг/л цефтазидима и 5,625 мг/л сумма фенольных соединений достоверно превышающие уровень ингибирования роста в контрольных образцах моновалентного использования веществ в указанных концентрациях p<0,001 t-критерий Стьюдента.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ повышения ингибирующей активности цефтазидима комплексом фенольных соединений, включающий выделение комплекса фенольных соединений водно-спиртового экстракта из Tarаxacum методом гомогенизации растительного материала с последующей очисткой хлороформом от алколоидных примесей; затем полученные фенольные соединения смешивают с цефтазидимом в концентрациях: цефтазидим 0,0038 мг/л и фенольные соединения 1,406 мг/л в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa и цефтазидим 0,00006 мг/л и фенольные соединения 5,625 мг/л в отношении бактерий Staphylococcus aureus. Изобретение обеспечивает увеличение ингибирующих характеристик цефтазидима в отношении P. aeruginosa и S. aureus. 2 табл.

Способ повышения ингибирующей активности цефтазидима комплексом фенольных соединений, включающий выделение комплекса фенольных соединений водно-спиртового экстракта из Tarаxacum методом гомогенизации растительного материала, помещение его в круглодонную колбу с обратным холодильником, добавление 96% этилового спирта из расчета 30 мл спирта на 1 г сырья с последующим кипячением на водяной бане с обратным холодильником в течение 50 мин с момента закипания водно-спиртовой смеси; затем колбу с растительным материалом охлаждают до комнатной температуры 23±1°С, полученный экстракт фильтруют через фильтр Шотта; остаток растительного материала заливают 70% этанолом, кипятят с обратным холодильником, охлаждают и фильтруют; затем процедуру повторяют с добавлением 40% этанола с последующей очисткой хлороформом от алколоидных примесей; затем полученные фенольные соединения смешивают с цефтазидимом в концентрациях: цефтазидим 0,0038 мг/л и фенольные соединения 1,406 мг/л в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa и цефтазидим 0,00006 мг/л и фенольные соединения 5,625 мг/л в отношении бактерий Staphylococcus aureus.