ИНАКТИВИРОВАННЫЕ ТОКСИНЫ APXIA, APXIIA И APXIIIA Российский патент 2025 года по МПК C07K14/285 A61K39/102 C12N15/31 C12N15/63 A61P31/04 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к инактивированным токсинам ApxIA, ApxllA и ApxlllA, вакцинам, содержащим указанные инактивированные токсины, и их применению для иммунизации и защиты млекопитающих.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) представляет собой грам-отрицательные бактерии и является членом семейства Pasteurellaceae. APP представляет собой этиологический агент плевропневмонии свиней, тяжелого легочного заболевания свиней, которое вызывает сильные экономические потери в свиноводстве по всему миру. Заболевание характеризуется геморрагическим, фибринозным и некротическим поражением легких. Свиньи, которые выжили после заболевания, часто становятся бессимптомными носителями APP и являются основной причиной бактериальной диссеминации.

На данный момент идентифицировано 18 серотипов на основе антигенных свойств капсульных полисахаридов (КПС, CPS) и в результате генотипического анализа. Основные факторы вирулентности APP представляют собой экзотоксины, КПС, липополисахариды (ЛПС, LPS) и мембранные белки. Наиболее важные факторы вирулентности представляют собой экзотоксины Apx, которые принадлежат к порообразующим повторам в семействе токсинов (RTX). Известно, что токсины являются высокоиммуногенными и крайне необходимыми для получения защитного иммунитета против APP, связанного с плевропневмонией. По меньшей мере четыре различных токсина Apx продуцируются APP, обозначаемые как Apxl, Apxll, Apxlll и ApxIV. Apxl демонстрирует сильную, а Apxll демонстрирует низкую гемолитическую активность. Оба являются цитотоксическими и активными против широкого спектра клеток различных организмов-хозяев. Apxlll не является гемолитическим, но является крайне цитотоксическим, основными мишенями которого являются макрофаги и нейтрофилы альвеол свиней. ApxIV не демонстрирует цитотоксической и только очень слабую гемолитическую активность. Никакой из серотипов APP не продуцирует все четыре токсина Apx. Большинство серотипов продуцируют три токсина Apx. Схема продуцирования токсина Apx связана с вирулентностью, при этом серотипы 1, 5, 9 и 11 продуцируют Apxl и Apxll, являющиеся наиболее вирулентными.

По меньшей мере четыре гена отвечают за продуцирование и секрецию активных токсинов Apx. Ген A кодирует структурный токсин, а ген C кодирует ацилтрансферазу, необходимую для пост-трансляционной активации токсина. Гены B и D кодируют два мембранных белка, которые необходимы для секреции зрелого токсина. Гены Apx организованы как опероны. Опероны токсинов Apxl и Apxlll состоят из генов CABD, тогда как оперон Apxll содержит только гены CA. Следовательно, секреция ApxllA зависит от активных генов B и D оперона Apxl.

В настоящий момент плевропневмонию, возникающую вследствие инфекции APP свиней, обычно лечат антибиотиками. Однако, было установлено, что APP часто демонстрирует антибиотикоустойчивость к по меньшей мере одному из антибиотиков, обычно используемых для лечения инфекции APP.

Вакцинация против APP представляет собой перспективную профилактическую стратегию для профилактики плевропневмонии. На рынке имеется несколько вакцин. Коммерчески доступные вакцины являются или химически инактивированными цельноклеточными вакцинами, или субъединичными вакцинами, или их комбинацией. Иммунологическая реакция животных, вакцинированных цельноклеточными вакцинами, в основном направлена на поверхностные структуры, такие как КПС и ЛПС. Отсутствие секретируемых белков, таких как токсины Apx, которые, как известно, являются высокоиммуногенными и необходимыми для защиты, объясняет ограниченную защиту, наблюдаемую у бактериальных вакцин. Кроме того, цельноклеточные вакцины APP обеспечивают только гомологическую защиту против серотипа, используемого для получения вакцины.

Коммерчески доступная субъединичная вакцина (патент EP0453024 B1) содержит химически инактивированные токсины ApxA, а также наружный белок мембран. Инактивация токсинов ApxA денатурирующими веществами, такими как формальдегид, потенциально приводит к снижению иммуногенности токсоидов. Недостатками такой вакцины являются недостаточная защита вследствие денатурирующих токсинов, а также сопутствующие серьезные побочные реакции, вероятно, вследствие остаточной токсичности, из-за неполной инактивации токсинов ApxA. Следовательно, вследствие сниженной иммуногенности после инактивации необходимо использовать большие количества токсинов, что приводит к увеличению количеств загрязняющего ЛПС в вакцинах. Высокое содержание ЛПС может вызвать побочные эффекты, как это наблюдается для коммерческих субъединичных вакцин APP.

Можно сделать вывод, что имеющиеся на данный момент коммерческие вакцины не обладают удовлетворительными профилями безопасности и/или эффективности против инфекции APP.

Более того, существуют некоторые другие экспериментальные подходы к вакцинам APP.

В патентной заявке W02004045639 (Al) раскрыта живая ослабленная вакцина против плевропневмонии свиней, содержащая штамм APP, который модифицирован в трансмембранных доменах генов, кодирующих токсины ApxIA и ApxllA. Для определения степени ослабления свиней в возрасте три месяца прививали модифицированными живыми штаммами APP. Через семь дней после привития животных умерщвляли и регистрировали макроскопические поражения органов дыхания. Все животные продемонстрировали изменение поведения и поражения легких при вскрытии. Эффективность такой живой вакцины не изучали.

В патентной заявке EP0810283 (A2) и патенте EP0861319 (B1) описаны живые ослабленные штаммы APP, содержащие делеции в генах активатора ApxA apxC. Модифицированный штамм APP не продуцирует белок-активатор ApxC в функциональной форме, а следовательно токсины ApxIA и ApxllA не активировались ацилированием. Мышей вакцинировали штаммом ΔapxC и заражали вирулентными полевыми штаммами APP. Вакцинированные мыши были защищены от гомологического заражения и частично защищены от гетерологического заражения. Было выполнено одно исследование на свиньях. У 1 из 6 вакцинированных свиней наблюдались поражения легких после гетерологического заражения при вскрытии. Эти ослабленные живые вакцины, вероятно, являются эффективными, но такие вакцины несут риск безопасности. Вакцинные штаммы продуцируют токсины Apx, которые не активируются ацилированием вследствие отсутствия apxC. Однако эти токсины обладают исходной аминокислотной последовательностью токсического ApxA. Очень вероятно, что гетерологическая ацилтрансфераза может ацилировать ApxA, превращая его в его активную токсическую форму. На большинстве свиноферм по всему миру есть бессимптомные носители вирулентных штаммов APP, а также свиньи, инфицированные штаммами APP с низкой вирулентностью. Если таких свиней вакцинировали с помощью вакцинного штамма ΔapxC, неактивированные токсины ApxA вакцинного штамма могут быть активированы функциональными белками ApxC полевых штаммов. Кроме того, существуют возможность комплементации делеции apxC путем захвата функциональных генов apxC. Существует возможность того, что ослабленный штамм вновь станет патогенным, что приведет к заболеванию привитых животных.

На сегодняшний момент на рынке нет ослабленных живых вакцин.

Следовательно, существует необходимость в усовершенствованных вакцинах против APP, которые являются безопасными и способными индуцировать перекрестный иммунитет против всех существенных серотипов у свиней и/или поросят.

Следовательно, объектом данного изобретения является получение инактивированных токсинов ApxIA, ApxllA и ApxlllA и применение этих токсоидов в безопасных и эффективных субъединичной и живой вакцинах против плевропневмонии свиней.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении раскрыты модификации сайтов ацилирования токсинов ApxIA, ApxllA и ApxlllA для создания неактивных, но полностью иммуногенных токсоидных форм этих белков. Замена обеих аминокислот двух сайтов ацилирования на другие предотвращает их ацилирование. Следовательно, эти модифицированные токсины Apx не могут инициировать связывание с мембраной клетки-мишени и не обладают цитотоксической или гемолитической активностью. Нет необходимости химически инактивировать токсины, что дает высокоиммуногенные белки. Требуемое количество этих белков для получения эффективной субъединичной вакцины является относительно низким. Следовательно, содержание загрязняющего ЛПС также является относительно низким, что приводит к незначительным побочным эффектам, таким как лихорадка, рвота и апатия. Вследствие лучшей иммуногенности по сравнению с химически инактивированными субъединицами Apx, субъединичные вакцины по данному изобретению обеспечивают лучший профиль безопасности.

Кроме того, изобретение можно применять в живых вакцинах, поскольку замена двух аминокислот основана на генетической модификации генов apxA. Таким образом, они могут быть перенесены в штаммы APP, которые затем продуцируют инактивированные и высокоиммуногенные белки Apx. Эти штаммы можно использовать в качестве живых вакцин, которые продуцируют токсоиды ApxA, а также широкий спектр других белков APP. Эти вакцины индуцируют комплексный иммунный ответ и перекрестный иммунитет против широкого спектра серотипов APP. Вследствие генетической модификации генов apxA полученные токсоиды Apx не могут быть активированы гетерологичными ацилтрансферазами. Существует еще несколько преимуществ при использовании живых вакцинных штаммов APP. Ожидается, что влияние исходных антител на вакцину будет ниже при использовании живых вакцин по сравнению с субъединичными вакцинами, состоящими из высокоиммуногенных антигенов. Следовательно, с высокой вероятностью вакцину можно использовать для поросят возрастом до 6 недель, и существующий иммунологический пробел среди имеющихся вакцин будет устранен. Дополнительные нокауты генов можно использовать для получения еще более ослабленного вакцинного штамма и для использования нокаутов генов как маркеров, чтобы различить инфицированных и вакцинированных животных (DIVA), например, по делеции гена apxIVA. Следовательно, в этом изобретении предложен лучший профиль безопасности и эффективности, чем для всех известных подходов к получению вакцин. Поскольку APP сильно приспособлен к свиньям, ослабленный вакцинный штамм APP можно также использовать в качестве вектора для антигенов других патогенов, которые имеют отношение к свиньям.

Изобретение определено прилагаемой формулой изобретения.

Раскрыты полипептиды ApxIA, ApxllA или ApxlllA Actinobacillus pleuropneumoniae, в которых

a. аминокислотная последовательность

i. ApxIA дикого типа, как представлено в SEQ ID №:1, содержит по меньшей мере одну модифицированную аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K560 и K686,

ii. ApxllA дикого типа, как представлено в SEQ ID №:2, содержит по меньшей мере одну модифицированную аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K557 и N687, и

iii. ApxlllA дикого типа, как представлено в SEQ ID №: 3, содержит по меньшей мере одну модифицированную аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K571 и K702,

и по меньшей мере одна аминокислота заменена на аминокислоту, не подверженную ацилированию; или

b. аналог или фрагмент модифицированной аминокислотной последовательности, определенной в a., по меньшей мере на 90% гомологичен модифицированной аминокислотной последовательности, определенной в a., и фрагмент содержит по меньшей мере 50% аминокислот подряд модифицированной аминокислотной последовательности, определенной в a., и причем указанный аналог или фрагмент содержит аминокислоту, не подверженную ацилированию, как определено в a; или

c. аминокислотная последовательность

i. ApxIA дикого типа, как представлено в SEQ ID №:1, содержит делеции, содержащие по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K560 и K686,

ii. ApxllA дикого типа, как представлено в SEQ ID №:2, содержит делеции, содержащие по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K557 и N687, и

iii. ApxlllA дикого типа, как представлено в SEQ ID №:3, содержит делеции, содержащие по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K571 и K702,

при этом указанные делеции удаляют не более 50% аминокислотной последовательности дикого типа;

d. аналог аминокислотной последовательности, содержащий делеции, как определено в c., по меньшей мере на 90% гомологичен аминокислотной последовательности, содержащей делеции, как определено в c.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующие заголовки служат только для организации раскрытия, и их не следует рассматривать как отделяющие один раздел описания от другого раздела описания. Признаки каждого раздела можно объединять с признаками любого другого раздела.

ОБЩИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин «фрагмент или аналог», при использовании в данном документе, имеют следующие определения:

«Аналог» можно рассматривать как последовательность аминокислот, демонстрирующую уровень гомологичности, составляющий по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или 97% по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью. Гомология, при использовании в данном документе, означает идентичность. Таким образом последовательности могут отличаться друг от друга на основании консервативного замещения, делеции или вставки.

Степень идентичности можно определить с использованием программы для белков Blast с помощью алгоритма Blastp с параметрами по умолчанию, которые представляют собой, например, ожидаемый порог: 10, длина сегмента: 3, матрица: BLOMSUM62, цена гэпа: наличие: 11, расширение: 1, и композиционная корректировка: условная композиционная корректировка матрицы замен (BLAST представляет собой зарегистрированную торговую марку Национальной медицинской библиотеки). Программу можно использовать для поиска в белковой базе данных используя запрос по белку. Идентичность свидетельствует о точных совпадениях между выровненным запрашиваемым белком и последовательностями из базы данных.

Консервативные аминокислотные «замены» предпочтительно представляют собой результат замещения одной аминокислоты на другую аминокислоту с подобными структурными и/или химическими свойствами, т.е. консервативные замены аминокислот. Замены аминокислот могут быть выполнены на основе схожести в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфифильной природе вовлеченных остатков. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.

«Вставки» или «делеции», как правило, находятся в диапазоне около 1, 2 или 3 аминокислот. Разрешенный вариант может быть определен экспериментально путем систематического введения вставок или делеций аминокислот в белок с использованием рекомбинантных технологий ДНК и анализа активности полученных рекомбинантных вариантов. Это не требует более, чем обычных экспериментов для специалиста в данной области техники.

«Фрагмент» полипептида содержит по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 97% от исходного полипептида. Эти фрагменты можно использовать как исключительный активный ингредиент в вакцине в соответствии с данным изобретением.

«Токсин» APP представляет собой полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности ApxIA, ApxllA или ApxlllA (например, как представлено в SEQ ID №: 1-3) и демонстрирует цитотоксическую и/или гемолитическую активность. «Токсоид» в этом описании представляет собой полипептид, который представляет собой модифицированную форму «токсина», причем модификацию получают путем замещения или делеции аминокислоты, которая подвержена ацилированию, in vivo в APP, и не демонстрирует какой-либо цитотоксической или гемолитической активности.

Термин «содержащий», при использовании в данном документе в контексте композиции вакцины, означает, что могут присутствовать дополнительные активные или иммуногенные компоненты. «Состоящий из» означает, что не присутствует никаких дополнительных компонентов, а «состоящий по существу из» означает, что могут присутствовать конкретные дополнительные компоненты, а именно те, которые существенно не влияют на ключевые характеристики вакцины (т.е. неактивные или неиммуногенные ингредиенты).

Род Actinobacillus включает грам-отрицательные, неспорообразующие и в основном инкапсулированные бактериальные виды, которые колонизируются на поверхностях слизистых респираторной и мочеполовой систем. Релевантные для ветеринарии виды представляют собой, например, A. pleuropneumoniae, A. suis, A. equuli и A. lignieresii, которые являются предпочтительными видами Actinobacillus в этом описании. Род Actinobacillus обычно демонстрирует сильную специфичность к хозяину. Предпочтительные серотипы APP представляют собой серотипы 1, 5, 7, 8, 9 и 11.

ПОЛИПЕПТИДЫ

Описание относится к полипептидам ApxIA, ApxllA или ApxlllA (далее взаимозаменяемо обозначены как полипептиды ApxA для краткости), причем полипептиды ApxIA, ApxllA или ApxlllA дикого типа модифицированы путем замены или делеции аминокислот в положениях аминокислот, подверженных ацилированию в полипептиде дикого типа. При замещении аминокислоты вводится аминокислота, которая не подвержена ацилированию. Неожиданно было установлено, что полипептиды ApxIA, ApxllA или ApxlllA, модифицированные вышеописанным способом, более не демонстрируют гемолитическую и/или цитотоксическую активность. Таким образом, они могут проявлять меньше побочных эффектов при использовании для вакцинирования млекопитающего, при этом обеспечивая иммунологическую защиту от APP. Следовательно, их можно рассматривать как инактивированные токсины, т.е. токсоиды. Следовательно, полипептиды по изобретению можно применять безопасно в вакцинах для иммунизации субъектов, в частности млекопитающих, против инфекции APP.

Полипептиды, содержащие замены в положениях аминокислот, подверженных ацилированию, в полипептиде дикого типа

В частности описание относится к полипептиду ApxIA, ApxllA или ApxlllA Actinobacillus pleuropneumoniae, причем

a. аминокислотная последовательность

i. ApxlA дикого типа, как представлено в SEQ ID №: 1, содержит по меньшей мере одну модифицированную аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K560 и K686,

ii. ApxllA дикого типа, как представлено в SEQ ID №: 2, содержит по меньшей мере одну модифицированную аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K557 и N687, и

iii. ApxlllA дикого типа, как представлено в SEQ ID №: 3, содержит по меньшей мере одну модифицированную аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K571 и K702,

и по меньшей мере одна аминокислота заменена на аминокислоту, не подверженную ацилированию.

Полипептид может вызывать гуморальный и/или клеточный иммунологический ответ против одного или более серотипов APP у млекопитающего, в частности свиньи, при введении указанному млекопитающему. Полипептид может вызывать гуморальный и/или клеточный иммунологический ответ против одного или более штаммов APP, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 штаммов APP, у млекопитающего, в частности свиньи, при введении указанному млекопитающему. Предпочтительно, полипептиды вызывают стерильный иммунитет против APP, штаммов APP или серотипов APP.

Каждый из ApxIA, ApxllA или ApxllIA содержит две аминокислоты, которые подвержены ацилированию. Модификации могут затрагивать одну или обе указанные аминокислоты.

Описание также относится к аналогу и/или фрагменту модифицированной аминокислотной последовательности, определенной выше, который по меньшей мере на 90% гомологичен модифицированной аминокислотной последовательности, определенной выше, и фрагмент содержит по меньшей мере 50% аминокислот подряд модифицированной аминокислотной последовательности, определенной выше, и аналог или фрагмент содержит аминокислоту, не подверженную ацилированию, как определено выше.

Как определено выше, аналог может отличаться от дикого типа за счет делеций или консервативных замен. Однако аналог всегда содержит те аминокислоты, которые заменяют аминокислоты, подверженные ацилированию.

Поскольку модифицированный полипептид не содержит аминокислоты, подверженные ацилированию, модифицированный полипептид не может быть ацилирован. Полипептиды, модифицированные таким образом, не могут быть ацилированы с помощью любой эндогенной или экзогенной ацилтрансферазы (например, ApxC Actinobacillus pleuropneumoniae). Как экспериментально показано ниже, такие модифицированные полипептиды больше не проявляют значительных патологических эффектов и, следовательно, могут безопасно использоваться в композициях вакцин. Эти модифицированные полипептиды являются более безопасными для применения в композициях вакцин, чем вакцины, в которых удалена ацилтрансфераза ApxC, поскольку они остаются патологическими, даже если ацилтрансфераза поступает извне, или за счет встречающегося в природе штамма APP, или за счет любого другого источника ацилтрансферазы in vivo. Те же рассуждения применяются к следующим полипептидам, в которых одна или две аминокислоты APP, которые подвержены ацилированию, удалены.

Полипептиды, содержащие делеции в положениях аминокислот, подверженных ацилированию, в полипептиде дикого типа

Вместо замены аминокислот, подверженных ацилированию, в полипептиде дикого типа, аминокислоты также можно удалить, чтобы ликвидировать патологические эффекты полипептида дикого типа.

Следовательно, описание также относится к полипептиду ApxIA, ApxllA или ApxlllA Actinobacillus pleuropneumoniae, при этом аминокислотная последовательность

i. ApxIA дикого типа, как представлено в SEQ ID №:1, содержит делеции, содержащие по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K560 и K686,

ii. ApxllA дикого типа, как представлено в SEQ ID №:2, содержит делеции, содержащие по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K557 и N687, и

iii. ApxlllA дикого типа, как представлено в SEQ ID №:3, содержит делеции, содержащие по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K571 и K702.

Полипептид может вызывать гуморальный и/или клеточный иммунологический ответ против одного или более серотипов APP у млекопитающего, в частности свиньи, при введении указанному млекопитающему. Полипептид может вызывать гуморальный и/или клеточный иммунологический ответ против одного или более штаммов APP, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 штаммов APP, у млекопитающего, в частности свиньи, при введении указанному млекопитающему. Предпочтительно, полипептиды вызывают стерильный иммунитет против APP, серотипов APP, штаммов APP или серотипов APP.

Как указано выше, каждый из ApxIA, ApxIIA или ApxIIIA содержит две аминокислоты, которые подвержены ацилированию. Делеция указанных аминокислот может включать одну или обе из указанных аминокислот.

Следовательно, делеции могут включать точечные делеции, при этом удаляют только любую одну или две аминокислоты, подверженные ацилированию, в каждой последовательности дикого типа. Также предусмотрено, что делециями также удаляют аминокислоты в области, смежной с одной или двумя аминокислотами, подверженными ацилированию. Таким образом, соответствующие делеции могут включать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 350, 400 аминокислот при условии, что делеция содержит одну из двух аминокислот, подверженных ацилированию. Размер делеции для каждой аминокислоты, подверженной ацилированию, может не зависеть от других или иметь такой же размер. Также рассматриваются делеции, которые охватывают непрерывный участок аминокислот между двумя аминокислотами, подверженными ацилированию.

Делеции удаляют не более 50% аминокислотной последовательности дикого типа.

Описание также относится к аналогу модифицированной аминокислотной последовательности, определенной выше, который по меньшей мере на 90% гомологичен модифицированной аминокислотной последовательности, определенной выше, и аналог не содержит аминокислоту, не подверженную ацилированию, как определено выше. Такой аналог может содержать консервативные замены и делеции, как определено в разделе, который относится к общим определениям. Таким образом, полипептид может содержать дополнительные делеции за пределами удаленного участка, содержащего одну или две аминокислоты, подверженные ацилированию, но эти делеции будут удалять только 1, 2, 3 аминокислоты.

АМИНОКИСЛОТЫ, НЕ ПОДВЕРЖЕННЫЕ АЦИЛИРОВАНИЮ

Аминокислоты, подверженные ацилированию, представляют собой встречающиеся в природе аминокислоты, например лизин и/или аспарагин. Аминокислоты, не подверженные ацилированию, известны специалисту в данной области техники и могут использоваться для замены одной или обеих аминокислот, подверженных ацилированию. Например, аминокислота, не подверженная ацилированию, может быть независимо выбрана из группы, состоящей из аланина, глицина, изолейцина, лейцина, метионина, валина, серина, треонина, аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты, гистидина, аспарагиновой кислоты, цистеина, пролина, фенилаланина, тирозина, триптофана и глутаминовой кислоты. В частности, аминокислота, не подверженная ацилированию, может быть независимо выбрана из группы, состоящей из аланина, глицина, серина, треонина, валина, изолейцина и лейцина.

Кроме того, аминокислота, не подверженная ацилированию, может быть независимо выбрана из группы, состоящей из аланина, глицина и серина. Наиболее предпочтительная аминокислота, не подверженная ацилированию, представляет собой аланин.

ПОЛИПЕПТИД APXIA, APXIIA ИЛИ APXIIIA С ДВУМЯ МОДИФИЦИРОВАННЫМИ АМИНОКИСЛОТАМИ

Предпочтительно, в каждом из ApxIA, ApxllA или ApxlllA модифицированы две аминокислоты, подверженные ацилированию.

Следовательно, последовательность ApxIA дикого типа, как представлено в SEQ ID №:1, модифицирована в K560 и K686. Следовательно, последовательность ApxllA дикого типа, как представлено в SEQ ID №:2, модифицирована в K557 и N687. Следовательно, последовательность ApxlllA дикого типа, как представлено в SEQ ID №: 3, модифицирована в K571 и K702.

Раскрыто также то, что указанные две аминокислоты, подверженные ацилированию, в каждом из ApxIA, ApxllA или ApxlllA изменены на аланин.

Таким образом, раскрытый модифицированный полипептид может иметь последовательность, представленную в SEQ ID №: 4, 5 или 6, или представляет собой ее аналог или фрагмент, как определено выше.

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Также раскрыты нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, способной кодировать описанные выше полипептиды. Раскрытая нуклеиновая кислота может представлять собой кДНК, ДНК, РНК, кРНК или ПНК (пептидо-нуклеиновая кислота). Термин «последовательность нуклеиновой кислоты» относится к гетерополимеру нуклеотидов последовательности этих нуклеотидов. Нуклеиновая кислота может содержать нуклеиновую кислоту, представленную в SEQ ID №: 10, 11 или 12.

Нуклеиновая кислота может входить в состав вектора, пригодного для клонирования или экспрессирования нуклеиновых кислот по изобретению. Иллюстративные векторы представляют собой pEX-A258 (SEQ ID №: 19), pQE-80L (SEQ ID №: 20) или pQE-60 (SEQ ID №: 21). Нуклеиновые кислоты или векторы могут содержать дополнительные регулирующие некодирующие элементы, такие как индуцируемые или не-индуцируемые промоторы, операторы (например, lac-оператор), или нуклеиновые кислоты, кодирующие другие белки AP. Дополнительно, предпочтительно, чтобы композиция вакцины в соответствии с данным изобретением дополнительно характеризовалась полинуклеотидом, который интегрирован в вектор, при этом полинуклеотид функционально связан областью контроля экспрессии в векторе. Таким образом, также описан экспрессионный вектор, при этом экспрессионный вектор предпочтительно содержит одну или более регуляторных последовательностей в дополнение к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим модифицированные формы ApxA. Термин «экспрессионный вектор» в общем относится к плазмиде, или фагу, или вирусу, или вектору для экспрессии полипептида из последовательности ДНК (РНК). Экспрессионный вектор может содержать единицу транскрипции, содержащую сборку из (1) генетического элемента или элементов с регуляторной ролью при экспрессии гена, например промоторы или энхансеры, (2) структурной или кодирующей последовательности, которая транскрибируется в мРНК и транслируется в белок, и (3) соответствующих последовательностей начала или конца транскрипции. Структурные единицы, предназначенные для применения в дрожжевых или эукариотических экспрессионных системах, предпочтительно включают лидерную последовательность, которая делает возможной внеклеточную секрецию транслируемого белка клеткой-хозяином. Альтернативно, когда рекомбинантный белок экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, он может включать N-концевой метиониновый остаток. Этот остаток затем может отщепляться или не отщепляться от экспрессионного рекомбинантного белка, чтобы получить конечный продукт.

МИКРООРГАНИЗМЫ

Также раскрыты микроорганизмы, содержащие раскрытые нуклеиновые кислоты и/или вектора, описанные выше. Микроорганизмы могут представлять собой Escherichia coli (E. coli), штамм E. coli, например штамм ToplOF' E. Coli,, или Actinobacillus pleuropneumoniae, штамм Actinobacillus pleuropneumoniae, например ST2 (например, APP23), ST2 (например, 07/07), ST5 (например, DZY47), ST7 (например, DZY33) или ST8 (например, DZY49). Микроорганизмы также включают нуклеиновые кислоты и/или векторы, кодирующие другие гены.

КОМПОЗИЦИЯ ВАКЦИНЫ

Также раскрыта композиция вакцины, содержащая по меньшей мере один модифицированный полипептид ApxIA, ApxllA или ApxlllA, как определено выше, молекулу нуклеиновой кислоты, как определено выше, или вектор, как определено выше, или микроорганизм, как определено выше. Композиция вакцины может содержать по меньшей мере фармацевтический носитель, разбавитель и/или адъювант.

Получение композиции вакцины в соответствии с изобретением известно в данной области техники и описано в справочных руководствах, известных специалисту в данной области техники. Для получения композиции вакцины в соответствии с данным изобретением используют фармацевтически приемлемые носители, разбавители или адъюванты, которые включают, но не ограничиваются следующим: адъюванты на основе минеральных солей (например, на основе алюминия, кальция, железа, циркония), поверхностно-активные адъюванты (например, Quil A, QS-21, другие сапонины), адъюванты, полученные из бактерий (например, N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамин (MDP), липополисахариды (ЛПС), монофосфориллипид A, димиколат трегалозы (TDM), ДНК, CpGs, бактериальные токсины), эмульгирующие адъюванты (например, FIA, Montanide, адъювант 65, Lipovant), липосомные адъюванты, полимерные адъюванты и носители, цитокины (например, гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор), углеводные адъюванты, живые системы доставки антигенов (например, бактерии, особенно модифицированные APP). Более того, носители также могут включать сухие составы, такие как покрытые пластыри, выполненные из титана или полимера. Способы получения составов и введения вакцин по данному изобретению можно также найти в "Remington, The Science and Practice of Pharmacy", 22-е издание.

Композиция вакцины в виде единичной композиции может содержать 0,01-2,0 мг белка, 0,01-2,0 мг нуклеиновой кислоты или 0,5-200 мг (или 1x10⁴ КОЕ-1x10¹⁰КОЕ, колониеобразующих единиц) микроорганизмов. Необходимое активное количество белка, нуклеиновой кислоты или микроорганизма может определяться рутинными способами тестирования специалистом в данной области техники, например у свиней или поросят.

Композиция вакцины, содержащая по меньшей мере один полипептид ApxIA, ApxllA или ApxlllA, как описано выше, может представлять собой субъединичную вакцину. Субъединичная вакцина может содержать дополнительные полипептиды APP.

Также подразумевается, что вакцина содержит по существу только нуклеиновую кислоту или вектор, например, представляет собой ДНК вакцину. ДНК вакцины представляют собой третье поколение вакцин. Вакцины на основе нуклеиновых кислот или ДНК содержат ДНК/нуклеиновые кислоты, которые кодируют конкретные белки (ApxAs) от APP. ДНК/нуклеиновую кислоту вводят в организм млекопитающего, и она поглощается клетками, нормальные метаболические процессы которого синтезируют белки на основе генетического кода в нуклеиновой кислоте, которую они поглотили. Поскольку эти белки содержат области аминокислотных последовательностей, которые являются характерными для APP, они распознаются как чужеродные агенты, и когда они процессируются клетками-хозяевами и отображаются на их поверхности, иммунная система активизируется, что затем запускает иммунные ответы.

Альтернативно, нуклеиновая кислота может быть заключена в белок для облегчения вхождения в клетку. Если этот капсидный белок включен в нуклеиновую кислоту, полученная вакцина может объединять активность живой вакцины без рисков «обратного переключения».

Микроорганизмы, как описано выше, в композиции вакцины, могут представлять собой род Actinobacillus, например Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, штамм бактерий рода Actinobacillus, например штамм Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis или конкретный серотип штамма бактерий рода Actinobacillus. Композиция вакцины может содержать по меньшей мере 1, например 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 штаммов бактерий рода Actinobacillus или серотипов штаммов бактерий рода Actinobacillus. Каждый из серотипов, штаммов или бактерий рода Actinobacillus может кодировать по меньшей мере один полипептид, как определено выше.

Микроорганизм, как описано выше, в композиции вакцины, может не содержать нуклеиновые кислоты APP, кодирующие белки APP, которые отличаются от описанных модифицированных полипептидов ApxIA, ApxllA или ApxlllA. Например, микроорганизм может содержать делеции гена apxlV или/и гена sxy.

Кроме того, по меньшей мере один из Actinobacillus pleuropneumoniae в композиции вакцины может содержать одну или по меньшей мере две из следующих модификаций (например, единичная или множественные делеции): ΔtbpA, ΔtonB2, ΔsodC, ΔdsbA, Δfur, ΔmlcA, ΔmglA, ΔexbB, ΔureC, вариант с двумя мутациями ΔexbB ΔureC, ΔfhuA, ΔhlyX, вариант с двумя мутациями ΔapxIC и ΔapxllC, вариант с тремя мутациями ΔapxIC ΔapxllC Δorf1, вариант с шестью мутациями ΔapxllA ΔureC ΔdmsA ΔhybB ΔaspA Δfur, вариант с двумя мутациями ΔapxlllB ΔapxlllD, вариант с двумя мутациями ΔcIpP и ΔapxllC, ΔznuA, ΔapfA, вариант с двумя мутациями ΔapxllA и ΔureC, вариант с пятью мутациями ΔapxIC ΔapxllC Δorfl ΔcpxAR ΔarcA, вариант с двумя мутациями ΔapxIC ΔompP2, вариант с двумя мутациями ΔapxllC ΔapxIVA, инактивированный apxllC, инактивированный apxIC, Δlip40, ΔcpxA/cpxR, ΔpotD2, ΔtolC2, ΔsapA или ΔPdxS/PdxT.

Токсоидная форма ApxIA, а также композиция вакцины, содержащая по меньшей мере один полипептид ApxIA, ApxllA или ApxlllA, как раскрыто выше, демонстрирует значительно возросшую иммуногенность и профилактическую эффективность. Токсоидная форма ApxIA , а также композиция вакцины, содержащей по меньшей мере один полипептид ApxIA, ApxllA или ApxlllA, как описано выше, не демонстрирует цитотоксического эффекта и гемолитического эффекта и не вызывает значительного повышения температуры тела после иммунизации, которое может наблюдаться после традиционной иммунизации.

Вышеуказанные модификации описаны в:

Baltes, Nina; Hennig-Pauka, Isabel; Gerlach, Gerald-F (2002): Both transferrin binding proteins are virulence factors in Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 7 infection. В FEMS microbiology letters 209 (2), pp. 283-287,

Sheehan, B. J.; Bosse, J. T.; Beddek, A. J.; Rycroft, A. N.; Kroll, J. S.; Langford, P. R. (2003): Identification of Actinobacillus pleuropneumoniae Genes Important for Survival during Infection in Its Natural Host. В Infection and immunity 71 (7), pp. 3960-3970. DOI: 10.1128/IAI.71.7.3960- 3970.2003,

Baltes, N.; Tonpitak, W.; Gerlach, G. F.; Hennig-Pauka, I.; Hoffmann-Moujahid, A.; Ganter, M.; Rothkötter, H. J. (2001): Actinobacillus pleuropneumoniae iron transport and urease activity. Effects on bacterial virulence and host immune response. В Infection and immunity 69 (1), pp. 472-478. DOI: 10.1128/IAI.69.1.472-478.2001,

Jacques, Mario (2004): Surface polysaccharides and iron-uptake systems of Actinobacillus pleuropneumoniae. В Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire 68 (2), pp. 81-85,

Baltes, Nina; N'diaye, Mohamed; Jacobsen, Ilse D.; Maas, Alexander; Buettner, Falk F. R.; Gerlach, Gerald-F (2005): Deletion of the anaerobic regulator HlyX causes reduced colonization and persistence of Actinobacillus pleuropneumoniae in the porcine respiratory tract. В Infection and immunity 73 (8), pp. 4614-4619. DOI: 10.1128/IAI.73.8.4614-4619.2005,

Lin, Liwen; Bei, Weicheng; Sha, Yonggang; Liu, Jinlin; Guo, Yi; Liu, Weihong et al. (2007): Construction and immunogencity of a DeltaapxIC/DeltaapxllC double mutant of Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 1. В FEMS microbiology letters 274 (1), pp. 55-62. DOI: 10.1111/j.1574-6968.2007.00813.x,

Yuan, Fangyan; Liu, Jinlin; Guo, Yi; Tan, Chen; Fu, Shulin; Zhao, Jin et al. (2011): Influences of 0RF1 on the virulence and immunogenicity of Actinobacillus pleuropneumoniae. В Current microbiology 63 (6), pp. 574-580. DOI: 10.1007/s00284-011-0016-0,

Maas, Alexander; Jacobsen, Ilse D.; Meens, Jochen; Gerlach, Gerald-F (2006): Use of an Actinobacillus pleuropneumoniae multiple mutant as a vaccine that allows differentiation of vaccinated and infected animals. В Infection and immunity 74 (7), pp. 4124-4132. DOI: 10.1128/IAI.00133-06,

Park, Changbo; Ha, Yooncheol; Kim, Soohee; Chae, Chanhee; Ryu, Doug-Young (2009): Construction and characterization of an Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2 mutant lacking the Apx toxin secretion protein genes apxlllB and apxlllD. В The Journal of veterinary medical science 71 (10), pp. 1317-1323,

Xie, Fang; Li, Gang; Zhou, Long; Zhang, Yanhe; Cui, Ning; Liu, Siguo; Wang, Chunlai (2017): Attenuated Actinobacillus pleuropneumoniae double-deletion mutant S-8AclpP/apxllC confers protection against homologous or heterologous strain challenge. В BMC veterinary research 13 (1), p. 14. DOI: 10.1186/S12917-016-0928-9,

Yuan, Fangyan; Liao, Yonghong; You, Wujin; Liu, Zewen; Tan, Yongqiang; Zheng, Chengkun et al. (2014): Deletion of the znuA virulence factor attenuates Actinobacillus pleuropneumoniae and confers protection against homologous or heterologous strain challenge. В Veterinary microbiology 174 (3-4), pp. 531-539. DOI: 10.1016/j.vetmic.2014.10.016,

Zhou, Yang; Li, Lu; Chen, Zhaohui; Yuan, Hong; Chen, Huanchun; Zhou, Rui (2013): Adhesion protein ApfA of Actinobacillus pleuropneumoniae is required for pathogenesis and is a potential target for vaccine development. В Clinical and vaccine immunology: CVI 20 (2), pp. 287-294. DOI: 10.1128/CVI.00616-12,

Tonpitak, Walaiporn; Baltes, Nina; Hennig-Pauka, Isabel; Gerlach, Gerald F. (2002): Construction of an Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2 prototype live negative-marker vaccine. В Infection and immunity 70 (12), pp. 7120-7125,

Yuan, Fangyan; Liu, Jinlin; You, Wujin; Bei, Weicheng; Wang, Chunlai; Zhao, Jin et al. (2018): Generation, safety and immunogenicity of an Actinobacillus pleuropneumoniae quintuple deletion mutant SLW07 (ΔapxICΔapxllCΔorf1ΔcpxARΔarcA). В Vaccine 36 (14), pp. 1830-1836. DOI: 10.1016/j.vaccine.2018.02.083,

Liu, Qiong; Gong, Yuheng; Cao, Yuqin; Wen, Xintian; Huang, Xiaobo; Yan, Qigui et al. (2013): Construction and immunogenicity of a ΔapxlC/ompP2 mutant of Actinobacillus pleuropneumoniae and Haemophilus parasuis. В The Onderstepoort journal of veterinary research 80 (1), p. 519. DOI: 10.4102/ojvr.v80i1.519,

Liu, Jinlin; Chen, Xia; Lin, Liwen; Tan, Chen; Chen, Yan; Guo, Yi et al. (2007): Potential use an Actinobacillus pleuropneumoniae double mutant strain DeltaapxllCDeltaapxIVA as live vaccine that allows serological differentiation between vaccinated and infected animals. В Vaccine 25 (44), pp. 7696-7705. DOI: 10.1016/j.vaccine.2007.07.053,

Bei, Weicheng; He, Qigai; Yan, Lin; Fang, Liurong; Tan, Yadi; Xiao, Shaobo et al. (2005): Construction and characterization of a live, attenuated apxllCA inactivation mutant of Actinobacillus pleuropneumoniae lacking a drug resistance marker. В FEMS microbiology letters 243 (1), pp. 21-27. DOI: 10.1016/j.femsle.2004.11.033,

Xu, Fu-Zhou; Shi, Ai-Hua; Chen, Xiao-Ling; Yang, Bing; Wang, Jin-Luo (2007): Construction and immunogenicity of an attenuated mutant of Actinobacillus pleuropneumoniae by insertional inactivation of apxIC. В Wei sheng wu xue bao = Acta microbiologica Sinica 47 (5), pp. 923-927,

Prideaux, C. T.; Lenghaus, C.; Krywult, J.; Hodgson, A. L. (1999): Vaccination and protection of pigs against pleuropneumonia with a vaccine strain of Actinobacillus pleuropneumoniae produced by sitespecific mutagenesis of the Apxll operon. В Infection and immunity 67 (4), pp. 1962-1966,

Liu, 2018 Outer Membrane Lipoprotein Lip40 Modulates Adherence, Colonization, and Virulence of Actinobacillus pleuropneumoniae. Front Microbiol. 2018 Jul 3;9:1472. doi: 10.3389/fmicb. 2018.01472,

Li, 2018 The CpxA/CpxR Two-Component System Affects Biofilm Formation and Virulence in Actinobacillus pleuropneumoniae. Front Cell Infect Microbiol. 2018 Mar 20;8:72. doi: 10.3389/fcimb. 2018.00072,

Zhu 2017 Polyamine-binding protein PotD2 is required for stress tolerance and virulence in Actinobacillus pleuropneumoniae. Antonie Van Leeuwenhoek. 2017 Dec;110(12):1647-1657. doi: 10.1007/S10482-017-0914-7,

Li 2017 TolC2 is required for the resistance, colonization and virulence of Actinobacillus pleuropneumoniae. J Med Microbiol. 2017 Jul 31. doi: 10.1099/jmm.0.000544,

Xie 2017 The SapA Protein Is Involved in Resistance to Antimicrobial Peptide PR-39 and Virulence of Actinobacillus pleuropneumoniae. Front Microbiol. 2017 May 10;8:811. doi: 10.3389/fmicb.2017.00811, и

Xie 2017 Pyridoxal phosphate synthases PdxS/PdxT are required for Actinobacillus pleuropneumoniae viability, stress tolerance and virulence. PLoS One. 2017 Apr 27;12(4):e0176374. doi: 10.1371/journal.pone.0176374.

Ожидается, что комбинация модифицированных полипептидов, как описано в данном документе, с дополнительными известными модификациями, перечисленными выше, будет приводить к синергетическому ослаблению Actinobacillus pleuropneumoniae.

МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ИЛИ СПОСОБ

Описанную композицию вакцины можно использовать при профилактике, метафилактике или лечении пневмонии, плеврита или плевропневмонии, в частности пневмонии, плеврита или плевропневмонии, вызванных Actinobacillus pleuropneumoniae у субъекта. Субъект, подлежащий лечению, представляет собой млекопитающее, в частности свинью. Композицию вакцины можно вводить внутримышечно, внутрикожно, внутривенно, подкожно или нанесением на слизистую (например, интраназально).

Композицию вакцины можно вводить путем по меньшей мере одного, например, одного или двух введений с использованием единичной композиции, как описано выше. В частности, композицию можно вводить в первый раз в день рождения, через 3 дня, через 1 неделю, 2 недели, 4 недели, 6 недель, 8 недель, 10 недель или 12 недель после рождения субъекта. Следовательно, вакцину предпочтительно можно вводить в ранний момент жизни млекопитающего. Однако, также предполагается, что вакцину можно вводить в любой момент жизни млекопитающего.

Композицию вакцины можно вводить во второй раз, при этом период времени между двумя введениями может составлять от 1 до 4 недель, от 1 до 3 недель или от 1 до 2 недель. Композицию вакцины, содержащей микроорганизм, предпочтительно вводить только один раз.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1 иллюстрирует осуществление анализа цитотоксичности с использованием клеток BL-3 и токсинов ApxA, выделенных из супернатантов APP.

Фигура 2 иллюстрирует цитотоксический анализ с клетками BL-3 и генетически модифицированным токсином ApxIA и токсином ApxIA дикого типа (A) и генетически модифицированным токсином ApxlllA и токсином ApxlllA дикого типа (B).

Фигура 3 иллюстрирует осуществление анализа на гемолиз с использованием крови овцы и токсинов ApxA, выделенных из супернатантов APP.

Фигура 4 иллюстрирует анализ на гемолиз с использованием крови овцы и генетически модифицированного токсина ApxIA и токсина ApxIA дикого типа.

Фигура 5: ректальная температура тела через 6 часов после первой вакцинации (A) и второй вакцинации (B). Каждая точка представляет ректальную температуру тела отдельного животного. Столбцы представляют медианы с 95%-ым доверительным интервалом. Критерий множественных сравнений Данна; * = p < 0,05; ** = p < 0,01.

Фигура 6: Количественное определение IgG, специфичных к ApxIA, ApxllA и ApxIIIA, в сыворотке свиней. IgG, связывающийся с различными антигенами, количественно определяли с использованием ELISA. Анализировали сыворотку свиней из различных групп до вакцинации (д0), через 2 недели после первой вакцинации (д14) и через 2 недели после второй вакцинации (д28). Рассчитанные средние значения IgG для групп для каждого момента времени сравнивали с соответствующим моментом времени для группы 1. Критерий множественных сравнений Данна; * = p < 0,05; ** = p < 0,01. Столбцы представляют медианы. Отн. ед.: относительные единицы.

Фигура 7: Анализ сывороточной нейтрализации с использованием 6 пг активного токсина ApxIA и сыворотки от свиней через две недели после второй вакцинации. Жизнеспособность клеток оценивали с использованием WST-1, который метаболизировался метаболически активными клетками. Легенда отображает количества животных, а в скобках данные ELISA относительно IgG, специфичного к ApxlA, (A). X-величины (концентрации сыворотки) ymax/2 рассчитывали с помощью криволинейных регрессионных кривых (B). Критерий множественных сравнений Данна; ** = p < 0,01; n.s. = не значимо. Столбцы представляют медианы. Отн. ед.: относительные единицы.

Фигура 8: Суммарные клинические показатели после заражения сероваром 9 APP в трех группах, получающих «вакцину 1» (группа 1), Porcilis® APP (группа 2) или плацебо (группа 3). Суммарные клинические показатели сравнивали с соответствующим клиническим показателем группы 3. Критерий множественных сравнений Данна; * = p < 0,05; ** = p < 0,01. Столбцы представляют медианы.

Фигура 9: Выживаемость свиней после заражения сероваром 9 APP в трех группах, получающих «вакцину 1» (группа 1), Porcilis® APP (группа 2) или плацебо (группа 3). Выживаемость в процентах представляет собой 100% для группы 1 и группы 2, тогда как 37,5% животных в группе 3 умерли или были умерщвлены в соответствии с требованиями содержания животных из-за тяжелых симптомов, вызванных APP.

Фигура 10: Показатели поражения легких после заражения сероваром 9 APP в трех группах, получающих «вакцину 1» (группа 1), Porcilis® APP (группа 2) или плацебо (группа 3). Показатели поражения легких группы 1 и группы 2 сравнивали с соответствующим показателем поражения легких контрольной группы (группа 3). Критерий множественных сравнений Данна; * = p < 0,05; ** = p < 0,01. Столбцы представляют медианы.

ПРИМЕРЫ

В следующих примерах представлены экспериментальные данные, которые объясняют данное изобретение, и их необходимо понимать только в качестве иллюстрации изобретения. В частности, подразумевается, что каждый конкретный признак, раскрытый в примерах, можно объединить с признаками предшествующей части описания.

ПРИМЕР 1: КЛОНИРОВАНИЕ APXIA, APXIIA ИЛИ APXIIIA ДИКОГО ТИПА ИЛИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ В PEX-A258

Последовательности белков ApxlA-ApxlllA дикого типа получали из базы данных Uniprot, т.е. ST5b ApxIA APP (Uniprot: A3N292), ST3 ApxllA APP (Uniprot BOBPPO, с модификацией S148G) и ST8 ApxlllA (Uniprot: P55131).

Кроме того, были получены последовательности белков, содержащие следующие модификации:

Таблица 1

Сайт ацилирования 1 Сайт ацилирования 2 ApxIA (110 кДа) K560A K686A ApxllA (102 кДа) K557A N687A ApxlllA (112 кДа) K571A K702A

Нуклеиновые кислоты были получены из белковых последовательностей, при этом последовательности нуклеиновых кислот были кодон-оптимизированы и синтетически получены (Eurofins Genomics) без инициирующего кодона. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты была перенесена в плазмиду pEX-A258 (SEQ ID №: 19), фланкированную сайтами рестрикции BamHI на 5'-конце и Sacl на 3'-конце.

ПРИМЕР 2: КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ APXIA-APXIIIA ДИКОГО ТИПА И МОДИФИЦИРОВАННЫХ В PQE-80L (SEQ ID №: 20)

1 мкг pEX-A258, содержащего соответствующие ApxlA-ApxlllA, рестриктировали BamHI FD (ThermoFisher) и Sacl FD (ThermoFisher) в соответствии с инструкциями производителя и разделяли на 1% агарозном геле. Фрагменты нуклеиновой кислоты соответствующего размера экстрагировали из агарозного геля (QUIAEX-II). pQE-80L рестриктировали BamHI FD (ThermoFisher) и Sacl FD (ThermoFisher) в соответствии с инструкциями производителя. Лигирование pQE-80L и соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты в соотношении 1:5 выполняли в течение ночи при комнатной температуре с использованием T4-ДНК-лигазы (ThermoFisher). Лигированную ДНК электропорировали в Topf10F’ E. Coli и подтверждали успешное клонирование форм дикого типа и модифицированных форм ApxlA-ApxlllA с помощью рестрикционного анализа и секвенирования. pQE-80L включает устойчивость к ампициллину.

ПРИМЕР 3: КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ APXIC, APXIIC И APXIIIC В PQE-60

Гены apxIC-IIIC амплифицировали из APP-ДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, указанных в таблице 2, а затем очищали.

Фрагменты ПЦР, содержащие соответствующие нуклеиновые кислоты apxIC-IIIC и pQE-60 рестриктировали с помощью эндонуклеаз рестрикции, указанных в таблице 2 ниже, в соответствии с инструкциями соответствующего производителя и разделяли на 1% агарозном геле.

Таблица 2

праймер направление плазмида Последовательность Эндонуклеаза рестрикции apxlc_for_pqe60 5' GCATCATGAGTAAAAAAATTAATGGATTTGAGG (SEQ ID №: 23) Pagl apxlc_rev_pqe60 5' GGTAGATCTTTAGCTATTTACTAATGAAAATTTAA (SEQ ID №: 24) Bglll apxllc_for_pqe60 5' GCAACATGTTAAAAAATGATTTTAACGTATTGG (SEQ ID №: 25) Pcil apxllc_rev_pqe60 5' GGTAGATCTTTATTGTAGAGCTGTTATTAACT (SEQ ID №: 26) Bglll apxlllc_for_pqe60 5' GCATCATGAGTTATAAAAATGTTAAAAATTTAACA (SEQ ID №: 27) Pagl apxlllc_rev_pqe60 5' GGTAGATCTTTATCCTCTTACAATTTTTTTGTG (SEQ ID №: 28) Bglll pQE-60 (SEQ ID №: 21) Ncol и Bglll

Фрагменты нуклеиновой кислоты подходящего размера экстрагировали из агарозного геля (QUIAEX-II). Лигирование pQE-60 и соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты в соотношении 1:5 выполняли в течение ночи при комнатной температуре с использованием T4-ДНК-лигазы (ThermoFisher).

Лигированную ДНК электропорировали в Topf10F’ E. coli и подтверждали успешное клонирование с помощью рестрикционного анализа и секвенирования.

ПРИМЕР 4: КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ APXIC, APXIIC И APXIIIC В PACYC184

Соответствующие гены apxIC, apxllC и apxlllC амплифицировали из соответствующих векторов pQE-60 примера 2 с использованием праймеров, указанных в таблице 3 ниже.

Таблица 3

праймер направление плазмида Последовательность Эндонуклеаза рестрикции apxlc_for_pacyc184 5' GCATCTAGAAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTT (SEQ ID №: 29) Xbal apxlc_rev_pacyc184 5' AGCTCGCGATTAGCTATTTACTAATGAAAATTTA (SEQ ID №: 30) Nrul apxllc_for_pacyc184 5' GCAATCGATAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTT (SEQ ID №: 31) Clal/Bscl apxllc_rev_pacyc184 5' AGCTCGCGATTATTGTAGAGCTGTTATTAACT (SEQ ID №: 32) Nrul apxlllc_for_pacyc184 5' GCATCTAGAAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTT (SEQ ID №: 33) Xbal apxlllc_rev_pacyc184 5' AGCTCGCGATTATCCTCTTACAATTTTTTTGT (SEQ ID №: 34) Nrul PACYC184 (SEQ ID №: 22) Xbal и Nrul (apxIC и apxlllC);
Clal/Bscl и Nrul (apxllC)

Таким путем промотор/lac-оператор и сайты связывания рибосомы также содержались в ампликонах (SEQ ID №: 16, 17 и 18).

Соответствующие продукты ПЦР были ограничены с использованием эндонуклеаз рестрикции, указанных в таблице 3 и клонированных в pACYC184 посредством сайтов рестрикции Xbal и Nrul (apxIC и apxlllC) или Clal/Bscl и Nrul (apxllC) с использованием того же способа и условий, как указано выше. pACYC184 включает устойчивость к хлорамфениколу.

Лигированную ДНК электропорировали в Topf10F’ E. coli и подтверждали успешное клонирование с помощью рестрикционного анализа и секвенирования.

ПРИМЕР 5: КОТРАНСФОРМАЦИЯ PACYC184, СОДЕРЖАЩЕГО ГЕНЫ APXIC, APXIIC ИЛИ APXIIIC, И PQE-80L, СОДЕРЖАЩЕГО APXIA, APXIIA ИЛИ APXIIIA

ApxC необходим для активации токсинов ApxA. Следовательно, pACYC184, содержащий соответствующие гены apxIC, apxllC или apxlllC, полученный в примере 4, котрансформировали с pQE-80L, содержащим соответствующий ген apxIA, apxllA или apxlllA, в TopflOF’ E. Coli, и успешную котрансформацию выбирали на агаровых пластинах с LB, содержащих 50 мкг/мл ампициллина и 15 мкг/мл хлорамфеникола. Успешную трансформацию подтверждали рестрикционным анализом.

ПРИМЕР 6: ЭКСПРЕССИЯ И ВЫДЕЛЕНИЕ ТОКСИНОВ И ТОКСОИДОВ APXA, В ЧАСТНОСТИ APXIA

Колонию E. Coli,, полученную Примере 5 и содержащую pACYC184 и pQE-80L, кодирующие соответствующие гены ApxA и ApxC, использовали для инокуляции 40 мл среды LB (100 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл хлорамфеникола). Культуру инкубировали при встряхивании при 30°C в течение ночи. На следующий день ночную культуру инокулировали в 400 мл среды LB (100 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл хлорамфеникола), так что была достигнута оптическая плотность 0,1 (оптическая плотность при 600 нм = OD600). Полученную культуру инкубировали при встряхивании до получения OD600, составляющей 0,5. Для индуцирования экспрессии был добавлен рекомбинантный белок 1 мМ IPTG (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид). Культуру инкубировали при встряхивании при 30°C в течение еще 4 часов. Затем культуру центрифугировали при 7000g в течение 10 минут. После удаления супернатанта осадок бактерий ресуспендировали в буфере LEW (50 мМ NaH₂PO₄, 300 мМ NaCI в дистиллированной воде; pH 8,0), 5 мл буфера LEW на 1 г осадка бактерий, и хранили при -20°C.

К 10 мл ресуспендированного осадка бактерий добавляли 1 мл 10x Bug Buster (Novagen), 5 мкл бензоазы (25 ед./мкл, Novagen) и 10 мг лизоцима. Полученную суспензию медленно вращали при комнатной температуре в течение 20 минут. После центрифугирования при 4°C и 15000 g в течение 60 минут осадок промывали буфером LEW (10 мл буфера LEW на 1 мг осадка) и центрифугировали (4 °C, 15000 g, 60 мин). Промытый осадок ресуспендировали в 2 мл денатурирующего солюбилизирующего буфера (8 M мочевина в буфере LEW; pH=8,0) на 1 г осадка, а затем в 1 мл Bug Buster (Novagen) на 10 мл ресуспендированного осадка. Суспензию инкубировали при 4°C в течение 1 часа, а затем центрифугировали (4 °C, 18000 g, 15 мин). Супернатант, содержащий белок, использовали на следующих стадиях для колоночной очистки белка.

В соответствии с инструкциями производителя колонки (колонки Protino Ni-IDA 2000, Machery-Nagel) уравновешивали 4 мл равновесного буфера (8 M мочевины в буфере LEW; pH=8,0). Затем в колонку загружали половину содержащего белок супернатанта и дважды промывали 4 мл равновесного буфера (всего 8 мл буфера). Белки дважды элюировали 3 мл элюирующего буфера (равновесный буфер с 250 мМ имидазола, всего 6 мл буфера). Процедуру повторяли со второй половиной содержащего белок супернатанта. Элюаты, содержащие белок, объединяли и диализировали в ФСБ, pH 8,0, содержащем 1 M мочевины при 4°C в течение ночи. Диализный буфер заменяли на 0,5 М мочевины в ФСБ (pH 8,0), и диализ продолжали еще 4 часа. Затем буфер заменяли на ФСБ (pH 8,0) без мочевины и диализировали еще 4 часа. Концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белков Pierce BCA (ThermoFisher) в соответствии с инструкциями производителя. Белок хранили при -80°C до использования.

ПРИМЕР 7: ВЫДЕЛЕНИЕ ТОКСИНОВ APXA ИЗ APP

Раствор APPVX содержит 1 г D(+)-глюкозы, моногидрата, 0,1 г L-глутамина, 0,362 г L-цистеина гидрохлорида моногидрата и 10 мл безнуклеазной H₂O. Изоляты APP высевали на шоколадный агар, содержащий IsovitaleX, и инкубировали при 37°C в течение ночи. Три колонии APP объединяли и использовали, чтобы инокулировать 3 мл колумбийской среды (10 мМ Ca²⁺, 0,2 мг/мл NAD, 1 % APPVX), и полученную культуру инкубировали при 37°C при встряхивании в течение 5 часов. Затем культуру центрифугировали при 3200g и 4°C в течение 20 минут. Прозрачный супернатант переносили в новую пробирку и постепенно добавляли 44,05 г сульфата аммония и перемешивали до полного растворения сульфата аммония. Затем раствор инкубировали при 4°C в течение ночи. Осажденные белки центрифугировали при 3200 g и 4°C в течение 3 часов, и супернатант удаляли. Белковый осадок сушили на воздухе, а затем суспендировали в 1 мл ФСБ, содержащего 6 М мочевину. Для удаления остаточного буфера полученный раствор белка очищали с помощью гель-фильтрации на колонках PDMidiTrap G25 (GE Healthcare). После уравновешивания ФСБ, содержащим 6 М мочевину, 1 мл раствора белка загружали в гель-фильтрационную колонку, а затем элюировали 1,5 мл ФСБ, содержащего 6 М мочевины. Затем элюированные белки хранили при -20°C. Идентификацию элюированных белков проводили с помощью SDS-PAGE.

ПРИМЕР 8: ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА НА ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ

Для определения цитотоксической активности рекомбинантных белков ApxA (дикого типа и токсоидных форм) проводили анализ на цитотоксичность с использованием клеток BL3 (BL3.1 CRL-2306) в качестве клеток-мишеней. Клетки BL3 получали из бычьих B-клеток, и известно, что они могут быть лизированы токсинами ApxA (Tu, A. H.; Hausler, C.; Young, R.; Struck, D. K. (1994): Differential expression of the cytotoxic and hemolytic activities of the ApxllA toxin from Actinobacillus pleuropneumoniae. В Infection and immunity 62 (5), pp. 2119-2121). Токсины ApxA, полученные в Примере 7, использовали в качестве положительного контроля, а ФСБ, содержащий 6 М мочевины, служил в качестве отрицательного контроля.

Клетки BL3 культивировали в среде (DMEM, содержащей 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 % FCS и заменимые аминокислоты, 1x) при 37 °C и 5 % CO₂. Для культивирования использовали колбы T75 с 25 мл среды. Клетки BL3 пересевали раз в неделю, при этом 50000 клеток/см² использовали для засевания в новую колбу.

Для применения в цитотоксическом анализе 50 мкл клеток BL3 в среде переносили в лунку 96-луночного планшета. Рекомбинантные белки и контроли разбавляли в DMEM. 50 мкл разбавленных рекомбинантных белков и контролей добавляли в каждую лунку, содержащую клетки. Затем планшет инкубировали при 37 °C и 5% CO₂ в течение 24 часов. После оценки морфологии клеток под микроскопом в каждую лунку добавляли 10 мкл WST-1 (Sigma Aldrich), и планшет инкубировали при 37°C и 5% CO₂ в течение еще 24 часов.

Затем определяют поглощение с помощью ридера ELISA при 450 нм. WST-1 расщепляется посредством сложного клеточного механизма на клеточной поверхности жизнеспособных клеток до растворимого формазана. Следовательно, количество образовавшегося красителя формазана и величина экстинкции, полученная на ридере для ELISA, напрямую коррелируют с количеством метаболически активных клеток в культуре.

ПРИМЕР 9: ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА НА ГЕМОЛИЗ

Для определения гемолитической активности рекомбинантных белков ApxA (дикого типа и токсоидных форм) осуществляли анализ на гемолиз. Использовали планшеты для культивирования клеток, содержащие колумбийский агар с 5% овечьей крови (Bection Dickinson). В планшетах для культивирования клеток вырезали отверстия диаметром 3 мм. 10 мкл соответствующих образцов рекомбинантного белка и контроля наливали в отверстие, и планшеты инкубировали при 37°C в течение ночи. Токсины ApxA, полученные в Примере 7, использовали в качестве положительного контроля, а ФСБ, содержащий 6 М мочевины, служил в качестве отрицательного контроля.

Считают, что гемолитическая активность присутствует, когда агар с овечьей кровью обесцвечивался и таким образом становился беловатым.

ПРИМЕР 10: ВЫДЕЛЕНИЕ ТОКСИНОВ APXA ИЗ APP

Штаммы APP ST2, ST5, ST7 и ST8 использовали для выделения супернатантов, содержащих токсины ApxA, с использованием методов экспрессии и выделения, описанных в примере 7. С помощью SDS-PAGE было установлено, что супернатанты содержали полосы при ожидаемых величинах молекулярной массы, соответствующих ApxIA, ApxllA, ApxlllA и ApxIVA (данные не показаны). Таким образом, каждый из полученных супернатантов соответствующих штаммов ST2, ST5, ST7 и ST8 содержит смесь ApxIA, ApxllA, ApxlllA и ApxIVA.

ПРИМЕР 11: ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ APXA из APP В КЛЕТКАХ BL-3

Используя способ из примера 8, 50 мкл токсинов ApxA примера 7, полученных из APP (штаммы APP ST2, ST5, ST7 и ST8), тестировали при возрастающих разбавлениях в DMEM (1:8, 1:16, 1:32; 1:64, 1:128; 1:256, 1:512; 1:1024, 1:2048, 1:4096).

Наблюдали цитотоксический эффект супернатантов APP, который уменьшался с увеличением разбавления (см. фигуру 1). Выделенные токсины ST8 продемонстрировали наиболее высокую цитотоксичность, тогда как выделенные токсины ST7 показали наиболее низкую токсичность. Не наблюдалось никакого влияния ЛПС в препарате ApxA на цитотоксичность (данные не показаны).

ПРИМЕР 12: ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ APXIA И APXIIIA В КЛЕТКАХ BL-3

С использованием способа из примера 8 были протестированы следующие образцы.

Таблица 4

Обозначение Состав ApxIA дикого типа 844 мкг/мл очищенного белка, полученного из E. coli, содержащей pACYC184 и pQE-80L, содержащие кодирующую последовательность для ApxIA дикого типа (SEQ ID №: 7) и ApxIC дикого типа (SEQ ID №: 13), в соответствии с примером 6 в ФСБ Токсоидная форма ApxIA 722 мкг/мл очищенного белка, полученного из E. coli, содержащей pACYC184 и pQE-80L, содержащие кодирующую последовательность для токсоидов ApxIA K560A и K686A (SEQ ID №: 10) и ApxIC (SEQ ID №: 13), в соответствии с примером 6 в ФСБ Apxll IA дикого типа 591 мкг/мл очищенного белка, полученного из E. coli, содержащей pACYC184 и pQE-80L, содержащие кодирующую последовательность для ApxllIA дикого типа (SEQ ID №: 9) и ApxllIC дикого типа (SEQ ID №: 15), в соответствии с примером 6 в ФСБ Токсоидная форма ApxllIA 1033 мкг/мл очищенного белка, полученного из E. coli, содержащей pACYC184 и pQE-80L, содержащие кодирующую последовательность для токсоидов ApxlllA K560A и K686A (SEQ ID №: 12) и ApxllIC (SEQ ID №: 15), в соответствии с примером 6 в ФСБ ST2 Выделенный супернатант из ST2 APP в соответствии с примером 7 в ФСБ с 6 М мочевины (положительный контроль) Среда без клеток в лунке DMEM (отрицательный контроль) Контроль ФСБ ФСБ и клетки

50 мкл каждого образца тестировали при возрастающих разбавлениях в DMEM (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32; 1:64, 1:128; 1:256, 1:512).

В контроле с клетками использовали разбавления ФСБ, чтобы оценить влияние ФСБ. Не наблюдали никакого эффекта (см. фигуру 2). Результаты показаны на фигуре 2.

Как проиллюстрировано на фигуре 2A, анализ цитотоксичности продемонстрировал, что рекомбинантный ApxIA дикого типа лизировал клетки BL3 и таким образом являлся активным. Начиная с разбавления 1:64 (13,1 мкг/мл токсина ApxIA дикого типа), величины жизнеспособности клеток были сопоставимы со значениями для контроля ФСБ. Жизнеспособность клеток BL3, которые инкубировали с токсоидной формой ApxIA, была сопоставима со значениями для контроля ФСБ. Это также применимо к морфологии клеток (данные не показаны).

Поскольку токсоидная форма ApxIA имеет точно такое же влияние на жизнеспособность и морфологию клеток, что и контроль ФСБ, тогда как форма ApxIA дикого типа обладает сильным цитотоксическим эффектом на клетки BL3, можно сделать вывод, что токсоидная форма ApxIA не обладает цитотоксическим эффектом. Подобные результаты были получены для токсоидных форм ApxllA (данные не показаны) и ApxlllA (фигура 2 B).

ПРИМЕР 13: ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ APXA ИЗ APP

С использованием способа примера 9, были протестированы 10 мкл токсинов ApxA из примера 7, полученных из APP (штаммы ST2, ST5 и ST8 APP).

Результаты показаны на фигуре 3. Штамм ST8 продемонстрировал сильный гемолиз, ST5 - гемолиз средней степени, и ST2 - не продемонстрировал гемолиза, как можно заключить из снижения интенсивности белого цвета слева направо на фигуре 3. Известно, что не каждый из ApxIA, ApxllA и ApxllA способен лизировать эритроциты. Поскольку различные штаммы секретируют различные количества соответствующих форм ApxA, супернатанты из соответствующих штаммов, которые содержат смеси различных форм ApxA могут демонстрировать различную гемолитическую активность.

В целом, можно продемонстрировать, что гемолитическая активность токсинов ApxA может быть выявлена в способе, включающем применение колумбийского агара, содержащего 5% овечьей крови, как описано в примере 9.

ПРИМЕР 14: ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ APXIA

С использованием способа из примера 9 были протестированы следующие образцы.

Таблица 5

Обозначение Состав ApxIA дикого типа 844 мкг/мл очищенного белка, полученного из E. coli, содержащей pACYC184 и pQE-80L, содержащие кодирующую последовательность для ApxIA дикого типа (SEQ ID №: 7) и ApxIC дикого типа (SEQ ID №: 13), в соответствии с примером 6 в ФСБ Токсоидная форма ApxIA 722 мкг/мл очищенного белка, полученного из E. coli, содержащей pACYC184 и pQE-80L, содержащие кодирующую последовательность для токсоидов ApxIA K560A и K686A (SEQ ID №: 10) и ApxIC (SEQ ID №: 13), в соответствии с примером 6 в ФСБ ApxlllA дикого типа 591 мкг/мл очищенного белка, полученного из E. coli, содержащей pACYC184 и pQE-80L, содержащие кодирующую последовательность для ApxllIA дикого типа (SEQ ID №: 9) и ApxllIC дикого типа (SEQ ID №: 15), в соответствии с примером 6 в ФСБ Токсоидная форма ApxlllA 1033 мкг/мл очищенного белка, полученного из E. coli, содержащей pACYC184 и pQE-80L, содержащие кодирующую последовательность для токсоидов ApxlllA K560A и K686A (SEQ ID №: 12) и ApxllIC (SEQ ID №: 15), в соответствии с примером 6 в ФСБ ST8 Выделенный супернатант из ST8 APP в соответствии с примером 7 в ФСБ с 6 М мочевины (положительный контроль) 6 M мочевина ФСБ 6 М мочевина (отрицательный контроль) ФСБ ФСБ (отрицательный контроль)

Результаты показаны на фигуре 4. Тогда как форма ApxIA дикого типа лизирует эритроциты, токсоидная форма ApxIA не лизирует эритроциты. Форма ApxlllA дикого типа не демонстрирует гемолитической активности, что также описано в литературе.

Поскольку токсоидная форма ApxIA имела точно такой же, т.е. отсутствие, гемолитический эффект, что и контроль ФСБ, тогда как форма ApxIA дикого типа обладала сильным гемолитическим эффектом на эритроциты овцы, можно сделать вывод, что токсоидная форма ApxIA не обладает гемолитическим эффектом. Подобные результаты были получены для токсоидных форм ApxllA (данные не показаны).

ПРИМЕР 15: ИММУНОГЕННОСТЬ ПОЛИПЕПТИДОВ APXIA, APXIIA И APXIIIA ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ У СВИНЕЙ

(1) Получение антигенов и составов вакцин

Нуклеиновые кислоты, кодирующие модифицированные ApxIA (SEQ ID №: 4), ApxllA (SEQ ID №: 5) и ApxlllA (SEQ ID №: 6), кодон-оптимизированные для экспрессии в E. coli, были получены синтетически (Eurofins Genomics), и последовательность введена в плазмиду pEX-A258 (SEQ ID №: 19), фланкированную сайтами рестрикции BamHI на 5'-конце и Sacl на 3'-конце. 1 мкг pEX-A258, содержащего соответствующие ApxlA и ApxlllA, рестриктировали BamHI FD (ThermoFisher) и Sacl FD (ThermoFisher) в соответствии с инструкциями. Нуклеотиды, кодирующие AA 439-801 ApxllA, амплифицировали с помощью ПЦР, используя pEX-A258 (SEQ ID №: 19), содержащий ген для ApxllA и праймеры (прямой: GCAGGATCCCAGGGGTATGATTCACGC и обратный GGTGAGCTCTTAGGTGATGGAGTCGTTGCC), вводящие сайт рестрикции BamHI на 5'- и Sacl на 3'-конце. Продукт ПЦР очищали с использованием набора для очистки ПЦР QIAquick 250 (Qiagen) и рестриктировали с помощью BamHI FD (ThermoFisher) и Sacl FD (ThermoFisher) в соответствии с инструкциями производителя. Рестриктированные ApxIA, ApxllA (усеченный) и ApxlllA разделяли в 1% агарозном геле. Фрагменты нуклеиновой кислоты соответствующего размера экстрагировали из агарозного геля (QUIAEX-II). pQE-80L рестриктировали с помощью BamHI FD (ThermoFisher) и Sacl FD 10 (ThermoFisher) в соответствии с инструкциями производителя. Лигирование pQE-80L и соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты в соотношении 1:5 выполняли в течение ночи при комнатной температуре с использованием T4-ДНК-лигазы (ThermoFisher). Лигированную ДНК электропорировали в TopflOF’ E. Coli и подтверждали успешное клонирование модифицированных форм ApxIA, ApxllA (усеченный) или ApxlllA с помощью рестрикционного анализа и секвенирования. pQE-80L включает устойчивость к ампициллину. Соответствующий pQE-80L, кодирующий модифицированный ApxIA, ApxllA (усеченный) или ApxlllA, котрансформировали в TopflOF’ E. Coli с плазмидой pACYC184, кодирующей соответствующий apxIC, apxllC и apxlllC, полученной в Примере 4, в соответствии со способом, описанным в Примере 5. После котрансформации TopflOF’ E. Coli селектировали на агаровых пластинках с LB, содержащих 50 мкг/мл ампициллина и 15 мкг/мл хлорамфеникола. Полученные колонии E. Coli, содержащие:

- PQE-80L, кодирующий модифицированный ApxIA, и pACYC184, кодирующий ApxIC

- PQE-80L, кодирующий усеченный ApxllA (усеченный), и pACYC184, кодирующий ApxllC

- PQE-80L, кодирующий модифицированный ApxlllA, и pACYC184, кодирующий ApxlllA

использовали для инокуляции 40 мл среды LB (дополненной 100 мкг/мл ампициллина, 30 мкг/мл хлорамфеникола). Культуру инкубировали при встряхивании при 30°C в течение ночи. Ночную культуру инокулировали в 400 мл среды LB (дополненная 100 мкг/мл ампициллина, 30 мкг/мл хлорамфеникола), так что была достигнута оптическая плотность 0,1 (оптическая плотность при 600 нм = OD600). Полученную культуру дополнительно инкубировали при встряхивании до получения OD600, составляющей 0,5. Для индуцирования экспрессии был добавлен рекомбинантный белок 1 мМ IPTG (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид). Культуру инкубировали при встряхивании при 30°C в течение еще 4 часов. Затем культуру центрифугировали при 7000g в течение 10 минут. После удаления супернатанта осадок бактерий ресуспендировали в буфере LEW (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCI в дистиллированной воде; pH 8,0), 5 мл буфера LEW на 1 г осадка бактерий, и хранили при -20°C. К 10 мл ресуспендированного осадка бактерий добавляли 1 мл 10x Bug Buster (Novagen), 5 мкл бензоазы (25 ед./мкл, Novagen) и 10 мг лизоцима. Полученную суспензию медленно вращали при комнатной температуре в течение 20 минут. После центрифугирования при 4°C и 15000 g в течение 60 минут осадок промывали буфером LEW (10 мл буфера LEW на 1 мг осадка) и центрифугировали (4 °C, 15000 g, 60 мин). Промытый осадок ресуспендировали в 2 мл денатурирующего солюбилизирующего буфера (8 M мочевина в буфере LEW; pH=8,0) на 1 г осадка, а затем в 1 мл Bug Buster (Novagen) на 10 мл ресуспендированного осадка. Суспензию инкубировали при 4°C в течение 1 часа, а затем центрифугировали (4 °C, 18000 g, 15 мин). Супернатант, содержащий белок, использовали на следующих стадиях для колоночной очистки белка. В соответствии с инструкциями производителя колонки (колонки Protino Ni-IDA 2000, Machery-Nagel) уравновешивали 4 мл равновесного буфера (8 M мочевины в буфере LEW; pH=8,0). Затем в колонку загружали половину содержащего белок супернатанта и дважды промывали 4 мл равновесного буфера (всего 8 мл буфера). Белки дважды элюировали 3 мл элюирующего буфера (равновесный буфер с 250 мМ имидазола, всего 6 мл буфера). Процедуру повторяли со второй половиной содержащего белок супернатанта. Фракции элюатов, содержащих белок, объединяли и диализировали в ФСБ, pH 8,0, содержащем 1 M мочевины при 4°C в течение ночи. Диализный буфер заменяли на 0,5 М мочевины в ФСБ (pH 8,0), и диализ продолжали еще 4 часа. Затем буфер заменяли на ФСБ (pH 8,0) без мочевины и диализировали еще 4 часа. Концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белков Pierce BCA (ThermoFisher) в соответствии с инструкциями производителя. Соответствующие антигены ApxA фильтровали с помощью стерилизующего фильтрования (0,2 мкм) и хранили при 4°C до включения в состав.

Montanide ISA 201 VG (серия 36075M, Seppic) использовали в соответствии с инструкцией производителя для получения тестовых партий с соответствующими модифицированными ApxIA, ApxllA (усеченный) и ApxlllA (Таблица 6). Вкратце, адъювант и антиген предварительно нагревали до 31°C на водяной бане. Объем антигена(-ов) делали равным объему адъюванта (50:50, мас./об.) путем добавления стерильного ФСБ и дополнительно выдерживали при 31°C. Montanide ISA 201 VG медленно перемешивали в стакане. Затем антиген добавляли к адъюванту и дополнительно перемешивали при 31°C в течение 5 мин. Состав хранили в течение 1 ч при 20°C в стеклянных флаконах и далее хранили при 4°C до использования.

Таблица 6: Состав различных тестовых партий для изучения иммуногенности

Концентрация Плацебо Вакцина 1 (25 мкг/доза каждого из ApxIA, ApxllA, ApxlllA) Вакцина 2 (100 мкг/доза каждого из ApxIA, ApxllA, ApxlllA) Вакцина 3 (25 мкг/доза ApxllA) ApxIA 755 мкг/мл нет данных 745 мкл 2,98 мл нет данных ApxllA 1279 мкг/мл нет данных 439 мкл 1,76 мл 1,76 мл ApxlllA 1040 мкг/мл нет данных 540 мкл 2,16 мл нет данных ФСБ нет данных 15 мл 13,27 мл 8,1 мл 13,24 мл Адъюванты (Montanide ISA 201 G) нет данных 15 г 15 г 15 г 15 г

(2) Исследование на животных (иммуногенность)

Иммуногенность составов вакцин определяли путем количественного определения антител IgG, специфичных к ApxIA, ApxllA и ApxlIIA, в ELISA и оценки ApxlA-нейтрализующих свойств в сыворотке крови после вакцинации свиней возрастом 8 недель.

Животные

Свиней обоих полов (самцы [кастрированные] и самки) приобретали у животновода, разводящего свиней (BHZP, 21337 Люнебург, Zuchtbetrieb Garlitz (DE-LWL 1051)). Каждую свинью идентифицировали с помощью уникального идентификационного номера на ухе и подвергали ветеринарному осмотру относительно соответствия критериям включения/исключения, указанным в протоколе исследования. Все животные не демонстрировали клинических признаков инфекции APP, и у животных не было клинических признаков (одышка, кашель, диарея, хромота) в начале исследования. Было подтверждено, что животные являлись сероотрицательными, что установлено с помощью коммерчески доступного анализа ELISA APP-ApxlV (IDEXX) до включения в исследование. Свиней содержали на огороженной территории животноводческого хозяйства IDT Biologika GmbH, Am Pharmapark, D-06861 Дессау-Рослау (Германия). В каждом блоке было две отдельных комнаты/площадки одинакового размера на сплошном настиле. В качестве подстилки использовали солому, которую меняли раз в день. Свиней кормили (пеллетами, продажная смесь) в необходимом количестве с использованием вручную заполненных кормушек для сухих кормов. Воду качества водопроводной подавали с помощью крановой и сосковой поилок. Все помещения убирали раз в день.

Дизайн исследования

В общем 25 свиней в возрасте 8 недель случайным образом распределяли в 5 групп, содержащих 5 животных на группу. Трем группам внутримышечно вводили 2 раза с интервалом 14 дней 1,5 мл «вакцины 1», «вакцины 2» или «вакцины 3». Одна группа из пяти животных получала 2 мл коммерчески доступной вакцины против Actinobacillus Pleuropneumoniae (Porcilis® APP, MSD Animal Health, партия: A784A01) дважды с интервалом 14 дней и служила положительным контролем. Другая группа получала вакцину-плацебо и служила отрицательным контролем. Обзор групп и типов воздействия представлен в Таблице 7.

Таблица 7: Группа исследования и воздействие

Группа Количество свиней Номера свиней Вакцинация в/м путем Введенный препарат 1-я в 0 день Доза (мл) 2-я в 14 день Доза (мл) 1 5 5805, 6407, 6715, 6719, 6814 5 1,5 5 1,5 Отрицательный контроль плацебо 2 5 5563, 5640, 5684, 6734, 6736 5 2,0 5 2,0 Положительный контроль Porcilis® APP 3 5 5575, 5847, 5945, 6775, 6870 5 1,5 5 1,5 Вакцина 1 (25 мкг/доза каждого из ApxIA, ApxllA, ApxlllA) 4 5 5574, 5595, 5669, 5670, 6717 5 1,5 4* 1,5 Вакцина 2 (10C мкг/доза каждого из ApxIA, ApxllA, ApxlllA) 5 5 5572, 5896, 6274, 6275, 6406 5 1,5 5 1,5 Вакцина 3 (25 мкг/доза ApxllA)

* свинья под номером 5670 (группа 4) была исключена из исследования в 14 день исследования вследствие инфекции, не связанной с тестируемыми вакцинами.

Образцы сыворотки собирали в 0 день исследования (день первой вакцинации), 14 (день второй вакцинации) и 28 (конец исследования) от каждого из животных.

Местные и системные реакции, связанные с вакцинацией, оценивали один раз на день, начиная с 1 дня до и заканчивая 3 днями после каждой из двух вакцинаций. Для оценки местных реакций оценивали покраснение и отек мест инъекции.

Ректальную температуру тела измеряли один раз на день, начиная с 1 дня до и заканчивая 3 днями после каждой из двух вакцинаций. В день вакцинации температуру измеряли до и через 6 ч после вакцинации. Результаты относительно температуры тела показаны в таблице 8 и на фигуре 5.

Результаты:

Таблица 8: Средняя ректальная температура тела на группу (возрастание температуры обозначено)

Группа Медианные величины ректальной температуры тела [°C] д-1 д0 д0 + 6 ч д1 д2 д3 д13 д14+6 ч д15 д16 д18 1 39,6 39,5 40,0 39,6 39,5 39,5 39,5 39,8 39,7 39,4 39,5 2 39,5 39,6 42,0 39,6 39,5 39,6 39,5 41,3 39,7 39,7 39,5 3 39,6 39,6 40,1 39,4 39,4 39,5 39,6 40,7 39,5 39,6 39,5 4 39,6 39,6 40,3 39,6 39,5 39,5 39,5 40,6 39,7 39,5 39,6 5 39,8 39,7 39,9 39,7 39,4 39,6 39,5 40,3 39,5 39,6 39,6

(3) Серологические данные (ELISA)

Анализы ELISA осуществляли для количественного определения антител IgG, специфичных к ApxIA, ApxllA или ApxllIA, в сыворотке свиней. Вкратце, ApxIA, ApxllA или ApxlllA экспрессировали, очищали и количественно определяли, как описано в Примере 5. Соответствующий ApxA разбавляли в покрывающем буфере lxELISA (120125; Candor Bioscience) до конечной концентрации 5 мкг/мл. 100 мкл соответствующего ApxA в покрывающем буфере ELISA помещают в каждую лунку 96-луночного планшета (планшет для ELISA Nunc MaxiSorb (44-2404-21, ThermoFisher)) и инкубируют при 4°C в течение ночи. Затем покрывающий буфер удаляют и планшеты 3 раза промывают промывающим буфером (ФСБ, 0,05% твина 20 (об./об.)). Планшеты блокируют с использованием блокирующего раствора, содержащего ФСБ с 10% (об./об.) FCS, в течение 1 ч при комнатной температуре (к.т.) на шейкере. Затем блокирующий раствор удаляют, а все лунки промывают 3 раза промывающим буфером. Сыворотку свиней предварительно разбавляют 1:100 блокирующим раствором, и готовят ряд разбавлений 1:5 в блокирующем растворе (включая разбавления 1:100-1:312500). 50 мкл каждого разбавления пипеткой переносят в одну из лунок планшета для ELISA. Гипериммунизированная сыворотка, полученная от животного, инфицированного A. Pleuropneumoniae несколько раз, служит в качестве положительного контроля и разбавлена, как описано ранее. Через 1 ч инкубации при к.т. на шейкере разбавленную сыворотку удаляют и каждую лунку промывают 3 раза промывающим буфером. IgG козы против IgG свиньи (H+L)- HRPO, без MinX (Dianova) служит в качестве вторичного антитела, и его разбавляют 1:4000 в блокирующем буфере, и 50 мкл добавляют в каждую лунку 96-луночного планшета. Через 1 ч инкубации при к.т. на шейкере разбавленные вторичные антитела удаляют и каждую лунку промывают 3 раза промывающим буфером. Затем 50 мкл субстрата TMB (555214, BD) помещают в каждую лунку планшета для ELISA и инкубируют в течение 6 минут при к.т. в темноте. Реакции останавливают путем добавления 20 мкл 2 н. H2SO4 (X873.1, Roth) на лунку. Поглощение в каждой лунке при длине волны 450 нм измеряют на ридере для ELISA. Данные поглощения обрабатывают с использованием GraphPad Prism 8.0 с логарифмическим превращением величин поглощения и нелинейной регрессией с сигмовидной зависимостью доза-ответ. Для статистического анализа результаты ELISA анализировали с использованием критерия Крускала-Уоллиса и критерия множественного сравнения Данна. Данные каждой группы сравнивали с соответствующими данными группы, получавшей плацебо (группа 1). p-величину меньше или равную 0,05 считали значимой. Результаты показаны на фигуре 6.

(4) Серологические данные (нейтрализационный анализ)

Нейтрализационный анализ позволяет количественно оценить нейтрализующую емкость рекомбинантного ApxlA дикого типа в соответствующей сыворотки свиней.

Клетки BL3 (BL3.1 CRL-2306) применяют в качестве клеток-мишеней. Клетки BL3 получали из бычьих B-клеток, а лизис этой клеточной линии токсинами ApxIA был описан (Tu, A. H.; Hausler, C.; Young, R.; Struck, D. K. (1994)). Клетки BL3 культивировали в среде (DMEM, содержащей 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 % FCS и заменимые аминокислоты, 1x) при 37 °C и 5 % CO₂. Для культивирования использовали колбы T75 с 25 мл среды. Клетки BL3 пересевали раз в неделю, при этом 50000 клеток/см² использовали для засевания в новую колбу. Для применения в нейтрализационном анализе 50 мкл клеток BL3 в среде переносили в каждую лунку 96-луночного планшета.

Сыворотку свиней инактивируют нагреванием при 56°C в течение 30 мин. Затем готовят ряд 2-кратных разбавлений сыворотки в DMEM, включая разбавления. Рекомбинантный ApxIA дикого типа (активный токсин) готовят в соответствии с Примером 7 и разбавляют до конечной концентрации 240 мкг/мл. 70 мкл каждого разбавления сыворотки смешивают с 30 мкл разбавлений ApxIA дикого типа (конечное количество ApxIA на лунку: 6 мкг) в 96-луночном планшете (что дает разбавления сыворотки в диапазоне 1:2 - 1:256) и инкубируют в течение 1 ч при 37°C. 50 мкл содержимого каждой лунки переносят в круглодонный 96-луночный планшет, содержащий 50000 клеток BL3/см² в 50 мкл DMEM), что приводит к конечным разбавлениям сыворотки в диапазоне 1:4 - 1:512. Планшеты инкубируют в течение 24 ч при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO₂ и при 100% влажности. Через 24 ч в каждую лунку планшета добавляют субстрат WST-1 (Sigma) в соответствии с инструкцией производителя. Планшеты инкубируют в течение еще 24 ч при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO₂ и при 100% влажности. Затем определяли поглощение с помощью ридера для ELISA при 450 нм. WST-1 расщепляется посредством сложного клеточного механизма на клеточной поверхности жизнеспособных клеток до растворимого формазана. Следовательно, количество образовавшегося красителя формазана и величина экстинкции, полученная на ридере для ELISA, напрямую коррелирует с количеством метаболически активных клеток в культуре. Нейтрализационный анализ применяли для сыворотки, полученной в 28 день серологического анализа животных в группах 1, 2 и 3. Результаты показаны на фигуре 7.

ПРИМЕР 16: ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОЛИПЕПТИДОВ APXIA, APXIIA И APXIIIA ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ У СВИНЕЙ

(1) Получение антигенов и составов вакцин

Получение антигена и состава осуществляли, как описано в Примере 15. Таблица 9 обобщает состав различных тестовых партий вакцины.

Таблица 9: Состав различных тестовых партий для изучения эффективности

Концентрация Плацебо Вакцина 1 (25 мкг/доза каждого из ApxIA, ApxllA, ApxlllA) ApxIA 810 мкг/мл нет данных 663,6 мкл ApxllA 1470 мкг/мл нет данных 365,6 мкл ApxlllA 1100 мкг/мл нет данных 484,2 мкл ФСБ нет данных 43 мл 17,6 мл Адъюванты (Montanide ISA 201 VG) нет данных нет данных 19,1 г

(2) Исследование на животных (эффективность)

Целью этого исследования было оценить эффективность защиты, полученной при вакцинации с использованием состава вакцин на основе рекомбинатно экспрессируемых, модифицированных ApxIA, ApxllA и ApxlllA против серовара 9 Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) у свиней.

Животные

Свиней обоих полов (самцы [кастрированные] и самки) приобретали у животновода, разводящего свиней (Dalmandi Mezögazdasági Zrt., 7211 Далманд, Felszabadulás u. 42). Каждую свинью идентифицировали с помощью уникального идентификационного номера на ухе и подвергали ветеринарному осмотру относительно соответствия критериям включения/исключения, указанным в протоколе исследования.

Источник (стадо) не имел APP и Mycoplasma. Поросята получены от самок, которые не были вакцинированы против APP, чтобы предотвратить взаимодействие антител, полученных от матери, с вакцинацией. Животные не имели клинических признаков заболевания (одышка, кашель, диарея, хромота). Кроме того, животные являлись сероотрицательными, что установлено с помощью коммерчески доступного анализа ELISA APP-ApxlV (IDEXX) до включения в исследование. Поросята были хорошо развиты, здоровы без каких-либо нарушений и не имели врожденных пороков развития.

Животных содержали на огражденной территории животноводческого хозяйства PROPHYL Ltd, Top. № 045/7, Бар H-7711, Венгрия). Свиней кормили (нашинкованный корм, продажная смесь) в необходимом количестве с использованием вручную заполненных кормушек для сухих кормов. Воду качества водопроводной подавали с помощью крановой и сосковой поилок. Все помещения убирали раз в день.

Дизайн исследования

Эффективность, вызванную вакциной, содержащей 25 пг каждого модифицированного ApxIA, ApxllA (усеченный) и ApxlllA, которые введены в состав с Montanide ISA 201 VG (партия 36075M, Seppic), по отношению к интраназальному заражению сероваром 9 APP сравнивали с эффективностью, вызванной зарегистрированной вакциной против APP (Porcilis® APP, MSD Animal Health, партия: A739A01) и группой плацебо, получающей ФСБ. Обзор групп и типов воздействия представлен в Таблице 10.

Таблица 10: Обзор групп и воздействие

Группа Количество свиней Вакцинация в/м путем Введенный препарат 1-я в 0 день Доза (мл) 2-я в 28 день Доза (мл) 1 8 8 2,0 8 2,0 Вакцина 1 (25 мкг/доза каждого из ApxIA, ApxllA, ApxlllA) 2 8 8 2,0 8 2,0 Положительный контроль: Porcilis® APP 3 8 8 2,0 8 2,0 Отрицательный контроль: Плацебо

В возрасте 42-45 дней все свиньи были внутримышечно вакцинированы 2,0 мл соответствующей вакцины в соответствии с группой лечения (0 день исследования). Через 28 дней свиньи получили 2-ю вакцинацию соответствующей вакциной (28 день исследования) с использованием внутримышечного пути. Через две недели после 2-й вакцинации всем животным было произведено внутриназальное заражение сероваром 9 APP (5x10⁷ КОЕ/свинья) (42 день исследования).

Клиническое обследование производили каждый день в течение 7 дней, начиная с дня заражения. Каждый из осмотров приводил к показателю, зависящему от клинических наблюдений и в соответствии с таблицей 11. Клинические показатели накапливают для каждого животного с течением времени, и рассчитывали средний показатель на группу за весь период наблюдения. Для статистического анализа значения клинических показателей анализировали с использованием критерия Крускала-Уоллиса и критерия множественного сравнения Данна. Данные каждой группы сравнивали с соответствующими данными группы, получавшей плацебо (группа 3). p-величину меньше или равную 0,05 считали значимой. Результаты показаны на фигуре 8. Результаты относительно выживаемости животных после заражения показаны на фигуре 9.

Таблица 11: Оценка клинического осмотра

Показатель Симптомы 0 нет признаков плевропневмонии 1 повышена частота дыхания, и/или спорадичный кашель, и/или животное эпизодически лежит, и/или умеренная апатия 2 брюшное дыхание, и/или кашель, и/или животное лежит, и/или апатия 3 одышка, и/или регулярный кашель, и/или животное лежит, и/или в значительной степени угнетенный вид, и/или кровянистые выделения, и/или агония 4 смерть

Через 7 дней после заражения все оставшиеся животные были гуманным образом умерщвлены и подвергнуты посмертному осмотру. Легкие всех животных были подвернуты вскрытию для регистрации поражений, вызванных APP. Оценку легких производили в соответствии с системой оценивания, представленной в таблице 12. Поражения легких оценивали от 0 до 5 на долю в соответствии с процентным содержанием уплотненных масс в легких. Результаты оценивания легких выражали как кумулятивные показатели легких (диапазон от 0 до 35) для каждой свиньи. Кумулятивные показатели легких анализировали с использованием критерия Крускала-Уоллиса и критерия множественного сравнения Данна. Данные каждой группы сравнивали с соответствующими данными группы, получавшей плацебо (группа 3). p-величину меньше или равную 0,05 считали значимой. Результаты показаны на фигуре 10.

Таблица 12: Оценка поражений легких

Степень поражения Отсутствие 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% Показатель 0 1 2 3 4 5

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> IDT Biologika GmbH

<120> Инактивированные токсины ApxIA, ApxIIA и ApxIIIA

<130> P46559-WO

<150> 19154466.7

<151> 2019-01-30

<160> 34

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 1022

<212> Белок

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIA дикого типа

<400> 1

Met Ala Asn Ser Gln Leu Asp Arg Val Lys Gly Leu Ile Asp Ser Leu

1 5 10 15

Asn Gln His Thr Lys Ser Ala Ala Lys Ser Gly Ala Gly Ala Leu Lys

20 25 30

Asn Gly Leu Gly Gln Val Lys Gln Ala Gly Gln Lys Leu Ile Leu Tyr

35 40 45

Ile Pro Lys Asp Tyr Gln Ala Ser Thr Gly Ser Ser Leu Asn Asp Leu

50 55 60

Val Lys Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ile Glu Val His Arg Ser Glu Lys

65 70 75 80

Asn Gly Thr Ala Leu Ala Lys Glu Leu Phe Gly Thr Thr Glu Lys Leu

85 90 95

Leu Gly Phe Ser Glu Arg Gly Ile Ala Leu Phe Ala Pro Gln Phe Asp

100 105 110

Lys Leu Leu Asn Lys Asn Gln Lys Leu Ser Lys Ser Leu Gly Gly Ser

115 120 125

Ser Glu Ala Leu Gly Gln Arg Leu Asn Lys Thr Gln Thr Ala Leu Ser

130 135 140

Ala Leu Gln Ser Phe Leu Gly Thr Ala Ile Ala Gly Met Asp Leu Asp

145 150 155 160

Ser Leu Leu Arg Arg Arg Arg Asn Gly Glu Asp Val Ser Gly Ser Glu

165 170 175

Leu Ala Lys Ala Gly Val Asp Leu Ala Ala Gln Leu Val Asp Asn Ile

180 185 190

Ala Ser Ala Thr Gly Thr Val Asp Ala Phe Ala Glu Gln Leu Gly Lys

195 200 205

Leu Gly Asn Ala Leu Ser Asn Thr Arg Leu Ser Gly Leu Ala Ser Lys

210 215 220

Leu Asn Asn Leu Pro Asp Leu Ser Leu Ala Gly Pro Gly Phe Asp Ala

225 230 235 240

Val Ser Gly Ile Leu Ser Val Val Ser Ala Ser Phe Ile Leu Ser Asn

245 250 255

Lys Asp Ala Asp Ala Gly Thr Lys Ala Ala Ala Gly Ile Glu Ile Ser

260 265 270

Thr Lys Ile Leu Gly Asn Ile Gly Lys Ala Val Ser Gln Tyr Ile Ile

275 280 285

Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Thr Thr Ala Ala Thr Gly Gly

290 295 300

Leu Ile Gly Ser Val Val Ala Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ser Phe Leu

305 310 315 320

Asn Val Ala Asp Lys Phe Glu Arg Ala Lys Gln Leu Glu Gln Tyr Ser

325 330 335

Glu Arg Phe Lys Lys Phe Gly Tyr Glu Gly Asp Ser Leu Leu Ala Ser

340 345 350

Phe Tyr Arg Glu Thr Gly Ala Ile Glu Ala Ala Leu Thr Thr Ile Asn

355 360 365

Ser Val Leu Ser Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Ala Ala Ala Thr Gly

370 375 380

Ser Leu Val Gly Ala Pro Val Ala Ala Leu Val Ser Ala Ile Thr Gly

385 390 395 400

Ile Ile Ser Gly Ile Leu Asp Ala Ser Lys Gln Ala Ile Phe Glu Arg

405 410 415

Val Ala Thr Lys Leu Ala Asn Lys Ile Asp Glu Trp Glu Lys Lys His

420 425 430

Gly Lys Asn Tyr Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg His Ser Ala Phe

435 440 445

Leu Glu Asp Thr Phe Glu Leu Leu Ser Gln Tyr Asn Lys Glu Tyr Ser

450 455 460

Val Glu Arg Val Val Ala Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Val Asn Ile

465 470 475 480

Gly Glu Leu Ala Gly Ile Thr Arg Lys Gly Ala Asp Ala Lys Ser Gly

485 490 495

Lys Ala Tyr Val Asp Phe Phe Glu Glu Gly Lys Leu Leu Glu Lys Asp

500 505 510

Pro Asp Arg Phe Asp Lys Lys Val Phe Asp Pro Leu Glu Gly Lys Ile

515 520 525

Asp Leu Ser Ser Ile Asn Lys Thr Thr Leu Leu Lys Phe Ile Thr Pro

530 535 540

Val Phe Thr Ala Gly Glu Glu Ile Arg Glu Arg Lys Gln Thr Gly Lys

545 550 555 560

Tyr Glu Tyr Met Thr Glu Leu Phe Val Lys Gly Lys Glu Lys Trp Val

565 570 575

Val Thr Gly Val Gln Ser His Asn Ala Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Leu

580 585 590

Ile Gln Leu Ala Ile Asp Lys Lys Gly Glu Lys Arg Gln Val Thr Ile

595 600 605

Glu Ser His Leu Gly Glu Lys Asn Asp Arg Ile Tyr Leu Ser Ser Gly

610 615 620

Ser Ser Ile Val Tyr Ala Gly Asn Gly His Asp Val Ala Tyr Tyr Asp

625 630 635 640

Lys Thr Asp Thr Gly Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Gln Ser Ala Gln Lys

645 650 655

Ala Gly Glu Tyr Ile Val Thr Lys Glu Leu Lys Ala Asp Val Lys Val

660 665 670

Leu Lys Glu Val Val Lys Thr Gln Asp Ile Ser Val Gly Lys Arg Ser

675 680 685

Glu Lys Leu Glu Tyr Arg Asp Tyr Glu Leu Ser Pro Phe Glu Leu Gly

690 695 700

Asn Gly Ile Arg Ala Lys Asp Glu Leu His Ser Val Glu Glu Ile Ile

705 710 715 720

Gly Ser Asn Arg Lys Asp Lys Phe Phe Gly Ser Arg Phe Thr Asp Ile

725 730 735

Phe His Gly Ala Lys Gly Asp Asp Glu Ile Tyr Gly Asn Asp Gly His

740 745 750

Asp Ile Leu Tyr Gly Asp Asp Gly Asn Asp Val Ile His Gly Gly Asp

755 760 765

Gly Asn Asp His Leu Val Gly Gly Asn Gly Asn Asp Arg Leu Ile Gly

770 775 780

Gly Lys Gly Asn Asn Phe Leu Asn Gly Gly Asp Gly Asp Asp Glu Leu

785 790 795 800

Gln Val Phe Glu Gly Gln Tyr Asn Val Leu Leu Gly Gly Ala Gly Asn

805 810 815

Asp Ile Leu Tyr Gly Ser Asp Gly Thr Asn Leu Phe Asp Gly Gly Val

820 825 830

Gly Asn Asp Lys Ile Tyr Gly Gly Leu Gly Lys Asp Ile Tyr Arg Tyr

835 840 845

Ser Lys Glu Tyr Gly Arg His Ile Ile Ile Glu Lys Gly Gly Asp Asp

850 855 860

Asp Thr Leu Leu Leu Ser Asp Leu Ser Phe Lys Asp Val Gly Phe Ile

865 870 875 880

Arg Ile Gly Asp Asp Leu Leu Val Asn Lys Arg Ile Gly Gly Thr Leu

885 890 895

Tyr Tyr His Glu Asp Tyr Asn Gly Asn Ala Leu Thr Ile Lys Asp Trp

900 905 910

Phe Lys Glu Gly Lys Glu Gly Gln Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Val

915 920 925

Asp Lys Asp Gly Ala Tyr Val Leu Ser Gln Tyr Leu Thr Glu Leu Thr

930 935 940

Ala Pro Gly Arg Gly Ile Asn Tyr Phe Asn Gly Leu Glu Glu Lys Leu

945 950 955 960

Tyr Tyr Gly Glu Gly Tyr Asn Ala Leu Pro Gln Leu Arg Lys Asp Ile

965 970 975

Glu Gln Ile Ile Ser Ser Thr Gly Ala Leu Thr Gly Glu His Gly Gln

980 985 990

Val Leu Val Gly Ala Gly Gly Pro Leu Ala Tyr Ser Asn Ser Pro Asn

995 1000 1005

Ser Ile Pro Asn Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Thr Gln Ser Ala

1010 1015 1020

<210> 2

<211> 956

<212> Белок

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIIA дикого типа

<400> 2

Met Ser Lys Ile Thr Leu Ser Ser Leu Lys Ser Ser Leu Gln Gln Gly

1 5 10 15

Leu Lys Asn Gly Lys Asn Lys Leu Asn Gln Ala Gly Thr Thr Leu Lys

20 25 30

Asn Gly Leu Thr Gln Thr Gly His Ser Leu Gln Asn Gly Ala Lys Lys

35 40 45

Leu Ile Leu Tyr Ile Pro Gln Gly Tyr Asp Ser Gly Gln Gly Asn Gly

50 55 60

Val Gln Asp Leu Val Lys Ala Ala Asn Asp Leu Gly Ile Glu Val Trp

65 70 75 80

Arg Glu Glu Arg Ser Asn Leu Asp Ile Ala Lys Thr Ser Phe Asp Thr

85 90 95

Thr Gln Lys Ile Leu Gly Phe Thr Asp Arg Gly Ile Val Leu Phe Ala

100 105 110

Pro Gln Leu Asp Asn Leu Leu Lys Lys Asn Pro Lys Ile Gly Asn Thr

115 120 125

Leu Gly Ser Ala Ser Ser Ile Ser Gln Asn Ile Gly Lys Ala Asn Thr

130 135 140

Val Leu Gly Gly Ile Gln Ser Ile Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Val

145 150 155 160

Asn Leu Asn Glu Leu Leu Gln Asn Lys Asp Pro Asn Gln Leu Glu Leu

165 170 175

Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn Glu Leu Val Gly Asn Ile Ala

180 185 190

Ser Ser Val Gln Thr Val Asp Ala Phe Ala Glu Gln Ile Ser Lys Leu

195 200 205

Gly Ser His Leu Gln Asn Val Lys Gly Leu Gly Gly Leu Ser Asn Lys

210 215 220

Leu Gln Asn Leu Pro Asp Leu Gly Lys Ala Ser Leu Gly Leu Asp Ile

225 230 235 240

Ile Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Ser Ala Gly Leu Ile Leu Ala Asp

245 250 255

Lys Glu Ala Ser Thr Glu Lys Lys Ala Ala Ala Gly Val Glu Phe Ala

260 265 270

Asn Gln Ile Ile Gly Asn Val Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu

275 280 285

Ala Gln Arg Val Ala Ser Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala

290 295 300

Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Leu Ala Val Ser Pro Leu Ser Phe Leu

305 310 315 320

Asn Val Ala Asp Lys Phe Lys Gln Ala Asp Leu Ile Lys Ser Tyr Ser

325 330 335

Glu Arg Phe Gln Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Arg Leu Leu Ala Asp

340 345 350

Phe His Arg Glu Thr Gly Thr Ile Asp Ala Ser Val Thr Thr Ile Asn

355 360 365

Thr Ala Leu Ala Ala Ile Ser Gly Gly Val Gly Ala Ala Ser Ala Gly

370 375 380

Ser Leu Val Gly Ala Pro Val Ala Leu Leu Val Ala Gly Val Thr Gly

385 390 395 400

Leu Ile Thr Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Lys Gln Ala Met Phe Glu His

405 410 415

Val Ala Asn Lys Val His Asp Arg Ile Val Glu Trp Glu Lys Lys His

420 425 430

Asn Lys Asn Tyr Phe Glu Gln Gly Tyr Asp Ser Arg His Leu Ala Asp

435 440 445

Leu Gln Asp Asn Met Lys Phe Leu Ile Asn Leu Asn Lys Glu Leu Gln

450 455 460

Ala Glu Arg Val Val Ala Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Asn Gln Ile

465 470 475 480

Gly Asp Leu Ala Ala Ile Ser Arg Arg Thr Asp Lys Ile Ser Ser Gly

485 490 495

Lys Ala Tyr Val Asp Ala Phe Glu Glu Gly Gln His Gln Ser Tyr Asp

500 505 510

Ser Ser Val Gln Leu Asp Asn Lys Asn Gly Ile Ile Asn Ile Ser Asn

515 520 525

Thr Asn Arg Lys Thr Gln Ser Val Leu Phe Arg Thr Pro Leu Leu Thr

530 535 540

Pro Gly Glu Glu Asn Arg Glu Arg Ile Gln Glu Gly Lys Asn Ser Tyr

545 550 555 560

Ile Thr Lys Leu His Ile Gln Arg Val Asp Ser Trp Thr Val Thr Asp

565 570 575

Gly Asp Ala Ser Ser Ser Val Asp Phe Thr Asn Val Val Gln Arg Ile

580 585 590

Ala Val Lys Phe Asp Asp Ala Gly Asn Ile Ile Glu Ser Lys Asp Thr

595 600 605

Lys Ile Ile Ala Asn Leu Gly Ala Gly Asn Asp Asn Val Phe Val Gly

610 615 620

Ser Ser Thr Thr Val Ile Asp Gly Gly Asp Gly His Asp Arg Val His

625 630 635 640

Tyr Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Ala Leu Val Ile Asp Ala Thr Ala Glu

645 650 655

Thr Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Val Lys Arg Tyr Val Gly Asp Ser Lys

660 665 670

Ala Leu His Glu Thr Ile Ala Thr His Gln Thr Asn Val Gly Asn Arg

675 680 685

Glu Glu Lys Ile Glu Tyr Arg Arg Glu Asp Asp Arg Phe His Thr Gly

690 695 700

Tyr Thr Val Thr Asp Ser Leu Lys Ser Val Glu Glu Ile Ile Gly Ser

705 710 715 720

Gln Phe Asn Asp Ile Phe Lys Gly Ser Gln Phe Asp Asp Val Phe His

725 730 735

Gly Gly Asn Gly Val Asp Thr Ile Asp Gly Asn Asp Gly Asp Asp His

740 745 750

Leu Phe Gly Gly Ala Gly Asp Asp Val Ile Asp Gly Gly Asn Gly Asn

755 760 765

Asn Phe Leu Val Gly Gly Thr Gly Asn Asp Ile Ile Ser Gly Gly Lys

770 775 780

Asp Asn Asp Ile Tyr Val His Lys Thr Gly Asp Gly Asn Asp Ser Ile

785 790 795 800

Thr Asp Ser Gly Gly Gln Asp Lys Leu Ala Phe Ser Asp Val Asn Leu

805 810 815

Lys Asp Leu Thr Phe Lys Lys Val Asp Ser Ser Leu Glu Ile Ile Asn

820 825 830

Gln Lys Gly Glu Lys Val Arg Ile Gly Asn Trp Phe Leu Glu Asp Asp

835 840 845

Leu Ala Ser Thr Val Ala Asn Tyr Lys Ala Thr Asn Asp Arg Lys Ile

850 855 860

Glu Glu Ile Ile Gly Lys Gly Gly Glu Arg Ile Thr Ser Glu Gln Val

865 870 875 880

Asp Lys Leu Ile Lys Glu Gly Asn Asn Gln Ile Ser Ala Glu Ala Leu

885 890 895

Ser Lys Val Val Asn Asp Tyr Asn Thr Ser Lys Asp Arg Gln Asn Val

900 905 910

Ser Asn Ser Leu Ala Lys Leu Ile Ser Ser Val Gly Ser Phe Thr Ser

915 920 925

Ser Ser Asp Phe Arg Asn Asn Leu Gly Thr Tyr Val Pro Ser Ser Ile

930 935 940

Asp Val Ser Asn Asn Ile Gln Leu Ala Arg Ala Ala

945 950 955

<210> 3

<211> 1052

<212> Белок

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIIIA дикого типа

<400> 3

Met Ser Thr Trp Ser Ser Met Leu Ala Asp Leu Lys Lys Arg Ala Glu

1 5 10 15

Glu Ala Lys Arg Gln Ala Lys Lys Gly Tyr Asp Val Thr Lys Asn Gly

20 25 30

Leu Gln Tyr Gly Val Ser Gln Ala Lys Leu Gln Ala Leu Ala Ala Gly

35 40 45

Lys Ala Val Gln Lys Tyr Gly Asn Lys Leu Val Leu Val Ile Pro Lys

50 55 60

Glu Tyr Asp Gly Ser Val Gly Asn Gly Phe Phe Asp Leu Val Lys Ala

65 70 75 80

Ala Glu Glu Leu Gly Ile Gln Val Lys Tyr Val Asn Arg Asn Glu Leu

85 90 95

Glu Val Ala His Lys Ser Leu Gly Thr Ala Asp Gln Phe Leu Gly Leu

100 105 110

Thr Glu Arg Gly Leu Thr Leu Phe Ala Pro Gln Leu Asp Gln Phe Leu

115 120 125

Gln Lys His Ser Lys Ile Ser Asn Val Val Gly Ser Ser Thr Gly Asp

130 135 140

Ala Val Ser Lys Leu Ala Lys Ser Gln Thr Ile Ile Ser Gly Ile Gln

145 150 155 160

Ser Val Leu Gly Thr Val Leu Ala Gly Ile Asn Leu Asn Glu Ala Ile

165 170 175

Ile Ser Gly Gly Ser Glu Leu Glu Leu Ala Glu Ala Gly Val Ser Leu

180 185 190

Ala Ser Glu Leu Val Ser Asn Ile Ala Lys Gly Thr Thr Thr Ile Asp

195 200 205

Ala Phe Thr Thr Gln Ile Gln Asn Phe Gly Lys Leu Val Glu Asn Ala

210 215 220

Lys Gly Leu Gly Gly Val Gly Arg Gln Leu Gln Asn Ile Ser Gly Ser

225 230 235 240

Ala Leu Ser Lys Thr Gly Leu Gly Leu Asp Ile Ile Ser Ser Leu Leu

245 250 255

Ser Gly Val Thr Ala Ser Phe Ala Leu Ala Asn Lys Asn Ala Ser Thr

260 265 270

Ser Thr Lys Val Ala Ala Gly Phe Glu Leu Ser Asn Gln Val Ile Gly

275 280 285

Gly Ile Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu Ala Gln Arg Leu Ala

290 295 300

Ala Gly Leu Ser Thr Thr Gly Pro Ala Ala Ala Leu Ile Ala Ser Ser

305 310 315 320

Ile Ser Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ala Phe Leu Arg Val Ala Asp Asn

325 330 335

Phe Asn Arg Ser Lys Glu Ile Gly Glu Phe Ala Glu Arg Phe Lys Lys

340 345 350

Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Lys Leu Leu Ser Glu Phe Tyr His Glu Ala

355 360 365

Gly Thr Ile Asp Ala Ser Ile Thr Thr Ile Ser Thr Ala Leu Ser Ala

370 375 380

Ile Ala Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Leu Val Gly Ala

385 390 395 400

Pro Ile Thr Leu Leu Val Thr Gly Ile Thr Gly Leu Ile Ser Gly Ile

405 410 415

Leu Glu Phe Ser Lys Gln Pro Met Leu Asp His Val Ala Ser Lys Ile

420 425 430

Gly Asn Lys Ile Asp Glu Trp Glu Lys Lys Tyr Gly Lys Asn Tyr Phe

435 440 445

Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg His Lys Ala Phe Leu Glu Asp Ser Phe

450 455 460

Ser Leu Leu Ser Ser Phe Asn Lys Gln Tyr Glu Thr Glu Arg Ala Val

465 470 475 480

Leu Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Glu Tyr Ile Gly Glu Leu Ala Gly

485 490 495

Ile Thr Gly Lys Gly Asp Lys Leu Ser Ser Gly Lys Ala Tyr Val Asp

500 505 510

Tyr Phe Gln Glu Gly Lys Leu Leu Glu Lys Lys Pro Asp Asp Phe Ser

515 520 525

Lys Val Val Phe Asp Pro Thr Lys Gly Glu Ile Asp Ile Ser Asn Ser

530 535 540

Gln Thr Ser Thr Leu Leu Lys Phe Val Thr Pro Leu Leu Thr Pro Gly

545 550 555 560

Thr Glu Ser Arg Glu Arg Thr Gln Thr Gly Lys Tyr Glu Tyr Ile Thr

565 570 575

Lys Leu Val Val Lys Gly Lys Asp Lys Trp Val Val Asn Gly Val Lys

580 585 590

Asp Lys Gly Ala Val Tyr Asp Tyr Thr Asn Leu Ile Gln His Ala His

595 600 605

Ile Ser Ser Ser Val Ala Arg Gly Glu Glu Tyr Arg Glu Val Arg Leu

610 615 620

Val Ser His Leu Gly Asn Gly Asn Asp Lys Val Phe Leu Ala Ala Gly

625 630 635 640

Ser Ala Glu Ile His Ala Gly Glu Gly His Asp Val Val Tyr Tyr Asp

645 650 655

Lys Thr Asp Thr Gly Leu Leu Val Ile Asp Gly Thr Lys Ala Thr Glu

660 665 670

Gln Gly Arg Tyr Ser Val Thr Arg Glu Leu Ser Gly Ala Thr Lys Ile

675 680 685

Leu Arg Glu Val Ile Lys Asn Gln Lys Ser Ala Val Gly Lys Arg Glu

690 695 700

Glu Thr Leu Glu Tyr Arg Asp Tyr Glu Leu Thr Gln Ser Gly Asn Ser

705 710 715 720

Asn Leu Lys Ala His Asp Glu Leu His Ser Val Glu Glu Ile Ile Gly

725 730 735

Ser Asn Gln Arg Asp Glu Phe Lys Gly Ser Lys Phe Arg Asp Ile Phe

740 745 750

His Gly Ala Asp Gly Asp Asp Leu Leu Asn Gly Asn Asp Gly Asp Asp

755 760 765

Ile Leu Tyr Gly Asp Lys Gly Asn Asp Glu Leu Arg Gly Asp Asn Gly

770 775 780

Asn Asp Gln Leu Tyr Gly Gly Glu Gly Asn Asp Lys Leu Leu Gly Gly

785 790 795 800

Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Ser Gly Gly Asp Gly Asn Asp Glu Leu Gln

805 810 815

Val Leu Gly Asn Gly Phe Asn Val Leu Arg Gly Gly Lys Gly Asp Asp

820 825 830

Lys Leu Tyr Gly Ser Ser Gly Ser Asp Leu Leu Asp Gly Gly Glu Gly

835 840 845

Asn Asp Tyr Leu Glu Gly Gly Asp Gly Ser Asp Phe Tyr Val Tyr Arg

850 855 860

Ser Thr Ser Gly Asn His Thr Ile Tyr Asp Gln Gly Lys Ser Ser Asp

865 870 875 880

Leu Asp Lys Leu Tyr Leu Ser Asp Phe Ser Phe Asp Arg Leu Leu Val

885 890 895

Glu Lys Val Asp Asp Asn Leu Val Leu Arg Ser Asn Glu Ser Ser His

900 905 910

Asn Asn Gly Val Leu Thr Ile Lys Asp Trp Phe Lys Glu Gly Asn Lys

915 920 925

Tyr Asn His Lys Ile Glu Gln Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Lys Leu

930 935 940

Thr Ala Glu Asn Leu Gly Thr Tyr Phe Lys Asn Ala Pro Lys Ala Asp

945 950 955 960

Asn Leu Leu Asn Tyr Ala Thr Lys Glu Asp Gln Asn Glu Ser Asn Leu

965 970 975

Ser Ser Leu Lys Thr Glu Leu Ser Lys Ile Ile Thr Asn Ala Gly Asn

980 985 990

Phe Gly Val Ala Lys Gln Gly Asn Thr Gly Ile Asn Thr Ala Ala Leu

995 1000 1005

Asn Asn Glu Val Asn Lys Ile Ile Ser Ser Ala Asn Thr Phe Ala Thr

1010 1015 1020

Ser Gln Leu Gly Gly Ser Gly Met Gly Thr Leu Pro Ser Thr Asn Val

1025 1030 1035 1040

Asn Ser Met Met Leu Gly Asn Leu Ala Arg Ala Ala

1045 1050

<210> 4

<211> 1022

<212> Белок

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIA K560A K686A

<400> 4

Met Ala Asn Ser Gln Leu Asp Arg Val Lys Gly Leu Ile Asp Ser Leu

1 5 10 15

Asn Gln His Thr Lys Ser Ala Ala Lys Ser Gly Ala Gly Ala Leu Lys

20 25 30

Asn Gly Leu Gly Gln Val Lys Gln Ala Gly Gln Lys Leu Ile Leu Tyr

35 40 45

Ile Pro Lys Asp Tyr Gln Ala Ser Thr Gly Ser Ser Leu Asn Asp Leu

50 55 60

Val Lys Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ile Glu Val His Arg Ser Glu Lys

65 70 75 80

Asn Gly Thr Ala Leu Ala Lys Glu Leu Phe Gly Thr Thr Glu Lys Leu

85 90 95

Leu Gly Phe Ser Glu Arg Gly Ile Ala Leu Phe Ala Pro Gln Phe Asp

100 105 110

Lys Leu Leu Asn Lys Asn Gln Lys Leu Ser Lys Ser Leu Gly Gly Ser

115 120 125

Ser Glu Ala Leu Gly Gln Arg Leu Asn Lys Thr Gln Thr Ala Leu Ser

130 135 140

Ala Leu Gln Ser Phe Leu Gly Thr Ala Ile Ala Gly Met Asp Leu Asp

145 150 155 160

Ser Leu Leu Arg Arg Arg Arg Asn Gly Glu Asp Val Ser Gly Ser Glu

165 170 175

Leu Ala Lys Ala Gly Val Asp Leu Ala Ala Gln Leu Val Asp Asn Ile

180 185 190

Ala Ser Ala Thr Gly Thr Val Asp Ala Phe Ala Glu Gln Leu Gly Lys

195 200 205

Leu Gly Asn Ala Leu Ser Asn Thr Arg Leu Ser Gly Leu Ala Ser Lys

210 215 220

Leu Asn Asn Leu Pro Asp Leu Ser Leu Ala Gly Pro Gly Phe Asp Ala

225 230 235 240

Val Ser Gly Ile Leu Ser Val Val Ser Ala Ser Phe Ile Leu Ser Asn

245 250 255

Lys Asp Ala Asp Ala Gly Thr Lys Ala Ala Ala Gly Ile Glu Ile Ser

260 265 270

Thr Lys Ile Leu Gly Asn Ile Gly Lys Ala Val Ser Gln Tyr Ile Ile

275 280 285

Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Thr Thr Ala Ala Thr Gly Gly

290 295 300

Leu Ile Gly Ser Val Val Ala Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ser Phe Leu

305 310 315 320

Asn Val Ala Asp Lys Phe Glu Arg Ala Lys Gln Leu Glu Gln Tyr Ser

325 330 335

Glu Arg Phe Lys Lys Phe Gly Tyr Glu Gly Asp Ser Leu Leu Ala Ser

340 345 350

Phe Tyr Arg Glu Thr Gly Ala Ile Glu Ala Ala Leu Thr Thr Ile Asn

355 360 365

Ser Val Leu Ser Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Ala Ala Ala Thr Gly

370 375 380

Ser Leu Val Gly Ala Pro Val Ala Ala Leu Val Ser Ala Ile Thr Gly

385 390 395 400

Ile Ile Ser Gly Ile Leu Asp Ala Ser Lys Gln Ala Ile Phe Glu Arg

405 410 415

Val Ala Thr Lys Leu Ala Asn Lys Ile Asp Glu Trp Glu Lys Lys His

420 425 430

Gly Lys Asn Tyr Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg His Ser Ala Phe

435 440 445

Leu Glu Asp Thr Phe Glu Leu Leu Ser Gln Tyr Asn Lys Glu Tyr Ser

450 455 460

Val Glu Arg Val Val Ala Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Val Asn Ile

465 470 475 480

Gly Glu Leu Ala Gly Ile Thr Arg Lys Gly Ala Asp Ala Lys Ser Gly

485 490 495

Lys Ala Tyr Val Asp Phe Phe Glu Glu Gly Lys Leu Leu Glu Lys Asp

500 505 510

Pro Asp Arg Phe Asp Lys Lys Val Phe Asp Pro Leu Glu Gly Lys Ile

515 520 525

Asp Leu Ser Ser Ile Asn Lys Thr Thr Leu Leu Lys Phe Ile Thr Pro

530 535 540

Val Phe Thr Ala Gly Glu Glu Ile Arg Glu Arg Lys Gln Thr Gly Ala

545 550 555 560

Tyr Glu Tyr Met Thr Glu Leu Phe Val Lys Gly Lys Glu Lys Trp Val

565 570 575

Val Thr Gly Val Gln Ser His Asn Ala Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Leu

580 585 590

Ile Gln Leu Ala Ile Asp Lys Lys Gly Glu Lys Arg Gln Val Thr Ile

595 600 605

Glu Ser His Leu Gly Glu Lys Asn Asp Arg Ile Tyr Leu Ser Ser Gly

610 615 620

Ser Ser Ile Val Tyr Ala Gly Asn Gly His Asp Val Ala Tyr Tyr Asp

625 630 635 640

Lys Thr Asp Thr Gly Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Gln Ser Ala Gln Lys

645 650 655

Ala Gly Glu Tyr Ile Val Thr Lys Glu Leu Lys Ala Asp Val Lys Val

660 665 670

Leu Lys Glu Val Val Lys Thr Gln Asp Ile Ser Val Gly Ala Arg Ser

675 680 685

Glu Lys Leu Glu Tyr Arg Asp Tyr Glu Leu Ser Pro Phe Glu Leu Gly

690 695 700

Asn Gly Ile Arg Ala Lys Asp Glu Leu His Ser Val Glu Glu Ile Ile

705 710 715 720

Gly Ser Asn Arg Lys Asp Lys Phe Phe Gly Ser Arg Phe Thr Asp Ile

725 730 735

Phe His Gly Ala Lys Gly Asp Asp Glu Ile Tyr Gly Asn Asp Gly His

740 745 750

Asp Ile Leu Tyr Gly Asp Asp Gly Asn Asp Val Ile His Gly Gly Asp

755 760 765

Gly Asn Asp His Leu Val Gly Gly Asn Gly Asn Asp Arg Leu Ile Gly

770 775 780

Gly Lys Gly Asn Asn Phe Leu Asn Gly Gly Asp Gly Asp Asp Glu Leu

785 790 795 800

Gln Val Phe Glu Gly Gln Tyr Asn Val Leu Leu Gly Gly Ala Gly Asn

805 810 815

Asp Ile Leu Tyr Gly Ser Asp Gly Thr Asn Leu Phe Asp Gly Gly Val

820 825 830

Gly Asn Asp Lys Ile Tyr Gly Gly Leu Gly Lys Asp Ile Tyr Arg Tyr

835 840 845

Ser Lys Glu Tyr Gly Arg His Ile Ile Ile Glu Lys Gly Gly Asp Asp

850 855 860

Asp Thr Leu Leu Leu Ser Asp Leu Ser Phe Lys Asp Val Gly Phe Ile

865 870 875 880

Arg Ile Gly Asp Asp Leu Leu Val Asn Lys Arg Ile Gly Gly Thr Leu

885 890 895

Tyr Tyr His Glu Asp Tyr Asn Gly Asn Ala Leu Thr Ile Lys Asp Trp

900 905 910

Phe Lys Glu Gly Lys Glu Gly Gln Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Val

915 920 925

Asp Lys Asp Gly Ala Tyr Val Leu Ser Gln Tyr Leu Thr Glu Leu Thr

930 935 940

Ala Pro Gly Arg Gly Ile Asn Tyr Phe Asn Gly Leu Glu Glu Lys Leu

945 950 955 960

Tyr Tyr Gly Glu Gly Tyr Asn Ala Leu Pro Gln Leu Arg Lys Asp Ile

965 970 975

Glu Gln Ile Ile Ser Ser Thr Gly Ala Leu Thr Gly Glu His Gly Gln

980 985 990

Val Leu Val Gly Ala Gly Gly Pro Leu Ala Tyr Ser Asn Ser Pro Asn

995 1000 1005

Ser Ile Pro Asn Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Thr Gln Ser Ala

1010 1015 1020

<210> 5

<211> 956

<212> Белок

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIIA S148G K557A N687A

<400> 5

Met Ser Lys Ile Thr Leu Ser Ser Leu Lys Ser Ser Leu Gln Gln Gly

1 5 10 15

Leu Lys Asn Gly Lys Asn Lys Leu Asn Gln Ala Gly Thr Thr Leu Lys

20 25 30

Asn Gly Leu Thr Gln Thr Gly His Ser Leu Gln Asn Gly Ala Lys Lys

35 40 45

Leu Ile Leu Tyr Ile Pro Gln Gly Tyr Asp Ser Gly Gln Gly Asn Gly

50 55 60

Val Gln Asp Leu Val Lys Ala Ala Asn Asp Leu Gly Ile Glu Val Trp

65 70 75 80

Arg Glu Glu Arg Ser Asn Leu Asp Ile Ala Lys Thr Ser Phe Asp Thr

85 90 95

Thr Gln Lys Ile Leu Gly Phe Thr Asp Arg Gly Ile Val Leu Phe Ala

100 105 110

Pro Gln Leu Asp Asn Leu Leu Lys Lys Asn Pro Lys Ile Gly Asn Thr

115 120 125

Leu Gly Ser Ala Ser Ser Ile Ser Gln Asn Ile Gly Lys Ala Asn Thr

130 135 140

Val Leu Gly Gly Ile Gln Ser Ile Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Val

145 150 155 160

Asn Leu Asn Glu Leu Leu Gln Asn Lys Asp Pro Asn Gln Leu Glu Leu

165 170 175

Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn Glu Leu Val Gly Asn Ile Ala

180 185 190

Ser Ser Val Gln Thr Val Asp Ala Phe Ala Glu Gln Ile Ser Lys Leu

195 200 205

Gly Ser His Leu Gln Asn Val Lys Gly Leu Gly Gly Leu Ser Asn Lys

210 215 220

Leu Gln Asn Leu Pro Asp Leu Gly Lys Ala Ser Leu Gly Leu Asp Ile

225 230 235 240

Ile Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Ser Ala Gly Leu Ile Leu Ala Asp

245 250 255

Lys Glu Ala Ser Thr Glu Lys Lys Ala Ala Ala Gly Val Glu Phe Ala

260 265 270

Asn Gln Ile Ile Gly Asn Val Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu

275 280 285

Ala Gln Arg Val Ala Ser Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala

290 295 300

Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Leu Ala Val Ser Pro Leu Ser Phe Leu

305 310 315 320

Asn Val Ala Asp Lys Phe Lys Gln Ala Asp Leu Ile Lys Ser Tyr Ser

325 330 335

Glu Arg Phe Gln Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Arg Leu Leu Ala Asp

340 345 350

Phe His Arg Glu Thr Gly Thr Ile Asp Ala Ser Val Thr Thr Ile Asn

355 360 365

Thr Ala Leu Ala Ala Ile Ser Gly Gly Val Gly Ala Ala Ser Ala Gly

370 375 380

Ser Leu Val Gly Ala Pro Val Ala Leu Leu Val Ala Gly Val Thr Gly

385 390 395 400

Leu Ile Thr Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Lys Gln Ala Met Phe Glu His

405 410 415

Val Ala Asn Lys Val His Asp Arg Ile Val Glu Trp Glu Lys Lys His

420 425 430

Asn Lys Asn Tyr Phe Glu Gln Gly Tyr Asp Ser Arg His Leu Ala Asp

435 440 445

Leu Gln Asp Asn Met Lys Phe Leu Ile Asn Leu Asn Lys Glu Leu Gln

450 455 460

Ala Glu Arg Val Val Ala Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Asn Gln Ile

465 470 475 480

Gly Asp Leu Ala Ala Ile Ser Arg Arg Thr Asp Lys Ile Ser Ser Gly

485 490 495

Lys Ala Tyr Val Asp Ala Phe Glu Glu Gly Gln His Gln Ser Tyr Asp

500 505 510

Ser Ser Val Gln Leu Asp Asn Lys Asn Gly Ile Ile Asn Ile Ser Asn

515 520 525

Thr Asn Arg Lys Thr Gln Ser Val Leu Phe Arg Thr Pro Leu Leu Thr

530 535 540

Pro Gly Glu Glu Asn Arg Glu Arg Ile Gln Glu Gly Ala Asn Ser Tyr

545 550 555 560

Ile Thr Lys Leu His Ile Gln Arg Val Asp Ser Trp Thr Val Thr Asp

565 570 575

Gly Asp Ala Ser Ser Ser Val Asp Phe Thr Asn Val Val Gln Arg Ile

580 585 590

Ala Val Lys Phe Asp Asp Ala Gly Asn Ile Ile Glu Ser Lys Asp Thr

595 600 605

Lys Ile Ile Ala Asn Leu Gly Ala Gly Asn Asp Asn Val Phe Val Gly

610 615 620

Ser Ser Thr Thr Val Ile Asp Gly Gly Asp Gly His Asp Arg Val His

625 630 635 640

Tyr Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Ala Leu Val Ile Asp Ala Thr Ala Glu

645 650 655

Thr Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Val Lys Arg Tyr Val Gly Asp Ser Lys

660 665 670

Ala Leu His Glu Thr Ile Ala Thr His Gln Thr Asn Val Gly Ala Arg

675 680 685

Glu Glu Lys Ile Glu Tyr Arg Arg Glu Asp Asp Arg Phe His Thr Gly

690 695 700

Tyr Thr Val Thr Asp Ser Leu Lys Ser Val Glu Glu Ile Ile Gly Ser

705 710 715 720

Gln Phe Asn Asp Ile Phe Lys Gly Ser Gln Phe Asp Asp Val Phe His

725 730 735

Gly Gly Asn Gly Val Asp Thr Ile Asp Gly Asn Asp Gly Asp Asp His

740 745 750

Leu Phe Gly Gly Ala Gly Asp Asp Val Ile Asp Gly Gly Asn Gly Asn

755 760 765

Asn Phe Leu Val Gly Gly Thr Gly Asn Asp Ile Ile Ser Gly Gly Lys

770 775 780

Asp Asn Asp Ile Tyr Val His Lys Thr Gly Asp Gly Asn Asp Ser Ile

785 790 795 800

Thr Asp Ser Gly Gly Gln Asp Lys Leu Ala Phe Ser Asp Val Asn Leu

805 810 815

Lys Asp Leu Thr Phe Lys Lys Val Asp Ser Ser Leu Glu Ile Ile Asn

820 825 830

Gln Lys Gly Glu Lys Val Arg Ile Gly Asn Trp Phe Leu Glu Asp Asp

835 840 845

Leu Ala Ser Thr Val Ala Asn Tyr Lys Ala Thr Asn Asp Arg Lys Ile

850 855 860

Glu Glu Ile Ile Gly Lys Gly Gly Glu Arg Ile Thr Ser Glu Gln Val

865 870 875 880

Asp Lys Leu Ile Lys Glu Gly Asn Asn Gln Ile Ser Ala Glu Ala Leu

885 890 895

Ser Lys Val Val Asn Asp Tyr Asn Thr Ser Lys Asp Arg Gln Asn Val

900 905 910

Ser Asn Ser Leu Ala Lys Leu Ile Ser Ser Val Gly Ser Phe Thr Ser

915 920 925

Ser Ser Asp Phe Arg Asn Asn Leu Gly Thr Tyr Val Pro Ser Ser Ile

930 935 940

Asp Val Ser Asn Asn Ile Gln Leu Ala Arg Ala Ala

945 950 955

<210> 6

<211> 1052

<212> Белок

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIIIA K571A K702A

<400> 6

Met Ser Thr Trp Ser Ser Met Leu Ala Asp Leu Lys Lys Arg Ala Glu

1 5 10 15

Glu Ala Lys Arg Gln Ala Lys Lys Gly Tyr Asp Val Thr Lys Asn Gly

20 25 30

Leu Gln Tyr Gly Val Ser Gln Ala Lys Leu Gln Ala Leu Ala Ala Gly

35 40 45

Lys Ala Val Gln Lys Tyr Gly Asn Lys Leu Val Leu Val Ile Pro Lys

50 55 60

Glu Tyr Asp Gly Ser Val Gly Asn Gly Phe Phe Asp Leu Val Lys Ala

65 70 75 80

Ala Glu Glu Leu Gly Ile Gln Val Lys Tyr Val Asn Arg Asn Glu Leu

85 90 95

Glu Val Ala His Lys Ser Leu Gly Thr Ala Asp Gln Phe Leu Gly Leu

100 105 110

Thr Glu Arg Gly Leu Thr Leu Phe Ala Pro Gln Leu Asp Gln Phe Leu

115 120 125

Gln Lys His Ser Lys Ile Ser Asn Val Val Gly Ser Ser Thr Gly Asp

130 135 140

Ala Val Ser Lys Leu Ala Lys Ser Gln Thr Ile Ile Ser Gly Ile Gln

145 150 155 160

Ser Val Leu Gly Thr Val Leu Ala Gly Ile Asn Leu Asn Glu Ala Ile

165 170 175

Ile Ser Gly Gly Ser Glu Leu Glu Leu Ala Glu Ala Gly Val Ser Leu

180 185 190

Ala Ser Glu Leu Val Ser Asn Ile Ala Lys Gly Thr Thr Thr Ile Asp

195 200 205

Ala Phe Thr Thr Gln Ile Gln Asn Phe Gly Lys Leu Val Glu Asn Ala

210 215 220

Lys Gly Leu Gly Gly Val Gly Arg Gln Leu Gln Asn Ile Ser Gly Ser

225 230 235 240

Ala Leu Ser Lys Thr Gly Leu Gly Leu Asp Ile Ile Ser Ser Leu Leu

245 250 255

Ser Gly Val Thr Ala Ser Phe Ala Leu Ala Asn Lys Asn Ala Ser Thr

260 265 270

Ser Thr Lys Val Ala Ala Gly Phe Glu Leu Ser Asn Gln Val Ile Gly

275 280 285

Gly Ile Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu Ala Gln Arg Leu Ala

290 295 300

Ala Gly Leu Ser Thr Thr Gly Pro Ala Ala Ala Leu Ile Ala Ser Ser

305 310 315 320

Ile Ser Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ala Phe Leu Arg Val Ala Asp Asn

325 330 335

Phe Asn Arg Ser Lys Glu Ile Gly Glu Phe Ala Glu Arg Phe Lys Lys

340 345 350

Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Lys Leu Leu Ser Glu Phe Tyr His Glu Ala

355 360 365

Gly Thr Ile Asp Ala Ser Ile Thr Thr Ile Ser Thr Ala Leu Ser Ala

370 375 380

Ile Ala Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Leu Val Gly Ala

385 390 395 400

Pro Ile Thr Leu Leu Val Thr Gly Ile Thr Gly Leu Ile Ser Gly Ile

405 410 415

Leu Glu Phe Ser Lys Gln Pro Met Leu Asp His Val Ala Ser Lys Ile

420 425 430

Gly Asn Lys Ile Asp Glu Trp Glu Lys Lys Tyr Gly Lys Asn Tyr Phe

435 440 445

Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg His Lys Ala Phe Leu Glu Asp Ser Phe

450 455 460

Ser Leu Leu Ser Ser Phe Asn Lys Gln Tyr Glu Thr Glu Arg Ala Val

465 470 475 480

Leu Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Glu Tyr Ile Gly Glu Leu Ala Gly

485 490 495

Ile Thr Gly Lys Gly Asp Lys Leu Ser Ser Gly Lys Ala Tyr Val Asp

500 505 510

Tyr Phe Gln Glu Gly Lys Leu Leu Glu Lys Lys Pro Asp Asp Phe Ser

515 520 525

Lys Val Val Phe Asp Pro Thr Lys Gly Glu Ile Asp Ile Ser Asn Ser

530 535 540

Gln Thr Ser Thr Leu Leu Lys Phe Val Thr Pro Leu Leu Thr Pro Gly

545 550 555 560

Thr Glu Ser Arg Glu Arg Thr Gln Thr Gly Ala Tyr Glu Tyr Ile Thr

565 570 575

Lys Leu Val Val Lys Gly Lys Asp Lys Trp Val Val Asn Gly Val Lys

580 585 590

Asp Lys Gly Ala Val Tyr Asp Tyr Thr Asn Leu Ile Gln His Ala His

595 600 605

Ile Ser Ser Ser Val Ala Arg Gly Glu Glu Tyr Arg Glu Val Arg Leu

610 615 620

Val Ser His Leu Gly Asn Gly Asn Asp Lys Val Phe Leu Ala Ala Gly

625 630 635 640

Ser Ala Glu Ile His Ala Gly Glu Gly His Asp Val Val Tyr Tyr Asp

645 650 655

Lys Thr Asp Thr Gly Leu Leu Val Ile Asp Gly Thr Lys Ala Thr Glu

660 665 670

Gln Gly Arg Tyr Ser Val Thr Arg Glu Leu Ser Gly Ala Thr Lys Ile

675 680 685

Leu Arg Glu Val Ile Lys Asn Gln Lys Ser Ala Val Gly Ala Arg Glu

690 695 700

Glu Thr Leu Glu Tyr Arg Asp Tyr Glu Leu Thr Gln Ser Gly Asn Ser

705 710 715 720

Asn Leu Lys Ala His Asp Glu Leu His Ser Val Glu Glu Ile Ile Gly

725 730 735

Ser Asn Gln Arg Asp Glu Phe Lys Gly Ser Lys Phe Arg Asp Ile Phe

740 745 750

His Gly Ala Asp Gly Asp Asp Leu Leu Asn Gly Asn Asp Gly Asp Asp

755 760 765

Ile Leu Tyr Gly Asp Lys Gly Asn Asp Glu Leu Arg Gly Asp Asn Gly

770 775 780

Asn Asp Gln Leu Tyr Gly Gly Glu Gly Asn Asp Lys Leu Leu Gly Gly

785 790 795 800

Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Ser Gly Gly Asp Gly Asn Asp Glu Leu Gln

805 810 815

Val Leu Gly Asn Gly Phe Asn Val Leu Arg Gly Gly Lys Gly Asp Asp

820 825 830

Lys Leu Tyr Gly Ser Ser Gly Ser Asp Leu Leu Asp Gly Gly Glu Gly

835 840 845

Asn Asp Tyr Leu Glu Gly Gly Asp Gly Ser Asp Phe Tyr Val Tyr Arg

850 855 860

Ser Thr Ser Gly Asn His Thr Ile Tyr Asp Gln Gly Lys Ser Ser Asp

865 870 875 880

Leu Asp Lys Leu Tyr Leu Ser Asp Phe Ser Phe Asp Arg Leu Leu Val

885 890 895

Glu Lys Val Asp Asp Asn Leu Val Leu Arg Ser Asn Glu Ser Ser His

900 905 910

Asn Asn Gly Val Leu Thr Ile Lys Asp Trp Phe Lys Glu Gly Asn Lys

915 920 925

Tyr Asn His Lys Ile Glu Gln Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Lys Leu

930 935 940

Thr Ala Glu Asn Leu Gly Thr Tyr Phe Lys Asn Ala Pro Lys Ala Asp

945 950 955 960

Asn Leu Leu Asn Tyr Ala Thr Lys Glu Asp Gln Asn Glu Ser Asn Leu

965 970 975

Ser Ser Leu Lys Thr Glu Leu Ser Lys Ile Ile Thr Asn Ala Gly Asn

980 985 990

Phe Gly Val Ala Lys Gln Gly Asn Thr Gly Ile Asn Thr Ala Ala Leu

995 1000 1005

Asn Asn Glu Val Asn Lys Ile Ile Ser Ser Ala Asn Thr Phe Ala Thr

1010 1015 1020

Ser Gln Leu Gly Gly Ser Gly Met Gly Thr Leu Pro Ser Thr Asn Val

1025 1030 1035 1040

Asn Ser Met Met Leu Gly Asn Leu Ala Arg Ala Ala

1045 1050

<210> 7

<211> 3078

<212> ДНК

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIA дикого типа

<400> 7

ggatccgcaa attctcaact ggaccgcgta aagggcctca ttgacagcct caaccaacac 60

accaaatcgg ctgcgaaatc cggtgcgggt gcgctgaaaa atggtctggg tcaggtgaaa 120

caggcgggtc agaaactgat cttatacatc ccgaaagatt atcaggcttc aaccggctcc 180

agtcttaatg atttggtaaa agccgccgaa gcactgggta ttgaagtaca tcgcagcgaa 240

aaaaatggga ctgcgttagc gaaagagctg tttggcacaa cggaaaagct gctgggcttt 300

agtgaacgtg gcattgcgct gtttgcacca cagttcgata aattgttaaa taagaatcag 360

aaactgagca agtccttagg cggctcatca gaagccctgg gtcagcgtct gaacaaaact 420

cagacagccc tgagtgcatt acagtcattt ctcgggacgg caattgcagg catggatctg 480

gatagcctgc ttcgccgtcg gcgtaacggt gaggatgtct cgggcagcga gctggcaaaa 540

gccggcgttg acctggcagc ccagttggtt gacaacatcg catctgccac cggcactgtt 600

gacgcttttg ccgaacaact gggcaaatta gggaacgcgc tgtctaacac gcgcttatct 660

gggctcgcat ccaaactcaa caacttgccg gacttgtcgc tggcaggacc tggctttgac 720

gcggtttcag gcattctgtc cgtggttagt gcttcgttca ttcttagcaa caaagacgcc 780

gatgcgggta ccaaggcggc cgctgggatt gaaatcagca cgaaaatctt gggtaatatt 840

ggcaaggcag tgtcgcagta tatcatcgct caacgtgtgg ccgcaggcct cagcaccacc 900

gcggccacag gtggcctgat tggtagtgtc gtcgctctgg ccatttctcc cctgtcgttc 960

ctgaacgttg cggacaaatt tgaacgcgct aaacagctgg aacagtattc tgaacgcttt 1020

aaaaaatttg gatatgaagg cgatagcctg ctggcatcct tttaccgcga aaccggtgcg 1080

attgaagccg cattgaccac cattaactcg gtactcagtg ctgccagtgc aggggtggga 1140

gcggcagcca caggttctct ggtcggagcc ccggttgctg ccttagtgtc tgccattacc 1200

gggattatct cgggcatcct tgatgcgtct aaacaggcga ttttcgaacg cgtggcgacg 1260

aaactggcga acaaaattga tgaatgggaa aagaaacacg gtaagaacta ctttgagaac 1320

ggctatgatg cccgtcatag tgcgtttctc gaagatacct ttgaactttt gtcgcaatac 1380

aacaaagagt atagcgtgga gcgcgtagtt gctattacac agcagcgttg ggatgtgaat 1440

attggggaat tggcggggat cacccgtaaa ggcgcggatg caaaatccgg taaagcttac 1500

gtcgatttct tcgaggaagg gaaactgctg gaaaaggacc cggatcgctt tgataagaaa 1560

gtgttcgacc cgcttgaggg taaaattgac ttgtcatcca ttaacaaaac gacgttgctg 1620

aaattcatta cgcccgtgtt tacggcggga gaagaaattc gcgaacgcaa acagactggg 1680

aaatacgagt acatgactga actgtttgtt aaagggaagg aaaagtgggt agtcaccggt 1740

gttcagtcgc acaatgcgat ttacgattat actaacctga ttcagctggc aatcgacaag 1800

aaaggtgaaa aacgccaagt gaccatcgag agtcaccttg gcgaaaagaa cgatcgtatc 1860

tatctgagca gtggcagctc aatcgtctat gccggcaacg gtcatgacgt tgcctattac 1920

gataaaacgg ataccggata tctgacgttt gacggtcaaa gcgcgcagaa agcgggtgaa 1980

tatatcgtca ctaaggaatt gaaagccgac gttaaagtcc tgaaagaggt ggtcaaaacc 2040

caagatatct cagtaggcaa acgcagcgag aaactggagt accgcgatta tgagctgagc 2100

ccgtttgaac ttggtaacgg gattcgtgcg aaagatgaac tgcatagcgt ggaagagatt 2160

attggatcga atcggaaaga caaattcttt ggtagccgct tcaccgatat ctttcatggc 2220

gccaaaggcg acgacgagat ttatgggaat gatgggcatg atatcctgta tggcgacgat 2280

ggcaacgatg tgattcatgg aggcgacggt aatgatcact tagtgggcgg caatgggaat 2340

gaccgtctga tcggcgggaa aggcaataat ttcctgaatg gcggtgatgg cgatgatgaa 2400

cttcaggtgt tcgaggggca atataatgtg ctgttaggcg gcgccggcaa cgatatttta 2460

tacggtagtg atggtaccaa cctcttcgat ggtggcgtgg gtaatgataa aatctatggt 2520

ggcctgggca aagatatcta tcgctattct aaagaatacg gtcggcatat tatcattgaa 2580

aaaggtggtg acgacgacac cctgctgttg agcgatcttt ccttcaagga cgtcggtttc 2640

attcgtattg gagatgatct gctggtgaac aaacggatcg gcggcaccct gtattaccac 2700

gaggattaca acggtaatgc gcttacaatc aaagattggt ttaaagaggg taaggaaggt 2760

cagaataaca aaattgaaaa gatcgttgac aaagatggag cttatgtcct gtcccagtat 2820

ttgaccgaac tcacggcgcc tggtcgtggc attaattact tcaacggatt agaagagaag 2880

ttatactacg gtgaaggcta caacgcgctc ccgcaactgc gcaaagatat tgaacaaatc 2940

atctccagca ccggagcttt aacgggcgaa catggccaag ttctggtagg agcgggtggc 3000

ccactggcgt attcaaattc tccgaacagc attccaaacg cgttttcgaa ttatctgact 3060

cagagcgctt aagagctc 3078

<210> 8

<211> 2880

<212> ДНК

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIIA дикого типа

<400> 8

ggatcctcga aaattacctt gtccagcctg aaatccagct tacagcaagg tctgaagaat 60

gggaagaaca aactgaacca agccggtacc acgctgaaga atggattgac gcaaacaggt 120

catagtctgc agaatggtgc gaagaaatta atcctctaca ttccgcaggg ctatgactca 180

ggccaaggca acggggtcca ggacctcgta aaagccgcga atgatctggg cattgaggtg 240

tggcgcgaag aacgtagtaa cctggatatt gcgaaaactt cgttcgatac cacccagaaa 300

attctgggat tcaccgaccg gggcatcgtg ttgttcgcac cccagctgga taatctcctg 360

aagaagaacc cgaaaatcgg caacacgctg ggcagcgcat caagcatctc gcagaacatc 420

ggcaaagcca ataccgtctt aggtggaatc cagagcattc tgggtagcgt gctttctggc 480

gtgaacttaa acgaattact tcagaacaaa gacccgaatc agctggaact ggcgaaagct 540

ggactggaac ttacgaacga actggtaggt aacattgcca gctctgtaca aaccgttgat 600

gcgtttgcgg agcagatcag taaactgggt tctcatttgc aaaatgttaa agggctgggt 660

ggtctgagta acaaattgca gaatctgccg gacctgggca aggcttcttt ggggctggat 720

attatctcgg ggctgttgtc tggcgcaagc gctggcctga ttttagcgga taaggaggct 780

tcgaccgaaa agaaggccgc tgccggcgta gaatttgcga accagattat tgggaacgtg 840

accaaagcgg tgagtagcta tattttggcg caacgtgttg cctccggttt gagtagtact 900

ggtccagtcg cagcactgat tgccagtact gtggcactgg cggttagtcc actgtccttt 960

ctgaatgtcg cggataaatt taaacaagcc gatctcatca aatcttatag tgaacgtttc 1020

cagaaattag gttatgatgg cgatcgctta ctggcggact ttcaccggga aacaggcacc 1080

attgatgcaa gcgtgaccac gattaatacc gcgcttgcag caatcagcgg tggtgttggg 1140

gcagcgagtg ctggaagcct ggttggcgcg cctgttgctc tgcttgtagc gggtgtaacg 1200

ggcttaatca caacgatcct cgaatattcc aaacaagcga tgtttgagca tgtcgctaac 1260

aaagtccacg accgcatcgt ggaatgggaa aaaaaacaca ataaaaacta ctttgagcag 1320

ggctacgaca gccgtcattt ggcagatctg caggacaata tgaaattcct catcaactta 1380

aacaaagaac ttcaggctga acgtgtcgtg gcgattacgc aacaacgttg ggataaccag 1440

attggcgacc tggcggccat ttcccgtcgc actgacaaaa tttcctcggg taaagcatat 1500

gtggacgcgt ttgaggaagg tcagcaccag agctatgata gttcagtgca gttagacaat 1560

aaaaatggta ttattaacat ttcaaacaca aaccgcaaga cccaatcagt actgtttcgc 1620

acgccgttac tgaccccggg tgaagaaaac cgcgagcgca ttcaggaggg taagaactcc 1680

tacattacca aacttcacat tcagcgcgta gattcatgga cggtgacgga tggcgatgcg 1740

tcatcgagcg tagatttcac caatgtggtt cagcgtattg cggtgaaatt cgatgatgca 1800

ggaaacatta tcgagtcaaa agatactaaa attatcgcca atctcggtgc cggtaatgac 1860

aatgtctttg taggcagcag cacgacggtg attgacggcg gtgacggcca tgatcgcgtt 1920

cattattcgc gtggcgaata cggcgctctg gtcattgacg caactgccga gacagagaaa 1980

ggtagctact ccgttaaacg ttatgttggt gactcaaaag cgctgcacga aacgattgcc 2040

actcatcaga ccaatgtggg gaatcgcgaa gagaaaatcg agtatcgccg cgaagatgat 2100

cggttccata ccgggtatac tgtgaccgat tcgctgaaaa gcgtcgaaga aattatcgga 2160

tctcaattca atgacatctt caaaggttcc cagtttgatg acgtgtttca tggcggtaat 2220

ggcgttgata ccattgacgg caacgatggc gacgaccatc tgtttggcgg ggctggtgat 2280

gacgtgatcg atggcggcaa cggcaacaac tttctggtgg gtggtaccgg gaacgatatc 2340

atttcaggcg gcaaagataa cgacatctac gttcacaaga caggggatgg gaatgatagc 2400

attactgatt cgggtggcca agataagctg gccttttctg acgttaatct gaaagatctg 2460

actttcaaaa aggtggattc tagcctggaa atcattaatc agaaaggaga gaaggtccgc 2520

attggaaatt ggtttctcga agatgatctt gcctcgaccg tggcaaacta caaagcgacc 2580

aatgaccgca aaatcgaaga aatcattggg aaaggcggtg aacgcatcac ctctgaacag 2640

gtggataaac tgatcaaaga aggcaataac cagatttccg ctgaagcgtt gtctaaagtc 2700

gtcaacgatt acaacacgtc caaagatcgc caaaacgtta gcaattcact tgccaaactg 2760

atctcgagcg ttggatcttt tacatcctcg agcgatttcc gtaacaacct cggcacctat 2820

gttccttctt cgattgatgt cagtaataat atccaactgg cccgtgccgc ctaagagctc 2880

<210> 9

<211> 3168

<212> ДНК

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIIIA дикого типа

<400> 9

ggatcctcta cctggtcctc catgctggct gatctgaaga agcgtgcgga agaagccaaa

60

cgtcaggcga aaaaaggtta tgacgtcacg aagaacggcc tgcagtacgg tgttagtcaa

120

gccaaactgc aggctctggc agccggtaaa gctgttcaga aatacggtaa caaacttgtg

180

ttagtaattc cgaaagaata tgatgggtcg gtgggtaatg gcttcttcga cctggtcaaa

240

gccgcggaag aactgggcat tcaggtgaaa tatgtcaacc gcaacgaact cgaggttgcg

300

cataaatctc tgggaacggc ggatcagttt ctgggtctga ctgagcgtgg cctgaccctg

360

tttgcaccgc agcttgacca gttcttacag aaacacagca aaatctcaaa tgtggttggt

420

tcttcaactg gtgacgcggt gagcaaactg gcaaagtctc agacaatcat ttctggaatc

480

cagtcggtgt tgggcactgt actcgctggg atcaacttaa atgaagccat catttcaggc

540

ggctctgaat tggagctggc ggaagctggc gtaagcctgg cgtcggaact ggtgtcgaat

600

atcgccaaag gcaccacgac aattgatgcg tttaccaccc aaattcagaa ttttggaaaa

660

ctggtcgaaa acgcgaaggg cctgggtggc gtgggtcgtc agctgcaaaa catttccggt

720

agcgccttga gcaaaactgg tttgggctta gacatcatca gcagcttgct gagtggagtc

780

acagcgagct ttgcgctggc aaacaagaat gcctctacct ccaccaaagt tgctgccggt

840

tttgaactgt cgaatcaagt tattggaggc attaccaaag cggtcagctc atatatcctg

900

gcccaacgtc tggcggcggg tttgagcacg actggacccg ctgcagcgct gattgcatct

960

agtattagtc tggccatcag cccgctggcg tttctgcgcg tagctgataa tttcaaccgc

1020

agcaaagaaa tcggtgagtt cgcggaacgc tttaagaaat taggctatga tggggataag

1080

ctgctgtctg aattttacca tgaggctggc accattgacg catctatcac gacaatttcg

1140

acagccctgt cagcgattgc cgcagggact gcagccgctt cagccggcgc cctggttggt

1200

gcaccgatta cgcttcttgt cacgggtatt accggcttga ttagcggcat cctggaattt

1260

tccaaacagc cgatgctgga ccatgtagca agtaaaattg gcaacaaaat cgacgagtgg

1320

gaaaagaaat atggtaagaa ctacttcgag aatggttatg atgctcgcca taaagccttc

1380

ttggaagatt cgttcagcct gctcagttcc ttcaataagc aatatgaaac cgaacgcgcc

1440

gtgctgatca cccaacagcg ctgggatgag tacattgggg aactggcggg tattacgggt

1500

aagggtgaca aattatcaag cgggaaggca tacgttgatt attttcagga gggtaaactt

1560

ctggagaaga aacccgacga tttcagcaaa gtagtgtttg atccgacaaa aggcgagatc

1620

gatatcagca attcccagac ctctaccctg ctgaaatttg tgacccctct cctgacccca

1680

ggaactgaaa gccgtgaacg cactcaaacg ggaaagtacg aatacattac taaactcgtg

1740

gtaaaaggga aagataaatg ggtcgtgaac ggcgtgaaag ataaaggcgc ggtatacgat

1800

tacaccaact taattcagca tgctcacatt tcctcttccg tggcgcgtgg cgaagagtat

1860

cgggaagtcc gcctggttag ccatttgggt aatggcaatg ataaagtctt tctggctgcg

1920

ggctcggcag aaattcacgc cggcgaaggc catgatgtcg tatattacga taaaacggac

1980

accggactcc tggtgatcga tggcacaaaa gcaaccgagc aagggcgcta tagtgttacg

2040

cgtgagctga gtggcgcgac caaaattttg cgtgaagtga tcaaaaatca gaaatcggca

2100

gttggcaagc gcgaagaaac gttagagtat cgcgattacg aactcacgca aagcggtaac

2160

agtaatctga aagcacacga cgaactgcat tctgttgaag aaattattgg cagcaatcag

2220

cgcgatgaat tcaaaggctc gaagtttcgt gatatctttc atggtgcaga cggggatgac

2280

ctcctgaacg gcaatgatgg ggatgacatt ttatatggag acaaagggaa cgatgaactg

2340

cgcggcgata acgggaacga ccaactgtac ggtggtgagg ggaatgataa actgttgggc

2400

gggaacggca ataactattt atcgggcgga gatggtaacg atgaacttca ggttctgggg

2460

aacggtttca acgtccttcg tggaggcaaa ggtgacgata aactttatgg tagcagcggc

2520

tccgacctcc ttgatggtgg agaaggcaac gattacttag aaggtggtga tgggagtgat

2580

ttctatgtgt atcggagcac cagtggcaat cacaccattt atgatcaggg taaatcctcc

2640

gatctggaca aattatacct gtcagatttc tcgtttgacc gcctcttggt ggagaaagtg

2700

gatgacaacc tcgttttgcg ttccaatgag agtagccaca ataatggcgt tttaaccatc

2760

aaagactggt ttaaagaagg gaacaagtac aaccacaaaa tcgagcagat tgtcgataag

2820

aatggccgca aactgacggc cgaaaatctg ggtacctatt ttaaaaacgc cccaaaagcg

2880

gacaaccttc tgaactatgc gaccaaagag gaccagaacg aatcaaattt atcttcattg

2940

aaaacggaac tgagtaaaat tatcactaat gcgggtaatt ttggcgttgc caaacaaggt

3000

aacaccggca ttaataccgc agcgcttaac aacgaagtga acaaaatcat ttcgtcagcg

3060

aacaccttcg ctacgagtca actcggtggc tcggggatgg gcacactgcc ttccacgaac

3120

gtgaatagca tgatgctggg caatcttgcc cgggcggcgt aagagctc

3168

<210> 10

<211> 3078

<212> ДНК

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIA K560A K686A

<400> 10

ggatccgcta attctcagtt agatcgtgtg aaaggattaa tcgatagcct gaaccagcac 60

accaaatccg cagcaaaatc aggagctggc gctctgaaga atggactggg ccaggtgaaa 120

caggcagggc agaaactgat tctctatatt ccgaaagact atcaagcttc caccggttcc 180

agcttgaatg atttggtgaa agcagcggaa gctctgggaa ttgaagtcca tcgtagcgag 240

aagaacggaa ccgcattggc gaaagagtta tttgggacca cggaaaaact gttaggcttt 300

agtgaacggg gtattgcact gtttgcacct cagtttgaca aactgcttaa caaaaaccag 360

aagttaagca aatcactggg tggcagctcc gaagccttgg gccagcgcct gaacaaaacc 420

cagacggcat tgagtgcact gcaaagtttt ctgggcacgg ctatcgccgg aatggatctg 480

gattctctcc tgcgtcggcg tcgcaacggt gaagatgtaa gtggatcgga gctggcgaaa 540

gctggtgtcg atctcgcggc acaattggtt gacaatattg cgtcggccac aggaacggtg 600

gatgcgtttg cggaacaact cggtaaactg ggcaacgcgt tatctaacac acgcttatcc 660

ggcttagcct ctaagctgaa taaccttccg gatctgtcct tggccggccc cggctttgat 720

gcggttagtg gcattcttag cgttgtgtcg gcgagtttca ttctgtccaa caaagatgca 780

gatgcgggca ccaaagccgc cgcgggcatt gaaatttcga cgaaaattct tggtaacatc 840

ggcaaggctg tgtctcagta tatcattgct caacgtgtgg ccgccgggtt aagcactaca 900

gcagcgacag gtggcctgat tggctctgtg gtagcactcg caattagtcc gctgtcattt 960

ctgaatgtcg cggataaatt tgaacgtgcc aaacaactgg aacagtatag cgaacgcttc 1020

aagaaatttg gttatgaagg ggatagtttg cttgcgagct tctaccgcga aaccggtgcc 1080

attgaagcgg ccctgaccac gatcaactcg gtgttgtcag ccgccagcgc cggggtcggt 1140

gcggcagcga cgggttcctt ggtaggtgca ccagttgcgg cgcttgtatc agccattact 1200

ggcatcatct ccggcattct ggatgccagc aagcaagcta tcttcgaacg tgtggcgacg 1260

aaactggcga acaaaattga tgaatgggag aaaaagcacg gcaaaaatta cttcgaaaac 1320

ggttatgatg cgcgccattc ggcgtttctg gaggatacat ttgaacttct gagccagtac 1380

aacaaagaat actctgtgga gcgtgtcgta gcgatcaccc agcaacggtg ggatgttaac 1440

attggtgaac tggccggcat tacccgcaaa ggcgctgacg cgaaatcagg caaagcatac 1500

gtcgacttct ttgaagaggg gaaactgttg gaaaaggacc cggaccgttt tgataagaaa 1560

gtctttgatc cgctggaagg gaaaattgat ctgtcctcta tcaacaaaac tacgttgctg 1620

aaattcatca cgcccgtttt cacagcgggt gaggaaattc gcgagcgtaa gcagactggg 1680

gcgtatgaat acatgaccga actgttcgtc aaaggtaaag agaaatgggt ggtgaccggc 1740

gttcagtcgc ataacgccat ctacgattat accaacttaa tccagctggc gattgacaaa 1800

aaaggtgaaa agcgtcaggt gaccattgag agccatctgg gcgagaagaa tgaccgcatc 1860

tatttaagca gtggtagttc gattgtctat gctggcaatg ggcatgatgt cgcctattat 1920

gacaaaaccg atacgggcta tttgaccttt gacggtcaga gcgcccagaa agcaggcgaa 1980

tatatcgtaa ccaaagaact gaaagctgat gtgaaagtcc tgaaagaggt tgtgaaaacg 2040

caagatatta gcgttggcgc ccgctcggag aaattagaat atcgcgatta tgagctgagc 2100

ccattcgaac tcggtaacgg cattcgcgcg aaagatgaac tccactctgt ggaagaaatt 2160

attggttcta atcgtaaaga taaattcttc gggtcacgct ttaccgatat ctttcatggc 2220

gcgaaagggg acgatgaaat ctatggcaac gacggccacg acattctgta tggtgatgat 2280

gggaacgacg ttatccatgg aggggatggc aatgatcatc tggttggcgg caatggaaat 2340

gaccgtctta tcggcggcaa aggtaataac tttcttaacg gtggtgatgg ggacgacgaa 2400

cttcaggtct ttgaaggtca gtataacgta ctgctgggcg gtgctgggaa cgacatcctt 2460

tatggtagtg atggtactaa tctgttcgac ggcggcgtgg gtaacgacaa gatctacgga 2520

gggttgggta aggacattta ccgctactcg aaagaatacg gccggcacat cattattgag 2580

aaaggcggag atgacgatac cctcctgctg tcggatttaa gctttaaaga cgtgggcttc 2640

attcgcatcg gggatgatct gttagtgaac aaacgcattg gaggcacgct gtactaccac 2700

gaagattaca atggcaatgc tctgaccatt aaggactggt tcaaagaagg caaggaaggt 2760

caaaacaata agatcgagaa aatcgtagat aaagacggcg cctatgttct cagccagtat 2820

ctcactgaac tgactgcacc tggccgcggt attaattact tcaatggtct ggaagagaaa 2880

ctgtactatg gcgagggtta taacgccctg ccacaactgc gcaaagacat tgaacagatt 2940

atcagctcta ccggggcgct gactggtgag catggtcaag ttctcgttgg tgcgggtggt 3000

ccgctggcgt actcaaattc gccgaatagc atcccgaatg ccttttccaa ttacctgacc 3060

cagtcagcat aagagctc 3078

<210> 11

<211> 2880

<212> ДНК

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIIA S148A K557A K686A

<400> 11

ggatccagca aaattaccct ctcatccctc aaatcaagcc tgcagcaggg gctgaagaac 60

ggcaagaaca agctgaatca ggcgggtacg actctgaaga atggcttaac gcaaacaggg 120

cactcattac agaacggtgc gaaaaaactg atcctgtaca tcccgcaagg ttacgactcg 180

gggcagggca atggggtcca agatcttgtt aaagcggcca atgacctggg aatcgaagtg 240

tggcgtgaag aacggagcaa cctggacatt gcgaaaacca gctttgatac gacccagaaa 300

atcctgggtt tcaccgaccg cggaattgta ctgtttgccc cgcaacttga taaccttctg 360

aaaaaaaacc cgaaaattgg aaatacattg ggttcggcaa gctctatcag tcagaacatt 420

ggcaaagcta acactgtgtt aggtggtatt cagtctattc tggggtcggt cttgtccggc 480

gttaacctga atgaactgct tcaaaacaaa gatccaaatc aactggaact ggccaaagcg 540

ggcctggagt taacgaacga gttggtagga aacattgcct cctctgtgca gacggtggat 600

gcatttgctg aacagattag caaattaggt tctcatctgc aaaacgtcaa aggactgggc 660

ggcctcagca acaaactgca gaatttaccg gatctgggca aagccagcct tgggttagat 720

attatctccg ggctcttgtc aggcgcgtca gccggtctta tcctggcgga caaagaagca 780

agcaccgaaa agaaagctgc cgcaggcgtc gagtttgcga accagattat tggaaatgtc 840

accaaagcgg tcagttccta catcctggcg cagcgtgtag cgtcgggcct gtcatctact 900

ggtccagttg ccgcgttgat tgcgtctacg gtcgccttag cggtttcgcc gctgtccttt 960

ctgaacgtgg cggataagtt caaacaagcg gatttgatca aaagctatag tgaacgcttt 1020

cagaaattag gttatgatgg tgaccgtctg ctggcggatt tccaccgcga aaccgggacc 1080

attgatgcct ctgtcactac catcaatacg gctttggcag cgatctccgg tggggtgggc 1140

gcggcgagcg ctggctcact ggtaggagcc cctgttgctc ttttggttgc aggcgttaca 1200

ggcctgatta cgaccatttt agagtatagc aaacaagcga tgtttgagca cgtcgcaaat 1260

aaggtacacg atcgtattgt agagtgggaa aagaaacata acaagaatta cttcgaacag 1320

gggtatgatt cacgccatct ggcagatctt caggacaaca tgaaatttct gatcaatctg 1380

aacaaagagc tgcaagcaga acgcgttgtg gcgattacac aacagcgttg ggataaccag 1440

attggcgatc tggcagcaat ctcgcgccgt acggacaaaa tttcttcggg taaagcctac 1500

gtggacgcct ttgaagaagg acagcatcag tcttatgatt cctcggtaca gctggacaac 1560

aaaaatggaa tcatcaacat tagtaatacc aaccgcaaga cccaaagtgt cctgtttcgc 1620

actcccctgc tcaccccggg cgaagagaac cgcgaacgca ttcaagaggg tgcaaactca 1680

tacattacca aattgcacat tcagcgtgtg gatagttgga ctgtcactga cggtgatgcg 1740

agcagcagtg ttgactttac taacgtggtt caacgcattg ccgtcaaatt cgacgacgct 1800

gggaatatta ttgaaagcaa agatacgaaa attatcgcta atttgggcgc tggtaatgat 1860

aatgtgttcg tgggttccag caccacggtt attgatggtg gcgatgggca tgaccgcgtg 1920

cattactcgc gtggcgaata tggcgccctt gtaatcgacg ccaccgcgga aacagagaaa 1980

ggtagctatt cggtgaaacg ctatgtgggt gattctaaag cgttacacga aaccattgcc 2040

acacatcaga ccaacgtggg cgctcgtgaa gagaaaatcg aatatcggcg tgaagatgat 2100

cgttttcata caggctacac cgtaacggac tctctcaaaa gcgttgaaga aattatcggc 2160

agccagttca atgatatctt caaaggctca caattcgacg atgtgttcca tggaggtaat 2220

ggggttgaca ccattgatgg caatgacggc gatgatcatc tgtttggcgg cgctggtgac 2280

gatgtgatcg atggtggtaa cggtaataat tttctcgtcg gcggtaccgg gaacgatatt 2340

atcagcggcg gtaaggacaa tgatatttat gtgcacaaga ctggtgatgg caacgactcc 2400

atcaccgata gcggtggcca ggataaactg gcatttagcg atgtgaacct caaagatctg 2460

acctttaaaa aagtggactc tagtctggaa atcattaacc agaagggcga gaaagtccgc 2520

attggtaact ggtttctgga agatgactta gctagcaccg tggcgaacta taaagccacg 2580

aatgatcgca aaattgaaga aatcatcggc aagggcggcg agcgtattac ttcggaacag 2640

gtggataaac tgatcaaaga gggtaacaat caaattagcg ccgaagcgct gtcgaaagta 2700

gtgaacgact acaatacgag taaagatcgc cagaatgttt ccaactcgct ggccaagctg 2760

atctccagtg ttggctcatt caccagttcg agtgatttcc ggaacaatct cggtacgtat 2820

gttccttctt ccatcgacgt tagtaacaat attcagttgg cacgcgcagc ataagagctc 2880

<210> 12

<211> 3168

<212> ДНК

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIIIA K571A K702A

<400> 12

ggatccagca catggagcag tatgcttgcg gacttgaaga aacgggcgga agaagcgaaa

60

cgccaagcga agaaaggata tgatgtgact aagaacggcc tgcagtacgg tgtatcgcaa

120

gctaaactgc aggccctggc ggccgggaaa gcggttcaga agtatggtaa caaactcgtc

180

cttgtgattc ccaaagaata cgatggcagc gtgggtaatg gtttctttga tctggttaaa

240

gcggccgagg aactcggcat tcaggttaaa tatgtcaatc gtaacgagct tgaggttgcg

300

cacaaatccc tgggtactgc ggatcaattc ctcggcctca cggaacgtgg tctgactctg

360

ttcgccccac agctcgatca gttcttacag aagcacagca agatttccaa tgtagtcggg

420

agtagcactg gtgatgctgt cagcaaactt gctaaatcgc agactatcat ctcgggtatt

480

cagtcagtgc tgggcacggt tctggcgggc atcaacctga acgaagctat tatcagtggt

540

ggttccgaat tagaactggc cgaagccggg gtgagtcttg cctcagaact ggtgagcaat

600

attgcgaaag gcacgaccac gattgatgct ttcaccaccc aaatccagaa ttttgggaaa

660

ttggtggaaa atgcgaaagg cctgggaggc gtaggccgcc agctgcaaaa catttcgggg

720

agcgccctct ctaaaaccgg cctggggtta gacattatct cttcgctgct gtcaggagtt

780

accgcgagct ttgccctggc aaacaagaat gccagcacgt ctactaaagt ggcagcgggt

840

tttgaactct caaatcaggt cattggtggc attactaaag ccgtatcgag ttacattctg

900

gcgcaacgtc tggctgcagg cctgtctacg accggccctg cggcagcgct gattgcgtct

960

tctatctcgt tggcgatttc gcctctggcg tttctgcgtg ttgctgataa tttcaatcgg

1020

tccaaagaaa tcggggagtt tgcagagcgt tttaagaagc tgggatatga cggtgataaa

1080

ttgctgagcg aattttacca tgaggcgggc actatcgacg cctccattac caccatttca

1140

accgcactga gcgcgatcgc agcaggaacg gcggcagctt cggcgggtgc attagtggga

1200

gcaccgatta ccctgttggt taccgggatt accgggttaa ttagcggcat tctggaattc

1260

agtaaacaac cgatgctgga tcatgtcgca agcaaaatcg gtaacaaaat tgacgaatgg

1320

gaaaaaaaat acggcaaaaa ctacttcgaa aatggctatg acgcgcgcca caaggccttt

1380

ctcgaagatt cattttcact gttgagcagc ttcaataagc agtatgaaac ggaacgtgcc

1440

gttttgatca cgcagcagcg ttgggatgaa tacattggcg aattagccgg aattacgggc

1500

aaaggtgaca aactgtcctc tggcaaagcc tatgtggact acttccaaga aggtaaactg

1560

ctcgaaaaaa aaccagatga tttctcgaaa gtggtctttg atcccacgaa gggtgagatc

1620

gacatcagca attctcagac atctaccctg ctgaagtttg ttacgccgtt gttgaccccg

1680

ggtacggaat cacgcgaacg cacacagaca ggcgcctatg agtacattac caaattagtg

1740

gtaaaaggca aagataaatg ggtagttaac ggcgtgaaag acaaaggagc agtgtatgac

1800

tacacgaact taattcagca tgcacacatt agctcctccg tcgcacgcgg tgaagagtac

1860

cgtgaagttc gccttgtaag tcatttgggt aacggaaatg ataaagtgtt cctcgccgca

1920

ggaagtgcgg aaattcatgc tggcgaaggt catgacgtcg tgtactatga taaaaccgat

1980

acaggccttc tggttattga cggcactaaa gctaccgaac aggggcgtta cagtgtgacc

2040

cgcgaacttt ccggtgctac caaaatctta cgcgaagtca tcaagaatca gaaaagtgcc

2100

gtaggcgcgc gtgaagagac actggaatat cgggactatg agttaacgca aagcgggaac

2160

agtaatttaa aggctcacga tgaactgcat tccgtagagg agattatcgg cagcaaccag

2220

cgtgatgaat ttaaaggcag caaattccgc gatatcttcc atggtgccga cggtgacgac

2280

cttcttaacg ggaatgatgg ggatgacatc ctgtatggtg acaagggcaa tgatgaactg

2340

cgtggcgata acggcaatga ccagctgtac ggtggtgagg ggaatgacaa attgttaggt

2400

ggcaacggaa acaactatct gtccggcggc gacggtaatg atgagttgca agttcttggc

2460

aatggcttta acgtgctgcg cggcggcaaa ggtgatgata aactgtatgg tagttcaggc

2520

tcagatttgc tggatggcgg ggaaggtaac gattatctgg aaggcggtga tggctctgat

2580

ttctatgtgt atcgctcgac ctctggcaac cataccattt atgaccaggg aaaatcctcg

2640

gatctggata aactctatct gtccgatttt agttttgatc gcctgctggt cgagaaagtt

2700

gatgacaatc tggttctgcg ctcgaacgaa tctagccaca acaatggtgt gcttaccatc

2760

aaagattggt ttaaagaggg taacaaatac aatcacaaaa tcgagcaaat tgtggataag

2820

aatggtcgca agctgaccgc cgagaattta gggacttact ttaaaaatgc cccgaaagcg

2880

gataatctcc tgaactatgc aaccaaggag gaccagaacg aatcgaacct gtcctctctg

2940

aaaacggaac tgagcaaaat cattaccaac gcaggcaact ttggcgtggc taaacaaggg

3000

aacacaggga tcaataccgc ggcgctgaac aacgaagtca acaaaattat cagtagcgcc

3060

aacacatttg cgacctctca actgggtggt agcggtatgg gaaccttgcc gtcaacgaat

3120

gtcaacagca tgatgctggg caacttagcc cgcgctgcat aagagctc

3168

<210> 13

<211> 527

<212> ДНК

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIC

<400> 13

tcatgagtaa aaaaattaat ggatttgagg ttttaggaga ggtggcatgg ttatgggcaa 60

gttctccttt acatcgaaag tggccgcttt ctttgttagc aattaatgtg ctacctgcga 120

ttgagagtaa tcaatatgtt ttgttaaagc gtgacggttt tcctattgca ttttgtagct 180

gggcaaattt gaatttggaa aatgaaatta aataccttga tgatgttgcc tcgctagttg 240

cggatgattg gacttccggc gatcgtcgat ggtttataga ttggatagca ccgttcggag 300

acagtgccgc attatacaaa catatgcgag ataacttccc gaatgagctg tttagggcta 360

ttcgagttga tccggactct cgagtaggga aaatttcaga atttcatgga ggaaaaattg 420

ataagaaact ggcaagtaaa atttttcaac aatatcactt tgaattaatg agtgagctaa 480

aaaataaaca aaattttaaa ttttcattag taaatagcta aagatct 527

<210> 14

<211> 488

<212> ДНК

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIIC

<400> 14

acatgttaaa aaatgatttt aacgtattgg gacaaattgc ttggttatgg gcaaattctc 60

caatgcaccg aaattggtca gtttcactgt taatgaagaa tgttattcct gcaattgaaa 120

atgaccaata tttgttacta gttgatgatg gttttcctat tgcatattgc agttgggcca 180

aattaactct agagagtgag gctcgctatg taaaggacac caattcatta aaaatagatg 240

attggaatgc aggagatcgt atatggatca ttgattggat tgccccattc ggggattcat 300

ctctattgta taaacatatg agacaacgtt ttccatacga tattggaagg gcaattagaa 360

tctatcctag caaaaaagat actggaaaaa tcatatattt aaaaggagga aaaataacaa 420

aaaaagtagc tgaaaagaca tttcttcagt atgagcaaga gttaataaca gctctacaat 480

aaagatct 488

<210> 15

<211> 530

<212> ДНК

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIIIC

<400> 15

tcatgagtta taaaaatgtt aaaaatttaa cagatgattt tacaacttta gggcatatcg 60

cttggttgtg ggctaattct ccgttacata aggagtggtc tatctctttg tttactaaga 120

atattttgcc agccattcaa catgatcaat atattttact tatgcgagat gagttccctg 180

tagcgttttg tagttgggca aatttaacgt taactaatga agtgaagtat gtacgtgatg 240

tgacgtcatt gacttttgaa gattggaatt caggagaacg aaaatggttg atcgactgga 300

ttgcgccatt tggggataac aatacgcttt atagatatat gcgtaaaaaa tttcctaatg 360

aagtattccg ggccattcga gtatatcctg gttctacaga agcgaaaatc attcatgttc 420

aaggaggaca aattaataaa tttacagcta aaaaattaat acaacaatat caggaagaac 480

ttattcaagt tcttaacaat cacaaaaaaa ttgtaagagg ataaagatct 530

<210> 16

<211> 639

<212> ДНК

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIC с промотором/lac-оператором и RBS

<400> 16

tctagaaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60

attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aaccatgagt 120

aaaaaaatta atggatttga ggttttagga gaggtggcat ggttatgggc aagttctcct 180

ttacatcgaa agtggccgct ttctttgtta gcaattaatg tgctacctgc gattgagagt 240

aatcaatatg ttttgttaaa gcgtgacggt tttcctattg cattttgtag ctgggcaaat 300

ttgaatttgg aaaatgaaat taaatacctt gatgatgttg cctcgctagt tgcggatgat 360

tggacttccg gcgatcgtcg atggtttata gattggatag caccgttcgg agacagtgcc 420

gcattataca aacatatgcg agataacttc ccgaatgagc tgtttagggc tattcgagtt 480

gatccggact ctcgagtagg gaaaatttca gaatttcatg gaggaaaaat tgataagaaa 540

ctggcaagta aaatttttca acaatatcac tttgaattaa tgagtgagct aaaaaataaa 600

caaaatttta aattttcatt agtaaatagc taatcgcga 639

<210> 17

<211> 600

<212> ДНК

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIIC с промотором/lac-оператором и RBS

<400> 17

atcgataaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60

attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aaccatgtta 120

aaaaatgatt ttaacgtatt gggacaaatt gcttggttat gggcaaattc tccaatgcac 180

cgaaattggt cagtttcact gttaatgaag aatgttattc ctgcaattga aaatgaccaa 240

tatttgttac tagttgatga tggttttcct attgcatatt gcagttgggc caaattaact 300

ctagagagtg aggctcgcta tgtaaaggac accaattcat taaaaataga tgattggaat 360

gcaggagatc gtatatggat cattgattgg attgccccat tcggggattc atctctattg 420

tataaacata tgagacaacg ttttccatac gatattggaa gggcaattag aatctatcct 480

agcaaaaaag atactggaaa aatcatatat ttaaaaggag gaaaaataac aaaaaaagta 540

gctgaaaaga catttcttca gtatgagcaa gagttaataa cagctctaca ataatcgcga 600

<210> 18

<211> 642

<212> ДНК

<213> Actonbacillus pleuropneumoniae

<220>

<223> ApxIIIC с промотором/lac-оператором и RBS

<400> 18

tctagaaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60

attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aaccatgagt 120

tataaaaatg ttaaaaattt aacagatgat tttacaactt tagggcatat cgcttggttg 180

tgggctaatt ctccgttaca taaggagtgg tctatctctt tgtttactaa gaatattttg 240

ccagccattc aacatgatca atatatttta cttatgcgag atgagttccc tgtagcgttt 300

tgtagttggg caaatttaac gttaactaat gaagtgaagt atgtacgtga tgtgacgtca 360

ttgacttttg aagattggaa ttcaggagaa cgaaaatggt tgatcgattg gattgcgcca 420

tttggggata acaatacgct ttatagatat atgcgtaaaa aatttcctaa tgaagtattc 480

cgggccattc gagtatatcc tggttctaca gaagcgaaaa tcattcatgt tcaaggagga 540

caaattaata aatttacagc taaaaaatta atacaacaat atcaggaaga acttattcaa 600

gttcttaaca atcacaaaaa aattgtaaga ggataatcgc ga 642

<210> 19

<211> 2446

<212> ДНК

<213> Плазмида pEX-A258

<220>

<223> pEX-A258

<400> 19

gtggcagctc tagagctagc gaattctttg gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 60

caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 120

cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 180

gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 240

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 300

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 360

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 420

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 480

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 540

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 600

gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 660

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 720

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 780

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 840

cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 900

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 960

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 1020

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 1080

attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 1140

ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 1200

tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 1260

aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgcgaacc 1320

acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 1380

aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 1440

agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 1500

ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 1560

agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 1620

tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 1680

tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 1740

attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 1800

taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 1860

aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 1920

caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 1980

gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 2040

cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 2100

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 2160

acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 2220

gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 2280

cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 2340

cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat 2400

tgtactgaga gtttggcaat tggtcgacct cgagggcgcg cccgta 2446

<210> 20

<211> 4751

<212> ДНК

<213> Плазмида pQE-80L

<220>

<223> pQE-80L

<400> 20

ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca

60

attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aactatgaga

120

ggatcgcatc accatcacca tcacggatcc gcatgcgagc tcggtacccc gggtcgacct

180

gcagccaagc ttaattagct gagcttggac tcctgttgat agatccagta atgacctcag

240

aactccatct ggatttgttc agaacgctcg gttgccgccg ggcgtttttt attggtgaga

300

atccaagcta gcttggcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc

360

actggatata ccaccgttga tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt

420

cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag accgttcagc tggatattac ggccttttta

480

aagaccgtaa agaaaaataa gcacaagttt tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc

540

ctgatgaatg ctcatccgga atttcgtatg gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg

600

gatagtgttc acccttgtta caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc

660

tggagtgaat accacgacga tttccggcag tttctacaca tatattcgca agatgtggcg

720

tgttacggtg aaaacctggc ctatttccct aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc

780

tcagccaatc cctgggtgag tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac

840

ttcttcgccc ccgttttcac catgggcaaa tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg

900

ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt

960

aatgaattac aacagtactg cgatgagtgg cagggcgggg cgtaattttt ttaaggcagt

1020

tattggtgcc cttaaacgcc tggggtaatg actctctagc ttgaggcatc aaataaaacg

1080

aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct

1140

cctgagtagg acaaatccgc cctctagatt acgtgcagtc gatgataagc tgtcaaacat

1200

gagaattgtg cctaatgagt gagctaactt acattaattg cgttgcgctc actgcccgct

1260

ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga

1320

ggcggtttgc gtattgggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag

1380

ctgattgccc ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg

1440

ccccagcagg cgaaaatcct gtttgatggt ggttaacggc gggatataac atgagctgtc

1500

ttcggtatcg tcgtatccca ctaccgagat atccgcacca acgcgcagcc cggactcggt

1560

aatggcgcgc attgcgccca gcgccatctg atcgttggca accagcatcg cagtgggaac

1620

gatgccctca ttcagcattt gcatggtttg ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc

1680

ttcccgttcc gctatcggct gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag

1740

acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc

1800

caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact

1860

gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc

1920

ttccacagca atggcatcct ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg

1980

ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat

2040

cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg

2100

cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc

2160

cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac

2220

tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg

2280

ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca cattcaccac

2340

cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt tgcaccattc

2400

gatggtgtcg gaatttcggg cagcgttggg tcctggccac gggtgcgcat gatctagagc

2460

tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg

2520

gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg

2580

ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat

2640

actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg

2700

aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc

2760

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg

2820

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag

2880

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc

2940

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag

3000

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga

3060

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc

3120

atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg

3180

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt

3240

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca

3300

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca

3360

ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag

3420

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca

3480

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg

3540

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa

3600

aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta

3660

tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag

3720

cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga

3780

tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac

3840

cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc

3900

ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta

3960

gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac

4020

gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat

4080

gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa

4140

gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg

4200

tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag

4260

aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc

4320

cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct

4380

caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat

4440

cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg

4500

ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc

4560

aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta

4620

tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg

4680

tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct

4740

ttcgtcttca c

4751

<210> 21

<211> 3431

<212> ДНК

<213> Плазмида pQE-60

<220>

<223> pQE-60

<400> 21

ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca

60

attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aaccatggga

120

ggatccagat ctcatcacca tcaccatcac taagcttaat tagctgagct tggactcctg

180

ttgatagatc cagtaatgac ctcagaactc catctggatt tgttcagaac gctcggttgc

240

cgccgggcgt tttttattgg tgagaatcca agctagcttg gcgagatttt caggagctaa

300

ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca

360

tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt

420

tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc

480

ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaatttc gtatggcaat

540

gaaagacggt gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga

600

gcaaactgaa acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct

660

acacatatat tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg

720

gtttattgag aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga

780

tttaaacgtg gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgc atgggcaaat

840

attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgtct

900

gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta atgaattaca acagtactgc gatgagtggc

960

agggcggggc gtaatttttt taaggcagtt attggtgccc ttaaacgcct ggggtaatga

1020

ctctctagct tgaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt

1080

tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc gctctagagc

1140

tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg

1200

gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg

1260

ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat

1320

actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg

1380

aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc

1440

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg

1500

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag

1560

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc

1620

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag

1680

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga

1740

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc

1800

atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg

1860

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt

1920

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca

1980

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca

2040

ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag

2100

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca

2160

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg

2220

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa

2280

aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta

2340

tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag

2400

cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga

2460

tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac

2520

cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc

2580

ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta

2640

gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac

2700

gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat

2760

gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa

2820

gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg

2880

tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag

2940

aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc

3000

cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct

3060

caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat

3120

cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg

3180

ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc

3240

aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta

3300

tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg

3360

tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct

3420

ttcgtcttca c

3431

<210> 22

<211> 4245

<212> ДНК

<213> Плазмида pACYC184

<220>

<223> pACYC184

<400> 22

gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt

60

gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt

120

ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga

180

tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga

240

aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt

300

ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc

360

ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat

420

ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt

480

gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg

540

acggggtggt gcgtaacggc aaaagcaccg ccggacatca gcgctagcgg agtgtatact

600

ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa

660

aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc

720

actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc

780

ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa

840

agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc

900

agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggcggctccc

960

tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt cattccgctg ttatggccgc

1020

gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc caagctggac

1080

tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt

1140

gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag cagccactgg taattgattt

1200

agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa actgaaagga caagttttgg

1260

tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc agagaacctt

1320

cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta cgcgcagacc

1380

aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa tatttctaga tttcagtgca

1440

atttatctct tcaaatgtag cacctgaagt cagccccata cgatataagt tgtaattctc

1500

atgtttgaca gcttatcatc gataagcttt aatgcggtag tttatcacag ttaaattgct

1560

aacgcagtca ggcaccgtgt atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc ctcggcaccg

1620

tcaccctgga tgctgtaggc ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc ctcttgcggg

1680

atatcgtcca ttccgacagc atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg ctatatgcgt

1740

tgatgcaatt tctatgcgca cccgttctcg gagcactgtc cgaccgcttt ggccgccgcc

1800

cagtcctgct cgcttcgcta cttggagcca ctatcgacta cgcgatcatg gcgaccacac

1860

ccgtcctgtg gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc gccacaggtg

1920

cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg

1980

ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt

2040

tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc

2100

tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga ccgatgccct

2160

tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg

2220

cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg

2280

tcattttcgg cgaggaccgc tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg

2340

tattcggaat cttgcacgcc ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt

2400

tcggcgagaa gcaggccatt atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc

2460

tggcgttcgc gacgcgaggc tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg

2520

gcatcgggat gcccgcgttg caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg

2580

gacagcttca aggatcgctc gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact ggaccgctga

2640

tcgtcacggc gatttatgcc gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag

2700

gcgccgccct ataccttgtc tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca

2760

cctcgacctg aatggaagcc ggcggcacct cgctaacgga ttcaccactc caagaattgg

2820

agccaatcaa ttcttgcgga gaactgtgaa tgcgcaaacc aacccttggc agaacatatc

2880

catcgcgtcc gccatctcca gcagccgcac gcggcgcatc tcgggcagcg ttgggtcctg

2940

gccacgggtg cgcatgatcg tgctcctgtc gttgaggacc cggctaggct ggcggggttg

3000

ccttactggt tagcagaatg aatcaccgat acgcgagcga acgtgaagcg actgctgctg

3060

caaaacgtct gcgacctgag caacaacatg aatggtcttc ggtttccgtg tttcgtaaag

3120

tctggaaacg cggaagtccc ctacgtgctg ctgaagttgc ccgcaacaga gagtggaacc

3180

aaccggtgat accacgatac tatgactgag agtcaacgcc atgagcggcc tcatttctta

3240

ttctgagtta caacagtccg caccgctgtc cggtagctcc ttccggtggg cgcggggcat

3300

gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc

3360

ggcagcgccc aacagtcccc cggccacggg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc

3420

gccctgcacc attatgttcc ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac

3480

acctacatct gtattaacga agcgctaacc gtttttatca ggctctggga ggcagaataa

3540

atgatcatat cgtcaattat tacctccacg gggagagcct gagcaaactg gcctcaggca

3600

tttgagaagc acacggtcac actgcttccg gtagtcaata aaccggtaaa ccagcaatag

3660

acataagcgg ctatttaacg accctgccct gaaccgacga ccgggtcgaa tttgctttcg

3720

aatttctgcc attcatccgc ttattatcac ttattcaggc gtagcaccag gcgtttaagg

3780

gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc agtactgttg

3840

taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacag acggcatgat gaacctgaat

3900

cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatgg tgaaaacggg

3960

ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac tcacccaggg

4020

attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg ccaggttttc

4080

accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat cgtcgtggta

4140

ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt aacaagggtg

4200

aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacg

4245

<210> 23

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 23

gcatcatgag taaaaaaatt aatggatttg agg 33

<210> 24

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 24

ggtagatctt tagctattta ctaatgaaaa tttaa 35

<210> 25

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 25

gcaacatgtt aaaaaatgat tttaacgtat tgg 33

<210> 26

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 26

ggtagatctt tattgtagag ctgttattaa ct 32

<210> 27

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 27

gcatcatgag ttataaaaat gttaaaaatt taaca 35

<210> 28

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 28

ggtagatctt tatcctctta caattttttt gtg 33

<210> 29

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 29

gcatctagaa aatcataaaa aatttatttg cttt 34

<210> 30

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 30

agctcgcgat tagctattta ctaatgaaaa ttta 34

<210> 31

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 31

gcaatcgata aatcataaaa aatttatttg cttt 34

<210> 32

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 32

agctcgcgat tattgtagag ctgttattaa ct 32

<210> 33

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 33

gcatctagaa aatcataaaa aatttatttg cttt 34

<210> 34

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 34

agctcgcgat tatcctctta caattttttt gt 32

<---

Изобретение относится к композиции вакцины для иммунизации и защиты путем профилактики или метафилактики свиней от плевропневмонии, вызванной Аctinobacillus pleuropneumoniаe, содержащей модифицированные полипептиды ApxIA, ApxIIA и ApxIIIA от Actinobacillus pleuropneumoniae. Также предложено применение указанной композиции вакцины для получения лекарственного средства для иммунизации и защиты путем профилактики или метафилактики свиней от плевропневмонии, вызванной Actinobacillus pleuropneumoniae, для получения гуморального и/или клеточного иммунологического ответа, причем композиция вакцины выполнена с возможностью введения внутримышечно, внутрикожно, внутривенно, подкожно или путем нанесения на слизистую. Изобретение обеспечивает эффективную иммунизацию и защиту свиней от плевропневмонии, вызванной Аctinobacillus pleuropneumoniаe. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 10 ил., 12 табл., 16 пр.

1. Композиция вакцины для иммунизации и защиты путем профилактики или метафилактики свиней от плевропневмонии, вызванной Аctinobacillus pleuropneumoniae, содержащая полипептид ApxIA, ApxIIA и ApxIIIA от Actinobacillus pleuropneumoniae, для получения гуморального и/или клеточного иммунологического ответа, в которой

a) аминокислотная последовательность дикого типа

i) ApxIA, как представлено в SEQ ID NO: 1, имеет замены K560 и K686,

ii) ApxIIA, как представлено в SEQ ID NO: 2, имеет замены K557 и N687, и

iii) ApxIIIA, как представлено в SEQ ID NO: 3, имеет замены K571 и K702,

и, по меньшей мере, аминокислота заменена аминокислотой, не подверженной ацилированию; или

b) аналог или фрагмент модифицированной аминокислотной последовательности, определенной в a), вызывающий гуморальный и/или клеточный иммунологический ответ, который по меньшей мере на 90% гомологичен модифицированной аминокислотной последовательности, определенной в a), и указанный аналог или фрагмент содержит, по меньшей мере, аминокислоту, замененную аминокислотой, не подверженной ацилированию, как определено в a);

и, по меньшей мере, фармацевтический носитель, разбавитель и/или адъювант.

2. Композиция вакцины по п. 1, отличающаяся тем, что аминокислота, не подверженная ацилированию, независимо выбрана из группы, состоящей из аланина, глицина, изолейцина, лейцина, метионина, валина, серина, треонина, глутамина, гистидина, цистеина, пролина, фенилаланина, тирозина, триптофана и глутаминовой кислоты; предпочтительно выбрана из группы, состоящей из аланина, глицина, серина, треонина, валина, изолейцина и лейцина; наиболее предпочтительно выбрана из группы, состоящей из аланина, глицина, серина.

3. Композиция вакцины по любому предшествующему пункту, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность дикого типа

a) ApxIA, как представлено в SEQ ID NO: 1, имеет замены K560 и K686,

b) ApxIIA, как представлено в SEQ ID NO: 2, имеет замены K557 и N687, и

c) ApxIIIA, как представлено в SEQ ID NO: 3, имеет замены K571 и K702,

и, по меньшей мере, аминокислота заменена аминокислотой, не подверженной ацилированию.

4. Композиция вакцины по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что

a) модифицированная аминокислотная последовательность дикого типа ApxIA представляет собой SEQ ID NO: 4,

b) модифицированная аминокислотная последовательность дикого типа ApxIIA представляет собой SEQ ID NO: 5, и

c) модифицированная аминокислотная последовательность дикого типа ApxIIIA представляет собой SEQ ID NO: 6.

5. Композиция вакцины по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что полипептид ApxIA, ApxIIA или ApxIIIA кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, входящей в состав конструкта нуклеиновой кислоты, содержащего последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид ApxIA, ApxIIA или ApxIIIA.

6. Композиция вакцины по п. 5, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты входит в состав вектора, пригодного для экспрессирования нуклеиновой кислоты по изобретению.

7. Композиция вакцины по любому одному из пп. 5 или 6, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты входит в состав микроорганизма по изобретению.

8. Композиция вакцины по п. 7, отличающаяся тем, что микроорганизм, содержащий нуклеиновую кислоту, представляет собой штамм Escherichia coli или штамм Actinobacillus, предпочтительно штамм Actinobacillus pleuropneumoniae.

9. Композиция вакцины по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что представляет собой субъединичную вакцину.

10. Композиции вакцины по п. 9, отличающаяся тем, что субъединичная вакцина содержит по меньшей мере один дополнительный полипептид Actinobacillus pleuropneumoniae.

11. Композиция вакцины по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что представляет собой живую вакцину, предпочтительно содержащую по меньшей мере один штамм Actinobacillus pleuropneumoniae.

12. Композиция вакцины по п. 11, отличающаяся тем, что содержит по меньшей мере два различных штамма Actinobacillus pleuropneumoniae.

13. Композиция вакцины по любому одному из пп. 11 или 12, отличающаяся тем, что штамм Actinobacillus pleuropneumoniae содержит делецию гена apxIV или/и гена sxy.

14. Применение композиции вакцины по любому одному из пп. 1-13 для получения лекарственного средства для иммунизации и защиты путем профилактики или метафилактики свиней от плевропневмонии, вызванной Actinobacillus pleuropneumoniae, для получения гуморального и/или клеточного иммунологического ответа, причем композиция вакцины выполнена с возможностью введения внутримышечно, внутрикожно, внутривенно, подкожно или путем нанесения на слизистую.