Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к вакцинной композиции, а также к ее применению для иммунизации и защиты млекопитающих, в частности свиней и людей, от Streptococcus suis.

Предпосылки создания изобретения

Streptococcus suis (S. suis) колонизирует дыхательный, пищеварительный и генитальный тракт свиней. S. suis также является одним из наиболее важных свиных патогенов, вызывающих различные патологии, такие как менингит, сепсис, артрит и эндокардит.

Инфекции, вызванные S. suis, являются причиной высоких производственных потерь в свиноводстве во всем мире. Для лечения инфекций, вызванных S. Suis, обычно используют антибиотики. Но рецидивирующие инфекции, которые часто возникают, а также продолжающиеся дискуссии по сокращению использования антибиотиков говорят о необходимости альтернативных мер контроля. В Европе нет в наличии лицензированных вакцин и обычно используются аутологические бактерины. Главным недостатком является тот факт, что эти вакцины защищают только от гомологичного серотипа. Но S. suis - это очень многообразный организм и за заболеваемость поросят отвечают разные серотипы. Особенно штаммы серотипа 2 играют важную роль в появлении заболеваний у поросят во всем мире.

Серотип 2 S. suis был идентифицирован как вызывающий менингит у взрослых в Азии, но до сих пор не было обнаружено ни одного случая передачи S. suis от человека человеку.

Как правило, инфекции вызывают ответ раннего антиген-специфического иммуноглобулина М (IgM), что приводит к аффинному созреванию и переключению изотопа. Кроме того, антитела IgM, присутствующие до инфицирования, которые встречаются в природе, важны для связывания врожденного и адаптивного иммунитета.

У свиней IgM особенно важен в качестве мономерного мембранного IgM (mIgM), поскольку он является единственным встречающимся В-клеточным рецептором, так как IgD у свиней отсутствует. Кроме того, синтез IgM у новорожденных поросят начинается гораздо раньше, чем синтез IgG и IgA. IgM в молозиве имеет решающее значение для защиты от патогенных микроорганизмов, которая осуществляется с помощью комплемент-опосредованного лизиса. Следовательно, антитела IgM играют важную роль в защите от различных патогенных микроорганизмов.

Были идентифицированы различные факторы вирулентности или вирулентность-ассоциированные факторы серотипа 2 S. suis, наряду с капсулой, которая до сих пор является единственным известным весьма важным фактором вирулентности, защищающим патоген от фагоцитоза. Ряд поверхностно-ассоциированных и секретируемых белков серотипа 2 S. suis показывают те же или очень похожие функции, как гомологичные факторы других патогенных стрептококков. Многие человеческие или животные патогены, такие как Streptococcus pyogenes, Streptococcus equi подвида equi и Streptococcus equi подвида zooepidemicus, экспрессируют специфические IgG-эндопептидазы, которые являются гомологами друг к другу.

Поверхностно-ассоциированный или секретируемый фактор с функцией, уникальной для S. Suis, был впервые описан автором Seele и соавторами в публикации ("Identification of a Novel Host-specific IgM Protease in Streptococcus suis." 2013, Journal of Bacteriology, 195: 930-940). Авторы Seele et al. показали, что эта IgM-протеаза, обозначенная IdeSsuis, не действует как IgG- эндопептидаза. IgM-протеаза разрушает опсонизирующий IgM на бактериальной поверхности и, следовательно, способствует выживанию S. suis в крови примированных бактерином поросят.IdeSsuis является высокоспецифичным по отношению к IgM и не расщепляет IgG или IgA. В публикации Seele и соавторов, однако, ничего не говорят о функции IdeSsuis, rIdeSsuis и их аналогов и фрагментов в качестве эффективной вакцины против инфекций, вызванных S. suis. Всего лишь выдвигается гипотеза, что нейтрализация активности IdeSsuis IgM-протеазы может существенно повысить защитную эффективность бактеринов или других будущих вакцин, индуцирующих опсонизирующие антитела. Однако не показано, что IdeSsuis и родственные белки могут использоваться в качестве единственного иммунизирующего агента в вакцине против инфекций, вызванных S. suis.

Авторы Baums и соавторы описывают в публикации Surface-associated and secreted factors of Streptococcus suis in epidemiology, pathogenesis and vaccine development, Animal Health Research Reviews, Volume 10, Issue 01, June 2009, pp 65-83 бактериальные факторы, как поверхностно-ассоциированные, так и секретируемые, которые считаются способствующими взаимодействию (-ям) S. suis с хозяйскими факторами и клетками. Факторы представлены по (i) их идентификации и характеристикам, (ii) их распределению среди S. suis и (iii) их значению для вирулентности, иммунного ответа и вакцинации. В этом обзоре особый акцент сделан на ряд сложных вопросов, на которые еще предстоит ответить в будущем.

Проблема, которая должна быть решена в соответствии с настоящим изобретением, состоит в решении проблем, описанных в данной области, и предоставлении новой вакцинной композиции для иммунизации и защиты млекопитающих, в частности свиней и людей, против инфекций, вызванных S. suis.

Сущность изобретения

Эта проблема решается, в соответствии с настоящим изобретением, предоставлением вакцинной композиции, которая содержит эффективное количество по меньшей мере одного полипептида или по меньшей мере одного вектора, выбранного из группы

(a) белок, обозначенный IdeSsuis, его аналог или фрагмент,

(b) белок, обозначенный rIdeSsuis, его аналог или фрагмент,

(c) вектор с полинуклеотидом, вставленным в него, кодирующий белок IdeSsuis, его аналог или фрагмент,

(d) вектор с полинуклеотидом, вставленным в него, кодирующий белок rIdeSsuis, его аналог или фрагмент и

по меньшей мере фармацевтический носитель, разбавитель или адъювант.

Подробное описание изобретения

Вакцинная композиция, используемая в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере один одиночный полипептид в соответствии с определением в (а) или (b) совместно с фармацевтическим носителем или разбавителем или адъювантом, или их смесью. Кроме того, вакцина может также содержать по меньшей мере один одиночный вектор в соответствии с определением в (с) или (d), с фармацевтическим носителем, разбавителем или адъювантом, или их смесью.

Предпочтительной является вакцинная композиция в соответствии с настоящим изобретением, отличающаяся тем, что IdeSsuis согласно (а) содержит

(а.а) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1;

(a.b) фрагмент или аналог аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1;

или

(а.с) фрагмент либо (а.а), либо (a.b), обладающий активностью IgM-протеазы.

Кроме того, предпочтительной является вакцинная композиция в соответствии с настоящим изобретением, отличающаяся тем, что rIdeSsuis согласно (b) содержит или состоит из следующего:

(b.а) аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 2, 6 или 7;

(b.b) фрагмент или аналог аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 6 или 7;

(b.c) аминокислотная последовательность, в которой отсутствуют аминокислоты от позиции 1 до 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1;

(b.d) аминокислотная последовательность, которая по меньшей мере на 60% гомологична, предпочтительно на 70% гомологична и наиболее предпочтительно на 85% гомологична к аминокислотной последовательности белка IdeSsuis SEQ ID NO: 1; (b.e) фрагмент либо (b.a), либо (b.b), либо (b.c), либо (b.d), обладающий активностью IgM - протеазы; или

(b.f) фрагмент либо (b.а), либо (b.b), либо (b.c), либо (b.d), содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 95% гомологична ей.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 2 представляет собой последовательность SEQ ID NO: 1, однако в ней отсутствуют аминокислоты 1-34 (сигнальный пептид), но добавлена HIS-метка. Следует отметить, что SEQ ID NO: 1 была извлечена из штамма серотипа 2 S. suis.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 6 представляет собой N-концевую последовательность SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 7 (также называемая антиген rIdeSsuisB2) содержит полную аминокислотную последовательность зрелого белка IdeSsuis штамма серотипа 7 S. suis, но с добавлением N-концевой HIS-метки. Белок IdeSsuis штамма серотипа 7 S. suis отличается С-концевой половиной белка, так как в нем отсутствует последовательность 114 аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 1. Аминокислоты 80-414 последовательности SEQ ID NO: 7 (высококонсервативная часть так называемого домена Мас-1) соответствует на 97,9% последовательности SEQ ID NO: 5. Полная идентичность между SEQ ID NO: 7 и 1 составляет 96,4% (без учета N-концевой HIS-метки и пробела из 114 аминокислот).

Термин «фрагмент или аналог», используемый в данном контексте, определяется следующим образом:

«Аналог» может рассматриваться как аминокислотная последовательность по аналогии с аминокислотными последовательностями, описанными выше и показывающие уровень гомологии по меньшей мере 60%, предпочтительно 70% и наиболее предпочтительно 85% к исходной аминокислотной последовательности (например, SEQ ID NO: 1, 2, 6 или 7). Также в настоящем документе рассматриваются более высокие степени гомологии, как например 95%. Гомология, используемая в данном контексте, означает идентичность. По существу, последовательности могут отличаться друг от друга на основании замены, делеции или вставки.

Степень идентичности может определяться с помощью программы blast для белка с использованием алгоритма медленного сравнения с целью поиска всех сходных последовательностей, с использованием стандартных параметров, например, Ожидаемое пороговое значение: 10, Размер слова: 3, Матрица: BLOMSUM62, Цена делеции: Наличие: 11 Расширение: 1 и Композиционные корректировки: Условная композиционная оценочная корректировка матрицы (BLAST является зарегистрированным товарным знакомНациональной медицинской библиотеки). Программа может быть использована в базе данных белков для поиска белка по запросу. Параметр «идентичность» сообщает о точных соответствиях между выровненными запрашиваемыми последовательностями и последовательностями из базы данных.

Предпочтительно, аминокислотные «замещения» являются результатом замены одной аминокислоты на другую аминокислоту, имеющую аналогичные структурные и/или химические свойства, т.е. консервативные аминокислотные замены. Аминокислотные замещения могут выполняться на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы вовлеченных остатков. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; положительно заряженные (базовые) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; а отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.

«Вставки» или «делеции», как правило, находятся в диапазоне примерно 1, 2 или 3 аминокислот.Допускаемая вариация может быть определена экспериментально путем систематического выполнения вставок или делеций аминокислот в белке с использованием методов рекомбинантной ДНК и путем тестирования полученных рекомбинантных вариантов на активность. От квалифицированного персонала для этого требуется проведение всего лишь рутинных экспериментов.

«Аналог» может быть альтернативно или дополнительно определен как аминокислотная последовательность, аналогичная последовательностям, описанным выше, и содержащая высококонсервативную часть домена Мас-1 (SEQ ID NO: 5), или аминокислотная последовательность, которая является по меньшей мере на 95% гомологична указанной. Авторы настоящего изобретения, как ни удивительно, обнаружили, что этот домен в основном отвечает за неожиданную иммуногенную активность белков IdeSsuis и, для себя, является достаточным для обеспечения иммунной защиты вакцинированному животному. Существуют различные серотипы S. suis, которые частично демонстрируют большие вариации в своей аминокислотной последовательности, приводя, таким образом, к уровню гомологии вплоть до примерно 60%. Однако высококонсервативный домен Мас-1 демонстрирует только небольшие вариации между различными серотипами, например, 97,9% между штаммами серотипов 2 и 7.

Следовательно, допускается, что аминокислоты по настоящему изобретению (а также нуклеиновые кислоты, кодирующие их) демонстрируют более высокий уровень вариаций вне домена Мас-1, чем в его пределах.

Термин «фрагмент» может быть определен аналогичным образом (смотри выше). Он описывает более короткую аминокислотную последовательность, чем аналог (меньше, чем примерно 400 аминокислот). Он содержит или состоит из высококонсервативной части домена Мас-1 (SEQ ID NO: 5) или аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% гомологична указанному. По желанию, фрагмент может быть определен как обладающий активностью IgM-протеазы, хотя это требование не является обязательным. Эти фрагменты могут использоваться в качестве единственного активного ингредиента в вакцине в соответствии с настоящим изобретением.

Таким образом, вакцинная композиция по настоящему изобретению в предпочтительном варианте осуществления содержит, по существу состоит из или состоит из белка, содержащего или состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% гомологична ей. В еще более предпочтительном варианте осуществления белок (или вектор, кодирующий его) является единственным активным или иммуногенным ингредиентом.

Термин «содержащий», используемый в данном документе, в контексте вакцинной композиции означает, что могут присутствовать дополнительные активные или иммуногенные компоненты. Термин «состоит из» означает, что никаких дополнительных компонентов нет, а «по существу состоящий из» означает, что могут присутствовать специфические дополнительные компоненты, а именно компоненты, которые не существенно влияют на основные характеристики вакцины (т.е. неактивные или не иммуногенные ингредиенты).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается вакцинная композиция, по существу состоящая из белка rIdeSsuis, который по меньшей мере на 60%, 70%, 85% или 95% гомологичен аминокислотной последовательности белка IdeSsuis SEQ ID NO: 1 и/или содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% гомологична ей.

Приведенные выше определения с соответствующими поправками применимы также к нуклеиновокислотным последовательностям по настоящему изобретению, кодирующим эти белки. Определения гомологии такие же, но длина фрагмента будет меньше, чем примерно 1200 нуклеиновых кислот.

Кроме того, предпочтительной является вакцинная композиция в соответствии с настоящим изобретением, отличающаяся тем, что фрагмент эффективного количества указанного полипептида (а) или (b) является частью слитого белка по меньшей мере с одним другим белком.

Предпочтительной является вакцинная композиция в соответствии с настоящим изобретением, отличающаяся тем, что полинуклеотид согласно (с) содержит последовательность, кодирующую белок, определенный как IdeSsuis, а именно

(а.а) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1;

(a.b) фрагмент или аналог аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; или

(а.с) фрагмент либо (а.а), либо (a.b), обладающий активностью IgM-протеазы.

Особенно предпочтительной является вакцинная композиция в соответствии с настоящим изобретением, которая характеризуется тем, что полинуклеотид содержит (с.а) последовательность SEQ ID NO: 3 или комплементарную ей последовательность;

(c.b) фрагмент последовательности согласно (с.а) или

(с.с) фрагмент последовательности согласно (с.а), которая кодирует белок, обладающий активностью IgM-протеазы.

Кроме того, предпочтительной является вакцинная композиция в соответствии с настоящим изобретением, отличающаяся тем, что полинуклеотид согласно (d) содержит последовательность, кодирующую белок, определенный как rIdeSsuis, а именно

(b.а) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(b.b) фрагмент или аналог аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;

(b.c) аминокислотную последовательность, в которой отсутствуют аминокислоты от позиции 1 до 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1;

(b.d) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% гомологична, предпочтительно на 70% гомологична и наиболее предпочтительно на 85%о гомологична аминокислотной последовательности белка IdeSsuis SEQ ID NO:; или

(b.e) фрагмент либо (b.а), либо (b.b), либо (b.c), либо (b.d), обладающий активностью IgM-протеазы и/или

(b.f) фрагмент либо (b.а), либо (b.b), либо (b.c), либо (b.d), содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 95% гомологична ей.

Особенно предпочтительной является вакцинная композиция в соответствии с настоящим изобретением, которая характеризуется тем, что полинуклеотид содержит

(d.a) последовательность SEQ ID NO: 4, 8 или 9, или комплементарную ей последовательность;

(d.b) фрагмент последовательности согласно (d.a) или

(d.c) фрагмент последовательности согласно (d.a), который кодирует белок, обладающий активностью IgM-протеазы.

Предпочтительной является вакцинная композиция в соответствии с настоящим изобретением, отличающаяся тем, что полинуклеотид представляет собой кДНК, ДНК или кРНК, РНК. Термин «нуклеиновокислотная последовательность» относится к гетерополимеру нуклеотидов или последовательности этих нуклеотидов. Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» используются в данном контексте взаимозаменяемо для ссылки на гетерополимер нуклеотидов.

Кроме того, предпочтительным является то, что вакцинная композиция в соответствии с настоящим изобретением дополнительно характеризуется полинуклеотидом, встроенным в вектор, причем полинуклеотид функционально связан с областью контроля экспрессии вектора.

Этот вектор экспрессии предпочтительно содержит один или несколько регуляторных последовательностей. Термин «вектор экспрессии», как правило, относится к плазмиде или фагу или вирусу или вектору, для экспрессии полипептида из последовательности ДНК (РНК). Вектор экспрессии может содержать транскрипционную единицу, содержащую сборку (1) генетического элемента или элементов, играющих регуляторную роль в экспрессии генов, например, промоторы или энхансеры, (2) структурную или кодирующую последовательность, которая транскрибируется в мРНК и преобразуется в белок, и (3) соответствующие последовательности инициации и терминации транскрипции. Структурные единицы, предназначенные для использования в дрожжевых или эукариотических системах экспрессии, предпочтительно включают лидерную последовательность, обеспечивающую возможность внеклеточной секреции транслируемого белка клеткой-хозяином. В качестве альтернативы, когда рекомбинантный белок экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, он может включать остаток N-концевого метионина. Этот остаток может впоследствии отщепляться или может не отщепляться от экспрессированного рекомбинантного белка с получением конечного продукта. Также предпочтительным является то, что вакцинная композиция в соответствии с настоящим изобретением предлагается в физиологически вводимой форме и пригодна для внутримышечной, внутривенной, подкожной или кожной инъекции или мукозального введения. Следует отметить, что менее предпочтительно внутривенное введение.

В еще одном аспекте настоящее изобретение направлено на фрагмент IdeSsuis, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95% гомологична ей. SEQ ID NO: 5 соответствует высококонсервативной части домена Мас-1. Хотя этот домен демонстрирует активность IgM- протеазы, иммуногенный эффект не обязательно связан с этой активностью. Например, в пределах объема настоящего изобретения имеются аналоги SEQ ID NO: 5, где активный центр протеазы инактивирован путем мутагенеза Cys-остатка. Кроме того, в этом случае аналог будет эффективным в качестве вакцины для индукции иммунного ответа.

Кроме того, оказалось, что аминокислотные последовательности могут быть эффективными в качестве вакцины против инфекций, вызванных S. suis, если они сохраняют гомологию по меньшей мере на 95% к SEQ ID NO: 5. Это включает замещение, вставку или делецию одиночных аминокислот.Оказалось, что встречающиеся в природе домены Мас-1, хотя и демонстрируют некоторые вариации, отличаются не более чем на 5%, или другими словами, имеют общую идентичность 95% или более в этом домене. Иллюстративные последовательности Streptococcus suis были получены из штаммов, выделенных в различных географических регионах (Америка, Азия, Европа) и были извлечены из различных организмов-хозяев (людей, свиней). Эти штаммы принадлежат к различным серотипам (1-4, 7-9, 14 и 16 или которые были нетипируемыми). Эти данные обобщены в прилагаемой таблице 1:

Информация о последовательности домена Мас-1 белков WP_044671938, WP_002935529, WP_015647040, WP_023370787 и WP_044678723 представлена в последовательностях SEQ ID NO: 10 - SEQ ID NO: 14. Так как их гомология с SEQ ID NO: 5 выше 95%, они попадают под определение фрагмента или гомолога по настоящему изобретению.

Еще один аспект представляет собой белок rIdeSsuis, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или 7 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, предпочтительно на 70%, 85% или 95% гомологична аминокислотной последовательности белка IdeSsuis SEQ ID NO: 6 или 7.

Другим объектом настоящего изобретения является клетка-хозяин, которая трансфицирована вектором.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения белка, определенного как rIdeSsuis, в качестве антигена-гостя в векторе или другом организме, соответственно клетки-хозяина, трансфицированной в условиях, подходящих для экспрессии указанного рекомбинантного белка.

Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой антитело, которое распознает белок IdeSsuis или rIdeSsuis, аналог или фрагмент, определенные выше. Антитело предпочтительно выбирают из группы, состоящей из поликлональных антител, моноклональных антител, гуманизированных антител, химерных антител и синтетических антител.

Термин «антитело» используется в данном контексте для интактных антител, а также фрагментов антител, которые обладают определенной способностью селективно связываться с эпитопом. Такие фрагменты включают, без ограничений, фрагменты антител Fab, F(ab') и Fv. Термин «эпитоп» означает любой антигенный детерминант антигена, с которым может связываться паратоп антитела. Детерминанты эпитопа обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул (например, остатки аминокислоты или сахара), и, как правило, отображают трехмерную структуру, а также специфические физические свойства.

Антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены в соответствии с любой известной методикой. Например, чистый полный белок IdeSsuis или rIdeSsuis согласно настоящему изобретению или его фрагмент/аналог может быть получен и использован в качестве иммуногена для иммунизации животного и для получения специфических антител.

Технология получения поликлональных антител общеизвестна. Подробные протоколы можно найти, например, в публикации автора Green и соавторы Production of Polyclonal Antisera, Immunochemical Protocols (Manson, editor), pp.1-5 (Humana Press 1992) и в публикации автора Coligan и соавторы Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters, Current Protocols In Immunology, section 2.4.1 (1992). Кроме того, специалистам известны несколько методов по очистке и концентрированию поликлональных антител, а также моноклональных антител (Coligan et al, Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994).

Технология получения моноклональных антител также общеизвестна. Примеры включают метод гибридом (Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497, Coligan et al., section 2.5.1 - 2.6.7; и Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, page 726 (Cold Spring Harbor Pub. 1988).), метод триом, метод человеческой В-клеточной гибридомы (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), и метод EBV-гибридомы для получения человеческих моноклональных антител (Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

Вкратце, моноклональные антитела можно получить путем введения смеси, содержащей белок в соответствии с изобретением, мышам. Продуцирование антител у мышей проверяют с помощью сывороточного зонда. В случае достаточного титра антител мышь умерщвляют и извлекают селезенку, чтобы выделить В-клетки. В-клетки объединяют с миеломными клетками, что приводит к образованию гибридом. Гибридомы клонируют и клоны анализируют. Положительные клоны, которые содержат моноклональные антитела против белка, отбирают и антитела выделяют из гибридомных культур. Существует много установившихся методов выделения и очистки моноклональных антител. Такие методы включают аффинную хроматографии с белком А-сефароза, гель-хроматографию и ионообменную хроматографию. Также смотри, например, Coligan и соавторы, раздел 2.7.1 - 2.7.12 и раздел «Иммуноглобулин G (IgG)» [ʺImmunglobulin G (IgG)ʺ], в Methods In Molecular Biology, том 10, страницы 79-104 (Humana Press 1992).

Предпочтительно, в настоящем изобретении предлагаются гуманизированные специфические антитела мыши IdeSsuis или rIdeSsuis.

Вышеуказанные антитела могут формировать часть парентеральной композиции для терапевтического лечения пациента, человека или животного (свинья), страдающего от инфекции, вызванной S. suis. Однако они могут также использоваться и в профилактических целях.

В еще одном аспекте настоящее изобретение направлено на применение предлагаемых выше белков для получения описанных выше антител.

Другим объектом настоящего изобретения является применение вакцинной или парентеральной композиции в соответствии с настоящим изобретением для осуществления профилактического или метафилактического или терапевтического лечения инфекции, вызванной Streptococcus suis, у свиней. Далее в данном документе предполагается использовать вакцину или парентеральную композицию в соответствии с настоящим изобретением для профилактического или метафилактического или терапевтического лечения инфекции, вызванной S. Suis, у пациента-человека.

Особенно предпочтительным является применение вакцинной композиции в соответствии с настоящим изобретением, отличающееся тем, что лечение вызывает иммунный ответ у свиней, тогда как иммунный ответ представляет собой активацию гуморального и клеточного ответа против белка IdeSsuis, продуцированного бактериями Streptococcus suis.

Лечение (вакцинация) предусматривает по меньшей мере одну или две иммунизации. Общая доза, вводимая одной свинье/одному человеку, составляет примерно 0,05-2,0 мг белка.

Приготовление вакцинной композиции в соответствии с изобретением известно в данной области и описано в справочниках, известных специалисту в данной области. Для получения вакцинной композиции в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться фармацевтически приемлемые носители, разбавители или адъюванты, которые содержат, но не ограничиваются этим, следующее: адьюванты минеральных солей (например, на основе алюминия, кальция, железа, циркония), тензоактивные адъюванты (например, Quil A, QS-21, другие сапонины), адъюванты, извлеченные из бактерий (например, N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин (MDP), липополисахариды (LPS), монофосфориллипид А, димиколат трегалозы (TDM), ДНК, CpGs, бактериальные токсины), адъювантные эмульсии (например, FIA, Монтанид, Адьювант 65, Липовант), липосомные адъюванты, полимерные адъюванты и носители, цитокины (например, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), углеводные адъюванты, живые системы доставки антигена (например, бактерии, вирусы). Кроме того, носители могут также содержать сухие препараты, такие как пластыри с покрытием, изготовленные из титана или полимера. Методы составления и введения вакцин в соответствии с настоящей заявкой также можно найти в «Remington, The Science and Practice of Pharmacy», 22-е издание.

Таким образом, настоящее изобретение направлено на вакцинную композицию, содержащую белок, обозначенный как IdeSsuis или rIdeSsuis, или фрагмент любого из них; или полинуклеотид, экспрессирующий либо белок IdeSsuis, либо rIdeSsuis, либо фрагмент любого из них, который встроен в вектор экспрессии, тогда как рекомбинантный белок является предпочтительным.

Авторами данного изобретения обнаружено следующее:

(a) индукция опсонизирующих антител имеет решающее значение для защитной эффективности S. suis бактерина.

(b) IdeSsuis способствует выживанию S. suis в крови вакцинированных поросят.

Кроме того, авторы изобретения показали, что вакцинация свиней с использованием только белка rIdeSsuis в качестве единственного антигена обеспечивает защиту свиней, инфицированных S. suis. В соответствии с изобретением вакцинация белком rIdeSsuis предотвращает расщепление IgMs с помощью IdeSsuis IgM-протеазы S. suis путем индукции нейтрализующих антител.

В соответствии с настоящим изобретением вакцинация свиней с помощью рекомбинантного белка rIdeSsuis или его фрагмента привело к высоким титрам IdeSsuis-специфических антител IgG с нейтрализующей активностью в отличие от реконвалесцентных или иммунизированных S. S. Suis-бактерином поросят.Кроме того, в соответствии с Примером 1, было показано, что rIdeSsuis обеспечивает более высокий иммунитет против вызванных S. suis инфекций, чем бактерин-вакцины известного уровня техники.

Кроме того, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что вакцинация свиней рекомбинантным белком rIdeSsuis или его аналогом или фрагментом снижает выживаемость S. suis в крови.

Один важный аспект настоящего изобретения - как уже отмечалось выше - заключается в неожиданном понимании того, что белки, нуклеиновые кислоты и их аналоги и фрагменты, согласно определению выше, могут использоваться в качестве единственного иммуногенного агента для обеспечения защиты от инфекций, вызванных S. suis. Никакие другие активные ингредиенты не требуются, как например бактерины и т.д., используемые в известном уровне техники. Это подтверждается экспериментальным свидетельством, представленным в Примере 2. Показано, что вакцины в соответствии с настоящим изобретением обладают существенно более высокой эффективностью по сравнению с плацебо/контрольными вакцинами, см. данные бактериального анализа испытаний 1 и 2 из Примера 2 (Фиг. 3 и 4). Выводы, которые можно сделать из результатов эксперимента, заключаются в следующем:

rIdeSsuis (SEQ ID NO: 2) обеспечивает иммунную защиту по различным серотипам S. Suis,

Белок, по меньшей мере содержащий высококонсервативный домен Мас-1 (SEQ ID NO: 5), является достаточным для обеспечения иммунной защиты,

Кроме того, белки IdeSsuis других серотипов, по меньшей мере содержащие высококонсервативный домен Мас-1 (SEQ ID NO: 5), индуцируют защиту, даже если их общая последовательность вне этого домена отличается от последовательности штаммов серотипа 2 (даже если определенные сегменты последовательности полностью отсутствуют).

В соответствии с настоящим изобретением белки IdeSsuis или rIdeSsuis или их аналоги/фрагменты могут также использоваться в слитых белках. Слитые белки создаются путем соединения двух или более генов, которые изначально закодированы на отдельные белки. Трансляция этого слитого гена дает в результате одиночный или множественный полипептид с функциями, каждая из которых происходит из первоначальных белков. На современном уровне развития слитые белки часто используют для упрощения специфических применений, таких как детекция, интеграция или транспорт белка, представляющего интерес. Основным элементом для детекции методом флуоресцентной микроскопии является зеленый флуоресцентный белок (GFP), слитый с белком, представляющим интерес.

Другие белки, которые могут быть слиты с IdeSsuis для улучшения доставки и иммуногенности антигена, представляют собой FC-фрагмент иммуноглобулина, нетоксичную СТА субъединицу холерного токсина, мутированные термолабильные токсины, белок оболочки спор сенной палочки или бактериальные флагеллины. Кроме того, слитые белки с белками вирусов или фагов (например, модифицированный вирус коровьей оспы Анкара (MVA), вирус гепатита В, фаг лямбда или нитевидные фаги типа fd, M13 или fI) могут использоваться для экспрессии IdeSsuis на поверхности вирусной частицы или вирусоподобной частицы.

Другая возможность обнаружить слитые белки заключается в использовании так называемых белковых меток, которые часто используются в процессе получения слитых белков, соответственно, их очистки и детекции посредством выполнения аффинной хроматографии, вестерн-блоттинга, иммуногистохимии или флуоресцентной микроскопии. Белковые метки обычно представляют собой короткие аминокислотные последовательности, например His-метка, myc-метка, НА-метка, Step-метка, GST-метка, связывающий мальтозу белок-метка или тиоредоксин-метка.

Способ получения рекомбинантных белков, таких как rIdeSsuis, их фрагментов или аналогов в соответствии с настоящим изобретением известен специалистам в данной области, а также описан в справочниках, известных специалистам в данной области. Как правило, для получения рекомбинантного белка используются клетки-хозяева для трансфицирования с вектором, кодирующим белок, представляющий интерес. В общем, эти клетки-хозяева могут представлять собой бактерии (например, штаммы Е. coli, Bacillus или Lactococcus), человеческие (например, 293-Т, НЕК-293), мышиные клеточные линии, клеточные линии насекомых, клетки дрожжей или системы на основе растений.

Для трансфекции векторов экспрессии клеток-хозяев, таких как плазмиды (например, рЕТ, pQE), могут использоваться вирусы и бактериофаги (например, бакуловирус, фаг лямбда или нитевидные бактериофаги).

Обычно вакцинные или парентеральные композиции готовят в виде инъецируемых препаратов, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий.

Предметом настоящего изобретения также является вакцинная или парентеральная композиция для подкожного, внутривенного, внутримышечного, кожного или мукозального введения.

Представленные вакцины используются для выполнения профилактического или метафилактического или терапевтического лечения инфекции, вызванной Streptococcus suis, у свиней или людей. Лечение предусматривает по меньшей мере одну, предпочтительно две иммунизации. Хотя на практике предпочтительной является одна иммунизация, стандартная иммунизация обычно включает в себя «прайм-буст» режим (prime-boost regimen), то есть 2 отдельные вакцинации. Буст-вакцинация обычно выполняется в сроки 1-3 недели, предпочтительно примерно 2 недели после прайм-вакцинации. Дозировка отдельных вакцинации может быть одинаковой или разной, хотя предпочтительно, чтобы доза вакцины была одинаковой для обеих вакцинаций. Общая доза, которая должна быть введена пациенту, животному или человеку, составляет примерно 0,05-2,0 мг белка IdeSsuis или rIdeSsuis, аналогов или фрагментов, как определено выше. Предпочтительные дозы включают 0,1-1,0, более предпочтительно примерно 0,5 мг.Эта доза вводится в виде одной дозы, при условии, что достаточной является одна вакцинации. Если применяется не одна вакцинация, общая доза разделяется на несколько равных субдоз, например, при использовании двух вакцинаций индивидуальная доза вакцины составляет примерно 0,025-1,0 мг белка.

Настоящее изобретение далее описано со ссылкой на следующие фигуры, где

На Фиг. 1 показана таблица времени, представляющая провокационные эксперименты по вакцинации с использованием S. suis у свиней,

На Фиг. 2 показан график, представляющий результаты, полученные в провокационных экспериментах вакцинации согласно Фиг. 1,

На Фиг. 3 показана схема испытания 1 по оценке эффективности вакцины с применением бактерицидного анализа,

На Фиг. 4 показана схема, представляющая результаты бактерицидного анализа при привлечении вакцинации с использованием плацебо против rIdeSsuis согласно Фиг. 3,

На Фиг. 5 показана схема испытания 2 по оценке эффективности вакцины с применением бактерицидного анализа,

На Фиг. 6 изображена схема, представляющая результаты бактерицидного анализа при привлечении вакцинации с использованием аналогов rIdeSsuis или rIdeSsuis против контрольной группы согласно Фиг. 5.

Кроме того, к этому описанию прилагается перечень последовательностей.

SEQ ID NO: 1 представляет аминокислотную последовательность белка IdeSsuis;

SEQ ID NO: 2 представляет аминокислотную последовательность рекомбинантного белка rIdeSsuis без сигнального пептида;

SEQ ID NO: 3 представляет нуклеотидная последовательность, кодирующую IdeSsuis и

SEQ ID NO: 4 представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую rIdeSsuis.

SEQ ID NO: 5 представляет аминокислотную последовательность высококонсервативной части домена Мас-1 IdeSsuis.

SEQ ID NO: 6 представляет аминокислотную последовательность аналога rIdeSsuis rIdeSsuis_homologue.

SEQ ID NO: 7 представляет аминокислотную последовательность аналога rIdeSsuis rIdeSsuisB2.

SEQ ID NO: 8 представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую аналог rIdeSsuis rIdeSsuis_homologue.

SEQ ID NO: 9 представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую аналог rIdeSsuis rIdeSsuisB2.

SEQ ID NO: 10 представляет аминокислотного последовательность аминокислот 91 - 425 белка WP_044671938.

SEQ ID NO: 11 представляет аминокислотного последовательность аминокислот 91 - 425 белка WP_002935529.

SEQ ID NO: 12 представляет аминокислотную последовательность аминокислот 92 - 426 белка WP_015647040.

SEQ ID NO: 13 представляет аминокислотную последовательность аминокислот 92 - 426 белка WP_023370787.

SEQ ID NO: 14 представляет аминокислотную последовательность аминокислот 92 - 426 белка WP_044678723.

Следующие примеры объясняют настоящее изобретение. Примеры следует понимать только в качестве одного предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения. Настоящее изобретение не ограничивается объемом приведенных примеров.

Пример 1

В следующем примере представлены экспериментальные данные после проведения провокационных экспериментов по вакцинации поросят, инфицированных S. suis.

Организация провокационных экспериментов по вакцинации поросят в отношении различных серотипов S. suis (серотип 2 и 9) и пути инфицирования (внутривенный и интраназальный).

Вкратце, как показано на Фиг. 1, поросята в возрасте пяти недель были прайм-вакцинированы rIdeSsuis-вакциной. В возрасте 7 недель эти поросята были бустер-вакцинированы с помощью rIdeSsuis и в одной группе также были прайм-вакцинированы бактерином путем внутримышечной инъекции (показано в таблице на Фиг. 1). Одна группа поросят была только прайм-вакцинирована бактерином в возрасте 7 недель, а последнюю группу животных вакцинировали дважды с помощью плацебо, состоящего из буфера и адъюванта. Поросят инфицировали через две недели после второй иммунизации интраназально. Мониторинг животных далее проводился каждые восемь часов. Из соображений благополучия животных, животных подвергали эвтаназии в каждом случае, когда у поросенка появлялась высокая температура в сочетании с апатией и анорексией, а также в случае клинических признаков острого полиартрита или тяжелого менингита.

Все оставшиеся в живых поросят были умерщвлены через 14 дней после инфицирования.

Эксперимент выявил, что иммунизация поросят с использованием только рекомбинантного белка rIdeSsuis является достаточной для защиты поросят от инфекций, вызванных серотипом 2 S. suis (Фиг. 2).

Пример 2

8 этом примере для оценки эффективности данной вакцины применяли бактерицидный анализ. Этот тест предусматривает определение выживаемости бактерий S. suis определенного серотипа после добавления в кровь подопытного животного. Если в крови этого подопытного животного присутствуют протективные антитела против определенного серотипа, бактерии будут эффективно уничтожены во время инкубации в течение 2-х часов. Степень защиты обозначается как «фактор выживания» (SF) и представляет собой отношение количества колоний через 120 мин. и количества колоний непосредственно после добавления бактерий в кровь подопытного животного. Низкий фактор выживаемости означает эффективное уничтожение бактерий в крови и, следовательно, эффективную защиту подопытного животного.

Экспрессию и очистку рекомбинантного IdeSsuis (SEQ ID NO: 2), рекомбинантного IdeSsuisB2 (SEQ ID NO: 7) и рекомбинантного IdeSsuis_homologue (SEQ ID NO: 6) осуществляли путем выращивания соответствующих штаммов в LB бульоне плюс ампициллин. Экспрессию белка индуцировали добавлением IPTG. Очистку рекомбинантных белков с помощью аффинной хроматографии с Ni²⁺-нитрилотриуксусной кислотой в нативных условиях проводили, как рекомендовано производителем (Macherey-Nagel).

Иммунизация поросят: Поросята были прайм- и бустер-вакцинированы с использованием 1,5 мл вакцины, содержащей 0,25 мг rIdeSsuis или 0,25 мг rIdeSsuisB2 или 0,5 мг rIdeSsuis_homologue с содержанием 20% [об/об] Emulsigen в качестве адьюванта.

Испытание 1.

Два или четыре однопометных поросенка случайным образом были распределены в две испытательные группы (n=9/группу), группа 1 контрольная (плацебо), группа 2, иммунизированная rIdeSsuis (SEQ ID NO: 2). Животные были иммунизированы и протестированы в соответствии со следующей схемой испытания на Фиг. 3.

Полученные результаты приведены на Фиг. 4.

Контрольная группа (плацебо) показала гораздо более высокий фактор выживаемости, чем вакцинированная группа. Рекомбинантный антиген rIdeSsuis (вакцинированная группа), содержащий полную последовательность белков IdeSsuis штамма серотипа 2 (SEQ ID NO: 2), индуцирует антитела, вызывающие эффективное уничтожение бактерий S. suis штамма 2, также, как и штамма 9.

Испытание 2.

Четыре однопометных поросенка случайным образом были распределены в четыре испытательные группы (n=6/группа, за исключением группы 4, где n=5): группа 1 контрольная (не иммунизированная); группа 2, иммунизированная rIdeSsuis_homologue (SEQ ID NO: 6); группа 3, иммунизированная IdeSsuis, полученным из штамма серотипа 7 (rIdeSsuisB2; SEQ ID NO: 7); группа 4, иммунизированная SEQ ID NO: 2. Животные были иммунизированы и протестированы в соответствии со следующей схемой испытания на Фиг. 5.

Полученные результаты приведены на Фиг. 6.

Результаты демонстрируют значительно более высокий фактор выживаемости в контрольной группе (группа 1), чем в трех вакцинированных группах. Рекомбинантный антиген rIdeSsuis_homologue (группа 2), содержащий только N-концевой фрагмент, включающий высоко консервативный домен Мас-1 (IGM-протеаза-домен), индуцировал антитела, которые дают в результате гораздо лучшее уничтожение бактерий по сравнению с контрольной группой. Результат по 2-й группе можно сравнить с результатами, полученными по группе 4. Кроме того, антиген rIdeSsuis, содержащий полную аминокислотную последовательность зрелого белка IdeSsuis штамма серотипа 2 S. Suis, индуцирует антитела, которые значительно снижают выживаемость штамма серотип 9 S. suis в крови. Выживаемость штамма серотипа 9 даже еще в большей степени снижается под влиянием антител, которые были индуцированы антигеном rIdeSsuisB2 (группа 3).

rIdeSsuisB2 (SEQ ID NO: 7) содержит полную аминокислотную последовательность зрелого белка IdeSsuis штамма серотипа 7 S. suis и отличается С-концевой половиной белка, так как в ней отсутствует последовательность 114 аа по сравнению с SEQ ID NO: 1. От аа 80 до 414 в SEQ ID NO: 7 (высококонсервативная часть так называемого домена Мас-1) соответствуют на 97,9% последовательности SEQ ID NO: 5. Идентичность между оставшейся С-концевой частью последовательности SEQ ID NO: 7 и 1 составляет 96,4%.

Выводы, которые можно сделать из результатов эксперимента, заключаются в следующем:

rIdeSsuis (SEQ ID NO: 2) обеспечивает иммунную защиту по различным серотипам S. suis,

Аминокислота, по меньшей мере содержащая высококонсервативный домен Мас-1, является достаточной для обеспечения иммунной защиты,

Кроме того, белки IdeSsuis других серотипов, по меньшей мере содержащие высококонсервативный домен Мас-1, индуцируют защиту, даже если их общая последовательность вне этого домена отличается от последовательности штамма серотипа 2 (даже если некоторые сегменты последовательности полностью отсутствуют).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ИДТ Биологика ГмбХ

<120> Вакцинная композиция против инфекции, вызванной Streptococcus suis

<130> P37819-WO

<150> EP14170637.4

<151> 2014-05-30

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1141

<212> PRT

<213> Streptococcus suis

<400> 1

Met Asn Ile Gln Glu Arg Phe Ser Leu Arg Lys Ser Ala Val Gly Leu

1 5 10 15

Val Ser Val Ser Leu Leu Cys Ala Ile Tyr Thr Ser Thr Val Ala Ala

20 25 30

Asp Thr Val Val Thr Gly Val Asn Glu Ile Ile Glu Glu Ser Gln Val

35 40 45

Lys Asp Glu Val Ser Ile Glu Ser Glu Lys Asn Glu Ser Leu Asp Gly

50 55 60

Ser Asn Ile Glu Ile Val Glu Glu Ile Ala Asp Asn Ile Pro Ser Pro

65 70 75 80

Val Ile Ala Glu Gly Glu Val Ala Val Glu Met Lys Val Asp Arg Gly

85 90 95

Thr Glu Asn Val Val Ser Arg Asn Asp Thr Glu Val Thr Thr Ser Glu

100 105 110

Gln Asn Gln Ile Glu Val Thr Glu Thr Lys Glu Ile Leu Asn Gln Thr

115 120 125

Ser Tyr Gln Thr Glu Ser Gly Glu Gln Arg Gln Ile Ile Trp Ala His

130 135 140

Gly Ile Thr Pro Pro Ala Met Glu Gln Ser Gly Gly Phe Val Lys Glu

145 150 155 160

Lys Tyr Gly Asp Tyr Leu Asn Tyr Thr Ala Pro Phe Glu Ala Gly Lys

165 170 175

Gly Tyr Tyr Asp Thr Asn Lys Ser Leu Asn Ala Ser Phe Ile Asp Leu

180 185 190

Asn Leu Cys Phe Ala Ala Val Ser Ser Asn Met Val His Trp Trp Leu

195 200 205

Glu Gln Asn Ser Ser Tyr Val Glu Arg Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Gly

210 215 220

Thr Val Asn Val Glu Glu Asn Tyr Ala Ile Thr Asp Leu Arg Arg Tyr

225 230 235 240

Ile Asn Ser Phe Gln Asn Gln Gln Asn Ser Arg Val Phe Asp Met Phe

245 250 255

Lys Thr Tyr Tyr Gly Tyr Arg Thr Asn Gly Phe Val Ser Asp Ala Leu

260 265 270

Val Asp Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Lys Pro Lys Ala Gln Gly Gly Val

275 280 285

Asn Leu Glu Asp Ser Gln Leu Val Pro Asp Ser Arg Gly Gly Phe Phe

290 295 300

Tyr Asp Val Phe Lys Glu Lys Lys Leu Thr Asn Arg Ile Phe Ser Gly

305 310 315 320

Ser Tyr Glu Arg Phe Gly Glu Asp Val Arg Thr Val Leu Glu Ser Lys

325 330 335

Gly Leu Leu Gly Leu Thr Tyr Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr His Ile

340 345 350

Val Thr Val Trp Gly Ala Glu Tyr Asp Asn Gln Gly Lys Ile Lys Ala

355 360 365

Val Tyr Ile Thr Asp Ser Asp Asp Gln Gln Glu Gln Ile Gly Leu Lys

370 375 380

Arg Met Gly Ile Thr Arg Asp Ala Ser Gly Asn Pro Arg Leu Asn Asn

385 390 395 400

His Met Lys Asn Asn Ser Ala Gly Ala Leu Leu Asp Tyr Val His Thr

405 410 415

Ile Arg Leu Gly Gln Asp Leu Trp Glu Glu Tyr Phe Asn Pro Leu Ala

420 425 430

Lys Ala Lys Glu Thr Ala Ser Gln Thr Leu Ala Asp Thr Lys Lys Ala

435 440 445

Leu Asp Leu Ser Ile Gln Gly Gln Ser Glu Leu Pro Glu Ser Met Arg

450 455 460

Leu Ile Tyr Leu Glu Lys Leu Asn Asn Leu Tyr Asn Gln Gly Ile Leu

465 470 475 480

Ser Ile Gln Lys Ala Glu Ser Ser Glu Met Leu Ser Gly Ala Leu Glu

485 490 495

Asn Gly Leu Asn Ser Leu Lys Ser Leu Asp Phe Pro Ile Ser Glu Val

500 505 510

Gly Asn Ala Leu Ala Pro Asp Leu Pro Val Gly Asp Arg Ser Thr Val

515 520 525

Ser Asp Val Asp Ser Leu Ser Ser Gln Glu Thr Ser Ser Thr Asn Leu

530 535 540

Glu Ala Asp Thr Glu Asn Ala Gly Ile Ile Ala Asp Gly Thr Asn Gln

545 550 555 560

Leu His Phe Pro Val Glu Ala Gln Thr Thr Ser Ser Val Glu Ala Glu

565 570 575

Gly Asp Asn Val Phe Glu Gln Glu Ala Asp Thr Leu Pro Ile Ile Ile

580 585 590

Glu Asn Lys Asp Glu Phe Gly Ser Glu Leu Ser Arg Asn Met Gln Thr

595 600 605

Ser Glu Thr Asp Ser Leu Val Val Ala Val Glu Glu Asp Val Lys Asn

610 615 620

Asp Glu Val Ala Gln Val Glu Glu Leu Leu Glu Ser Glu Lys Val Glu

625 630 635 640

Asn Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Asp Thr Leu Ile Val Glu Ser Ala

645 650 655

Asn Asp Lys Glu Glu Asp Arg Val Glu Ala Val Val Ser Glu Gln Pro

660 665 670

Asp Ser Ile Pro His Gln Asn Val Glu Ile Ser Leu Val Glu Pro Thr

675 680 685

Asn Val Glu Thr Glu Thr Val Val Thr Pro Ile Asn Asp Ala Ala Thr

690 695 700

Pro His Gly Ser Pro Thr Tyr Ile Asp Asn Ser Val Thr Glu Ser Val

705 710 715 720

Ala Thr Pro Leu Glu Lys Asp Ser Ile Gln Ala Gly Glu Thr Glu Ile

725 730 735

Ala Glu Pro Thr Ser Ser Glu Ser Thr Asn Val Glu Thr Glu Thr Val

740 745 750

Val Thr Pro Val Asn Asp Val Ala Thr Pro His Gly Ser Pro Thr Tyr

755 760 765

Ile Asp Asn Ser Val Thr Glu Ser Val Ala Thr Pro Leu Glu Lys Asp

770 775 780

Ser Ile Gln Ala Gly Glu Thr Glu Ile Ala Glu Pro Thr Ser Ser Glu

785 790 795 800

Ser Thr Asn Val Glu Thr Glu Thr Val Val Thr Pro Val Asn Asp Val

805 810 815

Ala Thr Pro His Gly Ser Pro Thr Tyr Ile Asp Asn Ser Val Thr Glu

820 825 830

Ser Val Ala Thr Pro Leu Glu Lys Asp Ser Ile Gln Ala Gly Glu Thr

835 840 845

Glu Ile Ala Glu Pro Thr Ser Ser Glu Ser Thr Ser Val Glu Ala Glu

850 855 860

Leu Val Asp Asn Ser Glu Ile His Ala Ala Thr Ser Ser Val Thr Pro

865 870 875 880

Cys Gly Ser Ser Ala Tyr Ala Asp Gly Ser Thr Thr Glu Ser Val Ala

885 890 895

Thr Pro Leu Glu Lys Asp Ser Ile Gln Thr Gly Asn Thr Glu Ile Ala

900 905 910

Glu Pro Thr Ser Ser Lys Ser Thr Asn Val Glu Ala Ala Ser Val Asp

915 920 925

Asn Ser Glu Ile His Ala Asp Ala Ser Leu Thr Ala Val Ser Ser Val

930 935 940

Asn Leu Asp Asn Pro Val Ile Glu Pro Val Ala Ile Ser Leu Ile Gly

945 950 955 960

Ser Lys Arg Asp Thr Asn Ala Glu Val Glu Val Ser Ser Leu Ser Lys

965 970 975

Arg Glu Val Arg Lys Thr Asn Thr Asp Gly Leu Ile Ser Val Gln Ser

980 985 990

Lys Val Ile Lys Lys Glu Leu Leu Glu Ser Ser Leu Ala Glu Ala Gly

995 1000 1005

Ser Pro Leu Leu Glu Ala Thr Ile Ala Gln Ser Ser Asn Ser Asn

1010 1015 1020

Ser Thr Glu Ile Gly Met Ser Tyr Gln Asn Thr Val Leu Leu Glu

1025 1030 1035

Ser Asn Asn Thr Glu Arg Gln Val Ser Lys Ala Glu Ile Val Met

1040 1045 1050

Glu His Lys Glu Thr Glu Leu Val Glu Thr Val Ser Ser Ala Ser

1055 1060 1065

Glu Pro Val Val Leu Val Glu Asn Ile Ser Gln Thr Ser Asn Asn

1070 1075 1080

Thr Ile Glu Ser Gly Lys Asn Met Gly Val Gln Ser Gln Ala Gly

1085 1090 1095

Ala Lys Gln Ile Leu Gly Val Glu Gln Ser Ser Lys Val Ser Thr

1100 1105 1110

Pro Thr Ser Arg Gln Ile Met Gly Val Gly Leu Leu Thr Leu Val

1115 1120 1125

Leu Gly Ser Ala Leu Gly Leu Leu Lys Lys Arg Arg Lys

1130 1135 1140

<210> 2

<211> 1130

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> rIdeSsuis

<400> 2

Met Ala His His His His His His Val Gly Thr Gly Ser Asn Asp Asp

1 5 10 15

Asp Asp Lys Ser Pro Asp Pro Val Val Thr Gly Val Asn Glu Ile Ile

20 25 30

Glu Glu Ser Gln Val Lys Asp Glu Val Ser Ile Glu Ser Glu Lys Asn

35 40 45

Glu Ser Leu Asp Gly Ser Asn Ile Glu Ile Val Glu Glu Ile Ala Asp

50 55 60

Asn Ile Pro Ser Pro Val Ile Ala Glu Gly Glu Val Ala Val Glu Met

65 70 75 80

Lys Val Asp Arg Gly Thr Glu Asn Val Val Ser Arg Asn Asp Thr Glu

85 90 95

Val Thr Thr Ser Glu Gln Asn Gln Ile Glu Val Thr Glu Thr Lys Glu

100 105 110

Ile Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Gln Thr Glu Ser Gly Glu Gln Arg Gln

115 120 125

Ile Ile Trp Ala His Gly Ile Thr Pro Pro Ala Met Glu Gln Ser Gly

130 135 140

Gly Phe Val Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Tyr Leu Asn Tyr Thr Ala Pro

145 150 155 160

Phe Glu Ala Gly Lys Gly Tyr Tyr Asp Thr Asn Lys Ser Leu Asn Ala

165 170 175

Ser Phe Ile Asp Leu Asn Leu Cys Phe Ala Ala Val Ser Ser Asn Met

180 185 190

Val His Trp Trp Leu Glu Gln Asn Ser Ser Tyr Val Glu Arg Tyr Leu

195 200 205

Lys Glu Lys Lys Gly Thr Val Asn Val Glu Glu Asn Tyr Ala Ile Thr

210 215 220

Asp Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Ser Phe Gln Asn Gln Gln Asn Ser Arg

225 230 235 240

Val Phe Asp Met Phe Lys Thr Tyr Tyr Gly Tyr Arg Thr Asn Gly Phe

245 250 255

Val Ser Asp Ala Leu Val Asp Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Lys Pro Lys

260 265 270

Ala Gln Gly Gly Val Asn Leu Glu Asp Ser Gln Leu Val Pro Asp Ser

275 280 285

Arg Gly Gly Phe Phe Tyr Asp Val Phe Lys Glu Lys Lys Leu Thr Asn

290 295 300

Arg Ile Phe Ser Gly Ser Tyr Glu Arg Phe Gly Glu Asp Val Arg Thr

305 310 315 320

Val Leu Glu Ser Lys Gly Leu Leu Gly Leu Thr Tyr Arg Thr Leu Gly

325 330 335

Tyr Ala Thr His Ile Val Thr Val Trp Gly Ala Glu Tyr Asp Asn Gln

340 345 350

Gly Lys Ile Lys Ala Val Tyr Ile Thr Asp Ser Asp Asp Gln Gln Glu

355 360 365

Gln Ile Gly Leu Lys Arg Met Gly Ile Thr Arg Asp Ala Ser Gly Asn

370 375 380

Pro Arg Leu Asn Asn His Met Lys Asn Asn Ser Ala Gly Ala Leu Leu

385 390 395 400

Asp Tyr Val His Thr Ile Arg Leu Gly Gln Asp Leu Trp Glu Glu Tyr

405 410 415

Phe Asn Pro Leu Ala Lys Ala Lys Glu Thr Ala Ser Gln Thr Leu Ala

420 425 430

Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Leu Ser Ile Gln Gly Gln Ser Glu Leu

435 440 445

Pro Glu Ser Met Arg Leu Ile Tyr Leu Glu Lys Leu Asn Asn Leu Tyr

450 455 460

Asn Gln Gly Ile Leu Ser Ile Gln Lys Ala Glu Ser Ser Glu Met Leu

465 470 475 480

Ser Gly Ala Leu Glu Asn Gly Leu Asn Ser Leu Lys Ser Leu Asp Phe

485 490 495

Pro Ile Ser Glu Val Gly Asn Ala Leu Ala Pro Asp Leu Pro Val Gly

500 505 510

Asp Arg Ser Thr Val Ser Asp Val Asp Ser Leu Ser Ser Gln Glu Thr

515 520 525

Ser Ser Thr Asn Leu Glu Ala Asp Thr Glu Asn Ala Gly Ile Ile Ala

530 535 540

Asp Gly Thr Asn Gln Leu His Phe Pro Val Glu Ala Gln Thr Thr Ser

545 550 555 560

Ser Val Glu Ala Glu Gly Asp Asn Val Phe Glu Gln Glu Ala Asp Thr

565 570 575

Leu Pro Ile Ile Ile Glu Asn Lys Asp Glu Phe Gly Ser Glu Leu Ser

580 585 590

Arg Asn Met Gln Thr Ser Glu Thr Asp Ser Leu Val Val Ala Val Glu

595 600 605

Glu Asp Val Lys Asn Asp Glu Val Ala Gln Val Glu Glu Leu Leu Glu

610 615 620

Ser Glu Lys Val Glu Asn Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Asp Thr Leu

625 630 635 640

Ile Val Glu Ser Ala Asn Asp Lys Glu Glu Asp Arg Val Glu Ala Val

645 650 655

Val Ser Glu Gln Pro Asp Ser Ile Pro His Gln Asn Val Glu Ile Ser

660 665 670

Leu Val Glu Pro Thr Asn Val Glu Thr Glu Thr Val Val Thr Pro Ile

675 680 685

Asn Asp Ala Ala Thr Pro His Gly Ser Pro Thr Tyr Ile Asp Asn Ser

690 695 700

Val Thr Glu Ser Val Ala Thr Pro Leu Glu Lys Asp Ser Ile Gln Ala

705 710 715 720

Gly Glu Thr Glu Ile Ala Glu Pro Thr Ser Ser Glu Ser Thr Asn Val

725 730 735

Glu Thr Glu Thr Val Val Thr Pro Val Asn Asp Val Ala Thr Pro His

740 745 750

Gly Ser Pro Thr Tyr Ile Asp Asn Ser Val Thr Glu Ser Val Ala Thr

755 760 765

Pro Leu Glu Lys Asp Ser Ile Gln Ala Gly Glu Thr Glu Ile Ala Glu

770 775 780

Pro Thr Ser Ser Glu Ser Thr Asn Val Glu Thr Glu Thr Val Val Thr

785 790 795 800

Pro Val Asn Asp Val Ala Thr Pro His Gly Ser Pro Thr Tyr Ile Asp

805 810 815

Asn Ser Val Thr Glu Ser Val Ala Thr Pro Leu Glu Lys Asp Ser Ile

820 825 830

Gln Ala Gly Glu Thr Glu Ile Ala Glu Pro Thr Ser Ser Glu Ser Thr

835 840 845

Ser Val Glu Ala Glu Leu Val Asp Asn Ser Glu Ile His Ala Ala Thr

850 855 860

Ser Ser Val Thr Pro Cys Gly Ser Ser Ala Tyr Ala Asp Gly Ser Thr

865 870 875 880

Thr Glu Ser Val Ala Thr Pro Leu Glu Lys Asp Ser Ile Gln Thr Gly

885 890 895

Asn Thr Glu Ile Ala Glu Pro Thr Ser Ser Lys Ser Thr Asn Val Glu

900 905 910

Ala Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Ile His Ala Asp Ala Ser Leu Thr

915 920 925

Ala Val Ser Ser Val Asn Leu Asp Asn Pro Val Ile Glu Pro Val Ala

930 935 940

Ile Ser Leu Ile Gly Ser Lys Arg Asp Thr Asn Ala Glu Val Glu Val

945 950 955 960

Ser Ser Leu Ser Lys Arg Glu Val Arg Lys Thr Asn Thr Asp Gly Leu

965 970 975

Ile Ser Val Gln Ser Lys Val Ile Lys Lys Glu Leu Leu Glu Ser Ser

980 985 990

Leu Ala Glu Ala Gly Ser Pro Leu Leu Glu Ala Thr Ile Ala Gln Ser

995 1000 1005

Ser Asn Ser Asn Ser Thr Glu Ile Gly Met Ser Tyr Gln Asn Thr

1010 1015 1020

Val Leu Leu Glu Ser Asn Asn Thr Glu Arg Gln Val Ser Lys Ala

1025 1030 1035

Glu Ile Val Met Glu His Lys Glu Thr Glu Leu Val Glu Thr Val

1040 1045 1050

Ser Ser Ala Ser Glu Pro Val Val Leu Val Glu Asn Ile Ser Gln

1055 1060 1065

Thr Ser Asn Asn Thr Ile Glu Ser Gly Lys Asn Met Gly Val Gln

1070 1075 1080

Ser Gln Ala Gly Ala Lys Gln Ile Leu Gly Val Glu Gln Ser Ser

1085 1090 1095

Lys Val Ser Thr Pro Thr Ser Arg Gln Ile Met Gly Val Gly Leu

1100 1105 1110

Leu Thr Leu Val Leu Gly Ser Ala Leu Gly Leu Leu Lys Lys Arg

1115 1120 1125

Arg Lys

1130

<210> 3

<211> 3426

<212> ДНК

<213> Streptococcus suis

<400> 3

atgaacattc aagaacgatt ttctttgaga aaatccgcgg ttggcttggt ctcagtctct 60

ttgctatgtg ctatttatac atccactgtt gctgccgata cagttgttac aggagtgaat 120

gaaataattg aagaatcaca agtcaaggat gaggtatcta ttgaatcaga aaaaaatgaa 180

tccctagatg gttctaatat tgaaattgta gaggaaatag cagacaacat cccatcacct 240

gttatcgctg aaggggaagt agcggtagag atgaaagttg acagagggac cgagaatgta 300

gtttctagaa atgatacaga agttacgacg agcgagcaaa atcagataga ggttactgag 360

acaaaagaaa ttttgaatca gaccagttat caaacggaga gtggcgagca acgacaaatt 420

atatgggccc atggaattac tcctcctgca atggaacaaa gcggtggttt tgtaaaggaa 480

aagtatggag actatttaaa ctatacagcg ccatttgagg ctggaaaagg ctactatgat 540

accaataaga gtctgaatgc ttcatttatt gaccttaatc tttgttttgc agctgtgtct 600

tcaaacatgg tacattggtg gttggaacag aatagttcct atgttgagcg atatctcaaa 660

gaaaaaaagg gtacagtaaa tgttgaagaa aactacgcaa taacggactt acggcgctat 720

attaattcat tccaaaatca acaaaatagt cgagtttttg atatgttcaa aacttactat 780

ggttatcgta caaatggttt tgtatcagat gccttggttg acttgtttat taacggatat 840

aaacctaagg cacagggcgg tgtcaatctg gaagatagcc agttagtacc agatagtagg 900

ggtggctttt tctacgacgt tttcaaagag aaaaaactga caaatcgaat ttttagtggt 960

agttatgagc ggtttggtga ggatgttcga actgttttgg aaagcaaagg attactcggc 1020

ttaacttata gaacattagg ttatgcaacg catattgtga cggtatgggg tgctgagtac 1080

gacaatcaag gtaagattaa ggctgtctat atcacagatt ctgatgatca acaagaacaa 1140

attggtttga agcgtatggg aatcactcgt gatgcttccg gaaatccacg tttgaataat 1200

catatgaaaa ataattcagc tggagcgctt ttggattatg tccatacaat ccgtctgggt 1260

caagacttat gggaagaata tttcaatccg cttgcaaaag ccaaagaaac agctagtcag 1320

acattagccg atacaaagaa ggcgttggat ttgtctattc aaggacaatc tgaattgcca 1380

gaatcaatgc gactgattta tcttgaaaaa ctaaataatc tctataatca aggaattcta 1440

tctattcaaa aggcagaaag ttctgagatg ctaagtggtg cattggaaaa tggtttaaat 1500

agtttaaaga gtttagattt tcctatttca gaagttggaa atgctttggc accagattta 1560

ccagtaggtg atcgctcaac ggtttcagat gttgattctc tatcatctca agaaacaagt 1620

tccacaaatt tggaagcaga cacagagaat gcaggtatta ttgcagatgg taccaatcaa 1680

ttgcattttc cagtggaggc ccaaacgaca tcttcagtag aggctgaggg agataatgtt 1740

tttgaacaag aggcagatac attaccaata attattgaaa acaaggatga atttggttca 1800

gaactatcaa gaaacatgca aacgtcagaa acggattcgc tagtagtagc tgttgaagaa 1860

gatgtgaaaa atgatgaggt agcccaagtt gaagagcttc ttgaatcaga aaaagttgaa 1920

aatcagagtt cggaacttct gtcagacacc ctaatcgtag agagtgcaaa tgacaaagaa 1980

gaagatagag tggaggcggt tgtttctgaa caaccagact caataccaca tcaaaatgta 2040

gaaatctctc ttgtagaacc aacgaatgtc gaaactgaaa ctgtggtcac tcctattaat 2100

gatgcagcta ctcctcatgg ttccccgacg tatatagata attccgtaac tgaatctgta 2160

gctactccac ttgaaaaaga ctccattcaa gccggggaga cagagattgc agaaccaacc 2220

tcgagcgaat caacgaatgt cgaaactgaa actgtggtca ctcctgttaa tgatgtagct 2280

actcctcatg gttccccgac gtatatagat aattccgtaa ctgaatctgt agctactcca 2340

cttgaaaaag actccattca agccggagag acagaaattg cagaaccaac ctcgagcgaa 2400

tcaacgaatg tcgaaactga aactgtggtc actcctgtta atgatgtagc tactcctcat 2460

ggttccccga cgtatataga taattccgta actgaatctg tagctactcc acttgaaaaa 2520

gactccattc aagccgggga gacagagatt gcagaaccaa cctcgagcga atcaactagt 2580

gttgaagctg aacttgtcga caattctgaa attcatgcag ctacctcttc agttactccc 2640

tgtggctcct cggcatatgc agatggttcc acaactgaat ctgtagccac tccgcttgaa 2700

aaagactcca ttcagactgg aaatacagaa attgcagaac caacctcgag caaatcaact 2760

aatgtagaag ctgcatctgt cgacaattct gaaattcatg cagatgcctc tctaactgct 2820

gtttcatcag ttaatctgga taatccagtg attgaaccag tagctatctc ccttatcggt 2880

tctaagaggg acacgaatgc agaagtagaa gtttcttcat tatcgaaaag agaggttaga 2940

aaaacaaata ctgacgggct aatctctgtt caatcaaaag ttattaagaa agaattgcta 3000

gaatcaagct tagcagaagc agggtctcca ttgctagaag ccaccattgc tcagtcttca 3060

aactcaaata gtactgagat aggtatgagc tatcagaata ctgtgttatt agagtctaat 3120

aatacagagc gtcaggtgtc taaagcagaa attgttatgg aacacaagga gacagagtta 3180

gttgaaacgg tttcatctgc ttctgagcct gtagtgctcg tagaaaatat ctcacaaacc 3240

tcaaataata ctattgaatc tggtaagaat atgggagttc aatctcaagc aggtgcaaaa 3300

caaattttag gcgtagaaca atcttcgaaa gtaagtacac ctacttcaag acagattatg 3360

ggagtcggtc tattgactct tgttcttggt agtgctttag gtttgttaaa gaaaagacgt 3420

aagtaa 3426

<210> 4

<211> 3393

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность кодирующая rIdeSsuis

<400> 4

atggcacatc accaccacca tcacgtgggt accggttcga atgatgacga cgacaagagt 60

ccggatccag ttgttacagg agtgaatgaa ataattgaag aatcacaagt caaggatgag 120

gtatctattg aatcagaaaa aaatgaatcc ctagatggtt ctaatattga aattgtagag 180

gaaatagcag acaacatccc atcacctgtt atcgctgaag gggaagtagc ggtagagatg 240

aaagttgaca gagggaccga gaatgtagtt tctagaaatg atacagaagt tacgacgagc 300

gagcaaaatc agatagaggt tactgagaca aaagaaattt tgaatcagac cagttatcaa 360

acggagagtg gcgagcaacg acaaattata tgggcccatg gaattactcc tcctgcaatg 420

gaacaaagcg gtggttttgt aaaggaaaag tatggagact atttaaacta tacagcgcca 480

tttgaggctg gaaaaggcta ctatgatacc aataagagtc tgaatgcttc atttattgac 540

cttaatcttt gttttgcagc tgtgtcttca aacatggtac attggtggtt ggaacagaat 600

agttcctatg ttgagcgata tctcaaagaa aaaaagggta cagtaaatgt tgaagaaaac 660

tacgcaataa cggacttacg gcgctatatt aattcattcc aaaatcaaca aaatagtcga 720

gtttttgata tgttcaaaac ttactatggt tatcgtacaa atggttttgt atcagatgcc 780

ttggttgact tgtttattaa cggatataaa cctaaggcac agggcggtgt caatctggaa 840

gatagccagt tagtaccaga tagtaggggt ggctttttct acgacgtttt caaagagaaa 900

aaactgacaa atcgaatttt tagtggtagt tatgagcggt ttggtgagga tgttcgaact 960

gttttggaaa gcaaaggatt actcggctta acttatagaa cattaggtta tgcaacgcat 1020

attgtgacgg tatggggtgc tgagtacgac aatcaaggta agattaaggc tgtctatatc 1080

acagattctg atgatcaaca agaacaaatt ggtttgaagc gtatgggaat cactcgtgat 1140

gcttccggaa atccacgttt gaataatcat atgaaaaata attcagctgg agcgcttttg 1200

gattatgtcc atacaatccg tctgggtcaa gacttatggg aagaatattt caatccgctt 1260

gcaaaagcca aagaaacagc tagtcagaca ttagccgata caaagaaggc gttggatttg 1320

tctattcaag gacaatctga attgccagaa tcaatgcgac tgatttatct tgaaaaacta 1380

aataatctct ataatcaagg aattctatct attcaaaagg cagaaagttc tgagatgcta 1440

agtggtgcat tggaaaatgg tttaaatagt ttaaagagtt tagattttcc tatttcagaa 1500

gttggaaatg ctttggcacc agatttacca gtaggtgatc gctcaacggt ttcagatgtt 1560

gattctctat catctcaaga aacaagttcc acaaatttgg aagcagacac agagaatgca 1620

ggtattattg cagatggtac caatcaattg cattttccag tggaggccca aacgacatct 1680

tcagtagagg ctgagggaga taatgttttt gaacaagagg cagatacatt accaataatt 1740

attgaaaaca aggatgaatt tggttcagaa ctatcaagaa acatgcaaac gtcagaaacg 1800

gattcgctag tagtagctgt tgaagaagat gtgaaaaatg atgaggtagc ccaagttgaa 1860

gagcttcttg aatcagaaaa agttgaaaat cagagttcgg aacttctgtc agacacccta 1920

atcgtagaga gtgcaaatga caaagaagaa gatagagtgg aggcggttgt ttctgaacaa 1980

ccagactcaa taccacatca aaatgtagaa atctctcttg tagaaccaac gaatgtcgaa 2040

actgaaactg tggtcactcc tattaatgat gcagctactc ctcatggttc cccgacgtat 2100

atagataatt ccgtaactga atctgtagct actccacttg aaaaagactc cattcaagcc 2160

ggggagacag agattgcaga accaacctcg agcgaatcaa cgaatgtcga aactgaaact 2220

gtggtcactc ctgttaatga tgtagctact cctcatggtt ccccgacgta tatagataat 2280

tccgtaactg aatctgtagc tactccactt gaaaaagact ccattcaagc cggagagaca 2340

gaaattgcag aaccaacctc gagcgaatca acgaatgtcg aaactgaaac tgtggtcact 2400

cctgttaatg atgtagctac tcctcatggt tccccgacgt atatagataa ttccgtaact 2460

gaatctgtag ctactccact tgaaaaagac tccattcaag ccggggagac agagattgca 2520

gaaccaacct cgagcgaatc aactagtgtt gaagctgaac ttgtcgacaa ttctgaaatt 2580

catgcagcta cctcttcagt tactccctgt ggctcctcgg catatgcaga tggttccaca 2640

actgaatctg tagccactcc gcttgaaaaa gactccattc agactggaaa tacagaaatt 2700

gcagaaccaa cctcgagcaa atcaactaat gtagaagctg catctgtcga caattctgaa 2760

attcatgcag atgcctctct aactgctgtt tcatcagtta atctggataa tccagtgatt 2820

gaaccagtag ctatctccct tatcggttct aagagggaca cgaatgcaga agtagaagtt 2880

tcttcattat cgaaaagaga ggttagaaaa acaaatactg acgggctaat ctctgttcaa 2940

tcaaaagtta ttaagaaaga attgctagaa tcaagcttag cagaagcagg gtctccattg 3000

ctagaagcca ccattgctca gtcttcaaac tcaaatagta ctgagatagg tatgagctat 3060

cagaatactg tgttattaga gtctaataat acagagcgtc aggtgtctaa agcagaaatt 3120

gttatggaac acaaggagac agagttagtt gaaacggttt catctgcttc tgagcctgta 3180

gtgctcgtag aaaatatctc acaaacctca aataatacta ttgaatctgg taagaatatg 3240

ggagttcaat ctcaagcagg tgcaaaacaa attttaggcg tagaacaatc ttcgaaagta 3300

agtacaccta cttcaagaca gattatggga gtcggtctat tgactcttgt tcttggtagt 3360

gctttaggtt tgttaaagaa aagacgtaag taa 3393

<210> 5

<211> 335

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Частичная последовательность домена Mac-1

<400> 5

Met Lys Val Asp Arg Gly Thr Glu Asn Val Val Ser Arg Asn Asp Thr

1 5 10 15

Glu Val Thr Thr Ser Glu Gln Asn Gln Ile Glu Val Thr Glu Thr Lys

20 25 30

Glu Ile Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Gln Thr Glu Ser Gly Glu Gln Arg

35 40 45

Gln Ile Ile Trp Ala His Gly Ile Thr Pro Pro Ala Met Glu Gln Ser

50 55 60

Gly Gly Phe Val Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Tyr Leu Asn Tyr Thr Ala

65 70 75 80

Pro Phe Glu Ala Gly Lys Gly Tyr Tyr Asp Thr Asn Lys Ser Leu Asn

85 90 95

Ala Ser Phe Ile Asp Leu Asn Leu Cys Phe Ala Ala Val Ser Ser Asn

100 105 110

Met Val His Trp Trp Leu Glu Gln Asn Ser Ser Tyr Val Glu Arg Tyr

115 120 125

Leu Lys Glu Lys Lys Gly Thr Val Asn Val Glu Glu Asn Tyr Ala Ile

130 135 140

Thr Asp Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Ser Phe Gln Asn Gln Gln Asn Ser

145 150 155 160

Arg Val Phe Asp Met Phe Lys Thr Tyr Tyr Gly Tyr Arg Thr Asn Gly

165 170 175

Phe Val Ser Asp Ala Leu Val Asp Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Lys Pro

180 185 190

Lys Ala Gln Gly Gly Val Asn Leu Glu Asp Ser Gln Leu Val Pro Asp

195 200 205

Ser Arg Gly Gly Phe Phe Tyr Asp Val Phe Lys Glu Lys Lys Leu Thr

210 215 220

Asn Arg Ile Phe Ser Gly Ser Tyr Glu Arg Phe Gly Glu Asp Val Arg

225 230 235 240

Thr Val Leu Glu Ser Lys Gly Leu Leu Gly Leu Thr Tyr Arg Thr Leu

245 250 255

Gly Tyr Ala Thr His Ile Val Thr Val Trp Gly Ala Glu Tyr Asp Asn

260 265 270

Gln Gly Lys Ile Lys Ala Val Tyr Ile Thr Asp Ser Asp Asp Gln Gln

275 280 285

Glu Gln Ile Gly Leu Lys Arg Met Gly Ile Thr Arg Asp Ala Ser Gly

290 295 300

Asn Pro Arg Leu Asn Asn His Met Lys Asn Asn Ser Ala Gly Ala Leu

305 310 315 320

Leu Asp Tyr Val His Thr Ile Arg Leu Gly Gln Asp Leu Trp Glu

325 330 335

<210> 6

<211> 457

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> rIdeSsuis_гомолог

<400> 6

Met Ala His His His His His His Val Gly Thr Gly Ser Asn Asp Asp

1 5 10 15

Asp Asp Lys Ser Pro Asp Pro Val Val Thr Gly Val Asn Glu Ile Ile

20 25 30

Glu Glu Ser Gln Val Lys Asp Glu Val Ser Ile Glu Ser Glu Lys Asn

35 40 45

Glu Ser Leu Asp Gly Ser Asn Ile Glu Ile Val Glu Glu Ile Ala Asp

50 55 60

Asn Ile Pro Ser Pro Val Ile Ala Glu Gly Glu Val Ala Val Glu Met

65 70 75 80

Lys Val Asp Arg Gly Thr Glu Asn Val Val Ser Arg Asn Asp Thr Glu

85 90 95

Val Thr Thr Ser Glu Gln Asn Gln Ile Glu Val Thr Glu Thr Lys Glu

100 105 110

Ile Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Gln Thr Glu Ser Gly Glu Gln Arg Gln

115 120 125

Ile Ile Trp Ala His Gly Ile Thr Pro Pro Ala Met Glu Gln Ser Gly

130 135 140

Gly Phe Val Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Tyr Leu Asn Tyr Thr Ala Pro

145 150 155 160

Phe Glu Ala Gly Lys Gly Tyr Tyr Asp Thr Asn Lys Ser Leu Asn Ala

165 170 175

Ser Phe Ile Asp Leu Asn Leu Cys Phe Ala Ala Val Ser Ser Asn Met

180 185 190

Val His Trp Trp Leu Glu Gln Asn Ser Ser Tyr Val Glu Arg Tyr Leu

195 200 205

Lys Glu Lys Lys Gly Thr Val Asn Val Glu Glu Asn Tyr Ala Ile Thr

210 215 220

Asp Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Ser Phe Gln Asn Gln Gln Asn Ser Arg

225 230 235 240

Val Phe Asp Met Phe Lys Thr Tyr Tyr Gly Tyr Arg Thr Asn Gly Phe

245 250 255

Val Ser Asp Ala Leu Val Asp Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Lys Pro Lys

260 265 270

Ala Gln Gly Gly Val Asn Leu Glu Asp Ser Gln Leu Val Pro Asp Ser

275 280 285

Arg Gly Gly Phe Phe Tyr Asp Val Phe Lys Glu Lys Lys Leu Thr Asn

290 295 300

Arg Ile Phe Ser Gly Ser Tyr Glu Arg Phe Gly Glu Asp Val Arg Thr

305 310 315 320

Val Leu Glu Ser Lys Gly Leu Leu Gly Leu Thr Tyr Arg Thr Leu Gly

325 330 335

Tyr Ala Thr His Ile Val Thr Val Trp Gly Ala Glu Tyr Asp Asn Gln

340 345 350

Gly Lys Ile Lys Ala Val Tyr Ile Thr Asp Ser Asp Asp Gln Gln Glu

355 360 365

Gln Ile Gly Leu Lys Arg Met Gly Ile Thr Arg Asp Ala Ser Gly Asn

370 375 380

Pro Arg Leu Asn Asn His Met Lys Asn Asn Ser Ala Gly Ala Leu Leu

385 390 395 400

Asp Tyr Val His Thr Ile Arg Leu Gly Gln Asp Leu Trp Glu Glu Tyr

405 410 415

Phe Asn Pro Leu Ala Lys Ala Cys Arg Ser Thr Ser Leu Arg Pro His

420 425 430

Ser Ser Leu Val Lys Lys Pro Leu Leu Arg Asn Leu Asn Ala Ser Thr

435 440 445

Trp Thr Arg Leu Leu Ala Gln Leu Asn

450 455

<210> 7

<211> 1016

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> rIdeSsuisB2

<400> 7

Met Ala His His His His His His Val Gly Thr Gly Ser Asn Asp Asp

1 5 10 15

Asp Asp Lys Ser Pro Asp Pro Val Val Thr Gly Val Asn Glu Ile Ile

20 25 30

Glu Glu Ser Gln Val Lys Asp Glu Val Ser Ile Glu Ser Glu Lys Asn

35 40 45

Glu Ser Leu Asp Gly Ser Asn Ile Glu Ile Val Glu Glu Ile Ala Asp

50 55 60

Asn Ile Pro Ser Pro Val Ile Ala Glu Gly Glu Val Ala Val Glu Met

65 70 75 80

Lys Val Asp Arg Gly Thr Glu Asn Val Val Ser Arg Asn Asp Thr Glu

85 90 95

Val Thr Thr Ser Glu Gln Asn Gln Ile Glu Val Thr Glu Thr Lys Glu

100 105 110

Ile Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Gln Thr Glu Ser Gly Glu Gln Arg Gln

115 120 125

Ile Ile Trp Ala His Gly Ile Thr Pro Pro Ala Met Glu Gln Ser Gly

130 135 140

Gly Phe Val Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Tyr Leu Asn Tyr Thr Ala Pro

145 150 155 160

Phe Lys Ala Gly Lys Gly Tyr Tyr Asp Thr Asn Lys Ser Leu Asn Ala

165 170 175

Ser Phe Ile Asp Leu Asn Leu Cys Phe Ala Ala Val Ser Ser Asn Met

180 185 190

Val His Trp Trp Leu Glu Gln Asn Ser Ser Tyr Val Glu Arg Tyr Leu

195 200 205

Lys Glu Lys Lys Gly Thr Val Asn Val Gly Glu Asn Tyr Ala Ile Thr

210 215 220

Asp Leu Arg Arg Tyr Ile Asp Ser Phe Gln Asp Gln Gln Asn Ser Arg

225 230 235 240

Val Phe Asp Met Phe Lys Thr Tyr Tyr Gly Tyr Arg Thr Asn Gly Phe

245 250 255

Val Ser Asp Ala Leu Val Asp Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Lys Pro Lys

260 265 270

Val Gln Gly Gly Val Asn Leu Glu Asp Ser Gln Leu Val Pro Asp Ser

275 280 285

Arg Gly Gly Phe Phe Tyr Asp Val Phe Lys Glu Lys Lys Leu Thr Asn

290 295 300

Arg Ile Phe Ser Gly Ser Tyr Glu Arg Phe Gly Glu Asp Val Arg Thr

305 310 315 320

Val Leu Glu Ser Lys Gly Leu Leu Gly Leu Thr Tyr Arg Thr Leu Gly

325 330 335

Tyr Ala Thr His Ile Val Thr Val Trp Gly Ala Glu Tyr Asp Asn Gln

340 345 350

Gly Lys Ile Arg Ala Val Tyr Ile Thr Asp Ser Asp Asp Gln Gln Glu

355 360 365

Gln Ile Gly Leu Lys Arg Met Gly Ile Thr Arg Asp Ala Ser Gly Asn

370 375 380

Pro Arg Leu Asn Asn His Val Lys Asn Asn Ser Ala Gly Ala Leu Leu

385 390 395 400

Asp Tyr Val His Thr Ile Arg Leu Gly Gln Asp Leu Trp Glu Glu Tyr

405 410 415

Phe Asn Pro Phe Ala Lys Ala Lys Glu Ile Ala Ser Gln Ile Leu Ala

420 425 430

Asp Arg Lys Lys Ala Leu Val Leu Ser Ile Gln Gly Gln Ser Glu Leu

435 440 445

Pro Glu Ser Met Arg Leu Ile Tyr Leu Glu Lys Leu Asn Asn Leu Tyr

450 455 460

Asn Gln Gly Ile Leu Ser Ile Gln Lys Thr Glu Ser Ser Glu Met Leu

465 470 475 480

Ser Gly Ala Leu Glu Asn Gly Leu Asn Ser Leu Lys Ser Leu Asp Phe

485 490 495

Pro Ile Ser Glu Val Gly Asn Ala Leu Ala Pro Asp Leu Ser Val Gly

500 505 510

Asp Arg Ser Thr Val Ser Asp Val Asp Ser Leu Ser Ser Gln Glu Thr

515 520 525

Ser Ser Thr Asn Leu Glu Ala Asp Thr Glu Asn Ala Gly Ile Ile Ala

530 535 540

Asp Gly Thr Asn Gln Leu His Phe Pro Val Glu Ala Gln Thr Thr Ser

545 550 555 560

Ser Val Glu Ala Glu Gly Asp Asn Val Phe Glu Gln Glu Ala Asp Thr

565 570 575

Leu Pro Ile Ile Ile Glu Asn Lys Asp Glu Phe Gly Ser Glu Leu Ser

580 585 590

Gly Asn Met Gln Thr Ser Glu Thr Asp Ser Leu Val Val Ala Val Glu

595 600 605

Glu Asp Val Lys Asn Asp Glu Val Asp Gln Val Glu Lys Leu Leu Glu

610 615 620

Ser Glu Lys Val Glu Asn Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Asp Thr Leu

625 630 635 640

Ile Val Glu Gly Ala Asn Asp Lys Glu Glu Asp Arg Val Glu Ala Val

645 650 655

Val Ser Glu Gln Pro Asp Ser Ile Pro His Gln Asn Val Glu Ile Ser

660 665 670

Pro Val Glu Pro Met Asn Val Glu Thr Glu Ser Val Val Thr Pro Ile

675 680 685

Asn Asp Ala Ala Thr Pro His Gly Phe Pro Met Tyr Ile Asp Asn Ser

690 695 700

Val Thr Glu Ser Val Ala Thr Pro Leu Glu Lys Asp Ser Ile Gln Ala

705 710 715 720

Gly Glu Thr Glu Ile Ala Glu Pro Thr Ser Ser Glu Ser Thr Ser Val

725 730 735

Glu Ala Glu Leu Val Asp Asn Ser Glu Ile His Ser Ala Thr Ser Ser

740 745 750

Val Thr Pro Arg Gly Ser Ser Ala Tyr Ala Asp Ser Ser Thr Thr Glu

755 760 765

Ser Val Ala Thr Leu Leu Glu Lys Asp Ser Ile Gln Ala Gly Glu Thr

770 775 780

Glu Ile Ala Glu Pro Thr Ser Ser Lys Ser Thr Asn Val Glu Ala Ala

785 790 795 800

Ser Val Asp Asn Ser Glu Ile His Ala Asp Thr Ser Leu Thr Ala Val

805 810 815

Ser Ser Val Asn Leu Asp Asn Pro Val Ile Glu Pro Val Ala Ile Pro

820 825 830

Leu Ile Gly Ser Lys Arg Asp Thr Asn Ala Glu Val Glu Val Ser Ser

835 840 845

Leu Ser Lys Arg Glu Val Arg Lys Pro Asn Thr Glu Gly Leu Ile Ser

850 855 860

Val Gln Ser Lys Val Ile Lys Lys Glu Leu Leu Glu Ser Ser Leu Val

865 870 875 880

Glu Ala Gly Ser Pro Leu Leu Glu Ala Thr Ile Ala Gln Ser Ser Asn

885 890 895

Ser Asn Ser Thr Glu Ile Gly Met Ser Tyr Gln Asn Thr Val Leu Leu

900 905 910

Glu Ser Asn Asn Thr Glu Arg Gln Val Ser Lys Ala Glu Ile Val Ile

915 920 925

Glu His Lys Glu Thr Glu Leu Val Glu Thr Val Ser Ser Ala Ser Glu

930 935 940

Pro Val Val Leu Val Glu Asn Ile Ser Gln Thr Ser Asn Asn Thr Ile

945 950 955 960

Glu Ser Gly Lys Asn Met Gly Val Gln Ser Gln Ala Gly Ala Lys Gln

965 970 975

Ile Leu Gly Ile Glu Gln Ser Ser Lys Val Ser Thr Pro Thr Ser Arg

980 985 990

Gln Ile Met Gly Val Gly Leu Leu Thr Leu Val Leu Gly Ser Ala Leu

995 1000 1005

Gly Leu Leu Lys Lys Arg Arg Lys

1010 1015

<210> 8

<211> 1374

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность кодирующая rIdeSsuis_гомолог

<400> 8